Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

En plate-basert cytotoksisitet analysen for vurdering av Rat placenta Natural killer Cell Cytolytisk funksjon

doi: 10.3791/58961 Published: June 2, 2019

Summary

Her gir vi en detaljert metodikk for å isolere og vurdere cytotoksisk funksjon av naturlige killer celler fra placentas av et fargemetrisk plate analysen. Den reduserte livmor trykk rotte modell av placenta iskemi ble valgt til å demonstrere antistoff-mediert isolasjon og vurdering av cytotoksisk funksjon av naturlige killer celler.

Abstract

Det er velkjent at decidual naturlig Killer (NK) celler spille en avgjørende rolle i etablering og vedlikehold av normal graviditet. Nyere studier har vist en endret befolkning på sirkulerende og decidual NK celler hos kvinner som lider av uønskede graviditet komplikasjoner som tilbakevendende spontanabort og preeclampsia. Studier fra vår gruppe har vist at hypertensjon i svangerskapet er forbundet med en økt befolkning på aktiverte NK celler i morkaken basert på uttrykk for overflaten aktiverings markører. Dette manuskriptet gir en detaljert protokoll for å vurdere cytotoksisk funksjon av NK celler isolert fra placentas i en preeclampsia-lignende dyr modell av kirurgisk indusert placenta iskemi. Følgende trinn er beskrevet i detalj: generering av enkelt celle suspensjon, NK celle isolasjon, ex vivo stimulering, effektor: Target celle co-kultur, og cytotoksisitet analysen.

Introduction

Preeclampsia er en hypertensive forstyrrelse av svangerskapet preget av fosterets vekst restriksjon, end organskade og kronisk immunforsvar. Kronisk uimottakelig aktivering hos kvinner med preeclampsia fører til økt sirkulerende og placenta inflammatorisk cytokiner, en ubalanse i CD4+ T celler populasjoner, og en økt befolkning på aktivert Natural Killer (NK) celler1. Studier nylig publisert av vår Lab demonstrere en rolle for NK celler i forårsaker noen av patofysiologi forbundet med preeclampsia i redusert livmor trykk (RUPP) rotte modell av preeclampsia. Benytter flyte flowcytometri å mål overflate gjengivelsen av aktivisering merker opp på NK celler, en forhøyet befolkning av aktivert NK celler inne sirkulasjonen og placentas av RUPP rotter sammenlignet med normal gravid (NP) rotter var observert2.

For å bekrefte flyten flowcytometri observasjoner, funksjonelle studier for å vurdere cytotoksisk aktivitet av NK celler isolert fra placentas av NP og RUPP rotter ble utført. Det er flere metoder tilgjengelig for vurdering av cytotoksisk funksjon av cytotoksisk CD8+ T celler og NK celler. Gullstandarden for funksjonell cytotoksisk analyse er den krom Release analysen3. Annet bebygget protokoller anvende inkludere flyte flowcytometri4, image flowcytometri5, calcein løslate6, og høyst i den seneste tid bioluminesens7. Denne videoen vil gi en detaljert protokoll om hvordan du bruker veletablerte melkesyre dehydrogenase (LDH) Release analysen for å måle cytotoksisk funksjon av NK celler ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig LDH cytotoksisitet analysen Kit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle protokoller ble godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee ved University of Mississippi Medical Center. Omsorgen og håndteringen av dyrene var i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer for etisk dyr behandling.

1. lymfocytter Cell Isolation fra placentas

  1. Fjern en placenta fra rotte livmoren (svangerskap dag 19) og plasser i 10 mL av iskald PBS8.
  2. Plasser en placenta på et 100 μm filter og sitte i en Petri parabolen inneholder 13,5 mL RPMI og 1,5 mL FBS (totalt volum er 15 mL). Bruk den flate siden av en sprøyte stempel for å skyve morkaken gjennom filteret i Petri parabolen.
  3. Klargjør 3 15 mL koniske rør for hvert vev. Tilsett 3 mL tetthet gradient medium (se tabell av materialer) til hvert rør, deretter forsiktig overlay 5 ml homogenisert placenta i hvert rør.
  4. Sentrifuger for 25 min ved 300 x g ved romtemperatur (RT) uten brems. Samle den tynne hvite Buffy laget med en overføring pipette.
    Merk: Etter sentrifugering, 3 lag er synlige, den røde RPMI på toppen, den hvite Buffy laget i midten, og den klare tettheten gradient medium lag nederst. Bruk en overførings pipette til å trekke opp det hvite Buffy-laget fra slangen. Kombiner Buffy laget fra alle rør av samme placenta i 1 tube.
  5. Tilsett 10 mL RPMI til kombinerte Buffy lag. Sentrifuger for 10 min, 300 x g, ved 4 ° c og kast supernatanten.

2. isolering av Natural killer celler

  1. Resuspend celle pellet i 50 til μL av iskald PBS
  2. Legg biotin-merket CD3 antistoff for å pelleted celler i henhold til produsentens protokoll og bland godt med en pipette. Plasser røret i et rør Rotator og ruge 20 min ved 4 ° c.
  3. Tilsett 1 mL RPMI, sentrifuger for 10 min ved 400 x g og 4 ° c, og kast supernatanten.
  4. Resuspend pellet i 1 mL RPMI og kombineres med 150 μL av magnetiske perler i et 1,5 mL mikrosentrifugen rør. Plasser mikrosentrifugen røret i et rør Rotator og roter mens incubating i 30 min ved 4 ° c.
    Merk: Trekke ut Release buffer på dette tidspunktet og la det komme RT i biosafety skapet.
  5. Plasser rørene i magneten i 1 min. samle supernatanten og lagre CD3 i et 15 mL rør på is.
    Merk: Dette er CD3- populasjonen av celler.
  6. Fjern slangen fra magneten og tilsett 1 mL RPMI. Bland celler og perler 5 ganger med en pipette.
  7. Gjenta trinn 2,5.
  8. Sentrifuger CD3- bestanden av celler i 10 min ved 400 x g og 4 ° c og kast supernatanten. Resuspend celle pellet i 50 μL av iskald PBS
  9. Legg biotin-merket CD161a antistoff til CD3- celler i henhold til produsentens protokoll og bland godt. Plasser røret i et rør Rotator og ruge i 20 min ved 4 ° c.
  10. Tilsett 1 mL RPMI, sentrifuger for 10 min ved 400 x g og 4 ° c, og kast supernatanten. Resuspend pellet i 1 mL RPMI og kombineres med 150 μL av magnetiske perler i et 1,5 mL mikrosentrifugen rør.
  11. Plasser mikrosentrifugen røret i et rør Rotator og roter mens incubating i 30 min ved 4 ° c.
  12. Plasser rørene i en magnet i 1 min. samle supernatanten og kast CD3-/CD161a- celler.
  13. Fjern slangen fra magneten og tilsett 1 mL RPMI. Bland celler og perler 5 ganger med en pipette.
  14. Gjenta trinn 2,12.
  15. Fjern mikrosentrifugen rør fra magneten og tilsett 1 mL av RT Release buffer. Plasser røret på røret Rotator og roter mens incubating i 15 min ved RT.
  16. Plasser rørene i magnet i 1 min. samle supernatanten i et nytt 15 mL konisk rør på is.
    Merk: Dette er befolkningen i NK celler.
  17. Fjern slangen fra magneten og tilsett 1 mL RT RPMI. Bland celler og perler 5 ganger med pipette.
  18. Gjenta trinn 2,16, og plasser supernatanten i samme rør. Bland godt og ta en 20 μL prøve å telle celler
    Merk: Hold slangen på isen.
  19. Sentrifuger CD3-/CD161a+ celler i 10 min, 400 x g ved 4 ° c, og fjern deretter supernatanten. Resuspend cellene i RPMI (10% FBS, 1% pen/strep, 2 ng/mL IL-2) og frø ved en konsentrasjon på 3 x 105 celler/brønn i en 6-brønn plate i 2,5 ml av NK Cell Activation Media. Ruge celler for 48 h ved 37 ° c, 5% CO2 i en fuktet inkubator.

3. cytotoksisitet analysen: hente NK celler eller YAC1 fra kultur eller bestått celler

Merk: Alle trinn må utføres under panseret. Alle celle rør må holdes på isen til enhver tid.

  1. Bruk et glass serologisk Pipet å samle YAC1 celler og Media fra kolbe, plass i en 50 mL rør på is, og bland godt. Ta 20 μL for å telle celler.
  2. Snurr YAC1-cellene i 10 minutter ved 300 x g og 4 ° c. Telle celler mens disse spinner.
  3. Legg Trypsin/EDTA til hver brønn i en NK celle 6-brønn plate. Trykk på platen og plasser i inkubator.
  4. Etter at cellene har inkubert med Trypsin/EDTA for ~ 5 min ved 37 ° c, skrape platen/kolbe med en steril plate skraper. Tilsett 1 mL NK Cell Media til hver brønn.
  5. Samle celler og medier med serologisk Pipet og samle inn et 15 mL sentrifugerør. Ta 20 μL for å telle celler.
  6. Snurre NK cellene i 10 min, 400 x g ved 4 ° c. Tell utvalget av celler fra trinn 3,5 i løpet av denne sentrifugering.
    Merk: Vis kultur platene under et mikroskop før du forkaster dem for å sikre at det ikke er flere celler som overholdes til bunnen av brønnene. Siden eksperimentet bruker NK celler og YAC1 celler, sørg for å telle hver enkelt separat.
  7. Count celler og resuspend ved konsentrasjoner bestemmes i optimaliserings forsøk for å teste for det aktuelle antall mål: effektor ratio. Dette vil bli oppnådd ved å re-suspendere pellet i deres tilsvarende Media for å gjøre følgende celle konsentrasjoner: YAC1 ved 4 x 105 celler/ml og NK celler ved 2 x 107 celler/ml.

4. cytotoksisitet analysen: analysen Protocol

  1. Bruk en rund bunn, kultur behandlet 96-brønn plate for å sette opp platen som foreslått i tabell 1. Denne tabellen viser eksperimentelle kontroller og 3 sett med NK eksperimentelle kolonner. Dette kan utvides til totalt 10 NK eksperimentelle søyler i en 96-brønn plate.
  2. Sentrifuger analysen plate på 250 x g for 4 min for å være sikker på at effektor og målcellene er i kontakt. Ruge den 96-brønn platen i 5 timer i et fuktet kammer inkubator ved 37 ° c, 5% CO2 for å oppnå god kontakt mellom mål og Effektor celler og mål cellelyse ved Effektor celler.
    Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her.
  3. 45 min. før høsting av supernatanter, tilsett 10 μL av 10x lyse Rings løsning til målcellen maksimal LDH Release brønner (Wells 1E, 1F, 1G, og 1H) og Plasser platen tilbake i fuktet kammeret.
  4. Etter at inkubasjonstiden er ferdig, sentrifuger platen ved 250 x g for 4 min. ved bruk av en flerkanals pipettehjelper, Overfør 50 μL alikvoter fra alle brønner til en frisk 96-brønn flat bunn analysen plate.
    Merk: Ikke berør bunnen av brønnene, slik at cellene ikke overføres til den friske analysen plate. Ikke bruk en kultivert behandlet plate som fersk analysen plate.
  5. Foreta analyse reagens.
    1. Etter at analysebuffer har nådd romtemperatur, tilsett 12 mL av analysen buffer til en substrat Mix flaske. Inverter og rist forsiktig til den er helt oppløst. 1 flaske er nok for 2 96-brønn plater.
      Merk: Analyse bufferen skal beskyttes mot lys mens den blir tint. Bland umiddelbart før bruk.
  6. Tilsett 50 μL av analyse reagens for alle brønner i analyse platen fra trinn 4,6. Dekkplaten med folie for å beskytte den mot lys og ruge i 30 min ved romtemperatur.
    Merk: Nylig utført analyse reagens skal oppbevares i en fryser. Reagens er bra i ca. 8 uker.
  7. Tilsett 50 μL av stopp løsning i hver brønn. Les plate innen 1 time etter at du har lagt til stopp Solution og ta opp absorbansen ved 490 NM. Representative data er vist i tabell 2.

5. beregning av resultater

  1. Beregn gjennomsnittlig absorbansen verdien fra kultur medium bakgrunn brønner og subtrahere fra alle absorbansen verdier for eksperimentell, Target Cell spontan LDH Release og effektor Cell spontan LDH Release brønner.
  2. Beregn de gjennomsnittlige absorbansen verdiene for volum Korrigerings kontroll brønnene og trekk fra de absorbansen verdiene som er ervervet for mål celle maksimal LDH Release Control-brønner.
  3. Bruk de korrigerte verdiene fra trinn 5,1 og 5,2 i følgende formel til å beregne prosent cytotoksisitet for hver effektor: mål godt.
    Equation 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Placenta NK celler Hentet fra NP og RUPP rotter var inkubert for 5 h med målcellene i sine respektive medier i forholdet 50:1 (NK: Target). Absorbansen ble innspilt ved 490 NM og rådata er vist i tabell 2. Gjennomsnitts absorbansen av kultur medium bakgrunn og kontroll brønnene for volum korrigering ble beregnet. Disse gjennomsnitt ble trukket fra de aktuelle brønnene angitt i produsentens protokoll og er representert i tabell 3. De korrigerte verdiene ble deretter brukt til å hente% cytotoksisitet ved hjelp av protokollen fra produsenten (Tabell 4).

1 2 3 4 5
Tcs Vcc ECSR-1 ECSR-2 ECSR-3
Tcs Vcc ECSR-1 ECSR-2 ECSR-3
Tcs Vcc ECSR-1 ECSR-2 ECSR-3
Tcs Vcc ECSR-1 ECSR-2 ECSR-3
Tcm CMB EW-1 EW-2 EW-3
Tcm CMB EW-1 EW-2 EW-3
Tcm CMB EW-1 EW-2 EW-3
Tcm CMB EW-1 EW-2 EW-3

Tabell 1: analyse plate oppsett. TCS = mål celle spontan LDH release (50 μL målceller + 50 μL mål celle medium); TCM = mål celle maksimal LDH-utgivelse (50 μL målceller + 50 μL mål celle medium); VCC = volum Korrigerings kontroll (50 μL mål celle medium + 50 μL NK celle medium); CMB = kultur medium bakgrunn kontroll (50 μL mål celle medium + 50 μL NK celle medium); ECSR = effektor celle spontan utgivelse (50 μL NK celler + 50 μL NK celler medium); EW = eksperimentelle brønner (50 μL målceller + 50 μL NK celler).

1 2 3 4 5
Np Rupp Np
0,615 for alle 0,484 for alle 0,473 for alle 0,463 for alle 0,471 for alle
0,586 for alle 0,484 for alle 0,458 for alle 0,474 for alle 0,469 for alle
0,61 for alle 0,486 for alle 0,464 for alle 0,459 for alle 0,469 for alle
0,578 for alle 0,495 for alle 0,478 for alle 0,458 for alle 0,482 for alle
0,605 for alle 0,55 for alle 0,524 for alle 0,526 for alle 0,543 for alle
0,576 for alle 0,504 for alle 0,519 for alle 0,502 for alle 0,528 for alle
0,565 for alle 0,512 for alle 0,515 for alle 0,513 for alle 0,531 for alle
0,563 for alle 0,581 for alle 0,526 for alle 0,508 for alle 0,519 for alle

Tabell 2: rå absorbansen data av en analyse plate som inneholder eksperimentelle kontroller i kolonne 1 og 2 og eksperimentelle brønner for å måle cytotoksisitet av placenta NK celler fra NP og RUPP rotter mot YAC1 Target celler.

1 2 3 4 5
Np Rupp Np
0,12775 for alle -0,01425 til en -0,02425 til en -0,01625 til en
0,09875 for alle -0,02925 til en -0,01325 til en -0,01825 til en
0,12275 for alle -0,02325 til en -0,02825 til en -0,01825 til en
0,09075 for alle -0,00925 til en -0,02925 til en -0,00525 til en
0,06825 for alle 0,03675 for alle 0,03875 for alle 0,05575 for alle
0,03925 for alle 0,03175 for alle 0,01475 for alle 0,04075 for alle
0,02825 for alle 0,02775 for alle 0,02575 for alle 0,04375 for alle
0,02625 for alle 0,03875 for alle 0,02075 for alle 0,03175 for alle

Tabell 3. Korrigert absorbansen. Absorbansen av brønner etter subtraksjon av gjennomsnittlig absorbansen av kontroll brønner i henhold til produsentens protokoll. Kolonne 1, Wells 1-4, er TCS absorbances verdier-den gjennomsnittlige CMB absorbansen-verdien. Kolonne 1, Wells 5-8, er TCM absorbansen verdier-den gjennomsnittlige VCC absorbansen verdi.

Np Rupp Np
128,9916 for alle 108,8235 for alle 93,69748 for alle
63,44538 for alle 118,9076 for alle 66,80672 for alle
75,92593 for alle 72,75132 for alle 64,28571 for alle
66,27907 for alle 63,17829 for alle 83,33333 for alle
Gjennomsnittlig% cytotoksisitet 83,66049 for alle 90,91518 for alle 77,03081 for alle

Tabell 4. Cytotoksisitet beregninger. Gjennomsnittlig prosent cytotoksisitet av replikere prøver av placenta NK celler isolert fra NP og RUPP rotter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finnes en rekke viktige viktige notater å vurdere for optimale resultater. Sterilitet av cellene utnyttet er svært viktig. Etter samling av morkaken, er det viktig at utarbeidelse og isolering av NK cellene er utført under sterile forhold i en biosafety kabinett. Videre, fordi alle celler slipper LDH upon Cellular skade, bør forsiktighet tas for å få en høy levedyktighet av NK celler etter isolasjon og under co-kulturen prosessen. For mye spontan LDH utgivelse fra NK cellene kan ofte føre til negative, ubrukelig data

Det er noen aspekter av denne protokollen som vil være spesifikke for brukeren og deres behov. For eksempel er det ulike metoder for isolering av mononukleære celler fra placenta i tillegg til metodene i denne artikkelen, for eksempel mekaniske og enzymatisk Disaggregation. I tillegg er det opp til brukeren å bestemme det optimale målet celler nummer og effektor: mål ratio som vil være egnet for eksperimentet. I våre hender, 10 000 målceller og en effektor: målet ratio på 50:1 var fast bestemt på å være optimal for våre eksperimenter. Disse tallene kan endres avhengig av målcellene valgt og på vevet som NK cellene er isolert. Andre etterforskere har benyttet denne metoden for å vurdere NK funksjon av celler isolert fra lever og milt9. Derfor kan denne metoden være ansatt i ulike områder av forskningen, ikke bare i studier av preeclampsia, som vi har valgt å bruke den.

Gullstandarden for cytotoksisitet vurdering er den krom utgivelsen analysen5. Selv om denne metoden er pålitelig og reproduserbar, er den mest åpenbare begrensningen bruk av radioaktiv eksponerings risiko for personell og Radioaktiv avhending. Andre, ikke-radioaktive cytotoksisitet analyser som Flow flowcytometri-baserte og calcien frigjør analysene rapporteres å ha sammenlignbare resultater til CRA6,10,11. Men, Flow-flowcytometri-baserte analyser krever ekstra spesialisert opplæring av personell i Flow flowcytometri å kjøre analysen. Den LDH Release analysen krever ikke noen spesialisert trening, da denne testen bare krever enkel pipettering å utføre analysen. I tillegg, mens LDH Release analysen kan utnyttes ved hjelp av standard spektroskopi eller fluorescerende deteksjon, den calcien utgivelse og Flow-flowcytometri-baserte metoder krever utstyr i stand til å oppdage fluorescens. Begrensninger av LDH løslate analysen inkludere en undervurdering av cellen død på grunn av ufullstendig løslate av LDH fra sterkt skadd celler.

I denne analysen, måling av LDH sluppet inn i Media skjer ved en enzymatisk reaksjon der iodonitrotetrazolium (en tetrazolium salt) omdannes til formazan (rød i farge). Absorbansen måles etter standard spektroskopi, og mengden skadede celler i kulturen er proporsjonal med intensiteten i den røde fargen. Denne analysen gjør det mulig for nøyaktig bestemmelse av skadede eller skadde celler i en prøve. Til slutt, denne fargemetrisk analysen kan også brukes med andre celletyper til analysen cytotoksisitet forekommende via celle-mediert samt kjemisk-mediert mekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen konflikter av interesse, økonomisk eller på annen måte, er erklært av forfatterne.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Heart Lung og Blood Institute of National Institutes of Health under Grant R00HL130456, National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health under prisen P20GM104357, og av Mississippi INBRE, finansiert av en institusjonell Development Award (idé) fra National Institutes of General Medical Sciences i National Institutes of Health under stipend nummer P20GM103476. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf tube Fisher 5408129
100 µL Filter Fisher 22363549 Nylon Mesh
15 mL conical tube Fisher 0553859A
3 mL syringe Fisher 14823436
50 mL conical tube Fisher 7203510
6-well cell culture plate Corning 720083
96-well Tissue Culture Plate CELLTREAT 229190 Sterile, Round Bottom
AOPI Nexcelom CS201065ML
Cell scraper Fisher 8100241
Cellometer Disposable Counting Chambers Nexcelom CHT4-SD100
Cellometer Vision Image Cytometer Nexcelom N/A
Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit Promega G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit Invitrogen 11061D
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D
EDTA Sigma Aldrich EDS-100G
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Flow Cytometry Tube Corning 352008
Lymphoprep Fisher NC0460539 Density gradient medium; 4 x 250 mL
PBS Fisher SH3025801 10 x 500 mL
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
Petri dishes Fisher 9720500 Without Pad
Purified Mouse anti-Rat CD161a BD Biosciences 555006
Purified Mouse anti-Rat CD3 BD Biosciences 554829
Recombinant Rat IL-2 R&D Systems 502-RL
RPMI Gibco 11875135 1640 Medium
T25 flask Corning 430639
Trypsin ThermoFisher 15090046
YAC-1 cell ATCC TIB-160

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. (2018).
  2. Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131, (23), 2753-2762 (2017).
  3. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, (2), 181-196 (1968).
  4. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325, (1-2), 51-66 (2007).
  5. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10, (10), 0141074 (2015).
  6. Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8, (6), 1131-1135 (2001).
  7. Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9, (2), 89357 (2014).
  8. Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother's diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29, (3), 158-165 (2014).
  9. Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11, (3), 285-293 (2012).
  10. Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180, (1), 1-13 (1995).
  11. Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42, (1), 42-49 (2012).
En plate-basert cytotoksisitet analysen for vurdering av Rat placenta Natural killer Cell Cytolytisk funksjon
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Baik, C. H., Geer, M., Travis, O. K., Cornelius, D. C. A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function. J. Vis. Exp. (148), e58961, doi:10.3791/58961 (2019).More

Baik, C. H., Geer, M., Travis, O. K., Cornelius, D. C. A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function. J. Vis. Exp. (148), e58961, doi:10.3791/58961 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter