Summary
Här ger vi en detaljerad metodik för att isolera och bedöma cytotoxisk funktion av naturliga mördar celler från moderkakor av en kolorimetrisk plattanalys. Den reducerade uterin per fusion tryck råtta modell av placenta ischemi valdes för att demonstrera anti kropp-medierad isolering och bedömning av den cytotoxiska funktionen av naturliga mördar celler.
Abstract
Det är väl känt att decidubbla naturliga mördare (NK) celler spelar en avgörande roll för etablering och underhåll av normal graviditet. Nyligen genomförda studier har visat en förändrad population av cirkulerande och decidubbla NK celler hos kvinnor som lider av ogynnsamma graviditetskomplikationer såsom recidiverande missfall och preeclampsi. Studier från vår grupp har visat att hypertoni under graviditeten är förknippad med en ökad population av aktiverade NK-celler i moderkakan baserat på uttrycket av ytan aktiverings markörer. Detta manuskript ger ett detaljerat protokoll för att bedöma den cytotoxiska funktionen av NK celler isolerade från moderkakor i en Preeclampsia-liknande djur modell av kirurgiskt inducerad placenta ischemia. Följande steg beskrivs i detalj: generering av enstaka cell SUS pension, NK cell isolering, ex vivo stimulering, Effector: mål cell co-Culture, och cytotoxicitetsanalysen.
Introduction
Preeclampsi är en Hypertensiv sjukdom av graviditeten kännetecknas av foster tillväxt begränsning, organ skador och kronisk immun aktivering. Kronisk immun aktivering hos kvinnor med preeclampsi leder till ökad cirkulerande och placenta inflammatoriska cytokiner, en obalans i CD4+ T-celler populationer, och en ökad population av aktiverade Natural Killer (nk) celler1. Studier som nyligen publicerats av vårt labb visar en roll för NK celler i att orsaka en del av patofysiologin i samband med havandeskaps förgiftning i minskad uterin per fusion Pressure (Rupp) råtta modell av preeclampsi. Använda flödescytometri för att mäta ytan uttryck för aktiverings markörer på NK-celler, en ökad population av aktiverade NK-celler i cirkulationen och moderkakor av Rupp råttor jämfört med normala gravida (NP) råttor observerades2.
För att bekräfta flödescytometri observationer, funktionella studier för att bedöma den cytotoxiska aktiviteten hos NK-celler isolerade från moderkakor av NP och Rupp råttor utfördes. Det finns flera metoder tillgängliga för bedömning av cytotoxisk funktion av cytotoxiska CD8+ T celler och NK celler. Den gyllene standarden för funktionell cytotoxisk analys är krom release assay3. Andra utvecklade protokoll som används inkluderar flödescytometri4, bildcytometri5, calcein release6, och senast mareld7. Denna video kommer att ge ett detaljerat protokoll om hur du använder den väletablerade laktatdehydrogenas (LDH) Release-test för att mäta cytotoxisk funktion av NK celler med hjälp av en kommersiellt tillgänglig LDH cytotoxicitet assay kit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll godkändes av den institutionella djur omsorgs-och användnings kommittén vid University of Mississippi Medical Center. Vården och hanteringen av djuren var i överensstämmelse med de nationella hälso instituten rikt linjer för etisk djur behandling.
1. isolering av lymfocytceller från placentas
- Ta bort en moderkakan från råtta livmodern (graviditets dag 19) och placera i 10 ml iskall PBS8.
- Placera en moderkakan på ett 100 μm filter och sitta i en petriskål som innehåller 13,5 ml RPMI och 1,5 ml FBS (total volym är 15 ml). Använd den plana sidan av en sprutkolv för att trycka moderkakan genom filtret i petriskål.
- Förbered 3 15 mL koniska rör för varje vävnad. Tillsätt 3 ml densitet gradient medium (se tabell över material) till varje tub, sedan försiktigt overlay 5 ml homogeniserad moderkakan i varje tub.
- Centrifugera i 25 min vid 300 x g vid rums temperatur (RT) utan broms. Samla in det tunna vita Buffy-skiktet med en överföringspipett.
Anmärkning: Efter centrifugering, är 3 lager synliga, den röda RPMI på toppen, den vita Buffy Layer i mitten, och klar densitet gradient medium skiktet i botten. Använd en överföringspipett för att dra upp det vita Buffy-skiktet från röret. Kombinera Buffy Layer från alla rör av samma moderkakan i 1 tub. - Tillsätt 10 mL RPMI till kombinerade Buffy-skikt. Centrifugera i 10 min, 300 x g, vid 4 ° c och Kassera supernatanten.
2. isolering av naturliga mördar celler
- Omsuspendera cellpelletar i 50 μL iskaffe PBS
- Tillsätt biotin-märkt CD3 anti kropp till pelleterat celler enligt tillverkarens protokoll och blanda väl med en pipett. Placera röret i en tubrotator och inkubera 20 min vid 4 ° c.
- Tillsätt 1 mL RPMI, Centrifugera i 10 min vid 400 x g och 4 ° c och Kassera supernatanten.
- Omsuspendera pelleten i 1 mL RPMI och kombinera med 150 μL magnetiska pärlor i ett 1,5 mL mikrocentrifugerör. Placera mikrocentrifugerröret i en tubrotator och rotera vid inkubering under 30 min vid 4 ° c.
Anmärkning: Dra ut frigöringskbufferten vid denna tidpunkt och låt den nå RT i biosäkerhets skåpet. - Placera rören i magneten i 1 min. samla supernatanten och spara CD3-cell population i en 15 mL tub på is.
Anmärkning: Detta är CD3- populationen av celler. - Ta bort röret från magneten och tillsätt 1 mL RPMI. Blanda celler och pärlor 5 gånger med en pipett.
- Upprepa steg 2,5.
- Centrifugera CD3- populationen av cellerna i 10 min vid 400 x g och 4 ° c och Kassera supernatanten. Omsuspendera cellpelleten i 50 μL iskaffe PBS
- Tillsätt biotin-märkt CD161a anti kropp till CD3- celler enligt tillverkarens protokoll och blanda väl. Placera röret i en tubrotator och inkubera i 20 min vid 4 ° c.
- Tillsätt 1 mL RPMI, Centrifugera i 10 min vid 400 x g och 4 ° c och Kassera supernatanten. Omsuspendera pelleten i 1 mL RPMI och kombinera med 150 μL magnetiska pärlor i ett 1,5 mL mikrocentrifugerör.
- Placera mikrocentrifug röret i en tubrotator och rotera under inkubering under 30 min vid 4 ° c.
- Placera rören i en magnet i 1 min. samla supernatanten och kassera CD3-/Cd161a- celler.
- Ta bort slangen från magneten och tillsätt 1 mL RPMI. Blanda celler och pärlor 5 gånger med en pipett.
- Upprepa steg 2,12.
- Avlägsna mikrocentrifugrör från magneten och tillsätt 1 mL RT-Frigörningsbuffert. Placera röret på rör rotatorn och rotera under inkubering i 15 min vid RT.
- Placera rören i magneten i 1 min. samla supernatanten i ett nytt 15 mL koniskt rör på is.
Anmärkning: Detta är populationen av NK-celler. - Ta bort slangen från magneten och tillsätt 1 mL RT RPMI. Blanda celler och pärlor 5 gånger med pipett.
- Upprepa steg 2,16, placera supernatanten i samma tub. Blanda väl och ta ett 20 μL prov för att räkna celler
Anmärkning: Håll röret på isen. - Centrifugera CD3-/Cd161a+ celler i 10 min, 400 x g vid 4 ° c, ta sedan bort supernatanten. Omsuspendera cellerna i RPMI (10% FBS, 1% penna/STREP, 2 ng/mL IL-2) och frö vid en koncentration av 3 x 105 celler/brunn i en 6-brunn platta i 2,5 ml av NK cell Activation media. Inkubera celler för 48 h vid 37 ° c, 5% CO2 i en befuktad inkubator.
3. cytotoxicitetsanalys: hämtar NK-celler eller YAC1 från kultur eller passerar celler
Anmärkning: Alla steg måste utföras under huven. Alla cell rör måste alltid hållas på is.
- Använd ett glas serologiska Pipettera att samla in YAC1 celler och media från kolven, plats i en 50 mL tub på is, och blanda väl. Ta 20 μL för att räkna celler.
- Snurra YAC1 cellerna i 10 min vid 300 x g och 4 ° c. Räkna celler medan dessa snurrar.
- Lägg trypsin/EDTA till varje brunn i en NK cell 6-well plattan. Knacka på plattan och placera i inkubator.
- Efter att cellerna har inkuberats med trypsin/EDTA för ~ 5 min vid 37 ° c, skrapa plattan/kolven med en steril plåt skrapa. Tillsätt 1 mL NK-Cellmedia till varje brunn.
- Samla in celler och media med serologiska Pipettera och samla i ett 15 mL centrifug tub. Ta 20 μL för att räkna celler.
- Snurra NK-cellerna i 10 min, 400 x g vid 4 ° c. Räkna provet av celler från steg 3,5 under denna centrifugering.
Anmärkning: Visa kultur plattorna under ett Mikroskop innan kasta dem för att se till att det inte finns några fler celler som fastnat på botten av brunnarna. Eftersom experimentet använder NK-celler och YAC1-celler, se till att räkna var och en separat. - Räkna celler och resuspendera vid de koncentrationer som fastställts i optimerings försök att testa för lämpligt antal mål: Effector ratio. Detta kommer att uppnås genom att åter suspendera pelleten i motsvarande media för att göra följande cellkoncentrationer: YAC1 vid 4 x 105 celler/ml och NK-celler vid 2 x 107 celler/ml.
4. cytotoxicitetsanalys: analys protokoll
- Använd en rund botten, kulturbehandlad 96-brunn plattan för att ställa in plattan som föreslås i tabell 1. Denna tabell visar experimentella kontroller och 3 uppsättningar av NK experimentella kolumner. Detta kan utökas till totalt 10 NK experimentella kolonner i en 96-brunn tallrik.
- Centrifugera analys plattan vid 250 x g i 4 min för att vara säker på att effektor-och mål cellerna är i kontakt. Inkubera 96-brunn plattan i 5 timmar i en förfuktad kammare vid 37 ° c, 5% CO2 för att uppnå riklig kontakt mellan mål-och effektor celler och Målcell lysis av effektor celler.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här. - 45 min före skörd supernatants, tillsätt 10 μL av 10x Lys lösning till mål cellen maximala LDH release brunnar (Wells 1E, 1F, 1G och 1H) och placera plattan tillbaka i befuktade kammaren.
- När inkubations tiden är avslutad, Centrifugera plattan vid 250 x g i 4 min. med hjälp av en multikanalpipett, överför 50 μL Ali kvoter från alla brunnar till en fräsch 96-brunn platta botten analys platta.
Anmärkning: Vidrör inte botten av brunnarna så att cellerna inte överförs till den friska analys plattan. Använd inte en odlade behandlad platta som den färska analys plattan. -
Gör assay reagens.
- Efter analysbuffert har uppnått rums temperatur, tillsätt 12 mL analysbuffert till en substrat mix flaska. Invertera och skaka försiktigt tills det är helt upplöst. 1 flaska är tillräckligt för 2 96-well tallrikar.
Anmärkning: Analysbufferten ska skyddas från ljus samtidigt som den Tinas. Blanda omedelbart före användning.
- Efter analysbuffert har uppnått rums temperatur, tillsätt 12 mL analysbuffert till en substrat mix flaska. Invertera och skaka försiktigt tills det är helt upplöst. 1 flaska är tillräckligt för 2 96-well tallrikar.
- Tillsätt 50 μL Analyreagens till alla brunnar i analys plattan från steg 4,6. Täck plattan med folie för att skydda den från ljus och inkubera i 30 min vid rums temperatur.
Anmärkning: Nytillverkade Analysreagens ska förvaras i frys. REA gen sen är bra i cirka 8 veckor. - Tillsätt 50 μL stopp lösning till varje brunn. Läs plattan inom 1 timme efter att ha lagt till stopp lösning och registrera absorbansen vid 490 nm. Representativa data visas i tabell 2.
5. beräkning av resultat
- Beräkna det genomsnittliga absorbansvärdet från källorna för kultur medium bakgrund och subtrahera från alla absorbansvärden för experimentell, spontan LDH-frisättning och Effector cell spontan LDH release brunnar.
- Beräkna de genomsnittliga absorbansvärdena för Volymkorrigeringskontroll-brunnarna och subtrahera från de absorbansvärden som erhållits för de högsta LDH release Control-brunnarna i Target cell.
- Använd de korrigerade värdena från steg 5,1 och 5,2 i följande formel för att beräkna procent cytotoxicitet för varje effektor: mål väl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Placenta NK-celler som erhållits från NP-och RUPP-råttor inkuberades för 5 timmar med mål celler i sina respektive medier med ett förhållande på 50:1 (NK: Target). Absorbansen registrerades vid 490 nm och rå data visas i tabell 2. Den genomsnittliga absorbansen av den kulturella medel bakgrund och volym korrigering kontroll brunnar beräknades. Dessa medelvärden har dragits från de lämpliga brunnar som anges i tillverkarens protokoll och finns representerade i tabell 3. De korrigerade värdena användes sedan för att erhålla% Cytotoxiciteten med hjälp av det protokoll som tillverkaren tillhandahållit (tabell 4).
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcm | Cmb | EW-1 | EW-2 | EW-3 |
| Tcm | Cmb | EW-1 | EW-2 | EW-3 |
| Tcm | Cmb | EW-1 | EW-2 | EW-3 |
| Tcm | Cmb | EW-1 | EW-2 | EW-3 |
Tabell 1: layout för analys platta. TCS = Målcell spontan LDH Release (50 μL mål celler + 50 μL mål cells medium); TCM = mål cellen maximal LDH Release (50 μL mål celler + 50 μL mål cells medium); VCC = volym korrigering kontroll (50 μL mål cell medium + 50 μL NK cell medium); CMB = kultur medium bakgrunds kontroll (50 μL mål cell medium + 50 μL NK cell medium); ECSR = effektor cell spontan frisättning (50 μL NK-celler + 50 μL NK-celler medium); EW = experimentella brunnar (50 μL mål celler + 50 μL NK-celler).
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Np | Rupp | Np | ||
| 0,615 | 0,484 | 0,473 | 0,463 | 0,471 |
| 0,586 | 0,484 | 0,458 | 0,474 | 0,469 |
| 0,61 | 0,486 | 0,464 | 0,459 | 0,469 |
| 0,578 | 0,495 | 0,478 | 0,458 | 0,482 |
| 0,605 | 0,55 | 0,524 | 0,526 | 0,543 |
| 0,576 | 0,504 | 0,519 | 0,502 | 0,528 |
| 0,565 | 0,512 | 0,515 | 0,513 | 0,531 |
| 0,563 | 0,581 | 0,526 | 0,508 | 0,519 |
Tabell 2: rå absorbansdata för en analys platta som innehåller de experimentella kontrollerna i kolumnerna 1 och 2 och experimentella brunnar för att mäta cytotoxiciteten hos placenta NK-celler från NP-och RUPP-råttor mot YAC1-målceller.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Np | Rupp | Np | ||
| 0,12775 | -0,01425 | -0,02425 | -0,01625 | |
| 0,09875 | -0,02925 | -0,01325 | -0,01825 | |
| 0,12275 | -0,02325 | -0,02825 | -0,01825 | |
| 0,09075 | -0,00925 | -0,02925 | -0,00525 | |
| 0,06825 | 0,03675 | 0,03875 | 0,05575 | |
| 0,03925 | 0,03175 | 0,01475 | 0,04075 | |
| 0,02825 | 0,02775 | 0,02575 | 0,04375 | |
| 0,02625 | 0,03875 | 0,02075 | 0,03175 |
I tabell 3. Korrigerad absorbans. Absorbans av brunnar efter subtraktion av genomsnittlig absorbans av kontrollbrunnar enligt tillverkarens protokoll. Kolumn 1, Wells 1-4, är TCS absorbansvärden-det genomsnittliga CMB-absorptionsvärdet. Kolumn 1, Wells 5-8, är TCM absorbansvärden-den genomsnittliga VCC absorbans värde.
| Np | Rupp | Np | |
| 128,9916 | 108,8235 | 93,69748 | |
| 63,44538 | 118,9076 | 66,80672 | |
| 75,92593 | 72,75132 | 64,28571 | |
| 66,27907 | 63,17829 | 83,33333 | |
| Genomsnittlig% cytotoxicitet | 83,66049 | 90,91518 | 77,03081 |
I tabell 4. Cytotoxicitet beräkningar. Genomsnittlig procentuell cytotoxicitet av replikatprover av placenta NK-celler isolerade från NP-och RUPP-råttor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns ett antal viktiga viktiga anmärkningar att överväga för optimala resultat. Steriliteten av de celler som används är mycket viktigt. Efter insamlingen av moderkakan är det viktigt att beredning och isolering av NK-cellerna utförs under sterila förhållanden i ett biosäkerhets skåp. Dessutom, eftersom alla celler frigör LDH vid cellulära skador, bör försiktighet iakttas för att erhålla en hög livs kraft för NK-celler efter isolering och under samkulturprocessen. För mycket spontan LDH-frisättning från NK-cellerna kan ofta resultera i negativa, oanvändbara data
Det finns vissa aspekter av detta protokoll som kommer att vara specifika för användaren och deras behov. Till exempel finns det olika metoder för isolering av mononukleära celler från moderkakan utöver de metoder i denna artikel, såsom mekanisk och enzymatisk disaggregation. Dessutom är det upp användaren att bestämma de optimala mål cellerna nummer och effektor: mål kvoten som kommer att vara lämplig för deras experiment. I våra händer, 10 000 mål celler och en effektor: mål förhållandet 50:1 var fast besluten att vara optimala för våra experiment. Dessa siffror kan variera beroende på vilka mål celler som valts och på den vävnad från vilken NK-cellerna isoleras. Andra utredare har utnyttjat denna metod för att bedöma NK funktion av celler isolerade från levern och mjälten9. Därför kan denna metod vara anställd inom olika forsknings områden, inte bara i studier av preeclampsi, som vi har valt att använda den.
Den gyllene standarden för cytotoxicitetsbedömning är krom release assay5. Även om denna metod är pålitlig och reproducerbar, är den mest uppenbara begränsningen användningen av radioaktiv exponerings risk för personal och radioaktivt omhändertagande. Andra, icke-radioaktiv cytotoxicitetsanalyser såsom flödescytometri baserad och kalcien release analyser rapporteras ha jämförbara resultat till CRA6,10,11. Dock kräver flödescytometri-baserade analyser ytterligare specialiserad utbildning av personal i flödescytometri för att köra analysen. LDH release-analysen kräver inte någon specialiserad utbildning, eftersom detta test endast kräver enkel pipettering för att utföra analysen. Dessutom, medan LDH release-analysen kan utnyttjas med hjälp av standard spektroskopi eller fluorescerande detektion, den kalcien release och flödescytometri-baserade metoder kräver utrustning som kan detektera fluorescens. Begränsningar av LDH release assay innehålla en underskattning av celldöd på grund av ofullständig frisättning av LDH från skadade celler.
I denna analys, mätning av LDH släpps ut i medierna sker genom en enzymatisk reaktion där iodonitrotetrazolium (en tetrazolium salt) omvandlas till formazan (röd i färg). Absorbansen mäts med standardspektroskopi och mängden skadade celler i kulturen är proportionell mot intensiteten i den röda färgen. Denna analys möjliggör noggrann bestämning av skadade eller skadade celler i ett prov. Slutligen, denna kolorimetriska analysen kan också användas med andra cell typer att assay cytotoxicitet inträffar via Cell-medierad samt kemisk-medierade mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intresse konflikter, finansiella eller på annat sätt, deklareras av författarna.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av den nationella hjärt lung-och blod Institutet för de nationella hälso institut under Grant R00HL130456, det nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper av nationella institut för hälsa under tilldelning P20GM104357, och av Mississippi INBRE, finansierat av en institutionell utveckling Award (IDeA) från de nationella instituten för allmänna medicinska vetenskaper av nationella institut för hälsa under bidrag nummer P20GM103476. Innehållet är helt och hållet författarens ansvar och representerar inte nödvändigt vis de officiella åsikterna hos de nationella hälso instituten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
References
- Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
- Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
- Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother's diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
- Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
- Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).
