Summary
حجم وشكل جزيئات في للحماه هي المعالم الهامة التي يتم قياسها باستخدام أساليب مختلفة. تنشأ أخطاء من العينات غير ممثلة، والصور دون المستوى الأمثل، والمعلمات تحليل ذاتي. لتقليل هذه الأخطاء وسهولة قياس، نقدم بروتوكول تحديد كل خطوة من خطوات، بما في ذلك أنبوب لبرمجيات مصدر مفتوح.
Abstract
المفاعلات الحيوية التجريبية، مثل تلك معالجة المياه المستعملة، وتحتوي على جزيئات الشكل والحجم الذي يتم المعالم الهامة. على سبيل المثال، حجم وشكل من فلكس للحماه يمكن الإشارة إلى الظروف السائدة في عبارة، وتؤثر أيضا بصورة مباشرة جيدا كيف يستقر الحمأة في انارات.
حجم الجسيمات والشكل قياسات شكل مضلل 'بسيطة' على حد سواء. العديد من القضايا الدقيقة، كثيرا ما لا تعالج في البروتوكولات غير رسمية، يمكن أن تنشأ عند أخذ العينات، والتصوير، وتحليل الجزيئات. طرق أخذ العينات قد تكون متحيزة أو لا توفر ما يكفي من القوة الإحصائية. قد يتم حفظ سيئة العينات أنفسهم أو الخضوع للتعديل أثناء التثبيت. قد لا تكون الصور ذات جودة كافية؛ تداخل الجسيمات، عمق الميدان ومستوى التكبير، والضوضاء المختلفة يمكن أن جميع نتائج الفقراء. يمكن إدخال التحليل المحدد سيئة التحيز، مثل تلك التي تنتجها العتبة صورة اليدوي وتجزئة.
ومن المستصوب جنبا إلى جنب مع إمكانية تكرار نتائج القدرة على تحمل التكاليف والإنتاجية. طريقة إنتاجية عالية بأسعار معقولة، ويمكن قياس الجسيمات أكثر تواترا، إنتاج العديد من الصور التي تحتوي على الآلاف من الجسيمات. يسمح أسلوب يستخدم الكواشف غير مكلفة ومجهر تشريح المشتركة وبرمجيات المصدر المفتوح متاحة بحرية لتحليل النتائج التجريبية قابلة للتكرار وموجودا واستنساخه، ومؤتمته جزئيا. علاوة على ذلك، يمكن أن تكون نتاج لمثل هذا الأسلوب مهيأ جيدا ومحددة تحديداً جيدا وفهمها بسهولة من قبل برامج تحليل البيانات، تخفيف داخل مختبر التحليلات والبيانات تبادل بين مختبرات.
هذا بروتوكول بالتفصيل الخطوات اللازمة لإنتاج هذه منتجات، بما في ذلك: أخذ العينات، وعينه من الإعداد والتثبيت في أجار، والحصول على الصور الرقمية، وتحليل الصور الرقمية، وأمثلة لتوليد الشكل الخاصة بالتجربة من نتائج التحليل. كما أدرجنا أنبوب تحليل بيانات المصدر المفتوح لدعم هذا البروتوكول.
Introduction
والغرض من هذا الأسلوب لتوفير أسلوب محددة جيدا وقابلة للتكرار، ومؤتمته جزئيا لتحديد حجم وشكل توزيعات الجسيمات في المفاعلات الحيوية، لا سيما تلك التي تحتوي على فلكس للحماه وحبيبات الهوائي1 , 2-الأساس المنطقي وراء هذا الأسلوب زيادة في القدرة على تحمل التكاليف، والبساطة، والإنتاجية، والتكرار لدينا القائمة بروتوكولات داخلية3،4، سهولة قياس الجسيمات للآخرين، وتيسير تبادل و مقارنة البيانات.
وهناك فئتين عريضتين من التحليل قياس الجسيمات-أساليب التصوير مباشرة واستنتاجي باستخدام مثل هذه الصفات تشتت الضوء5. على الرغم من أن أساليب استنتاجي يمكن أن يكون آليا وإنتاجية كبيرة، المعدات مكلفة. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما يمكن تحديد أساليب استنتاجي بدقة ما يعادل حجم الجسيمات6، أنها لا توفر معلومات مفصلة الشكل7.
بسبب الحاجة إلى بيانات الشكل، ونحن قد أسلوبنا على أساس التصوير مباشرة. على الرغم من وجود بعض أساليب التصوير الفائق، أنها عادة تتطلب الأجهزة التجارية باهظة الثمن أو الحلول التي بنيت8،9. وقد وضعت أسلوبنا لتوظيف الأجهزة المشتركة بأسعار معقولة والبرامج التي، على الرغم من أن الذين يعانون من انخفاض في الإنتاجية، وتنتج الصور الجسيمات أكثر بكثير من الحد الأدنى المطلوب للعديد من التحليلات10.
قد لا تحدد البروتوكولات القائمة أهمية أخذ العينات وخطوات الحصول على الصورة. بروتوكولات أخرى قد تحدد الخطوات اليدوية إدخال تحيز شخصي (مثل مستوى العتبة المخصصة11). سيتم تعزيز أسلوب المعالم التي تحدد خطوات الحصول على العينات، والتثبيت وصورة جنبا إلى جنب مع برامج التحليل متاحة بحرية داخل مختبر تحليل الصور والمقارنات بين مختبرات. أحد الأهداف رئيسية من هذا البروتوكول هو توفير سير عمل والأدوات التي ينبغي أن تؤدي إلى النتائج استنساخه من مختبرات مختلفة لنفس العينة.
وبصرف النظر عن تطبيع عملية تحليل الصورة، البيانات التي تنتجها هذه الأنابيب يتم تسجيلها في ملف محددة تحديداً جيدا ومنسقة جيدا12 مناسبة للاستخدام بشعبية بيانات تحليل الحزم13،14، تخفيف التجربة تحليلات محددة (مثل توليد الرقم المخصص) وتيسير تبادل بين مختبرات البيانات.
ويقترح هذا البروتوكول وبخاصة للباحثين الذين تتطلب بيانات الشكل الجسيمات، ولا يستطيعون الوصول إلى أساليب استنتاجي، لا ترغب في وضع خط أنابيب تحليل الصور الخاصة بهم، وترغب في تبادل البيانات بسهولة مع الآخرين
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-جمع عينات لتحليل الجسيمات
- تحديد حجم العينة للمفاعلات المحددة التي سوف تنتج جسيمات كافية للتحليل الإحصائي10 (> 500) مع تجنب تداخل الجسيمات.
- تفترض أن طائفة من 0.5 إلى 2 مل كل عينة الخمور المختلطة غير كافية لعينات للحماه مع الخمور مختلطة تعليق المواد صلبة (مهنيين) بين 250 و 5,000 مغ/لتر.
- وبخلاف ذلك، إعداد ثلاث لوحات أجار اختبار باستخدام 0.5 و 2 و 5 مل من العينة (الخطوات 1، 2 عن طريق 2.7).
- تقدير بصريا الذي (أن وجدت) حجم العينة أفضل تلبية المعايير المذكورة في الخطوة 1، 1.
- إذا كان لا يزال تداخل جزيئات العينة 0.5 مل، كرر الخطوات من 1.1.2 و 1.1.3 مع عينات 0.5 مل ثلاثة إضعاف مع إضافة 0.5 و 1 و 2 مل من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة لتحديد الدرجة التي يجب أن تضعف عينة 0.5 مل قبل الخطوة 2، 1.
ملاحظة: الخطوات 1.1 − 1.1.4 بحاجة إلى إجراء فقط مرة واحدة كل تجربة، أو إذا كانت محتويات المفاعل التغيير أن القياسات اللاحقة لم تعد تفي بالمعايير الواردة في الخطوة 1، 1.
- الحصول على عينة تمثيلية من جزء جيدا مختلطة من المفاعل بالاستيلاء على ~ 40 مل في الكأس أو أنبوب الطرد المركزي 50 مل، خلط بلطف، وصب حجم عينة العزم انتزاع جيدا مختلطة فورا إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل. تمييع العينة، الضرورية، كما يحدده خطوة 1.1.4.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا ويمكن تخزين العينة تحت التبريد (4 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 48 ساعة. عدم تجميد العينة.
تنبيه: الحفاظ على الوسائط الشائعة (مثل الفورمالديهايد/ميثلامين) ليست مناسبة. مساحة كبيرة من اللوحة، في تركيبة مع فتح حاوية، إنتاج الحرارة من مصدر الضوء، ويحتمل أن تكون سيئة التهوية مجهرية الإعداد ظروف خطرة دون داع لتحقيق مكاسب ضئيلة في جودة الصورة.
2-إعداد لوحات أجار الجسيمات الملون، والمعطل تداولها
- إضافة 5 ميليلتر من 1% (w/v) الميثيلين الأزرق لكل عينة، ثم كاب وعكس بلطف في 3 مرات أقل المزيج. تسمح العينات وصمة عار على 5 على الأقل ولكن ليس أكثر من 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد حوالي 10 مل كل عينة أجار 7.5% (w/v) في المياه.
ملاحظة: قد أنتجت قبل الموعد المحدد أجار وتخزينها إلى أجل غير مسمى إذا كان التعقيم. [اغروس] يمكن الاستعاضة، ولكن ليس إلى حد كبير تحسين الصور. - تذوب أجار استخدام حمام الماء أو الميكروويف والسماح لتبرد قليلاً قبل الاستعمال. ضمان أجار ذاب تماما ويصب بسهولة. كريات صلبة لاجار وصمة بشكل مختلف، تنتج صوراً رديئة النوعية.
- نقل تكفي أجار 7.5% (w/v) يذاب بالانبوب الطرد المركزي لكي حجم إجمالي الأنبوب بين 6.5 و 9 مل.
- خلاصة أنابيب الطرد المركزي، وعكس بلطف على الأقل 3 مرات لخلط.
- بينما يشير الغطاء بعيداً عن نفسه، أو في غطاء محرك السيارة، فتح الغطاء. صب محتويات الأنبوبة في بلاستيك 100 مم طبق بيتري حين تعصف بلطف الطبق تحقيقا لطلاء كامل، على نحو سلس وتوزيعا بصريا موحد للجسيمات.
تنبيه: قد تنتج الحرارة من أجار وسيلة طفيف في الأنبوب. وهذا غالباً ما تنتج همسة مسموعة ولديه القدرة على طرد قطيرات صغيرة من أجار الساخنة. - السماح لوحات لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة على الأقل 5 دقائق، حتى يتصلب أجار.
ملاحظة: قد يكون مؤقتاً في البروتوكول هنا. مخزن مطلي بالمقلوب ومختومة (على سبيل المثال، في كيس من بلاستيك ختم أو مع الفيلم البارافين) لمدة تصل إلى 48 ساعة تحت التبريد (4 درجات مئوية).
3-الحصول على صور الجسيمات باستخدام ستيريوميكروسكوبي والكاميرا الرقمية
- ضع لوحة كشف الوجه حتى في مرحلة مجهر ستيريوميكروسكوبي قادرة على 10 x 20 x التكبير. تسليط الضوء العينة من أسفل مع ضوء منتشر، وحتى باستخدام المعدات مثل الوقوف إضاءة LED أو لوحة الخفيفة.
- فتح برنامج التقاط الصور وضمان تعيين مسار الخفيفة الميكروسكوب إلى الصورة، وانقر فوق الكاميرا المناسبة من قائمة الكاميرا.
- ضبط المجهر حيث تظهر جزيئات متعددة في البرنامج في المستوى البؤري مع حواف كبيرة ومحددة تحديداً جيدا. استخدم تكبير من 10-20 x لقياس الجسيمات مع الاحتفاظ المستوى البؤري العميقة نسبيا.
- مؤقتاً إزالة لوحة أجار ووضع الميكرومتر على المسرح. ضبط التركيز ما يرام حتى التخرج في الميكرومتر تظهر مركزة تركيزاً شديدا في برنامج التقاط الصور.
- إذا لم تكن محسوبة، سجل بكسل لنسبة صغيرة من أجل التكبير الحالي.
- تعيين التكبير/التصغير إلى 100% عن طريق النقر فوق التكبير > "الحجم الفعلي" وحدد خيارات > معايرة ثم قم بمحاذاة شريط المعايرة الأحمر في منفذ العرض الرئيسي على طول المحور الطويل ميكرومتر، مع أشرطة عمودية تركز على تخريج ميكرومتر 0 و 200. في شاشة معايرة ، أدخل مستوى التكبير الحالي والطول الفعلي من 200 مليميكرون.
- إذا كان الفعل معايرة حدد التكبير من شريط القوائم، وحدد التكبير الحالي المستوى وتأكيد المعايرة.
- حدد المقاييس > خط > التعسفي الخط. انقر فوق تقاطع التخرج 0 ومحور طويل ميكرومتر. انقر مرة أخرى فوق التقاطع في 200 والمحور منذ فترة طويلة. أ الصحيح المعايرة يجب عرض ما يقرب من 200 ميكرومتر. حذف السطر بالنقر على ذلك، حذف الملحة، والضغط على نعم في مربع التأكيد.
ملاحظة: التعليمات المعطاة لاختيار الكاميرا والمعايرة الخاصة بالبرمجيات المستخدمة لهذا الجهاز. وظائف مماثلة ينبغي أن تكون متاحة في برامج التصوير الأخرى. والهدف تحديد بكسل لنسبة ميكرون من الصورة لقياس حجم الجسيمات الدقيقة.
- حدد المقاييس > خط > التعسفي الخط. انقر فوق تقاطع التخرج 0 ومحور طويل ميكرومتر. انقر مرة أخرى فوق التقاطع في 200 والمحور منذ فترة طويلة. أ الصحيح المعايرة يجب عرض ما يقرب من 200 ميكرومتر. حذف السطر بالنقر على ذلك، حذف الملحة، والضغط على نعم في مربع التأكيد.
- استبدال لوحة أجار وضبط تركيز جيد لتحقيق أقصى قدر من التفصيل في برامج التصوير.
- ضبط برامج التصوير بحيث يتم تحقيق جودة الصورة كحد أقصى.
- زيادة عمق البت إلى قيمة الحد الأقصى المسموح به، عن طريق تحديد زر الراديو في لوحة بت عمق الشريط الجانبي الكاميرا . تعيين البرنامج للحصول على الصور الرمادية بتحديد زر الخيار المناسب في لوحة اللون/رمادي الكاميرا في الشريط الجانبي.
- انهيار أي أفرقة فتح الشريط الجانبي بين التعرض والرسم البياني. تخفيض الربح إلى 1.0 وزيادة التعرض حتى يظهر صورة واضحة في إطار المعاينة، وحتى يظهر الرسم البياني توزيعه لا يتم قص أما نهاية مربع الرسم البياني.
- ضبط الرسم البياني لتجنب أكثر وناقص. في لوحة الرسم البياني للشريط الجانبي الكاميرا، الشريحة الحدود اليسرى من الرسم البياني للتو خارج قيم أدنى والحد الأيمن للتو خارج أعلى القيم.
- حفظ الصورة TIFF غير مضغوط، بما في ذلك المعلومات التكبير في صورة بيانات التعريف باستخدام ملف > حفظ باسم مربع الحوار تحديد تنسيق TIFF، والتأكد من أن مربع حفظ معلومات المعايرة يتم فحص.
ملاحظة: حفظ بيانات تعريف الصورة، بما في ذلك معايرة المكانية، قد تختلف بين اقتناء البرامج. فيجي15، البرامج الأساسية المستخدمة من قبل خط الأنابيب، وتفهم المتغيرات الأكثر شيوعاً. معلومات هامة لتسجيل هو الارتفاع بكسل، العرض، والوحدة (الوحدات) المرتبطة بها. - استخدام أما مرحلة متنقلة أو نقل اللوحة نفسها يدوياً، حدد مجال آخر، التي لا تتداخل الصور السابقة، بعد مسار التي المناوبين بين اليمين لليسار واليمين لليسار كأحد يتحرك أسفل اللوحة؛ يعرف أيضا باسم 'تهذيب الحشائش بحث نمط'. كرر الخطوة 3، 6 حتى يتم إنتاج الصور كافية لالتقاط الجسيمات بصريا ما يقدر 500 على الأقل، أكثر أفضل.
ملاحظة: أنماط بدائل (مثلاً.، دائرية، عشوائي) مقبولة ولكن ينبغي الإبلاغ عنها. الحصول على صور متداخلة متعددة لتركيبة في فسيفساء عبر الرقمية تنتج خياطة حجم ملف الناتج الذي يعرقل إلى حد كبير التجهيز النهائي والتحف من خياطة قد أدخلت ولا ينصح حاليا. - الاحتفاظ بلوحات حتى بعد تحليل الصور لتصوير المتابعة المحتملة. وبعد التصوير النهائي، تجاهل حسب الاقتضاء للنفايات البيولوجية.
4-قياس وتحليل الجسيمات الظلية
- تثبيت حزم البرامج تحليل الصورة المطلوبة
- تثبيت فيجي (نسخة محسنة من إيماجيج v1.52e "المعاهد الوطنية للصحة" اتباع الإرشادات التي تظهر في: https://imagej.net/Fiji/Downloads
- تثبيت بوابة، إذا لم يكن موجوداً بالفعل، باتباع التعليمات الموجودة على: https://git-scm.com/downloads
- الحصول على رمز تحليل الجسيمات من طريق الاستنساخ مستودع بوابة16.
- في سطر الأوامر، استرداد أحدث إصدار من التعليمات البرمجية بكتابة:
بوابة استنساخ https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git- تثبيت تحليل التعليمات البرمجية التالية الإرشادات الموجودة في الملف النصي README.md موجود في الدليل الأعلى مستوى مستودع المستنسخة.
ملاحظة: استخدام بوابة المفضل، كما أنه سيتم تلقائياً استرداد أحدث نسخة من التعليمات البرمجية. إذا لم يتوفر بوابة، من الممكن أيضا لتحميل التعليمات البرمجية كملف مضغوط على الصفحة الإصدار: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
- تثبيت تحليل التعليمات البرمجية التالية الإرشادات الموجودة في الملف النصي README.md موجود في الدليل الأعلى مستوى مستودع المستنسخة.
- في سطر الأوامر، استرداد أحدث إصدار من التعليمات البرمجية بكتابة:
- تحرير ملف نصي سرد الدلائل المراد معالجتها، جنبا إلى جنب مع المعلمات الاختيارية. الرجوع إلى الدليل الفرعي الأمثلة والتحليل للحصول على قائمة المعلمات وأمثلة.
- قم بتشغيل التحليل سطر الأوامر بكتابة:
< فيجي-مسار > \ImageJ-win64.exe-وحدة التحكم--الماكرو < بارامسفيلي > سبارموريا-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis
حيث هو < فيجي-مسار > < بارامسفيلي > موقع ملف نص يصف إعداد التحليل والدليل الذي يقع إيماجيج-win64.exe
ملاحظة: الاسم القابل للتنفيذ قد تختلف, اعتماداً على أي فيجي نظام التشغيل المثبت على. اعتماداً على عدد وحجم الصور، قد يستغرق بضع دقائق إلى ساعات التحليل وسيتم تشغيلها تلقائياً. - إجراء فحص مراقبة الجودة
- دراسة مراقبة جودة الملفات الموجودة في دليل فرعي للدليل الإخراج المحدد تراكب. ملاحظة الصور مع زائفة، وغاب، وسوء القبض على الجسيمات، كل شيء واضح كتظليل الخطوط العريضة التي لا تتطابق مع الخلفية. يشير إلى الرقم 3 للحصول على أمثلة من هذا القبيل. بيانات الجسيمات جاهزة الآن لتوليد الشكل التحليل الخاصة بالتجربة.
- رفض لوحات كلها أو الجسيمات الفردية عن طريق تحديد في التعليمات البرمجية تحليل الملفات لاحظ و/أو الجسيمات معرفات لا يمكن تجاهله. أرجع إلى الأمثلة/رقابة في المستودع لرمز بيثون والتطوير ذات الصلة.
- توليد أرقام محددة تجربة استخدام نتائج تحليل الصور لكل صورة مخزنة في ملف نصي فصل فاصلة مرتبة12 في النتائج دليل فرعي للدليل الإخراج المحدد. الرجوع إلى الدلائل الفرعية أمثلة/أرقام/R وأمثلة/أرقام/بيثون لأمثلة على كيفية قراءة الملفات النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الملفات التي تم إنشاؤها
عملية هو موضح في الشكل 1 سوف ينتج ملفين كل صورة تم تحليلها. الملف الأول هو فاصلة فصل ملف نص القيمة (CSV) حيث كل صف يناظر جسيمات فردية والأعمدة وصف مختلف المقاييس الجسيمات مثل منطقة، والتدوير، والصلابة، والمحددة في دليل إيماجيج17. يتم تضمين ملفات CSV المثال كمعلومات تكميلية وفي الدليل أمثلة والبيانات.
رقم 1: سير العمل الرسومية التي تصف الخطوات الرئيسية الأربع للبروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
معد للاستخدام في مراقبة الجودة (مراقبة الجودة) الملف الثاني وهو ملف صورة بتنسيق GIF الذي يعلو جزيئات الصورة مع المناطق شبه معتمة يمثلون حددت الأصلي، كما هو الحال في الشكل 2. يمكن ثم تقييم جودة تحديد الجسيمات وتجزئة بسرعة يدوياً. على الرغم من أن أي أسلوب العتبة الجسيمات هو الكمال18، يرد الرقم 2 كمثال على نتيجة مقبولة. سوء نوعية الصور يمكن أما استعادت، أو إذا كانت تتوفر بيانات كافية، ببساطة إزالة من معالجة إضافية.
رقم 2: مثال "مراقبة النوعية" (QC) gif التي تم إنشاؤها بواسطة أنابيب تحليل الصورة. التكبير للصورة الرئيسية 15 س. مقتطفات مكبراً رقمياً لإظهار أرقام تحديد الجزيئات الفردية في الصورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
عند تقييم الصور ومراقبة الجودة، وهناك ثلاثة أخطاء شائعة العثور على:
1-عدم التقيد بدقة بحدود الجسيمات
2-عدم تحديد الجسيمات
3-قطعة أثرية إدراج أما بسبب: المكونات غير الجسيمات (فقاعات مثلاً)، أو أخطاء في مستوى العتبة
وترد أمثلة لهذه الأخطاء في الشكل 3. تحديد الحدود الجسيمات الفقراء والانقسام بين الجسيمات في كثير من الأحيان نتيجة الإفراط الموت، كما هو مبين في الشكل 3 ألف. يمكن أن يؤدي سوء الإضاءة إلى كلا الفشل في تحديد الجسيمات (الشكل 3b، دائرة مصمتة الأزرق) وجزيئات كاذبة الحرفية (الشكل 3b، دائرة متقطع أحمر). المسألة عدم الجسيمات، مثل فقاعات، البروتوزوا، والفطريات، وميتازوانس، مثل تارديجرادي في الشكل 3 جيم يمكن تحديد أيامهم أيضا كجسيمات.
الشكل 3: الأخطاء الشائعة التي اكتشفت أثناء التحليل ومراقبة الجودة. () الكشف عن الحدود الجسيمات الفقراء. (ب) جزيئات زائفة (القطع الناقص متقطع أحمر) والجسيمات غير مصنف (القطع الناقص صلبة زرقاء). (ج) غير الجسيمات الأجنبية الكائن. التكبير 15 س. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
فمن الأسهل على رفض الصورة بأكملها. ومع ذلك، من الممكن استخدام المعرف الجسيمات في الصورة ومراقبة الجودة (الشكل 2، اقحم) رفض الجزيئات الفردية. هذا النهج مفيدة بشكل خاص عندما يكون هناك عدد قليل من القضايا بصورة مفيدة خلاف ذلك (مثل إدراج غير الجسيمات) ج 3 الشكل. أمثلة للقيام حتى بطريقة استنساخه و reportable مدرجة في الدليل أمثلة/رقابة المستودع github.
عندما يتم تحديد الحد أدنى يبلغ قطرها صغير (< 10 بكسل)، يمكن تحديد تشويش الصورة أيامهم كجسيمات. وفي تلك الحالات، الصورة تكون لا تزال يمكن قبولها عند مواصلة تحليل المتلقين للمعلومات يزيل وجودهم. كمبدأ توجيهي، ينبغي أن يعامل بيانات الشكل مع الشكوك عندما جزيئات تتكون من أقل من 200 ~ بكسل19.
توليد الشكل
ملفات CSV الناتجة عن تحليل الصورة هي مرتبة12 وقد يمكن بسهولة جنبا إلى جنب وتحليلها في حزمة البرامج المفضلة للباحث (مثل الباندا20 مع سيابورن21 في بايثون أو دبلير22 مع ggplot223 في البحث والتطوير). ومع ذلك، نوع الرقم الدقيق المطلوب يتفاوت بالضرورة مع مسائل البحث والنتيجة. ويرد مثال على هذا الرقم ممكن أدناه (الشكل 4) وتتوفر التعليمات البرمجية المقابلة ذلك توليد من ملفات CSV على github16.
4 الرقم: مثال للشكل الخاصة بالتجربة المتولدة من بيانات CSV المنتجة بصورة خط الأنابيب. في هذا المثال، عرض توزيعات الجسيمات بين المفاعلين التجريبية على مر الزمن وجنبا إلى جنب مع البيانات الوصفية النوعية لاحظ الباحث. انظر الأمثلة/أرقام/R لتوليد التعليمات البرمجية والبيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن نظام تحليل صورة قوية إلى حد ما وتتخذ خطوات مراقبة الجودة لضمان إزالة صور الفقراء، الاهتمام المناسب لقضايا محددة في أخذ العينات، وإعداد لوحة، والحصول على الصور يمكن تحسين كل من دقة البيانات ونسبة صور تمرير QC.
تركيز العينات
افتراض قد أخذت عينة تمثيلية، أهم خطوة لضمان هذا الممثل9 وتحليل كفاءة في حين تتركز حتى لا أن تتداخل مع جزيئات جسيمات كافية.
هذا وقد يقابل حوالي 0.5 إلى 2 مل الخمور المختلطة أكثر من مجموعة واسعة من المواد الصلبة العالقة الكلية، ولكن التصميم الخاصة بالتجربة قد تكون ضرورية. أمثلة على تركيز مفرط، مفرط-مخففة، وترد تركيزات الجسيمات الملائمة في الشكل 5 كمرجع. تلوين يتأثر أيضا بتركيز الجسيمات. يمكن أن يؤدي تخفيف الإفراط الجسيمات مفرط الملون، ضبابية حين تمييع وكيل قد لا تنتج جسيمات مع تباين كافي للعتبة المثلى.
5 الرقم: مرجع صور تبين تركيزات الجسيمات وجدا مركزة ومقبولة، وتضعف مفرط. التكبير 15 س. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تركيز صبغة
مقدار وصمة عار تضاف إلى العينة حاسم وقد يختلف المبلغ الصحيح بين حماة. يوفر حوالي 5 ميليلتر من 1% (w/v) الميثيلين الأزرق كل 0.5 إلى 2 مل عينة تباين كافي للعتبة دون التسبب في 'نزيف' وتحجب الشكل الجسيمات.
هناك لا تركيز مثالية واحدة؛ يجب اختيار توازن بين التباين والوضوح. يبين الشكل 6 هذه المقايضة في ثلاث عينات ملطخة ميليلتر 5 و 25 و 50 1% الميثيلين الأزرق كل 2 مل حماة. عند الموازنة بين هذه المقايضة، الجسيمات المتناقضة سيئة أحياناً (الشكل 6a) المفضل على النقط قابل للحل (الشكل 6 ج).
رقم 6: وصمة عار في زيادة تركيز يحسن تباين الجسيمات، ولكن أيضا يشوه الحدود الملحوظة. التكبير 15 س. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
لوحة التخزين
بعد التثبيت، يمكن تخزين لوحات تحت التبريد (4 درجة مئوية) لمدة 3 أيام على الأقل. هذه هي فترة محافظ خلالها من المحتمل حدوث تلوث نشر النمو وصبغ. قد لا تزال تصويرها لوحات لم تظهر أي من المشكلات الموضحة أدناه بعد 3 أيام. عند تخزينها لفترة طويلة جداً، قد يستمر الجسيمات الموجودة لتنمو، وسوف تظهر في المستوى البؤري للجزيئات الأخرى مع الاحتفاظ بهوى من وصمة عار، كما يتبين في الشكل 7 ألف. أيضا قد تنمو الملوثات السطحية، مثل الجراثيم الفطرية، بعد فترات طويلة من التخزين. هذه عموما لن يصل اللون من وصمة عار وستظهر في البؤري مختلفة، كما يتبين في الشكل 7b. في بعض الحالات، من غير الواضح ما إذا كان قد حدث فرط أو نشرها من وصمة عار، كما في الجزء السفلي من الشكل 7b ومركز الرقم 7 ج. بغض النظر عن السبب، تشير البقع مثل تلك التي قد تتراوح أعمارهم بين اللوحة تتجاوز عمرها المفيد
7 الرقم: مرجع الصور التي توضح فرط مما يشير إلى أن تم تخزينه صفيحة يتجاوز عمرها المفيد. التكبير 15 س. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
إعداد لوحة
هناك مسألتان المرتبطة بإعداد لوحات أجار-أجار سميكة مفرطة ويحوم المفرط جسديا. ففي الحالة الأولى (الشكل 8)، تصبح تعليق الجسيمات في أعماق مختلفة، مما يجعل من الصعب الحصول على صور مع أغلبية الجسيمات في التركيز.
8 الرقم: استخدام كميات مفرطة من أجار ستنتج عينة أكثر سمكا من المستوى البؤري، أسفر عن جزيئات ضبابية. التكبير 15 س. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وفي الحالة الثانية، يحوم تنتج توزيعاً غير موحدة للجسيمات (الشكل 9 ألف)، يتحامل نتائج أقسام مختلفة من اللوحة (الرقم 9b، ج. عموما، لا يزيد عن 7 مل أجار مطلوب لتغطية طبق بيتري 100 ملم وهناك حاجة فقط لطيف من ناحية الطلبات لتغطية الطبق بالتساوي.
الشكل 9: دوامات قوة مفرطة أثناء إعداد لوحة ستظهر كالجسيمات غير موحدة توزيعات ()، يتحامل المقاطع اللوحة نحو توزيع الجسيمات (ج) أصغر وأكبر (ب). لوحة قطر 100 ملم، وتضخيم ميكروجرافس 15 x. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التصوير المجهري
هناك مسألتان اقتناء الصورة الرئيسية التي تؤثر على الجودة. المسألة الأولى هي ضمان غالبية الجسيمات في المستوى البؤري. حتى في التكبير المنخفض، حجم العديد من الجزيئات للحماه أن هذه دون إجراء تعديلات طفيفة على التركيز الخشنة، سيكون العديد من الجزيئات قليلاً من التركيز، الأخذ بقياس الجسيمات غير دقيقة. سوف تحتوي على لا صورة جسيمات 100% ركز تماما؛ الرقم 8 و الشكل 5b أمثلة كل منها التركيز على الفقراء ومقبولة.
مستويات التعرض تشكل القضية الرئيسية الثانية. سيئة تعرض الصور يسفر عن فقدان البيانات، وتجزئة الفقراء11. علاوة على ذلك، يمكن أن تنتج على النقيض عالية من الصبغة مدرج تكراري ضيقة، الحد من النطاق الديناميكي الفعال للبيانات. ويمكن تعديل حدود العلوية والسفلية من الرسم البياني قبل التقاط صورة منع التعرض للفقراء وزيادة النطاق الديناميكي. أمثلة من فوق، تحت، ومقبول التعرض ترد أدناه في الشكل 10.
10 الرقم: مرجع صور تظهر التعرض للصورة السيئة ومقبولة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
مزايا هذه الطريقة أنها توفر معايير محددة تشمل العملية برمتها. علاوة على ذلك، فقد وفرنا خط أنابيب برامج تخفيف داخل مختبر التحليل وتعزيز البيانات القابلة للمقارنة بين مختبر. القيد الرئيسي من هذا الأسلوب أن شرط أن تبقى جميع جزيئات ركزت يمنع تكبير عالية، تحد من فائدته لجسيمات ذات أبعاد ثانوية صغيرة-لا سيما الخيطية الهياكل. الاتجاهات المستقبلية لهذا الأسلوب يمكن أن تدمج تقنيات تحليل الصور المتقدمة (على وجه التحديد الحد من الضوضاء24،25والتصوير بالمدى الديناميكي العالي والتركيز التراص26،27وآله التعلم ساعد العتبة وتجزئة وتصنيف28. تحسين الحصول على الصورة الرئيسية تضم برامج لمراقبة المراحل الميكانيكية8 وإنتاج المحفوظات فسيفساء 'لوحة كاملة'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل بمنحه من 1336544 كبة مؤسسة العلوم الوطنية.
وتستخدم الشعارات فيجي، والبحث والتطوير، وبايثون مع وفقا للسياسات العلامات التالية:
بيثون: https://www.python.org/psf/trademarks/
ص: https://www.r-project.org/Logo/ ، وفقا للرخصة 4.0 نسخة من SA المسرودة في: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
فيجي: https://imagej.net/Licensing
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Bleach solution | Chlorox | 31009 | For workspace disinfection. |
| 15 mL centrifuge tube with cap | Corning | 430790 | Per sample. |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Corning | 4980-50 | Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing |
| 500 mL Kimax Bottle | Kimble-Chase | 14395-50 | Or otherwise sufficient for agar handling |
| Agar | BD | 214010 | Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample. |
| Data analysis software | N/A | N/A | R or Python are suggested |
| Deionized water | N/A | N/A | Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine. |
| Desktop computer | N/A | N/A | Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient. |
| External hard drive | Seagate | STEB5000100 | Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested. |
| FIJI | NIH | version 1.51d | Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GIT | Open Source | version 2.19.1 or later | Available at: https://git-scm.com/ |
| Image capture software | ToupView | version 3.7.5177 | Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data. |
| Mechanical (X/Y) Stage | OMAX | A512 | Not fully required, but greatly aids image acquisition. |
| Methylene blue | Fisher | M291-100 | Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample. |
| Microscope camera | OMAX | A35140U | Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested. |
| Optical Stage Micrometer | OMAX | A36CALM1 | Or otherwise sufficient for spatial calibration. |
| Petri dish, 100 mm | Fisher | FB0875712 | 1 per sample. |
| PPE | N/A | N/A | Standard lab coat, gloves, and eyewear. |
| Sparmoria macro | NCSU | version 0.2.1 | Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis |
| Stereo/dissecting microscope | Nikon | SMZ-2T | Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD. |
References
- Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. Aerobic granulation: Advances and challenges. Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).
- Adav, S. S., Lee, D. -J., Show, K. -Y., Tay, J. -H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).
- Williams, J. C. Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University. , Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162 (2004).
- Moghadam, B. K. Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation. , Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761 (2012).
- Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor. Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).
- Kelly, R. N., et al. Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems. AAPS Pharm SciTech. 7 (3), Available from: http://www.aapspharmscitech.org E1-E14 (2006).
- Walisko, R., et al. The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).
- Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy. PLoS ONE. 9 (2), e88977 (2014).
- Dias, P. A., et al. Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images. BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64 (2016).
- Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. III Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge. Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).
- Cromey, D. W. Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images. Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).
- Wickham, H. Tidy Data. Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , Available from: http://www.r-project.org (2017).
- van Rossum, G. Python tutorial. , Amsterdam. CS-R9526 (1995).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. FIJI: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Weaver, J. E. SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis. , Available from: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis (2018).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. , National Institute of Health. (2012).
- Sezgin, M., Sankur, B. Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation. Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).
- Kröner, S., Doménech Carbó, M. T. Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images. Powder Technology. 245, 297-313 (2013).
- McKinney, W. Data Structures for Statistical Computing in Python. Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).
- Waskom, M., et al. seaborn: v0.5.0 (November 2014). , (2014).
- Wickham, H. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html (2016).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. Available from: http://ggplot2.org (2009).
- Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. Digital Photography: A Primer for Pathologists. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).
- Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy. Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).
- Eastwood, B. S., Childs, E. C. Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy. Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).
- Bell, A. A., Brauers, J., Kaftan, J. N., Meyer-Ebrecht, D., Aach, T. High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology). 3 (1), Available from: https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/ 170-184 (2009).
- Jain, V., et al. Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks. 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).
