Måling af form og størrelse af aktiveret slam partikler immobiliseret i Agar med en Open Source Software-rørledningen

Summary

Størrelse og form af partikler i aktiveret slam er vigtige parametre, der er målt ved hjælp af forskellige metoder. Unøjagtigheder opstår fra ikke-repræsentative stikprøver, suboptimal billeder og subjektive analyseparametre. For at minimere disse fejl og lette måling, præsenterer vi en protokol, angive hvert skridt, herunder en open source software rørledning.

Abstract

Eksperimentelle bioreaktorer, såsom de behandling af spildevand, indeholder partikler, hvis størrelse og form er vigtige parametre. For eksempel, kan størrelse og form af aktiveret slam flocs angive betingelser på en individuel, og også direkte påvirke, hvor godt slammet afregner i en afklaring.

Partikelstørrelse og form er både misvisende 'simpel' målinger. Mange subtile spørgsmål, ofte adresseløse i uformelle protokoller, kan opstå når prøvetagning, imaging og analysere partikler. Prøveudtagningsmetoder kan være forudindtaget eller levere ikke strøm nok statistiske. Prøverne sig selv kan være dårligt bevaret eller gennemgå ændring under immobilisering. Billeder kan ikke være af tilstrækkelig god kvalitet; overlappende partikler, kan dybdeskarphed, forstørrelsesniveau, og forskellige støj alle producere dårlige resultater. Dårligt specificerede analyse kan indføre bias, som der produceres af manuel billede tærskel og segmentering.

Overkommelige priser og overførselshastighed er ønskeligt sammen med reproducerbarhed. En overkommelig pris, høj overførselshastighed metode kan aktivere hyppigere partikel måling, producerer mange billeder, der indeholder tusindvis af partikler. En metode, der bruger billig reagenser, en fælles dissekere mikroskop og frit tilgængelige open source analyse software giver repeterbare, tilgængelige, reproducerbare og delvist automatiseret eksperimentelle resultater. Yderligere, produktet af en sådan metode kan være godt formateret, velafgrænset og let at forstå data analyse software, lette både inden for lab analyser og datadeling mellem labs.

Vi præsenterer en protokol, der beskriver de nødvendige skridt for at producere sådan et produkt, herunder: prøvetagning, prøve forberedelse og immobilisering i agaren, digitalt billede erhvervelse, digital billedanalyse og eksempler på eksperiment-specifikke tal generation fra den analyseresultater. Vi har også inkluderet en open-source data analyse rørledningen for at understøtte denne protokol.

Introduction

Formålet med denne metode er at give en veldefineret, repeterbare og delvist automatiseret metode til bestemmelse af størrelse og form distributioner af partikler i bioreaktorer, især dem der indeholder aktiveret slam flocs og aerob granulat^{1 , 2}. rationalet bag denne metode var at øge overkommelighed, enkelhed, overførselshastighed, og repeterbarhed af vores eksisterende in-house protokoller^3,4, lette partikel måling for andre, og lette deling og sammenligning af data.

Der er to hovedkategorier af partikel måling analyse - direct imaging og inferential metoder ved hjælp af sådanne kvaliteter som lysspredning⁵. Selvom inferential metoder kan automatiseres og har store overførselshastighed, er udstyret dyrt. Hertil kommer, mens inferential metoder kan præcist bestemme den tilsvarende størrelse af en partikel⁶, giver de ikke detaljeret form information⁷.

På grund af behovet for Figurdata, har vi baseret vores metode på direkte billeddannelse. Mens nogle høj overførselshastighed Billeddannende metoder findes, har de traditionelt kræves enten dyre kommercielle hardware eller specialløsninger bygget^8,9. Vores metode er blevet udviklet for at anvende fælles, overkommelige hardware og software, der selv lider af en reduktion i overførselshastighed, producerer langt mere partikel billeder end det minimum, der er nødvendige for mange analyser¹⁰.

Eksisterende protokoller kan ikke angive vigtige prøveudtagning og image erhvervelse trin. Andre protokoller kan angive manuelle trin, der indfører subjektiv bias (såsom ad hoc-tærskel¹¹). En veldefineret metode, der angiver prøveudtagning, immobilisering og image erhvervelse trin kombineret med frit tilgængelige analyse software vil forbedre både inden for lab billedanalyse og sammenligninger mellem labs. Et vigtigt mål i denne protokol er at give en arbejdsproces og værktøjer, der bør føre til reproducerbare resultater fra forskellige labs for samme prøve.

Bortset fra normalisere billede analyse proces, er data produceret af denne rørledning registreret i en veldefineret, godt formateret fil¹² egnet til brug af populære data analyse pakker^13,14, lempelse eksperiment specifikke analyser (f.eks. brugerdefinerede figur generation) og lette datadeling mellem labs.

Denne protokol er især foreslået for forskere, der kræver partikel Figurdata, har ikke adgang til inferential metoder, ikke ønsker at udvikle deres eget billede analyse pipeline, og ønsker at dele deres data nemt med andre

Protocol

1. indsamle prøver for partikel analyse

1. Bestemme sample volumen for specifikke reaktorer, der vil producere tilstrækkeligt partikler for statistisk analyse¹⁰ (> 500) samtidig undgå partikel overlapning.
   1. Antage, at en række 0,5 til 2 mL pr. sample af blandet spiritus er tilstrækkelig for aktiverede slam prøver med en blandet spiritus suspenderet tørstof (MLSS) mellem 250 og 5.000 mg/L.
   2. Ellers, forberede tre test agar plader ved hjælp af 0,5, 2 og 5 mL af prøven (trin 1.2 gennem 2.7).
   3. Visuelt anslår som (hvis nogen) prøve diskenheder bedst opfylder kriterierne listet taktfast 1.1.
   4. Hvis partikler stadig overlapper for 0,5 mL prøve, skal du gentage trin 1.1.2 og 1.1.3 med tre 0,5 mL prøverne fortyndes med en tilsat 0,5, 1 og 2 mL af fosfatbufferet saltopløsning til at bestemme graden som en 0,5 mL prøve skal fortyndes før trin 2.1.
      Bemærk: Trin 1.1 − 1.1.4 skal kun udføres én gang pr. eksperiment, eller hvis reaktoren indhold ændres således, at efterfølgende målinger ikke længere opfylder kriterierne i trin 1.1.
2. Erhverve en repræsentativ prøve fra et godt blandet portion af reaktoren af sensationsprægede ~ 40 mL i et bægerglas eller 50 mL centrifugeglas, forsigtigt blandes, og straks hælde bestemt sample volumen af den godt blandede grab i en 15 mL-centrifugerør. Fortyndes prøven nødvendige, som bestemmes af trin 1.1.4.
   Bemærk: Protokollen kan blive standset her og prøven kan opbevares i køle (4 ° C) i op til 48 timer. Ikke fryse prøven.
   Forsigtig: fælles opbevaring medier (fx formaldehyd/formamid) er ikke egnede. Den store overflade af pladen, i kombination med en åben container, varmen fra lyskilden, og potentielt dårligt ventilerede mikroskopi setup producere unødigt farlige betingelser for lille gevinst i billedkvalitet.

2. klargør agar plader af bejdset, immobiliserede partikler

1. Tilføj 5 µL af 1% (w/v) methylenblåt til hver prøve, så cap og forsigtigt vendes på 3 mindst gange at blande. Tillad prøver at pletten for mindst 5 men ikke mere end 30 minutter ved stuetemperatur.
2. Forberede ca 10 mL pr. sample af 7,5% (w/v) agar i ionbyttet vand.
   Bemærk: Agar må produceret før tid og opbevares på ubestemt tid hvis steriliseret. Agarosen kan erstattes, men væsentligt forbedrer ikke billeder.
3. Smeltes agaren ved hjælp af en mikroovn eller vand bad og afkøles lidt før brug. Sikre agaren er helt smeltet og hælder nemt. Solid globules af agar vil plette forskelligt, producerer dårlig kvalitetsbilleder.
4. Overføre tilstrækkelig smeltet 7,5% (w/v) agar til at bringe den samlede tube volumen mellem 6,5 og 9 mL-centrifugerør.
5. Opsummere centrifugeglas og forsigtigt vendes mindst 3 gange for at blande.
6. Samtidig peger fælles landbrugspolitik fra sig selv eller i en hætte, åbne fælles landbrugspolitik. Hæld tube indholdet i en 100 mm plast petriskål mens blidt rokkende parabol for at opnå en fuld, glat belægning og en visuelt ensartet fordeling af partikler.
   Forsigtig: Varmen fra agaren kan producere en lille overtryk i røret. Dette ofte producerer en hørbar hiss og har potentiale til at udvise små dråber af varm agar.
7. Tillad tallerkner afkøles ved stuetemperatur i mindst 5 minutter, indtil agaren størkner.
   Bemærk: Protokollen kan midlertidigt her. Store forkromet inverteret og forseglet (f.eks. i en forsegling plastikpose eller med paraffin film) i op til 48 timer under køle (4 ° C).

3. anskaffe partikel billeder ved hjælp af et stereomikroskop og digital kamera

1. Placere den udækkede pladen med billedsiden opad på mikroskop fase af et stereomikroskop habil i 10 x 20 x forstørrelse. Belyse prøven nedefra med selv, diffuse lys ved hjælp af udstyr såsom en LED illuminator stativ eller lys plade.
2. Åbne image capture software, sikre mikroskopet lys stien er angivet til foto, og klik på den relevante kamera kamera på listen.
3. Juster mikroskopet, så flere partikler vises i softwaren i brændplanet med store, veldefinerede kanter. Brug 10-20 x forstørrelse for at måle partikler samtidig opretholde en forholdsvis dyb fokalplan.
   1. Midlertidigt fjerne agar plade og placere mikrometer på scenen. Fokusér fint, indtil gradueringer på mikrometer vises skarpt fokuserede i image capture software.
   2. Hvis ikke tidligere kalibreret, optage pixel til mikro-forholdet for den aktuelle forstørrelse.
      1. Indstil zoom til 100% ved at klikke på Zoom > faktiske størrelse og vælg Indstillinger > Calibrate derefter justere rød kalibrering bar i de vigtigste viewport langs længdeaksen på mikrometer, med de lodrette linjer centreret om de 0-200 µm gradueringer. Angiv den aktuelle forstørrelsesniveau og faktiske længde af 200 µm i dialogboksen Kalibrer .
   3. Hvis allerede kalibreret vælge forstørrelse fra menulinjen, og vælg den aktuelle forstørrelse niveau og bekræfte kalibreringen.
      1. Vælg målinger > linje > vilkårlig linje. Klik på skæringspunktet mellem 0 graduering og lange akse af mikrometer. Klik igen på skæringspunktet på 200 og lange akse. A korrekt kalibrering skal vise ca 200 µm. slette linjen ved at klikke på det, at trykke på slette, og trykke på Ja på bekræftelsesboks.
         Bemærk: Instruktionerne for at vælge camera og kalibrering er specifikke for den software, der bruges til denne hardware. Lignende funktioner bør være tilgængelige i andre billedbehandlingsprogrammer. Målet er at bestemme pixel til micron forholdet mellem billede for nøjagtig partikel størrelse måling.
4. Erstatte agar plade og justere den fine fokus for at opnå maksimal detaljegrad i den billedbehandlingsprogrammer.
5. Justere den billedbehandlingsprogrammer, således at maksimal billedkvalitet er opnået.
   1. Øge bitdybde til den maksimale værdi tilladt, ved at vælge radioknappen i panelet Bitdybde af kamera indholdsoversigten. Indstille software til at erhverve gråtonebilleder ved at vælge den relevante alternativknap i panelet Farve/grå i kamera indholdsoversigten.
   2. Skjule alle åbne sidebjælken paneler mellem eksponering og histogram. Reducere gevinsten til 1,0 og øge eksponeringen indtil et klart billede vises i viewport, og indtil histogrammet vises som en fordeling, der ikke er klippet af begge ender af boksen histogram.
   3. Justere histogram at undgå- og undereksponering. Skub den venstre kant af histogrammet til lige uden for de laveste værdier og den højre kant til bare udenfor de højeste værdier i panelet histogram i kameraet side bar.
6. Gemme billedet som en ukomprimeret TIFF, herunder forstørrelse oplysninger i billedets metadata, ved hjælp af den fil > Gem som dialogboksen, hvis du vælger formatet TIFF, og at sikre, at afkrydsningsfeltet Gem med kalibrering oplysninger er kontrolleret.
   Bemærk: Gemmer billedets metadata, herunder rumlige kalibrering, kan variere mellem erhvervelse programmer. FIJI¹⁵, de underliggende software bruges af rørledningen, forstår mest almindelige varianter. De vigtige oplysninger til at registrere er pixel højde, bredde og tilknyttede enhed.
7. Ved hjælp af enten en mobil fase eller manuelt flytte pladen selv, Vælg et andet område, som ikke overlapper tidligere billeder, følge en sti, som suppleanter mellem venstre mod højre og højre mod venstre som man bevæger sig ned på pladen; også kendt som en 'plæneklipper søgemønster'. Gentag trin 3.6 indtil tilstrækkelig billeder er produceret for at fange mindst 500 visuelt anslåede partikler, mere er bedre.
   Bemærk: Alternativer mønstre (fx., cirkulære, tilfældige) kan accepteres, men bør rapporteres. Erhverve flere overlappende billeder til kombination til en mosaik via digital syning producerer en resulterende filstørrelse, som høj grad hindrer downstream forarbejdning og artefakter fra syninger kan indføres og anbefales ikke i øjeblikket.
8. Bevare plader indtil efter billedanalyse for potentielle opfølgning billeddannelse. Efter sidste imaging, kassere som passende for biologisk affald.

4. måle og analysere partikel silhuetter

1. Installere de krævede billede analyse softwarepakker
   1. Installere FIJI (en udvidet version af National Institutes of Health's ImageJ v1.52e følge vejledningen på: https://imagej.net/Fiji/Downloads
   2. Installere git, hvis ikke allerede er til stede, ved at følge vejledningen på: https://git-scm.com/downloads
   3. Erhverve partikel analyse kode fra ved kloning git repository¹⁶.
      1. På kommandolinjen, skal du hente den nyeste version af koden ved at skrive:
         git klon https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
         1. Installer analysis kode følgende instruktioner i README.md tekstfil findes i mappen på øverste niveau af de klonede repository.
            Bemærk: Ved hjælp af git er at foretrække, da det vil automatisk hente den nyeste version af koden. Hvis git ikke er tilgængelig, det er også muligt at downloade koden som en zip-fil på siden udgivelsen på: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
   4. Redigere en tekstfil liste den biblioteker skal behandles sammen med valgfri parametre. Henvise til undermappen eksempler/analyse for en liste over parametre og eksempler.
2. Køre analysen på kommandolinjen ved at skrive:
   < FIJI-sti > \ImageJ-win64.exe--konsol - makro SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < paramsfile >
   hvor < FIJI-sti > er den mappe som ImageJ-win64.exe er placeret og < paramsfile > placeringen af den tekstfil, der beskriver analysis setup
   Bemærk: Navnet på den eksekverbare fil kan variere, afhængigt af hvilket operativsystem FIJI er installeret på. Afhængigt af antallet og størrelsen af billeder, analysen kan tage et par minutter til timer og vil køre automatisk.
3. Udføre en kvalitetskontrol kontrol
   1. Undersøge den kvalitetskontrol filer placeret i undermappen overlay på den angivne output mappe. Bemærk billeder med falske, ubesvarede og dårligt fanget partikler, alle tilsyneladende som skyggefulde konturer, som ikke matcher baggrunden. Se figur 3 for eksempler på sådanne. Partikel data er nu klar til eksperiment-specifik analyse tal generation.
4. Afvise enten hele plader eller enkelte partikler ved at angive i koden analyse bemærkes filer og/eller partikel id'er, der skal ignoreres. Henvise til eksempler/censur i opbevaringssted for relevante Rasmussen og Python-kode.
5. Generere eksperiment specifikke tal ved hjælp af analyseresultater billede for hvert billede gemmes i en RYDDELIG¹² komma separeret tekstfil i undermappen resultater af den angivne output mappe. Henvise til eksempler/tal/R og eksempler/tal/Python undermapper til eksempler på, hvordan at læse filerne resultater.

Representative Results

Filer genereret
Den proces, der er illustreret i figur 1 vil producere to filer pr billede analyseret. Den første fil er et komma separeret værdi (CSV) tekstfil, hvor hver enkelt række svarer til en enkelt partikel og kolonnerne beskrive forskellige partikel målinger som område, cirkularitet og soliditet og defineret i ImageJ manuel¹⁷. Eksempel CSV-filer er inkluderet som supplerende oplysninger og i mappen eksempler/data.

Figur 1: Grafisk workflow beskriver de fire vigtigste trin i protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Den anden fil er beregnet til brug ved kvalitetskontrol (QC) og er et GIF-billede fil hvilke overlays de oprindelige billede med semi-uigennemsigtige regioner der repræsenterer identificeret partikler, som i figur 2. Kvaliteten af partikel identifikation og segmentering kan derefter evalueres hurtigt manuelt. Selv om ingen partikel tærskel metode er perfekt¹⁸, er figur 2 præsenteret som et eksempel på et acceptabelt resultat. Dårlig kvalitetsbilleder kan enten være generobret, eller hvis der foreligger tilstrækkelige oplysninger, simpelthen fjernet fra yderligere behandling.

Figur 2: Eksempel på en kvalitetskontrol (QC) gif genereret af billede analyse pipeline. De vigtigste billede 15 x ganges forstørrelse. Uddrag er digitalt zoomet for at vise tal at identificere enkelte partikler i billedet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Når de evaluerer QC billeder, der er tre fælles fejl fundet:
1. manglende præcist overensstemmelse med partikel grænser
2. manglende identifikation partikler
3. artefakt optagelse skyldes enten at: ikke-partikel komponenter (fx bobler) eller fejl i tærskel

Eksempler på disse fejl er illustreret i figur 3. Dårlig partikel grænse identifikation og segmentering mellem partikler ofte er et resultat af over dør, som det ses i figur 3a. Dårlig belysning kan føre til både manglende evne til at identificere partikler (figur 3b, blå massiv cirkel) og artefakt falsk partikler (figur 3b, røde stiplede cirkel). Non-partikel noget, som bobler, protozoer, svampe og metazoans, som tardigrade i figur 3 c kan også identificeres spuriously som partikler.

Figur 3: Almindelige fejl opdaget under QC analyse. (en) fattige partikel grænsen afsløring. (b) spurious partikler (rød stiplet ellipse) og unsegmented partikler (blå massivt ellipse). (c) udenlandske ikke-partikel objekt. Forstørrelse 15 x. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Det er lettest at afvise hele billedet. Det er dog muligt at bruge partikel id i QC billede (figur 2, inset) til at afvise enkelte partikler. Denne fremgangsmåde er især nyttig, når der er en håndfuld spørgsmål i et ellers nyttigt billede (såsom inddragelsen af ikke-partikler) figur 3 c. Eksempler på gør er så i en reproducerbar og indberetningspligtige måde inkluderet i mappen eksempler/censur på github opbevaringssted.

Når en lille mindste diameter er angivet (< 10 pixels), billedstøj spuriously kan identificeres som en partikel. I disse tilfælde billedet kan stadig være accepteres når videre downstream analyse er fjerner deres tilstedeværelse. Som en retningslinje, Figurdata, bør behandles med skepsis når partikler er sammensat af mindre end ~ 200 pixels¹⁹.

Figur Generation
CSV-filer som følge af billedanalyse er ryddeligt¹² og kan nemt kombineres og analyseret i forskerens foretrukne softwarepakke (såsom pandaer²⁰ med seaborn²¹ i Python eller dplyr²² med ggplot2²³ i R). Den nøjagtige tal type kræves varierer dog nødvendigvis med forskningsspørgsmål og resultat. Et eksempel på en mulig figur er medtaget nedenfor (figur 4) og den tilsvarende kode for at generere det fra CSV-filer er tilgængelige på github¹⁶.

Figur 4: Eksempel på eksperiment-specifikke tal genereret fra CSV data produceret af billede-rørledningen. I dette eksempel, partikel-distributioner mellem to experimental reaktorer med tiden vises og kombineret med kvalitative metadata konstateret af forskeren. Se eksempler/tal/R for at generere kode og data. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Selv om billedet analysesystem er temmelig robust og QC skridt til at sikre fattige billeder er fjernet, kan behørig opmærksomhed på specifikke emner i prøvetagning, plade forberedelse og image erhvervelse forbedre både nøjagtigheden af oplysningerne og andelen af billeder passerer QC.

Prøveudtagning koncentration
Under forudsætning af en repræsentativ prøve er taget, er det vigtigste skridt at sikre, at tilstrækkelig partikler er til stede for repræsentative⁹ og effektiv analyse, mens ikke så koncentreret, at partikler overlapper.

Dette har svarede til ca. 0,5 til 2 mL blandet spiritus over en bred vifte af samlede mængde suspenderede stoffer, men eksperiment-specifikke bestemmelse kan være nødvendigt. Eksempler på alt for koncentreret, overdrevent - fortyndet, og passende partikel koncentrationer er vist i figur 5 som reference. Farvning påvirkes også af partikel koncentration. Overdreven fortynding kan resultere i alt for farvede, sløret partikler, mens under fortynding ikke kan producere partikler med tilstrækkelig kontrast for optimal tærskel.

Figur 5: Reference billeder viser partikel koncentrationer, som er for koncentreret, acceptable og alt for udvandet. Forstørrelse 15 x. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Dye koncentration
Mængden af pletten tilsættes prøven er afgørende og det korrekte beløb kan variere mellem slam. Cirka 5 µL 1% (w/v) methylenblaat pr. 0,5 til 2 mL af prøven indeholder tilstrækkelig kontrast for tærskel uden at forårsage 'blødning' og tilsløre den partikel form.

Der er ingen enkelt ideelle koncentration; en balance mellem kontrast og klarhed skal vælges. Figur 6 illustrerer denne afvejning i tre prøver farves med 5, 25 og 50 µL 1% methylenblaat pr. 2 mL af slam. Når vejer denne afvejning, foretrækkes den lejlighedsvise dårligt kontrasterende partikel (figur 6a) frem for dårligt opløselige klatter (figur 6 c).

Figur 6: Øget pletten koncentration forbedrer partikel kontrast, men også fordrejer den observerede grænse. Forstørrelse 15 x. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Plade opbevaring
Efter immobilisering, kan pladerne opbevares under køle (4 ° C) i mindst 3 dage. Dette er en konservativ periode, hvorunder det er usandsynligt, at forurene vækst og farvestof diffusion vil forekomme. Plader ikke viser nogen af de spørgsmål, der er beskrevet nedenfor kan stadig være afbildet efter 3 dage. Når gemt for længe, eksisterende partikler kan fortsætte med at vokse og vil vises i brændplanet af andre partikler samtidig bevare nuancen af pletten, som kan ses i figur 7a. Overflade forurenende stoffer, såsom svampesporer, kan også vokse efter længere tids opbevaring. Disse generelt vil ikke tage farve af pletten og vises i en anden brændplanet, som kan ses i figur 7b. I nogle tilfælde er det uklart om overvækst eller udbredelse af pletten er opstået, som i bunden af figur 7b og midten af figur 7 c. Uanset årsagen angive steder som dem pladen har alderen ud over dens levetid

Figur 7: Reference billeder illustrerer overvækst signalerer, at en plade er gemt uden for dens levetid. Forstørrelse 15 x. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Plade forberedelse
Der er to spørgsmål i forbindelse med fysisk forbereder agar plader - alt for tyk agar og overdreven hvirvlende. I det første tilfælde (figur 8) blive partikler suspenderet på forskellige dybder, hvilket gør det vanskeligt at erhverve billeder med størstedelen af partikler i fokus.

Figur 8: Ved hjælp af store mængder af agar vil producere en prøve tykkere end brændplanet, hvilket resulterer i sløret partikler. Forstørrelse 15 x. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

I det andet tilfælde, hvirvlende producerer en uensartet fordeling af partikler (figur 9a), påvirke resultaterne fra forskellige dele af pladen (figur 9b, c. Generelt, ikke mere end 7 mL af agar er forpligtet til at dække en 100 mm petriskål og kun blid hånd bevægelser er nødvendige for at jævnt dække skålen.

Figur 9: Alt for energisk hvirvlende plade forberedelsen vises som ikke-ensartet partikel distributioner (en), påvirke sektioner af plade mod større (b) og mindre (c) partikel distributioner. Pladen er 100 mm i diameter, micrographs forstørret 15 x. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Mikroskopisk billeddannelse
Der er to store billede erhvervelse spørgsmål, der vedrører kvalitet. Det første spørgsmål er at sikre, at fleste af partikler i brændplanet. Selv ved lav forstørrelse er størrelsen af mange aktiveret slam partikler sådan, at uden mindre justeringer af grove fokus, mange partikler vil være lidt ude af fokus, at indføre unøjagtige partikel måling. Intet billede indeholder 100% perfekt fokuserede partikler; Figur 8 og figur 5b er respektive eksempler på dårlig og acceptabelt fokus.

Eksponeringsniveauer udgør det andet store spørgsmål. Dårligt eksponeret billeder resulterer i mistede data og fattige segmentering¹¹. Yderligere, den høje kontrast af farvestoffet kan producere en smal histogrammet, reducerer den effektive dynamiske rækkevidde af data. De øvre og nedre grænser for histogrammet kan justeres inden indfange et billede for at både at forebygge dårlig eksponering og øge det dynamiske område. Eksempler af over, under, og acceptabel engagementer er medtaget nedenfor i figur 10.

Figur 10: Reference billeder viser fattige og acceptabelt billede engagementer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Denne metode fordele er, at det giver specifikke kriterier omfatter hele processen. Derudover har vi givet en software-rørledningen lempelse i lab analyse og at fremme sammenlignelige mellem lab data. De store begrænsning af denne metode er, at kravet om at holde alle partikler fokuseret forhindrer høje forstørrelser, begrænser dens nytte for partikler med små mindre dimensioner - navnlig trådformede strukturer. Fremtidige retning for denne metode kunne indarbejde avancerede billede analyseteknikker (specielt støj reduktion^24,25, high dynamic range imaging, fokus stabling^26,27, og maskine-læring assisteret tærskel, segmentering og klassificering²⁸. Store billede erhvervelse forbedring ville optage software til at styre mekaniske faser⁸ og producere 'hel plade' mosaik arkiver.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Bleach solution	Chlorox	31009	For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap	Corning	430790	Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask	Corning	4980-50	Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle	Kimble-Chase	14395-50	Or otherwise sufficient for agar handling
Agar	BD	214010	Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software	N/A	N/A	R or Python are suggested
Deionized water	N/A	N/A	Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer	N/A	N/A	Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive	Seagate	STEB5000100	Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI	NIH	version 1.51d	Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	version 2.19.1 or later	Available at: https://git-scm.com/
Image capture software	ToupView	version 3.7.5177	Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage	OMAX	A512	Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue	Fisher	M291-100	Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera	OMAX	A35140U	Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer	OMAX	A36CALM1	Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm	Fisher	FB0875712	1 per sample.
PPE	N/A	N/A	Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro	NCSU	version 0.2.1	Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope	Nikon	SMZ-2T	Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.