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Misurare la forma e la dimensione delle particelle di fango attivo immobilizzato in Agar con una Pipeline di Software Open Source

doi: 10.3791/58963 Published: January 30, 2019

Summary

Le dimensioni e la forma delle particelle a fanghi attivi sono parametri importanti che sono misurati utilizzando metodi diversi. Imprecisioni derivano da campionamento non rappresentativo, immagini non ottimali e parametri di analisi soggettiva. Per ridurre questi errori e facilitare la misurazione, presentiamo un protocollo specificando ogni passo, tra cui una pipeline software opensource.

Abstract

Bioreattori sperimentale, come ad esempio quelli trattamento delle acque reflue, contengono particelle la cui dimensione e la forma sono parametri importanti. Ad esempio, la dimensione e la forma di fiocchi di fango attivo può indicare le condizioni a Microscala e anche direttamente influenzare quanto bene il fango si deposita in un chiarificatore.

Forma e dimensione delle particelle sono entrambe le misurazioni misleadingly 'semplice'. Molti problemi sottili, spesso non indirizzate in protocolli informali, possono sorgere quando campionamento, imaging e l'analisi di particelle. Metodi di campionamento possono essere prevenuti o non forniscono sufficiente potenza statistica. I campioni stessi potrebbero essere mal conservati o subiscono alterazione durante immobilizzazione. Immagini non siano di qualità sufficiente; sovrapposizione di particelle, profondità di campo, il livello di ingrandimento e vari rumori possono tutti producono scarsi risultati. Analisi scarsamente specificata possono introdurre bias, come quella prodotta dalla segmentazione e soglia manuale dell'immagine.

Convenienza e velocità effettiva sono desiderabili al fianco di riproducibilità. Un metodo conveniente, alta velocità di trasmissione può consentire più frequente misurazione delle particelle, producendo molte immagini contenenti migliaia di particelle. Un metodo che utilizza reagenti poco costosi, un comune microscopio da dissezione e software di analisi di open source disponibile liberamente permette risultati sperimentali ripetibili, accessibili, riproducibili e parzialmente automatizzata. Inoltre, il prodotto di tale metodo può essere ben formattato, ben definito e facilmente comprensibili dal software di analisi dati, sia all'interno del laboratorio analisi e condivisione dei dati tra laboratori di interpolazione.

Vi presentiamo un protocollo che descrive in dettaglio i passaggi necessari per produrre un prodotto del genere, tra cui: campionamento, campione preparazione e immobilizzazione in agar, acquisizione di immagini digitali, analisi digitale delle immagini ed esempi di generazione specifico esperimento figura dalla risultati dell'analisi. Abbiamo anche incluso una pipeline di analisi di dati open source per supportare questo protocollo.

Introduction

Lo scopo di questo metodo è quello di fornire un metodo ben definito, ripetibile e parzialmente automatizzata per determinare le distribuzioni di dimensioni e forma delle particelle in bioreattori, specialmente quelli che contengono flocculi di fanghi e aerobica granuli1 , 2. la spiegazione razionale dietro questo metodo erano per migliorare l'accessibilità, la semplicità, la velocità effettiva, e ripetibilità delle nostre esistente di protocolli interni3,4, facilitare la misurazione delle particelle per gli altri e facilitare la condivisione e confronto dei dati.

Ci sono due grandi categorie di analisi di misurazione delle particelle - Metodi inferenziali e direct imaging utilizzando tali qualità come dispersione della luce5. Sebbene metodi di verosimiglianza possono essere automatizzati e hanno grande velocità effettiva, l'attrezzatura è costosa. Inoltre, mentre metodi di verosimiglianza possono determinare con precisione la dimensione equivalente di una particella6, non forniscono informazioni dettagliate forma7.

A causa della necessità per i dati di forma, abbiamo basato il nostro metodo su formazione immagine diretta. Mentre esistono alcuni metodi di imaging ad alta velocità, essi hanno tradizionalmente richiesto costosi hardware commerciale o soluzioni personalizzate costruito8,9. Il nostro metodo è stato sviluppato per impiegare hardware comune, accessibile e software che, anche se soffre di una riduzione nella capacità produttiva, produce immagini di particelle molto più rispetto al minimo necessario per molte analisi10.

I protocolli esistenti non possono specificare importante campionamento e procedura di acquisizione immagine. Altri protocolli possono specificare passaggi manuali che introducono pregiudizi soggettivi (ad esempio ad hoc Sogliatura11). Un metodo ben definito che specifica campionatura, immobilizzazione e immagine acquisizione passaggi combinati con software di analisi liberamente disponibile migliorerà sia all'interno del laboratorio immagine analisi e comparazioni tra i laboratori. Degli obiettivi principali di questo protocollo è quello di fornire un flusso di lavoro e strumenti che dovrebbero portare a risultati riproducibili da laboratori diversi per lo stesso esempio.

Oltre a normalizzare il processo di analisi di immagine, i dati prodotti da questa pipeline viene registrati in una ben definita e ben formattato file12 adatto per l'uso di dati popolari analisi pacchetti13,14, esperimento di interpolazione analisi specifiche (ad esempio di generazione personalizzata figura) e facilitare condivisione dei dati tra laboratori.

Questo protocollo è suggerito specialmente per i ricercatori che richiedono dati di forma delle particelle, non hanno accesso a metodi di verosimiglianza, non si desiderano sviluppare la propria pipeline di analisi di immagine e desiderano condividere i loro dati facilmente con gli altri

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Protocol

1. raccogliere campioni per analisi delle particelle

  1. Determinare il volume del campione per i reattori specifici che produrrà sufficiente particelle per analisi statistica10 (> 500), evitando la sovrapposizione delle particelle.
    1. Si supponga che una gamma di 0,5-2 mL per campione di liquore misto è sufficiente per i campioni di fango attivo con un solidi misti liquore sospesa (MLSS) tra 250 e 5.000 mg/L.
    2. In caso contrario, preparare tre piastre di agar di prova utilizzando 0,5, 2 e 5 mL di campione (passaggi 1.2 attraverso 2,7).
    3. Visivamente, una stima che (se qualsiasi) volumi di campione migliore soddisfano i criteri elencati al punto 1.1.
    4. Se le particelle si sovrappongono ancora per il campione di 0,5 mL, ripetere i passaggi da 1.1.2 e 1.1.3 con tre campioni di 0,5 mL diluiti con un aggiunto 0,5, 1 e 2 mL di tampone fosfato salino per determinare il grado a cui un campione di 0,5 mL deve essere diluito prima del punto 2.1.
      Nota: I passaggi 1.1 − 1.1.4 devono essere eseguito solo una volta ogni esperimento, o se il reattore Sommario cambiamento tale che le misurazioni successive non soddisfano più i criteri elencati nel punto 1.1.
  2. Acquisire un campione rappresentativo di una porzione ben mescolata del reattore da afferrante ~ 40 mL in un bicchiere o una provetta da 50 mL, mescolando delicatamente e versando immediatamente il volume del campione determinato di grab ben mescolato in una provetta da centrifuga da 15 mL. Diluire il campione, necessario, come determinato dal passaggio 1.1.4.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui e il campione può essere conservato in frigorifero (4 ° C) fino a 48 ore. Non congelare il campione.
    Attenzione: comuni supporti di conservazione (ad es. formaldeide/formammide) non sono adatti. L'ampia superficie della piastra, in combinazione con il contenitore aperto, calore dalla sorgente luminosa e potenzialmente poco ventilate microscopia installazione produrre condizioni di pericolo inutilmente per poco guadagno in qualità dell'immagine.

2. preparare piastre di agar di particelle macchiate, immobilizzate

  1. Aggiungere 5 µ l di blu di metilene 1% (p/v) per ogni campione, poi il tappo e capovolgere delicatamente a almeno 3 volte per mescolare. Permetta che i campioni a macchiare per almeno 5 ma non più di 30 minuti a temperatura ambiente.
  2. Preparare circa 10 mL per campione del 7,5% (p/v) agar in acqua deionizzata.
    Nota: Agar possono essere prodotte prima del tempo e conservati a tempo indeterminato se sterilizzati. Agarosio può essere sostituito, ma non migliora sostanzialmente immagini.
  3. Sciogliere l'agar utilizzando un forno a microonde o bagnomaria e lasciare per raffreddare leggermente prima dell'uso. Garantire l'agar è completamente sciolto e versa facilmente. Globuli solidi di agar si macchiano in modo diverso, producendo immagini di scarsa qualità.
  4. Trasferimento sufficiente sciolto 7,5% (p/v) agar per la provetta da centrifuga per portare il volume totale tubo a fra 6,5 e 9 mL.
  5. Richiudere le provette da centrifuga e capovolgere delicatamente almeno 3 volte per mescolare.
  6. Mentre si punta il tappo lontano da se stessi o in una cappa, aprire il tappo. Versare il contenuto di tubo in una plastica di 100 mm di Petri mentre delicatamente a dondolo il piatto per ottenere un rivestimento completo, liscio e una visivamente uniforme distribuzione delle particelle.
    Attenzione: Il calore da agar può produrre una leggera sovrappressione nel tubo. Questo spesso produce un sibilo udibile e ha il potenziale per espellere piccole goccioline di agar caldo.
  7. Lasciate raffreddare a temperatura ambiente per almeno 5 minuti, fino a quando l'agar solidifica le piastre.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Archivio placcato invertito e sigillato (ad esempio, in un sacchetto di plastica tenuto o con la pellicola di paraffina) per fino a 48 ore in frigorifero (4 ° C).

3. acquisizione di immagini di particelle usando un stereomicroscopio e fotocamera digitale

  1. Posizionare il volto scoperto piastra fino sul palco di uno stereomicroscopio microscopio capace di 10x di ingrandimento x 20. Illuminare il campione da sotto con la luce diffusa anche utilizzando attrezzature quali un basamento illuminatore LED o luce targa.
  2. Aprire il software di acquisizione immagine, verificare che il percorso della luce microscopio è impostato su fotoe clicca sulla fotocamera appropriata dall'elenco fotocamera.
  3. Regolare il microscopio in modo che più le particelle appaiono nel software nel piano focale con bordi ben definiti, grandi. Utilizzare un ingrandimento di 10-20 x per misurare le particelle pur mantenendo un piano focale relativamente profondo.
    1. Rimuovere la piastra di agar temporaneamente e posizionare il micrometro sulla scena. Regolare la messa a fuoco fino a quando le graduazioni sul micrometro appaiono perfettamente a fuoco nel software di acquisizione immagini.
    2. Se non precedentemente calibrato, registrare il pixel rapporto micro per l'ingrandimento corrente.
      1. Impostare lo zoom al 100% facendo clic Zoom > dimensioni reali e selezionare Opzioni > Calibra quindi allineare la barra di calibrazione rosso nella finestra principale lungo l'asse del micrometro, con le barre verticali centrata sulla graduazione 0 e 200 µm. Nella finestra di dialogo Calibra , immettere l'attuale livello di ingrandimento e la lunghezza effettiva di 200 µm.
    3. Se già calibrato seleziona ingrandimento dalla barra dei menu, e selezionare l'ingrandimento corrente livello e confermare la calibrazione.
      1. Selezionare misure > Riga > arbitrario linea. Fare clic sull'intersezione della graduazione 0 e asse lungo del micrometro. Fare nuovamente clic sull'intersezione a 200 e il lungo l'asse. A corretta calibrazione dovrebbe visualizzare circa 200 µm. eliminare la riga facendo clic su di esso, premendo CANC, e premendo nella finestra di conferma.
        Nota: Le istruzioni per selezionare la fotocamera e la taratura sono specifiche per il software utilizzato per questo hardware. Funzioni simili dovrebbero essere disponibili in altri software di imaging. L'obiettivo è quello di determinare il pixel rapporto micron dell'immagine per misura di dimensione delle particelle accurata.
  4. Sostituire la piastra di agar e regolare la messa a fuoco fine per ottenere il massimo dettaglio nel software di imaging.
  5. Regolare il software di imaging in modo che si ottiene la massima qualità dell'immagine.
    1. Aumentare la profondità di bit per il valore massimo consentito, selezionando il pulsante di opzione nel pannello della barra laterale fotocamera Profondità di Bit . Impostare il software per acquisire immagini in scala di grigi selezionando il pulsante di opzione nel pannello Colore/grigio della barra laterale della fotocamera .
    2. Comprimere i pannelli della barra laterale aperta tra esposizione e istogramma. Ridurre il guadagno a 1.0 e aumentare l'esposizione fino a quando una chiara immagine viene visualizzata nella finestra grafica e fino a quando l'istogramma viene visualizzato come una distribuzione che non viene ritagliata da delle estremità della casella di istogramma.
    3. Regolare l'istogramma per evitare l'eccessivo e la sottoesposizione. Nel pannello Istogramma della barra laterale della fotocamera, far scorrere il limite sinistro dell'istogramma per appena fuori i valori più bassi e il limite destro per appena fuori i valori più alti.
  6. Salvare l'immagine come un TIFF non compresso, comprese le informazioni di ingrandimento nei metadati dell'immagine, utilizzando il File > Salva con nome nella finestra di dialogo, selezionando il formato TIFF e verificando che la casella Salva con informazioni sulla calibrazione è controllato.
    Nota: Salvare i metadati dell'immagine, tra cui calibrazione spaziale, possono variare tra i programmi di acquisizione. FIJI15, il software sottostante utilizzato dalla pipeline e capisce le varianti più comuni. Le informazioni importanti da registrare sono l'altezza in pixel, larghezza e le unità associato.
  7. Utilizzando sia una fase mobile o manualmente lo spostamento della placca stessa, selezionare un'altra zona, che non si sovrappongono le immagini precedenti, seguendo un percorso che alterna da sinistra a destra e destra-sinistra come uno si muove verso il basso la piastra; conosciuto anche come 'tosaerba criterio di ricerca'. Ripetere il passaggio 3.6 per immagini sufficienti sono prodotte per catturare almeno 500 particelle visivamente stimate, più sono meglio.
    Nota: Modelli alternative (ad es.., circolare, casuale) sono accettabili, ma dovrebbe essere segnalato. L'acquisizione di immagini multiple sovrapposte per combinazione in un mosaico tramite cuciture digitale produce una dimensione di file risultante che ostacola notevolmente la lavorazione a valle e artefatti da impunture può essere introdotto e attualmente non è raccomandata.
  8. Conservare le piastre fino a dopo analisi dell'immagine per potenziali imaging follow-up. Dopo formazione immagine finale, scartare come appropriato per rifiuti biologici.

4. misurare e analizzare le sagome delle particelle

  1. Installare i pacchetti di software di analisi di immagine richiesta
    1. Installare FIJI (una versione migliorata del ImageJ v1.52e di National Institutes of Health seguendo le istruzioni a: https://imagej.net/Fiji/Downloads
    2. Installare git, se non già presente, seguendo le istruzioni a: https://git-scm.com/downloads
    3. Acquisire il codice di analisi delle particelle da clonando il repository git16.
      1. Nella riga di comando, è possibile recuperare l'ultima versione del codice digitando:
        git clone https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
        1. Installare il seguente codice di analisi le istruzioni nel file di testo README.md trovate nella directory principale del repository clonato.
          Nota: Usare git è preferito, come recupererà automaticamente l'ultima versione del codice. Se git non è disponibile, è anche possibile scaricare il codice come un file zip sulla pagina di rilascio a: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
    4. Modificare un file di testo elenco le directory da elaborare, insieme con i parametri facoltativi. Fare riferimento alla sottodirectory esempi/analisi per un elenco di parametri ed esempi.
  2. Eseguire l'analisi sulla riga di comando digitando:
    < FIJI-percorso > \ImageJ-win64.exe - console - macro SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < paramsfile >
    dove < FIJI-percorso > è la directory in cui si trova ImageJ-win64.exe e < paramsfile > la posizione del file di testo che descrive l'installazione di analysis
    Nota: Il nome del file eseguibile può variare, a seconda di quale sistema operativo FIJI è installato. A seconda del numero e dimensione delle immagini, l'analisi potrebbe richiedere alcuni minuti a ore e verrà eseguito automaticamente.
  3. Eseguire un controllo di qualità
    1. Esaminare i file di controllo di qualità si trova nella sottodirectory sovrapposizione della directory di output specificata. Nota immagini con spurie, perse e scarsamente particelle catturate, tutto apparente come contorni ombreggiati che non corrispondere allo sfondo. Riferirsi alla Figura 3 per alcuni esempi di tali. I dati delle particelle sono ora pronti per la generazione di figura di analisi specifico per esperimento.
  4. Rifiutare o piastre intere o singole particelle specificando il codice di analisi il file indicati e/o particella ID verrà ignorato. Fare riferimento a esempi/censura nel repository per il pertinente codice R e Python.
  5. Generare figure specifiche esperimento utilizzando i risultati di analisi di immagine per ogni immagine sono memorizzati in un file di testo separato da virgole ordinata12 nella sottodirectory risultati della directory di output specificata. Consultare le sottodirectory esempi/figure/R ed esempi/figure/Python per esempi di come leggere i file dei risultati.

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Representative Results

File generati
Il processo illustrato nella Figura 1 produrrà due file per ogni immagine analizzati. Il primo file è una virgola separati file di testo (CSV) di valore dove ogni riga corrisponde a una singola particella e le colonne descrivono vari criteri di misurazione delle particelle come zona, circolarità e solidità e definiti nel manuale ImageJ17. I file CSV di esempio sono inclusi come informazioni supplementari e nella directory esempi/dati.

Figure 1
Figura 1: Flusso di lavoro grafico che descrive i quattro passaggi principali del protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il secondo file è destinato all'uso in controllo di qualità (QC) ed è un'immagine GIF file che si sovrappone le particelle di immagine con regioni semi-opache che rappresenta identificato originale, come illustrato nella Figura 2. La qualità di identificazione delle particelle e segmentazione quindi può essere valutata rapidamente manualmente. Anche se nessun metodo di Sogliatura delle particelle è perfetto18, nella figura 2 è presentato come esempio di un risultato accettabile. Immagini di scarsa qualità possono essere riconquistate, o se sono disponibili dati sufficienti, semplicemente rimosso da un'ulteriore elaborazione.

Figure 2
Figura 2: Esempio di un file gif di controllo qualità (QC) generato dalla pipeline di analisi di immagine. Ingrandimento di 15x immagine principale. Estratto digitalmente è ingrandita per visualizzare i numeri di identificazione di singole particelle nell'immagine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Durante la valutazione di immagini QC, ci sono tre errori comuni trovati:
1. mancanza di conformità con precisione ai limiti della particella
2. mancata individuazione di particelle
3. l'inclusione di artefatto dovuto a: componenti non-particella (ad es., bolle), o errori nella soglia

Esempi di questi errori sono illustrati nella Figura 3. Identificazione di contorno povero particelle e segmentazione tra particelle spesso è il risultato di over-morire, come visto in Figura 3a. Scarsa illuminazione può portare ad entrambi l'omissione di identificare particelle (Figura 3b, cerchio solido blu) e manufatto false particelle (Figura 3b, cerchio con tratteggio rosso). Particelle non importa, come bolle, protozoi, funghi e metazoi, come il Tardigrada in Figura 3 c può anche essere spurio identificato come particelle.

Figure 3
Figura 3: Comuni errori rilevati durante l'analisi QC. (un) rilevamento contorno povero. (b) le particelle spurie (ellisse rossa tratteggiata) e particelle non segmentate (ellisse tinta blu). (c), non-particella straniera oggetto. Ingrandimento 15 x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

È più facile respingere l'intera immagine. Tuttavia, è possibile utilizzare l'identificatore di particella nell'immagine QC (Figura 2, inserto) di rifiutare singole particelle. Questo approccio è particolarmente utile quando ci sono una manciata di numeri in un'immagine altrimenti utile (come l'inclusione di particelle non) Figura 3 c. Esempi di fare così in modo riproducibile e segnalabile sono inclusi nella directory esempi/censura del repository su github.

Quando viene specificato un piccolo diametro minimo (< 10 pixel), disturbi dell'immagine possono essere identificati spurio come una particella. In questi casi, l'immagine potrebbe essere ancora essere accettato quando ulteriori analisi a valle sono rimuove la loro presenza. Come linea guida, dati di forma devono essere trattati con scetticismo quando le particelle sono composte da meno di ~ 200 pixel19.

Generazione di figura
I file CSV risultanti dall'analisi immagine sono ordinate12 e possono essere facilmente combinati e analizzati nel pacchetto software preferito del ricercatore (ad esempio Panda20 con seaborn21 in Python o dplyr22 con ggplot223 in R). Tuttavia, è necessario che il tipo di cifra esatta necessario varia necessariamente con domande di ricerca e risultato. Un esempio di una possibile figura è incluso di seguito (Figura 4) e il corrispondente codice di generarlo dai file CSV è disponibile su github16.

Figure 4
Figura 4: Esempio di Figura esperimento specifiche generata dai dati CSV prodotti dalla pipeline immagine. In questo esempio, le distribuzioni di particelle tra due reattori sperimentali nel corso del tempo sono visualizzate e combinate con metadati qualitativi notato dal ricercatore. Vedere esempi/figure/R per la generazione codice e dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Anche se il sistema di analisi dell'immagine è abbastanza robusto e QC sono misure per garantire immagini poveri vengono rimossi, giusta attenzione per i problemi specifici nel campionamento, preparazione e acquisizione di immagini può migliorare sia la precisione dei dati e la proporzione di immagini passando QC.

Concentrazione di campionamento
Supponendo che è stato prelevato un campione rappresentativo, il passo più importante è quello di garantire la presenza per analisi efficiente e rappresentativo9 mentre non è così concentrato che si sovrappongono particelle particelle sufficiente.

Questo ha corrisposto a circa 0,5-2 mL di liquore misto sopra una vasta gamma di solidi sospesi totali, ma determinazione esperimento specifico può essere necessario. Esempi di eccessivamente concentrato, diluito eccessivamente-, e le concentrazioni delle particelle appropriato sono illustrate nella Figura 5 come riferimento. Colorazione è influenzata dalla concentrazione di particelle. Eccessiva diluizione può provocare particelle eccessivamente macchiate, sfocate, mentre sotto-diluizione non può produrre particelle con sufficiente contrasto per soglia ottima.

Figure 5
Figura 5: Riferimento immagini visualizzando le concentrazioni di particelle che sono troppo concentrati, accettabile ed eccessivamente diluito. Ingrandimento 15 x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Concentrazione di tintura
La quantità di macchia aggiunto al campione è cruciale e l'importo corretto può variare tra fanghi. Circa 5 µ l di blu di metilene 1% (p/v) per 0,5-2 mL di campione fornisce un contrasto sufficiente per soglia senza causare 'spurgo' e oscurando la forma della particella.

Non c'è nessuna singola concentrazione ideale; deve essere scelto un equilibrio tra contrasto e nitidezza. La figura 6 illustra questo compromesso in tre campioni colorati con 5, 25 e 50 µ l di blu di metilene 1% per 2 mL di fanghi. Quando il peso di questo compromesso, la particella poco contrasto occasionale (Figura 6a) è preferibile scarsamente risolvibile BLOB (Figura 6C).

Figure 6
Figura 6: Macchia aumentata concentrazione migliora il contrasto delle particelle, ma anche distorce il confine osservato. Ingrandimento 15 x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Deposito di placca
Dopo immobilizzazione, piastre possono essere riposta in frigorifero (4 ° C) per almeno 3 giorni. Si tratta di un conservatore periodo durante il quale è improbabile che si verifichi la contaminazione diffusione della crescita e della tintura. Piastre non mostrando i problemi descritti di seguito possono essere imaged ancora dopo 3 giorni. Quando memorizzate per troppo tempo, particelle esistenti possono continuare a crescere e sarà visualizzato nel piano focale di altre particelle mantenendo la tonalità della macchia, come si può vedere in Figura 7a. Contaminanti di superficie, quali le spore fungine, possono crescere anche dopo lunghi periodi di stoccaggio. Questi generalmente non assumerà il colore della macchia e apparirà in un diverso piano focale, come si può vedere in Figura 7b. In alcuni casi, è poco chiaro se la crescita eccessiva o diffusione della macchia si è verificato, come nella parte inferiore della Figura 7b e centro della Figura 7C. Indipendentemente dalla causa, macchie come quelli indicano che la piastra è invecchiato oltre la sua durata utile

Figure 7
Figura 7: Immagini di riferimento che illustrano la crescita eccessiva di segnalazione che un piatto è stato memorizzato oltre la sua durata utile. Ingrandimento 15 x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Preparazione del piatto
Ci sono due problemi associati fisicamente preparando le piastre di agar - agar eccessivamente spessi e vorticoso eccessivo. Nel primo caso (Figura 8), le particelle diventano sospesi a varie profondità, rendendo difficile acquisire immagini con la maggior parte delle particelle a fuoco.

Figure 8
Figura 8: Utilizzando una quantità eccessiva di agar produrrà un campione più spesso che il piano focale, particelle sfocate. Ingrandimento 15 x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nel secondo caso, vorticoso produce una distribuzione non uniforme delle particelle (figura 9a), differenziazione dei risultati dalle diverse sezioni della piastra (Figura 9b, c. In genere, non più di 7 mL di agar è necessaria a coprire una capsula di Petri 100 mm e solo movimenti della mano delicata sono necessari per coprire in modo uniforme il piatto.

Figure 9
Figura 9: Vorticoso eccessivamente vigorosa durante la preparazione del piatto apparirà come distribuzioni di particelle non uniforme (un), polarizzazione sezioni della piastra verso più grandi (b) e distribuzioni di particelle più piccole (c). Piastra ø 100 mm, micrografie ingrandimento 15x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Formazione immagine microscopica
Ci sono due problemi di acquisizione immagine principali che influenzano la qualità. Il primo problema consiste nel garantire che la maggior parte delle particelle è nel piano focale. Anche a basso ingrandimento, le dimensioni di molte particelle di fango attivato sono tale che senza aggiustamenti minori di messa a fuoco macrometrica, molte particelle sarà leggermente fuori fuoco, introduzione di misurazione delle particelle imprecise. Nessuna immagine conterrà particelle perfettamente concentrato al 100%; Figura 8 e Figura 5b rispettivi esempi di messa a fuoco povero e accettabile.

Livelli di esposizione costituiscono il secondo problema principale. Scarsamente esposti risultato immagini dati persi e scarsa segmentazione11. Inoltre, l'elevato contrasto del colorante può produrre un istogramma stretto, riducendo la gamma dinamica effettiva dei dati. I limiti superiori e inferiore dell'istogramma possono essere regolati prima di catturare un'immagine per prevenire l'esposizione povera e aumentare la gamma dinamica. Esempi di sopra, sotto e accettabile le esposizioni sono inclusi sotto nella Figura 10.

Figure 10
Figura 10: Immagini di riferimento che mostrano le esposizioni di immagine scadente e accettabile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I vantaggi di questo metodo sono che fornisce criteri specifici che comprende l'intero processo. Inoltre, abbiamo fornito una pipeline software analisi all'interno del laboratorio di interpolazione e promuovere dati comparabili tra-lab. La limitazione principale di questo metodo è che il requisito di mantenere tutte le particelle focalizzate previene alti ingrandimenti, limitando la sua utilità per le particelle di piccole dimensioni minori - in particolare le strutture filamentose. Direzioni future di questo metodo potrebbero integrare tecniche di analisi avanzata delle immagini (in particolare rumore riduzione24,25, alta gamma dinamica imaging, messa a fuoco accatastamento26,27e apprendimento automatico soglia, segmentazione e classificazione assistita28. Il miglioramento di acquisizione immagine principali sarebbe incorporare del software per il controllo meccanico fasi8 e produrre 'whole plate' mosaico archivi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della National Science Foundation CBET 1336544.

I loghi di FIJI, R e Python sono utilizzati con il secondo i seguenti criteri di marchio:
Python: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ , secondo la licenza CC-BY-SA 4.0 elencata presso: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
Fiji: https://imagej.net/Licensing

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Bleach solution Chlorox 31009 For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap Corning 430790 Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask Corning 4980-50 Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle Kimble-Chase 14395-50 Or otherwise sufficient for agar handling
Agar BD 214010 Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software N/A N/A R or Python are suggested
Deionized water N/A N/A Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer N/A N/A Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive Seagate STEB5000100 Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI NIH version 1.51d Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT Open Source version 2.19.1 or later Available at: https://git-scm.com/
Image capture software ToupView version 3.7.5177 Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage OMAX A512 Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue Fisher M291-100 Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera OMAX A35140U Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer OMAX A36CALM1 Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm Fisher FB0875712 1 per sample.
PPE N/A N/A Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro NCSU version 0.2.1 Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope Nikon SMZ-2T Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. Aerobic granulation: Advances and challenges. Applied Biochemistry and Biotechnology. 167, (6), 1622-1640 (2012).
  2. Adav, S. S., Lee, D. -J., Show, K. -Y., Tay, J. -H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnology Advances. 26, (5), 411-423 (2008).
  3. Williams, J. C. Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University. Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162 (2004).
  4. Moghadam, B. K. Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation. Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761 (2012).
  5. Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor. Journal of Applied Microbiology. 91, (1), 168-175 (2001).
  6. Kelly, R. N., et al. Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems. AAPS Pharm SciTech. 7, (3), Available from: http://www.aapspharmscitech.org E1-E14 (2006).
  7. Walisko, R., et al. The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).
  8. Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy. PLoS ONE. 9, (2), e88977 (2014).
  9. Dias, P. A., et al. Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images. BioMedical Engineering OnLine. 15, (1), 64 (2016).
  10. Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. III Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge. Applied and Environmental Microbiology. 70, (4), 2420-2428 (2004).
  11. Cromey, D. W. Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images. Science and Engineering Ethics. 16, (4), 639-667 (2010).
  12. Wickham, H. Tidy Data. Journal of Statistical Software. 59, (10), (2014).
  13. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. Available from: http://www.r-project.org (2017).
  14. van Rossum, G. Python tutorial. Amsterdam. CS-R9526 (1995).
  15. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. FIJI: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  16. Weaver, J. E. SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis. Available from: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis (2018).
  17. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. National Institute of Health. (2012).
  18. Sezgin, M., Sankur, B. Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation. Journal of Electronic Imaging. 13, (1), 146-166 (2004).
  19. Kröner, S., Doménech Carbó, M. T. Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images. Powder Technology. 245, 297-313 (2013).
  20. McKinney, W. Data Structures for Statistical Computing in Python. Proceedings of the 9th Python in Science Conference. 51-56 (2010).
  21. Waskom, M., et al. seaborn: v0.5.0 (November 2014). (2014).
  22. Wickham, H. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html (2016).
  23. Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. Springer-Verlag. New York. Available from: http://ggplot2.org (2009).
  24. Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. Digital Photography: A Primer for Pathologists. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18, (2), 91-128 (2004).
  25. Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy. Journal of Microscopy. 256, (3), 231-236 (2014).
  26. Eastwood, B. S., Childs, E. C. Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy. Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. 225-232 (2012).
  27. Bell, A. A., Brauers, J., Kaftan, J. N., Meyer-Ebrecht, D., Aach, T. High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology). 3, (1), Available from: https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/ 170-184 (2009).
  28. Jain, V., et al. Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks. 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. 1-8 (2007).
Misurare la forma e la dimensione delle particelle di fango attivo immobilizzato in Agar con una Pipeline di Software Open Source
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Weaver, J. E., Williams, J. C., Ducoste, J. J., de los Reyes III, F. L. Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline. J. Vis. Exp. (143), e58963, doi:10.3791/58963 (2019).More

Weaver, J. E., Williams, J. C., Ducoste, J. J., de los Reyes III, F. L. Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline. J. Vis. Exp. (143), e58963, doi:10.3791/58963 (2019).

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