Summary
Størrelsen og form av partikler i aktivert slam er viktige parametere som måles ved hjelp av ulike metoder. Feil oppstår fra ikke-representative utvalg, suboptimal bilder og subjektive analyser parametere. For å minimere disse feilene og lette måling, presenterer vi en protokoll angir hvert trinn, inkludert en åpen kildekode programvare rørledning.
Abstract
Eksperimentell bioreaktorer, som de behandler avløpsvannet, inneholde partikler som størrelse og form er viktige parametere. For eksempel kan størrelsen og formen på aktivslam flocs angi forholdene på Mikroskala, og også direkte påvirke hvor godt slam bosetter seg i en clarifier.
Partikkelstørrelse og form er begge villedende "enkel" mål. Mange subtile problemer, ofte uadressert i uformelle protokoller kan oppstå når prøvetaking imaging og analyserer partikler. Prøvetaking metoder kan være partisk eller gir ikke nok statistisk styrke. Prøvene seg kan være dårlig bevart eller gjennomgå endring under immobilisering. Bilder kan ikke være av tilstrekkelig kvalitet; overlappende partikler, kan dybdeskarphet, forstørrelsesnivå, og ulike støy alle gi dårlige resultater. Dårlig angitte analyse kan introdusere bias, som produseres av manuell bilde terskelverdi og segmentering.
Rimelig og gjennomstrømning er ønskelig sammen med reproduserbarhet. En rimelig, høy gjennomstrømming metode kan aktivere hyppigere partikkel måling, produsere mange bilder som inneholder tusenvis av partikler. En metode som bruker billig reagenser, felles dissecting mikroskop og fritt tilgjengelige åpen kildekode analyseprogramvare kan gjentas, tilgjengelig, reproduserbare og delvis automatisert eksperimentelle resultater. Videre, produktet av slik metode kan være velutformet, veldefinerte og lett forstått av dataanalyse programvare, lettelser både innen-lab analyser og datadeling mellom laboratorier.
Vi presenterer en protokoll som viser trinnene som trengs for å produsere et produkt, inkludert: prøvetaking, prøve forberedelse og immobiliseringsløsninger agar, digital image vinningen, digital bildeanalyse og eksempler på eksperimentet-spesifikk figur generasjon fra den analyseresultater. Vi har også inkludert en åpen kilde data analyse rørledning for å støtte denne protokollen.
Introduction
Formålet med denne metoden er en godt definert, repeterbare og delvis automatisert metode for å bestemme størrelsen og formen distribusjoner av partikler i bioreactors, spesielt de som inneholder aktivslam flocs og aerobic granulater1 , 2. begrunnelsen bak denne metoden var å forbedre den rimelig, enkelhet, gjennomstrømning, og repeterbarhet våre eksisterende in-house protokoller3,4, lette partikkel måling for andre, og lette deling og sammenligning av data.
Det er to hovedkategorier av partikkel måling analyse - direkte tenkelig og inferential metoder å bruke slike egenskaper som lysspredning5. Selv om inferential metoder kan automatiseres og har stor gjennomstrømming, er utstyret dyrt. Dessuten, mens inferential metoder å nøyaktig bestemme tilsvarende størrelsen på en partikkel6, gir de ikke detaljert form information7.
Behovet for figurdata, har vi basert vår metode på direkte bildebehandling. Mens noen høy gjennomstrømming tenkelig metoder finnes, har de tradisjonelt nødvendige dyr kommersiell maskinvare eller tilpassede innebygde løsninger8,9. Vår metode er blitt bebygget for å ansette felles, rimelig maskinvare og programvare som, selv om lider av en reduksjon i gjennomstrømning, gir langt mer partikkel bilder enn minimum nødvendig for mange analyser10.
Eksisterende protokoller kan ikke angi viktig prøvetaking og bilde oppkjøpet trinnene. Andre protokoller kan angi manuelle trinn som innføre subjektive bias (for eksempel ad hoc terskelverdi11). En veldefinert metode som angir prøvetaking immobilisering trinnene, og bilde oppkjøpet kombinert med fritt tilgjengelig analyseprogramvare vil forbedre både innen-lab bildeanalyse og sammenligninger mellom laboratorier. Et hovedmål for denne protokollen er å gi en arbeidsflyt og verktøy som skal føre til reproduserbar resultater fra ulike labs for samme prøven.
Bortsett fra normalisere bildet analyseprosessen, er data produsert av denne rørledningen registrert i en veldefinert og godt formatert fil12 egnet for bruk av populære data analyse pakker13,14, lettelser eksperiment konkrete analyser (som egendefinert figur generasjon) og går lettere datadeling mellom laboratorier.
Denne protokollen er spesielt foreslått for forskere som krever partikkel figurdata, har ikke tilgang til inferential metoder, ikke ønsker å utvikle sine egne bildet analyse rørledning, og ønsker å dele sine data enkelt med andre
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. samle inn eksempler for partikkel analyse
- Finne eksempel volumet for bestemte reaktorer som vil produsere nok partikler for statistisk analyse10 (> 500) og unngå partikkel overlapping.
- Anta at en rekke 0,5 til 2 mL per prøve blandet brennevin er tilstrekkelig for aktivslam prøver med en blandet brennevin suspendert stoff (MLSS) mellom 250 og 5000 mg/L.
- Ellers forberede tre test agar plater med 0,5, 2 og 5 mL av prøven (trinn 1.2 gjennom 2.7).
- Visuelt anslå hvilke (hvis noen) eksempel volumer beste oppfyller kriteriene vises i trinn 1.1.
- Hvis partikler fortsatt overlapper for 0,5 mL prøven, Gjenta trinn 1.1.2 og 1.1.3 med tre 0,5 mL prøver fortynnet med en ekstra 0,5 og 1 2 mL fosfat bufret saltoppløsning å bestemme hvilken som et eksempel på 0,5 mL må fortynnes før trinn 2.1.
Merk: Trinn 1.1 − 1.1.4 må kun utføres én gang per forsøk, eller hvis reaktoren innholdet endres slik at påfølgende mål ikke lenger oppfyller kriteriene nevnt i trinn 1.1.
- Skaffe seg et representativt utvalg fra en velkomponert del av reaktoren ved flytte ~ 40 mL i et beaker eller 50 mL sentrifuge tube, miksing forsiktig og umiddelbart pouring bestemt eksempel volumet av det godt blandet fange i en 15 mL sentrifuge rør. Fortynne prøven, eventuelt etter trinn 1.1.4.
Merk: Protokollen kan pauses her og prøven kan lagres under nedkjøling (4 ° C) i opptil 48 timer. Må ikke fryses prøven.
Forsiktig: vanlig bevaring media (f.eks formaldehyd/formamide) er ikke egnet. Den store overflaten av platen, i kombinasjon med den åpne beholderen, varme fra lyskilde og potensielt dårlig ventilerte mikroskopi installasjonsprogrammet produsere unødvendig farlige forhold for liten gevinst i bildekvalitet.
2. Forbered agar plater flekkete, immobilisert partikler
- Legge til 5 µL av 1% (w/v) methylene blåfarge hver prøve, så cap og forsiktig Inverter 3 minst ganger å blande. Tillate prøver stain minst 5 men ikke mer enn 30 minutter ved romtemperatur.
- Forberede ca 10 mL per eksempel på 7,5% (w/v) agar i deionisert vann.
Merk: Agar kan være produsert forhånd og lagret på ubestemt tid hvis sterilisert. Agarose kan erstattes, men vesentlig forbedrer ikke bilder. - Smelte agar bruker en mikrobølgeovn eller vann bad og la avkjøles litt før bruk. Sikre agar er helt smeltet og skjenker lett. Solide globules av agar vil flekke annerledes, produsere kvalitet bilder.
- Overføre tilstrekkelig smeltet 7,5% (w/v) agar til sentrifuge røret å bringe totale tube volumet mellom 6,5 og 9 mL.
- Oppsummering sentrifuge rør og forsiktig Inverter minst 3 ganger for å blande.
- Mens peker hetten fra seg eller en hette, åpne lokket. Hell innhold i en 100 mm plast Petriskål mens forsiktig rocking parabolen for å oppnå en full, glatt belegg og en visuelt jevn fordeling av partikler.
FORSIKTIG: Varmen fra agar kan produsere en liten overtrykk i røret. Dette ofte produserer en hørbar susing og har potensial til å utvise små dråper av varme agar. - La platene avkjøles til romtemperatur i minst 5 minutter, før agar stivner.
Merk: Protokollen kan pauses her. Store belagt invertert og forseglet (f.eks i en forsegling plastpose eller med parafin film) i opptil 48 timer under nedkjøling (4 ° C).
3. få partikkel bilder ved hjelp av en stereomicroscope og digitalt kamera
- Plass avdekket plate ansiktet opp på mikroskopet scenen av en stereomicroscope i stand til 10 x til 20 x forstørrelse. Belyse eksemplet nedenfor med selv, diffus lys med utstyr som LED illuminator stå eller lys plate.
- Åpne bildet fange programvare, sikre mikroskop lys banen er satt til Photo, og klikk på det aktuelle kameraet fra listen kameraet.
- Juster mikroskopet slik at flere partikler vises i programvaren i fokalplanet med store, veldefinerte kanter. Bruk en forstørrelse på 10-20 x som måler partikler samtidig opprettholde en relativt dyp fokalplanet.
- Midlertidig fjerne agar platen og plasser mikrometer på scenen. Justere finskruen til eksamener på mikrometer vises skarpt fokuserte i image fange programvare.
- Hvis ikke tidligere kalibrert, registrere bildepunktet til mikro ratio for gjeldende forstørrelse.
- Sette zoom til 100% ved å klikke Zoom > faktisk størrelse og velg Alternativer > Calibrate deretter justere det røde kalibreringslinjen i viktigste viewport langs den lange aksen mikrometer, med den vertikale barer sentrert på 0 og 200 µm eksamener. Angi gjeldende forstørrelsesnivå og faktiske lengden på 200 μm i dialogboksen Kalibrer .
- Hvis allerede kalibrert Velg forstørrelse på menylinjen og velg gjeldende forstørrelse nivå og bekrefte kalibreringen.
- Velg målinger > linje > vilkårlig linje. Klikk på krysset av 0 eksamen og lange aksen til mikrometer. Klikk igjen på krysset til 200 og langt aksen. A riktig kalibrering skal vise ca 200 µm. slette linjen ved å klikke den, trykke delete, og trykke Ja boksen bekreftelse.
Merk: Instruksjonene for å velge kamera og kalibrering er spesifikke for programvaren som brukes for denne maskinvaren. Tilsvarende funksjoner være tilgjengelig i andre bilderedigeringsprogrammer. Målet er å avgjøre bildepunktet til mikron-forhold av bildet for nøyaktig partikkel størrelse måling.
- Velg målinger > linje > vilkårlig linje. Klikk på krysset av 0 eksamen og lange aksen til mikrometer. Klikk igjen på krysset til 200 og langt aksen. A riktig kalibrering skal vise ca 200 µm. slette linjen ved å klikke den, trykke delete, og trykke Ja boksen bekreftelse.
- Erstatt agar platen og justere finskruen for å oppnå maksimale detaljer i tenkelig programvare.
- Juster bildebehandlingsprogramvare slik at maksimal bildekvalitet er oppnådd.
- Øke bitdybden til maksimal verdi tillatt, ved å velge alternativknappen i Bitdybde panelet i kameraet sidepanelet. Sette programvare å erverve gråtonebilder ved å velge alternativknappen i Farge/grå -panelet i kameraet sidepanelet.
- Skjule alle åpne side paneler mellom eksponering og histogrammet. Redusere gevinsten 1.0 og øke eksponeringen til et klart bilde vises i viewport, og til histogrammet vises som en distribusjon som ikke er kuttet av hver ende av boksen histogrammet.
- Justere histogramvisning å unngå og undereksponering. I histogrampanelet av kameraet siden bar, skyv den venstre kantlinjen i histogrammet bare utenfor de laveste verdiene og den høyre grenselinjen til like utenfor de høyeste verdiene.
- Lagre bildet som en TIFF ukomprimert, inkludert forstørrelse informasjon i bildemetadata, bruker den Fil > Lagre som dialogboksen velger TIFF-format, og sikre at boksen Lagre med Kalibreringsinformasjon kontrolleres.
Merk: Lagre bildemetadata, herunder romlig, kan variere mellom oppkjøpet programmer. FIJI15, underliggende programvaren rørledningen, forstår vanligste variantene. Viktig informasjon til posten er den pixel høyde, bredde og tilknyttede unit(s). - Ved hjelp av enten en mobil stage eller manuelt flytte platen selv, velger du et annet område som ikke overlapper forrige bilder, følger en sti som bytter mellom venstre mot høyre og høyre mot venstre som en trekk ned plate; også kjent som 'gressklipper søk'. Gjenta trinn 3.6 til tilstrekkelig bilder produseres for å fange minst 500 visuelt anslagsvis partikler, mer er bedre.
Merk: Alternativer mønstre (f.eks., sirkulære, tilfeldig) er akseptabelt, men skal rapporteres. Anskaffe flere overlappende bilder for kombinasjon i en mosaikk via digital søm produserer en resulterende filstørrelsen som sterkt hindrer nedstrøms behandling og gjenstander fra søm kan bli introdusert og anbefales ikke for øyeblikket. - Beholde plater før etter bildeanalyser for potensielle oppfølging bildebehandling. Etter siste bildebehandling, kast som passer for biologisk avfall.
4. måle og analysere partikkel silhuetter
- Installere nødvendige bildet analyse programvarepakker
- Installere FIJI (en forbedret versjon av National Institutes of Health ImageJ v1.52e følge instruksjonene på: https://imagej.net/Fiji/Downloads
- Installere git, om ikke allerede finnes, ved å følge instruksjonene på: https://git-scm.com/downloads
- Kjøpe partikkel analyse koden fra ved kloning av git repository16.
- På kommandolinjen, kan du hente den nyeste versjonen av koden ved å skrive:
git klone https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git- Installere analyse koden følgende instruksjonene i tekstfilen README.md funnet i mappen på øverste nivå av klonet depotet.
Merk: Bruke git er foretrukket, som den vil automatisk hente den nyeste versjonen av koden. Hvis git ikke er tilgjengelig, er det også mulig å laste ned koden som en zip-fil på siden utgivelsen på: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
- Installere analyse koden følgende instruksjonene i tekstfilen README.md funnet i mappen på øverste nivå av klonet depotet.
- På kommandolinjen, kan du hente den nyeste versjonen av koden ved å skrive:
- Redigere tekstfilen med liste over kataloger som skal behandles, sammen med valgfrie parametere. Se eksempler/analyse undermappe for en liste over parametere og eksempler.
- Kjør analysen på kommandolinjen ved å skrive:
< FIJI-PATH > \ImageJ-win64.exe - konsoll - makroen SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < paramsfile >
der < FIJI-path > er mappen som ImageJ-win64.exe ligger og < paramsfile > plassering for tekstfilen som beskriver analyse oppsettet
Merk: Navnet på den kjørbare filen kan variere, avhengig av hvilket operativsystem FIJI er installert på. Avhengig av antallet og størrelsen på bilder, analysen kan ta noen minutter til timer og kjøres automatisk. - Utføre en kvalitetskontroll sjekk
- Undersøke kvalitetskontroll filene i overlegg-undermappe i mappen angitt utdata. Merk bilder med falske, tapte og dårlig fanget partikler, alle tilsynelatende som skyggelagt konturer som ikke samsvarer med bakgrunnen. Se Figur 3 for eksempler på slike. Partikkel dataene er nå klare eksperiment-Analyser figur generasjon.
- Avvis hele plater eller enkelte partiklene ved å angi i analyse koden bemerket filer og/eller partikkel-IDer som skal ignoreres. Se eksempler/sensur i repositoriet for relevante R og Python koden.
- Generere eksperiment spesifikke tall med analyseresultatene bilde for hvert bilde lagres i et RYDDIG12 kommaseparert tekstfil i resultater-undermappe i mappen angitt utdata. Se eksempler/figurer/R og eksempler/figurer/Python undermappene for eksempler på hvordan du skal lese resultatene filene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Filer generert
Prosessen illustrert i figur 1 vil produsere to filer per bilde analysert. Den første filen er komma separert fil (CSV) tekst der hver rad tilsvarer en personlige partikkel og kolonnene beskriver ulike partikkel beregninger som området, sirkularitet og soliditet og definert i ImageJ manuell17. Eksempel-CSV-filer er inkludert tilleggsinformasjon og i mappen eksempler/data.
Figur 1: Grafisk arbeidsflyt som beskriver de fire hovedtrinnene i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Den andre filen er ment for bruk i kvalitetskontroll (QC) og er en GIF bildefilen som overlegg opprinnelige bildet med semi-gjennomsiktig regioner som representerer identifisert partikler, som i figur 2. Kvaliteten på partikkel identifikasjon og segmentering kan deretter evalueres raskt manuelt. Selv om ingen partikkel terskelverdi metode er perfekt18, er figur 2 presentert som et eksempel på et akseptabelt resultat. Dårlig bildekvalitet kan enten være tilbake, eller hvis nok data tilgjengelig, bare fjernet fra videre behandling.
Figur 2: Eksempel på kvalitetskontroll (QC) gif generert av rørledningen bildet analyse. Forstørrelsen av hovedbildet 15 x. Utdrag er digitalt zoomet for å vise tall identifisere enkelte partiklene i bildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Når du vurderer QC bilder, det er tre vanlige feil funnet:
1. unnlatelse av å nøyaktig samsvar med partikkel grensene
2. feil å identifisere partikler
3. gjenstand inkludering grunn til: ikke-partikkel komponenter (f.eks bobler) eller feil i terskelverdi
Eksempler på disse feilene er illustrert i Figur 3. Dårlig partikkel grensen identifikasjon og segmentering mellom partikler ofte er et resultat av over døende, som vist i figur 3a. Dårlig belysning kan føre til både unnlatelse av å identifisere partikler (figur 3b, blå solid sirkel) og gjenstanden falske partikler (figur 3b, rød stiplet sirkel). Non-partikkel rolle, som bobler, protozoer, sopp og Metazoer, som Bjørnedyr i Figur 3 c kan også bli spuriously identifisert som partikler.
Figur 3: Vanlige feil oppdaget under QC analyser. (en) dårlig partikkel grensen gjenkjenning. (b) falske partikler (rød stiplet ellipse) og unsegmented partikler (blå solid ellipse). (c) utenlandsk partikkel-objektet. Forstørrelse 15 x. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Det er enklest å avvise hele bildet. Det er imidlertid mulig å bruke partikkel identifikatoren i QC bildet (figur 2, innfelt) å avvise enkelte partiklene. Dette er spesielt nyttig når det finnes en håndfull problemer i en ellers nyttig bilde (for eksempel inkludering av ikke-partikler) Figur 3 c. Eksempler på gjøre er så på en reproduserbar og rapporterte måte inkludert i eksempler/sensurere mappen på github oppbevaringssted.
Når en liten minimumsdiameteren angis (< 10 bildepunkter), image bråk kan spuriously identifisert som en partikkel. I disse tilfellene, bildet kan bli fortsatt aksepteres når ytterligere nedstrøms fjerner deres tilstedeværelse. Som en retningslinje, bør figurdata behandles med skepsis når partikler består av mindre enn ~ 200 piksler19.
Figur generasjon
CSV-filer fra bildeanalyser ryddig12 og kan lett kombineres og analysert i forskerens foretrukne programvarepakke (som pandaer20 med seaborn21 i Python eller dplyr22 med ggplot223 i R). Den eksakte tall typen som kreves varierer imidlertid nødvendigvis med problemstillinger og resultat. Et eksempel på en mulig figur er inkludert nedenfor (Figur 4) og den tilsvarende koden å generere den fra CSV-filer er tilgjengelig på github16.
Figur 4: Eksempel på eksperimentet-spesifikk figur generert fra CSV-data produsert av rørledningen bilde. I dette eksemplet partikkel distribusjonen mellom to eksperimentell reaktorer over tid vises og kombinert med kvalitativ metadata bemerket av forskeren. Se eksempler/figurer/R for genererer kode og data. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om bildet analyse systemet er ganske robust og QC skritt er tatt for å sikre dårlig bilder er fjernet, kan riktig oppmerksomhet til problemer i prøvetaking, plate forberedelser og bildeopptak forbedre både nøyaktigheten av dataene og andelen av bilder passerer QC.
Prøvetaking konsentrasjon
Antar et representativt utvalg overtatt, er viktigste å sikre at tilstrekkelig partikler tilstede for representant9 og effektiv analyse mens ikke så konsentrert at partikler overlapper.
Dette har tilsvarte ca 0,5 til 2 mL blandet brennevin over et bredt spekter av suspendert stoff, men eksperimentet-spesifikke vilje kan være nødvendig. Eksempler på altfor konsentrert, altfor - utvannet, og aktuelle partikkel konsentrasjoner er vist i figur 5 som referanse. Flekker er også påvirket av partikkel konsentrasjon. Over fortynning kan føre altfor farget, uskarp partikler mens under fortynning ikke kan produsere partikler med nok kontrast for optimal terskelverdi.
Figur 5: Referanse bilder viser partikkel konsentrasjoner som er for konsentrert akseptabel og altfor utvannet. Forstørrelse 15 x. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fargestoff konsentrasjon
Flekk lagt til utvalget er viktig og riktig beløp kan variere mellom sludges. Ca 5 µL av 1% (w/v) methylene blåfarge per 0,5 til 2 mL av prøve gir nok kontrast for terskelverdi uten forårsaker 'blødning' og skjule den partikkel formen.
Det er ingen enkelt ideelle konsentrasjon. du må velge en balanse mellom kontrast og klarhet. Figur 6 illustrerer dette kompromisset i tre prøvene med 5, 25 eller 50 µL av 1% methylene blåfarge per 2 mL av slam. Når veiing dette kompromisset, foretrekkes sporadisk dårlig kontrasterende partikkel (figur 6a) over dårlig løses BLOBer (figur 6 c).
Figur 6: Økt flekken konsentrasjon forbedrer partikkel kontrast, men forvrenges observert grensen. Forstørrelse 15 x. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Plate lagringsmedier
Etter immobilisering, kan plater lagres under nedkjøling (4 ° C) i minst 3 dager. Dette er en konservativ periode der det er usannsynlig at forurensende vekst og dye-diffusjon vil skje. Platene ikke viser noen av problemene som er beskrevet nedenfor kan fortsatt avbildes etter 3 dager. Når lagret for lenge, eksisterende partikler kan fortsette å vokse og vil vises i fokalplanet andre partikler samtidig som kuløren på flekken, som kan ses i figur 7a. Overflaten forurensning, som sopp spores, kan også vokse etter lengre lagring. Dette vanligvis ikke vil ta opp fargen på flekken og vises i en annen fokalplanet, som kan ses i figur 7b. I noen tilfeller er det uklart om overvekst eller spredning flekken har oppstått, slik som i bunnen av figuren 7b og midten av figur 7 c. Uansett årsak angir flekker som platen har alderen utenfor dets levetid
Figur 7: Referanse bilder illustrerer overvekst signaliserer at en plate har blitt lagret utenfor dets levetid. Forstørrelse 15 x. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Plate forberedelse
Det er to problemer forbundet med fysisk forbereder agar platene - altfor tykk agar og overdreven virvler. I det første tilfellet (Figur 8), bli partikler suspendert på ulike dyp, gjør det vanskelig å hente bilder med fleste av partikler i fokus.
Figur 8: Bruke store mengder agar vil produsere et utvalg tykkere enn fokalplanet, resulterer i uklare partikler. Forstørrelse 15 x. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I det andre tilfellet virvlende gir en ikke-uniform fordeling av partikler (figur 9a), biasing resultater fra ulike deler av platen (figur 9b, c. Vanligvis ikke mer enn 7 mL av agar er nødvendig for å dekke en 100 mm Petriskål og bare mild bevegelser for å jevnt dekke parabolen.
Figur 9: Altfor sterk virvlende under plate forberedelse vises som ikke-uniform partikkel distribusjoner (en), biasing deler av platen mot større (b) og mindre (c) partikkel distribusjoner. Platen er 100 mm diameter, micrographs forstørret 15 x. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Mikroskopiske bildebehandling
Det er to større image oppkjøpet problemer påvirke kvaliteten. Det første spørsmålet er å sikre at fleste av partikler er i fokalplanet. Selv på lav forstørrelse er størrelsen på mange aktivslam partikler slik at uten mindre justeringer til grov fokus, mange partikler vil være litt uskarpt, innføre unøyaktig partikkel måling. Ingen bilde inneholder 100% perfekt fokuserte partikler; Figur 8 og figur 5b er respektive eksempler på dårlig og akseptabel.
Eksponeringsnivåer utgjør det andre store problemet. Dårlig utsatt bilder resulterer i tapte data og fattige segmentering11. Videre, den høye kontrasten av fargestoffet kan produsere en smal histogrammet, redusere effektiv dynamikkområdet data. Øvre og nedre grensene for histogrammet kan justeres før fange både hindre dårlig eksponering og øke det dynamiske området. Eksempler på over, under og akseptabel eksponeringer er inkludert nedenfor i Figur 10.
Figur 10: Referanse bilder som viser fattige og akseptabel eksponeringer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Denne metoden fordelene er at det gir bestemte kriterier omfatter hele prosessen. Videre har vi gitt en programvare-rørledning lettelser i laboratoriet analyse og fremme sammenlignbare mellom-lab data. Stor begrensning av denne metoden er at kravet om å holde alle partikler fokusert hindrer stor forstørrelse, begrense sin nytteverdi for partikler med små mindre dimensjoner - spesielt trådformede strukturer. Fremtidige retninger av denne metoden kunne innlemme avansert dataanalyse teknikker (spesielt støy reduksjon24,25, utvidet dynamisk område, fokus stabling26,27og maskinlæring assistert terskelverdi, segmentering og klassifisering28. Større image oppkjøpet forbedring ville innlemme programvare for å kontrollere mekanisk trinn8 og produsere "hele platen" mosaikk arkiver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Science Foundation CBET 1336544.
FIJI, R og Python logoer brukes med den i samsvar med følgende varemerke retningslinjer:
Python: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ , som CC-BY-SA 4.0 lisens oppført på: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
Fiji: https://imagej.net/Licensing
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Bleach solution | Chlorox | 31009 | For workspace disinfection. |
| 15 mL centrifuge tube with cap | Corning | 430790 | Per sample. |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Corning | 4980-50 | Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing |
| 500 mL Kimax Bottle | Kimble-Chase | 14395-50 | Or otherwise sufficient for agar handling |
| Agar | BD | 214010 | Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample. |
| Data analysis software | N/A | N/A | R or Python are suggested |
| Deionized water | N/A | N/A | Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine. |
| Desktop computer | N/A | N/A | Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient. |
| External hard drive | Seagate | STEB5000100 | Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested. |
| FIJI | NIH | version 1.51d | Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GIT | Open Source | version 2.19.1 or later | Available at: https://git-scm.com/ |
| Image capture software | ToupView | version 3.7.5177 | Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data. |
| Mechanical (X/Y) Stage | OMAX | A512 | Not fully required, but greatly aids image acquisition. |
| Methylene blue | Fisher | M291-100 | Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample. |
| Microscope camera | OMAX | A35140U | Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested. |
| Optical Stage Micrometer | OMAX | A36CALM1 | Or otherwise sufficient for spatial calibration. |
| Petri dish, 100 mm | Fisher | FB0875712 | 1 per sample. |
| PPE | N/A | N/A | Standard lab coat, gloves, and eyewear. |
| Sparmoria macro | NCSU | version 0.2.1 | Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis |
| Stereo/dissecting microscope | Nikon | SMZ-2T | Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD. |
References
- Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. Aerobic granulation: Advances and challenges. Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).
- Adav, S. S., Lee, D. -J., Show, K. -Y., Tay, J. -H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).
- Williams, J. C. Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University. , Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162 (2004).
- Moghadam, B. K. Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation. , Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761 (2012).
- Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor. Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).
- Kelly, R. N., et al. Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems. AAPS Pharm SciTech. 7 (3), Available from: http://www.aapspharmscitech.org E1-E14 (2006).
- Walisko, R., et al. The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).
- Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy. PLoS ONE. 9 (2), e88977 (2014).
- Dias, P. A., et al. Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images. BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64 (2016).
- Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. III Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge. Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).
- Cromey, D. W. Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images. Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).
- Wickham, H. Tidy Data. Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , Available from: http://www.r-project.org (2017).
- van Rossum, G. Python tutorial. , Amsterdam. CS-R9526 (1995).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. FIJI: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Weaver, J. E. SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis. , Available from: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis (2018).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. , National Institute of Health. (2012).
- Sezgin, M., Sankur, B. Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation. Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).
- Kröner, S., Doménech Carbó, M. T. Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images. Powder Technology. 245, 297-313 (2013).
- McKinney, W. Data Structures for Statistical Computing in Python. Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).
- Waskom, M., et al. seaborn: v0.5.0 (November 2014). , (2014).
- Wickham, H. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html (2016).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. Available from: http://ggplot2.org (2009).
- Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. Digital Photography: A Primer for Pathologists. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).
- Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy. Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).
- Eastwood, B. S., Childs, E. C. Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy. Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).
- Bell, A. A., Brauers, J., Kaftan, J. N., Meyer-Ebrecht, D., Aach, T. High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology). 3 (1), Available from: https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/ 170-184 (2009).
- Jain, V., et al. Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks. 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).
