Summary
Aktif çamur parçacıklar şekli ve boyutu değişen yöntemlerle ölçülen önemli parametreleridir. Yanlışlıklar temsilcisi olmayan örnekleme, suboptimal görüntüleri ve öznel analiz parametrelerini kaynaklanan. Bu hataları en aza indirmek ve ölçüm kolaylaştırmak için biz bir açık kaynak yazılım boru hattı da dahil olmak üzere her adım belirten bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Bu tedavi Atıksu gibi deneysel Biyoreaktörler olan boyutu ve şekli önemli parametreleridir parçacıklar içerir. Örneğin, boyutunu ve şeklini aktif çamur flocs koşulları microscale adlı göstermek ve ne kadar iyi bir temizleyici çamur yerleşir de doğrudan etkiler.
Partikül büyüklüğü ve şekli yanıltıcı 'basit' her iki ölçüm vardır. Birçok ince konular, gayri resmi Protokoller'de kez adressiz örnekleme, görüntüleme ve parçacıklar analiz ortaya çıkabilir. Örnekleme yöntemleri önyargılı olabilir veya istatistiksel yeterli güç sağlamak değil. Örnekleri kendilerini kötü korunmuş veya immobilizasyon sırasında değişiklik tabi. Görüntü kalitesi yeterli olmayabilir; parçacıklar örtüşen, alan derinliği, büyütme düzeyini ve çeşitli gürültü tüm kötü sonuçlar üretebilir. Kötü belirtilen analiz önyargı, el ile görüntü eşik ve segmentasyon tarafından üretilen gibi ortaya çıkarabilir.
Uygun fiyatta ve işlem hacmi tekrarlanabilirlik arzu edilir. Bir uygun fiyatlı, yüksek üretilen iş yöntemi daha sık parçacık ölçümü, parçacıklar binlerce içeren çok sayıda resim üreten etkinleştirebilirsiniz. Ucuz reaktifler, ortak diseksiyon mikroskop ve serbestçe kullanılabilir açık kaynak analiz yazılımı kullanan bir yöntem tekrarlanabilir, erişilebilir, tekrarlanabilir ve kısmen otomatik deneysel sonuçlar sağlar. Ayrıca, böyle bir yöntem ürün-ebilmek var olmak iyi biçimlendirilmiş, iyi tanımlanmış ve veri analiz yazılımı, içinde laboratuar analizleri ve veri paylaşımı labs arasında hareket hızı tarafından kolayca anlaşılır.
Biz böyle bir ürün üretmek için gereken adımları ayrıntılı olarak bildiren bir iletişim kuralı mevcut de dahil olmak üzere: örnekleme, örnek hazırlama ve İmmobilizasyon agar, dijital resim alma, dijital görüntü analizi ve deneme özel şekil nesilden örnekleri çözümleme sonuçları. Ayrıca, bu protokolü destekleyen bir açık kaynak veri analizi potansiyel dahil ettik.
Introduction
Bu yöntemin amacı Biyoreaktörler, özellikle de aktif çamur flocs ve aerobik granül1 içeren parçacıklar boyutu ve şekli dağılımları belirlemek için iyi tanımlanmış, tekrarlanabilir ve kısmen otomatik bir yöntem sağlamaktır , 2. Bu yöntem arkasındaki mantığı vardı uygun fiyatta, basitlik, üretilen işi artırmak için ve varolan şirket içi iletişim kuralları3,4, tekrarlanabilirlik kolaylığı diğerleri için parçacık ölçümü ve paylaşımını kolaylaştırmak ve veri karşılaştırma.
Partikül ölçüm analiz - iki geniş kategoriye böyle nitelikleri ışık saçılma5olarak kullanarak doğrudan görüntüleme ve çıkarımsal yöntemleri vardır. Çıkarımsal yöntemleri otomatikleştirilebilir ve büyük üretilen iş sahip olsa da, pahalı cihazıdır. Çıkarımsal yöntemleri doğru bir parçacık6eşdeğer boyutunu belirlemek iken, buna ek olarak, onlar detaylı şekli bilgi7vermeyin.
Şekil verileri gereksinimini nedeniyle üzerinde doğrudan görüntüleme bizim Yöntem dayalı olması. Bazı yüksek üretilen iş görüntüleme yöntemleri var iken, onlar geleneksel olarak pahalı ticari donanım veya özel inşa edilmiş çözümler8,9gerekli. Bizim yöntemi yaygın, uygun donanım ve yazılım her ne kadar bir azalma işlem hacmi, acı birçok analizleri10için gerekli en az çok daha fazla parçacık görüntüler üretir istihdam için geliştirilmiştir.
Varolan iletişim kuralları önemli örnekleme ve görüntü alma adımları belirtemezsiniz. Diğer iletişim kurallarını (örneğin geçici eşik11) öznel önyargı tanıtmak adımları el ile belirtebilirsiniz. Serbestçe kullanılabilir analiz yazılımı ile birlikte örnekleme, immobilizasyon ve görüntü alma adımları belirtir iyi tanımlanmış bir yöntem laboratuvar içinde görüntü analizi ve labs arasında karşılaştırmalar artıracaktır. Bu iletişim kuralı ana amacı bir iş akışı ve tekrarlanabilir sonuçlar için aynı örnek için farklı Labs gitmelidir araçları sağlamaktır.
Görüntü analiz işlemi normalleştirme dışında bu boru hattı tarafından üretilen veri iyi tanımlanmış, iyi biçimlendirilmiş dosya12 kullanıma uygun deneme hareket hızı popüler veri analiz paketleri13,14tarafından kaydedilir (örneğin, özel şekil oluşturma) belirli analizleri ve kolaylaştırıcı veri labs arasında paylaşımı.
Bu iletişim kuralı özellikle parçacık şekil verileri gerektirir, çıkarımsal yöntemleri erişimi değil, kendi görüntü analiz boru hattı geliştirmek ve onların veri kolayca başkalarıyla paylaşmak istediğiniz istiyor musunuz araştırmacılar için önerilen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. toplamak için parçacık analiz örnekleri
- İstatistiksel analiz10 için yeterli parçacıklar üretecek belirli reaktörler için numune hacmi belirlemek (> 500) parçacık örtüşme kaçınırken.
- Bir dizi karışık içki örnek başına 0,5-2 mL 250 ve 5000 mg/l arasında karışık içki askıya katılar (ÖZLEDİN) ile aktif çamur örnekleri için yeterli olduğunu varsayalım
- Aksi takdirde, 0.5, 2 ve 5 mL örnek (adım 1.2 2.7 aracılığıyla) de kullanarak üç test agar tabak hazırlamak.
- Görsel olarak tahmin etmek hangi (varsa) örnek birimleri en iyi 1.1. adımda listelenen ölçütlere uyan.
- Parçacıklar hala 0.5 mL örnek için üst üste gelirse, eklenen bir 0.5, 1 ve 2 mL için 0.5 mL örnek adım önce 2.1 seyreltilmiş gerekir belirlerken fosfat tamponlu tuz ile seyreltilmiş üç 0.5 mL örnek ile 1.1.2 ve 1.1.3 adımları yineleyin.
Not: Adımları 1.1 − 1.1.4 yalnızca bir kez deneme gerçekleştirilmesi veya sonraki ölçümler artık listelenen ölçütlere uyan öyle ki değişim reaktör içindekiler içinde 1.1 adım.
- Temsil edici bir örnek reaktör iyi karışık bir bölümünden kapma ~ 40 mL kabı veya 50 mL santrifüj tüpü yavaşça karıştırma ve hemen iyi karışık kapmak kararlı örnek hacmi 15 mL santrifüj tüpüne dökme tarafından elde etmek. Örnek, gerekli, adım 1.1.4 tarafından belirlenen sulandırmak.
Not: Burada protokol duraklatılmış ve örnek soğutma altında (4 ° C) 48 saate kadar süreyle saklanabilir. Örnek dondurma değil.
Dikkat: ortak koruma medya (örneğin, formaldehit/formamide) uygun değildir. Açık konteyner ile birlikte plaka geniş yüzey alanı ısı ışık kaynağı ve potansiyel olarak kötü havalandırılan mikroskobu kurulum görüntü kalitesinde küçük kazanmak için gereksiz yere tehlikeli koşullar üretmek.
2. ağar kaplamalar lekeli, immobilize parçacıkların hazırlayın
- %1 (w/v) metilen mavisi 5 µL her örneğe Ekle sonra kap ve karıştırmak için 3 en azından zamanlarda yavaşça tersine çevirin. Ama 30 dakika oda sıcaklığında en az 5 için leke örnekleri sağlar.
- Yaklaşık 10 mL % 7,5 (w/v) agar deiyonize su örnek başına hazırlayın.
Not: Agar vaktinden önce üretilen ve süresiz olarak sterilize depolanan. Özel yerine olabilir, ama önemli ölçüde görüntüleri iyileştirmez. - Bir mikrodalga veya su banyosu kullanarak agar eritin ve kullanmadan önce biraz soğumasını bekleyin. Agar tamamen erimiş ve kolayca dökülen olun. Ağar, katı globüller farklı, kalitesiz görüntüleri üreten leke.
- Santrifüj tüpü 6.5 ve 9 mL arasında toplam tüp ses getirmek yeterli erimiş % 7,5 (w/v) agar aktarın.
- Santrifüj tüpleri recap ve karıştırmak için en az 3 kez yavaşça tersine çevirin.
- Kendini uzak veya bir başlıklı kap işaret ederken, kapağı açın. Tüp içeriği nazikçe tam, pürüzsüz bir kaplama ve parçacıkların bir görsel olarak tekdüze dağılım elde etmek için çanak sallanan süre bir 100 mm plastik Petri kabına dökün.
Dikkat: Agar sıcaktan tüp içinde hafif bir aşırı basınç üretebilir. Bu kez bir sesli TIS üretir ve küçük damlacıklar sıcak agar sınırdışı potansiyeline sahiptir. - En az 5 agar katılaşır kadar dakika için oda sıcaklığında soğumaya plakaları izin.
Not: Protokol burada duraklatılmış. Kaplama deposu ters ve soğutma (4 ° C) altında 48 saat için (örneğin, sızdırmazlık bir plastik torba veya parafin film ile) kapalı.
3. bir stereomicroscope ve dijital kamera kullanarak parçacık görüntüleri elde
- Ele geçen plaka yüzünü bir stereomicroscope mikroskop sahne alanı üzerine 10 x 20 x büyütme yeteneğine yerleştirin. Örnek aşağıdan örneğin bir LED ışığı stand veya hafif plaka kullanarak bile, diffüz ışık ile aydınlatmak.
- Görüntü yakalama yazılımı açın, mikroskop ışık yolunu fotoğrafiçin ayarlandığından emin olun ve uygun fotoğraf makinesi kamera listeden tıklatın.
- Mikroskop büyük, iyi tanımlanmış kenarları ile odak düzlemi yazılımda birden çok parçacık görünmesini sağlayacak şekilde ayarlayın. 10-20 x büyütme nispeten derin odak düzlemi koruyarak parçacıklar ölçmek için kullanın.
- Geçici olarak agar plaka çıkarın ve sahne alanı'nda mikrometre yerleştirin. Mezuniyet mikrometre üzerinde görüntü yakalama yazılımı keskin odaklı görününceye kadar iyi odağı ayarlayın.
- Daha önce kalibre, piksel mikro oranı geçerli büyütmeyi için kayıt.
- Tıklatarak zoom % 100'e ayarlamak Zoom > gerçek boyut ve seçin seçenekleri > Ayarla'ya ana görüntüleme çerçevesinin mikrometre uzun ekseni boyunca kırmızı kalibrasyon barda 0 ve 200 µm mezuniyet merkezli dikey çubuklar ile hizalayın. Ayarla iletişim kutusunda, geçerli büyütme düzeyi ve 200 µm gerçek uzunluğunu girin.
- Eğer zaten menü çubuğundan seçin büyütme kalibre edilmiş ve geçerli büyütmeyi seçin düzey ve kalibrasyon onaylayın.
- Seçin ölçümleri > çizgi > rasgele hattı. 0 mezuniyet ve mikrometre uzun ekseninin kesişimi'ı tıklatın. 200 ve uzun eksenin kesiştiği üzerinde tekrar'ı tıklatın. A doğru yaklaşık 200 görüntü birimi ayarlaması µm. Sil satırı tıklatmak acil silme, ve Evet tuşlarına basarak onay kutusunu.
Not: fotoğraf makinesi ve kalibrasyon seçmek için verilen talimatları bu donanım için kullanılan yazılım özgüdür. Benzer işlevleri diğer görüntüleme yazılımı kullanılabilir olması gerekir. Mikron oranı doğru parçacık boyutu ölçüm için görüntünün piksel belirlemek için hedeftir.
- Seçin ölçümleri > çizgi > rasgele hattı. 0 mezuniyet ve mikrometre uzun ekseninin kesişimi'ı tıklatın. 200 ve uzun eksenin kesiştiği üzerinde tekrar'ı tıklatın. A doğru yaklaşık 200 görüntü birimi ayarlaması µm. Sil satırı tıklatmak acil silme, ve Evet tuşlarına basarak onay kutusunu.
- Agar plaka değiştirmek ve düşsel bilgisayar yazılımı içinde en fazla ayrıntı elde etmek için iyi odağı ayarlayın.
- En yüksek görüntü kalitesi elde görüntüleme yazılımı ayarlayın.
- Bit derinliği girebilir, Kamera kenar çubuğu Bit derinliği panelinde radyo düğmesini seçerek en yüksek değere artırın. Yazılım Kamera kenar çubuğu Renk/gri panelinde uygun radyo düğmesini seçerek gri tonlamalı görüntüler elde etmek için ayarlayın.
- Herhangi bir açık kenar çubuğu panelleri pozlama ve çubuk grafik arasında daraltır. Kazanç 1.0 için azaltmak ve görüntüleme çerçevesinin içinde ve histogram histogram kutusunu bir ucunu tarafından kırpılır değil bir dağıtım yerleşene kadar net bir görüntü belirene kadar artırmak.
- Çubuk grafik üzerinde önlemek için ve pozlama ayarlayın. Kamera kenar çubuğu histogram panelinde histogram olan en alt değerler dışında sadece sol sınır ve en yüksek değerleri dışında sadece sağ sınırını kaydırın.
- Görüntü meta verilerde büyütme bilgiler dahil olmak üzere, kullanarak bir sıkıştırılmamış TIFF, görüntü kaydetmek Dosya > Farklı Kaydet iletişim kutusunda, TIFF biçimini seçerek ve ayar bilgisi ile kaydet kutusunu sağlamak kontrol edilir.
Not: kayma kalibrasyon, içeren görüntü meta verileri kaydetme edinme programlar arasında değişebilir. FIJI15, temel yazılım ardışık düzeni tarafından kullanılan en yaygın değişik anlar. Kaydetmek için önemli piksel yükseklik, genişlik ve ilişkili tutarlarını bilgilerdir. - Her iki Mobil Sahne'nin kullanarak veya el ile taşıma plaka kendisi, diğerleri arasında soldan sağa ve sağdan sola bir hamle plaka bir yolunu izleyerek önceki görüntüleri örtüşmediğinden başka bir alanını seçin; olarak da bilinen bir 'çim biçme arama deseni'. Yeterli görüntüleri daha iyidir en azından 500 görsel olarak tahmini parçacıklar, yakalamak için üretilen kadar 3,6 adımı yineleyin.
Not: Alternatif desenler (e.g., dairesel, rastgele) kabul edilebilir ama rapor edilmelidir. İçine bir mozaik dijital dikiş üretir ile kombinasyon için birden çok örtüşen görüntüleri alma aşağı akım işleme ve dikiş gelen eserler büyük ölçüde engel bir elde edilen dosya boyutu tanıttı ve şu anda tavsiye edilmez. - Görüntü analizi kadar potansiyel izleme görüntüleme için sonra plakaları korur. Son görüntüleme sonra biyolojik atıklar için uygun şekilde atın.
4. ölçmek ve parçacık siluetleri analiz
- Gerekli görüntü analiz yazılım paketleri yüklemek
- FIJI yüklemek (Ulusal Sağlık Enstitüleri'nın ImageJ v1.52e adresindeki talimatlarý genişletilmiş bir sürümü: https://imagej.net/Fiji/Downloads
- Şu sayfadaki talimatları takip ederek önceden yüklü değilse, yüklemek git: https://git-scm.com/downloads
- Parçacık analiz kodu üzerinden git depo16klonlama tarafından elde.
- Komut satırına yazarak kodunun en son sürümünü almak:
Git klon https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git- README.md metin dosyasındaki yönergeleri klonlanmış depo üst düzey dizinde bulunan analiz kod aşağıda yükleyin.
Not: otomatik olarak kodunun en son sürümünü alır gibi git tercih edilen, kullanmaktır. Git yoksa, kod yayın sayfasında bir ZIP dosyası olarak indirmek mümkündür: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
- README.md metin dosyasındaki yönergeleri klonlanmış depo üst düzey dizinde bulunan analiz kod aşağıda yükleyin.
- Komut satırına yazarak kodunun en son sürümünü almak:
- İsteğe bağlı parametreler ile birlikte işlenmesi için dizinleri listeleyen bir metin dosyasına düzenleyin. Parametreler ve örneklerle listesi için örnekler/analiz alt bakın.
- Analiz komut satırına yazarak çalıştırın:
< FIJI-yol > \ImageJ-win64.exe - konsol - makro SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < paramsfile >
Burada < FIJI-> ImageJ-win64.exe bulunduğu dizine ve < paramsfile > analiz kurulumunu açıklayan metin dosyasının konumunu yoludur
Not: Çalıştırılabilir dosyanın adını, işletim sistemi FIJI bağlı olarak yüklü ise farklı olabilir. Görüntülerin boyutunu ve numarası, bağlı olarak çözümleme saat için birkaç dakika sürebilir ve otomatik olarak çalışır. - Kalite kontrol denetimi yap
- Belirtilen çıkış dizinini bindirme alt dizininde bulunan kalite kontrol dosyalarını inceleyin. Sahte, cevapsız ve kötü yakalanan parçacıkların, tüm arka plan eşleşmiyor gölgeli anahatlar olarak belirgin görüntülerle unutmayın. Şekil 3 ' e böyle örnekler için başvurun. Parçacık veri deneme özel analiz şekil üretimi için hazırsınız.
- Tüm plakaları veya bireysel parçacıkların kaydetti dosyaları ve/veya parçacık kimlikleri göz ardı analiz kodu belirterek reddetmek. Örnekler/sansür ilgili R ve Python kodu depodaki bakın.
- Deney belirli rakamlar her görüntünün depolandığı için düzenli12 virgülle ayrılmış metin dosyasında belirtilen çıkış dizininin sonuçları alt görüntü analiz sonuçları kullanarak oluşturun. Sonuç dosyalarını okumak nasıl örnekleri için örnekler/resimler/R ve örnekler/resimler/Python alt dizinler bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oluşturulan dosyalar
Şekil 1 ' de gösterilen süreci analiz resim başına iki dosya üretecek. Bir virgülle ayrılmış nerede her satır için bireysel bir parçacık karşılık gelir ve sütun alanı, Döngüsellik ve sağlamlık gibi çeşitli partikül ölçümleri tanımlamak değer (CSV) metin dosyası ve ImageJ el ile17' tanımlanmış ilk dosyadır. Örnek CSV dosyaları olarak ek bilgiler ve örnekler/veri dizini içinde yer almaktadır.
Şekil 1: Protokolü'nün dört önemli adımları açıklayan grafik iş akışı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
İkinci dosyanın kalite kontrol (QC) içinde kullanılmak için tasarlandı ve GIF resmi dosya hangi bindirmeleri özgün tespit görüntüsüyle yarı opak bölgeleri temsil eden parçacıkları, olduğu gibi Şekil 2. Kalitesi segmentasyon ve parçacık kimlik sonra hızlı bir şekilde el ile değerlendirilebilir. Herhangi bir parçacık eşik Yöntem mükemmel18olsa da, Şekil 2 kabul edilebilir bir sonuç bir örnek olarak sunulur. Kalitesiz görüntüleri tekrar girmesi veya yeterli veri kullanılabiliyorsa, sadece daha fazla işleme kaldırıldı.
Resim 2: Görüntü analiz boru hattı tarafından oluşturulan bir kalite kontrol (QC) GIF örneği. Ana görüntü 15 x büyütme. Alıntı dijital olarak bireysel parçacıkların görüntü tanımlama numaraları göstermeye büyütüldüğünden kullanılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
QC görüntüleri değerlendirirken, üç ortak hataları bulundu vardır:
1. doğru parçacık sınırları uymak için başarısız
2. başarısızlık parçacıklar tanımlamak için
3. yapı eklenmesi ya da nedeniyle: sigara-parçacık bileşenler (örneğin, kabarcıklar) veya eşik hataları
Bu hatalar örnekleri Şekil 3' te gösterilmiştir. Zavallı parçacık sınır kimlik ve segmentasyon kez parçacıklar arasında aşırı ölmek, bir sonucudur 3a rakamgörüldüğü gibi. Zavallı aydınlatma parçacıklar (Şekil 3b, mavi katı Daire) ve yapay doku yanlış parçacıklar (Şekil 3b, kırmızı kesikli Daire) belirlemek için her iki başarısızlığa yol açabilir. Sigara-parçacık önemli, kabarcıklar, tek hücreli, mantar ve metazoans, gibi gibi Şekil 3 c olarak tardigrade da spuriously tanecik olarak tespit edilebilir.
Şekil 3: Ortak hata QC çözümleme sırasında algılandı. (bir) zavallı parçacık sınır algılama. (b) sahte parçacıklar (kırmızı kesikli elips) ve unsegmented parçacıklar (mavi katı elips). (c) yabancı sigara-parçacık nesne. Büyütme 15 x. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tüm görüntü reddetmek en kolay yoldur. Ancak, QC görüntü parçacık tanımlayıcı kullanmak mümkündür (Şekil 2, iç metin) bireysel parçacıkların reddetmek için. Aksi takdirde yararlı bir görüntü (örneğin sigara-parçacıklar dahil) konularında bir avuç olduğunda bu yaklaşım özellikle kullanışlıdır Şekil 3 c. Örnekler yapmanın çok github repository örnekler/sansür dizininde tekrarlanabilir ve rapor edilebilir bir şekilde yer almaktadır.
Ne zaman küçük bir minimum çap belirtilir (< 10 piksel), görüntü paraziti spuriously tanımlanan bir parçacık. Bu gibi durumlarda görüntü hala olmak kabul edilebilir daha da aşağı akım Analizi kaldırır olduğunda onların varlığı. Ne zaman parçacıkları daha az ~ 200 piksel19oluşur bir kılavuz olarak, Şekil verileri şüphe ile değerlendirilmelidir.
Şekil oluşturma
Görüntü çözümlemesinden CSV dosyaları derli toplu12 ve kolay birleştirilir ve araştırmacı tercih edilen yazılım paketinde analiz (örneğin pandalar20 suçlayacaktır21 ' Python veya dplyr22 ggplot2 ile ile23 r). Ancak, gereken tam şekil türü mutlaka araştırma soruları ve sonuç ile değişir. Olası bir rakam örneği (Şekil 4) eklenmiştir ve CSV dosyaları oluşturmak için karşılık gelen kod github16tarihinde kullanılabilir.
Şekil 4: CSV veri görüntü boru hattı tarafından üretilen oluşturulan deneme özel şekil örneği. Bu örnekte, zaman içinde iki deneysel reaktör arasında parçacık dağılımları görüntülenir ve araştırmacı tarafından kaydetti nitel meta veriler ile birlikte. Örnekler/resimler/R üreten kod ve veriler için bkz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her ne kadar görüntü analiz sistemi oldukça sağlamdır ve QC adımlar yoksul görüntüler kaldırılır sağlamak için alınır, örnekleme, plaka hazırlık ve resim alma belirli konulara uygun dikkat hem verilerin doğruluğunu ve oranı artırabilir QC geçen görüntüler.
Örnekleme konsantrasyonu
Temsil edici bir örnek alınan, en önemli adım yeterli parçacıklar o kadar konsantre partiküller üst üste iken temsilcisi9 ve verimli analiz için mevcut olduğundan emin olmak için olduğunu varsayarsak.
Bu karışık içki yaklaşık 0,5-2 mL bir yelpazede Toplam askıda katı madde üzerinde denk ama deneme özel belirlenmesi gerekli olabilir. Aşırı konsantre örnekleri aşırı - seyreltilmiş, ve uygun parçacık konsantrasyonu Şekil 5 başvuru olarak gösterilir. Boyama parçacık konsantrasyon tarafından da etkilenir. Altı seyreltme parçacıklar en uygun eşik için yeterli kontrast üretmek olmayabilir iken aşırı sulanma aşırı lekeli, bulanık parçacıklar neden olabilir.
Şekil 5: Başvuru çok yoğun, kabul edilebilir ve aşırı seyreltilmiş gösteren parçacık konsantrasyonu görüntüleri. Büyütme 15 x. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Boya konsantrasyonu
Leke için örnek eklendi miktarı çok önemlidir ve doğru miktarda sludges arasında değişiklik gösterebilir. %1 (w/v) metilen mavisi 0,5-2 mL örnek başına yaklaşık 5 µL 'kanama' ve parçacığın şekil engellemeyecek neden olmadan eşik için yeterli kontrast sağlar.
İşte yok tek ideal konsantrasyonu; kontrast ve netlik arasında bir denge seçilmelidir. Şekil 6 bu tradeoff 5, 25 ve 50 µL % 1 metilen mavisi çamur 2 mL başına ile lekeli üç örnekte gösterilmektedir. Bu tradeoff tartım zaman zaman zaman kötü karşıt parçacık (Şekil 6a) kötü çözülebilir BLOB'lar (Şekil 6 c) tercih edilir.
Şekil 6: Artan leke konsantrasyon parçacık karşıtlığı artırır, ancak de gözlenen sınır bozan. Büyütme 15 x. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Plaka depolama
İmmobilizasyon sonra plakalar soğutma (4 ° C) en az 3 gün altında saklanır. Bu sırasında bu büyüme ve boya difüzyon kirletici oluşacağını düşüktür muhafazakar bir dönemdir. Aşağıda açıklanan sorunlardan herhangi biri değil göstermek plakaları 3 gün sonra hala görüntüsü. Çok uzun süre saklı varolan parçacıklar büyümeye ve olacaktır devam edebilir şekil 7aiçinde görülen renk leke, sıcaklığını koruyarak diğer parçacıklar odak düzlemi içinde görünür. Mantar sporları gibi yüzey kirletici maddeleri de depolama uzun süre sonra büyümeye. Bunlar genellikle leke rengi oluşturan almayacağız ve farklı bir odak düzlemi içinde şekil 7biçinde görüldüğü gibi görünür. Bazı durumlarda, belirsiz büyüme veya difüzyon leke oluştu olup olmadığını, gibi 7b rakam dibinde ve Şekil 7 cortasına öyle. Nedeni ne olursa olsun, bu gibi noktaları plaka yararlı ömrü yaşlanmış belirtmek
Şekil 7: Bir tabak yararlı ömrünü depolanan sinyal aşırı büyüme gösteren referans görüntüler. Büyütme 15 x. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Plaka hazırlık
Fiziksel olarak ağar kaplamalar - aşırı kalın agar ve aşırı dönen hazırlanması ile ilgili iki sorunları vardır. Birinci durumda (Şekil 8) partikülleri odak parçacıklar çoğunluğu ile görüntüleri elde etmek üzere çeşitli derinliklerde askıya olmak.
Şekil 8: Agar aşırı miktarda kullanarak bir örnek daha bulanık parçacıklar kaynaklanan odak düzlemi üretecek. Büyütme 15 x. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
İkinci durumda, girdap gibi parçacıklar (Þekil 9a), bir olmayan tekdüze dağılım plaka farklı bölümlerden sonuçları kutuplama üretir (Şekil 9b, c. Genel olarak, en fazla 7 mL agar 100 mm Petri kabına karşılamak için gereklidir ve sadece nazik el hareketleri eşit çanak karşılamak için gerekli.
Şekil 9: Aşırı güçlü plaka hazırlık sırasında dönen plaka daha büyük (b) ve küçük (c) parçacık dağıtımları doğru bölümlerini kutuplama üniform olmayan parçacık dağılımları (bir), görünür. Plaka 100 mm çap, 15 x filmler büyütülmüş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Mikroskobik görüntüleme
Kalitesini etkileyen iki büyük resim alma sorunları vardır. İlk konu parçacıklar çoğunluğu odak düzlem olduğunu garanti etmektedir. Böyle kaba odaklanmak için küçük ayarlamalar birçok parçacıklar biraz yanlış partikül ölçüm tanıtımı odak dışında olacak bile düşük büyütme oranında, birçok aktif çamur parçacıklar boyutudur. Resim yok % 100 mükemmel odaklanmış parçacıklar içerir; Şekil 8 ve Şekil 5b yoksul ve kabul edilebilir odak ilgili örnekleridir.
Maruz kalma seviyeleri ikinci önemli sorun oluşturmaktadır. Kötü görüntüleri sonuç veri kaybı ve zavallı segmentasyon11maruz. Ayrıca, yüksek kontrast boya, dar bir çubuk grafik, verileri etkili dinamik aralığını azaltarak üretebilir. Histogram üst ve alt sınırları zavallı etkilenme olasılığını ortadan kaldırmak hem de dinamik aralığı artırmak için bir görüntü yakalama önce ayarlanabilir. Örnekler, üzerinde altında ve kabul edilebilir poz aşağıda Şekil 10' dahil edilir.
Şekil 10: Referans gösteren zavallı ve kabul edilebilir bir görüntü pozlama görüntüleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Bu yöntemin avantajları tüm süreci kapsayan belirli ölçütler sağlar. Ayrıca, biz laboratuvar içinde analiz kolaylaştırılması ve laboratuvar arasında karşılaştırılabilir veri teşvik yazılım ardışık düzeni sağladı. Önemli Bu yöntem tüm parçacıklar odaklı tutmak için gereksinimin yararını parçacıklar küçük küçük boyutlu - özellikle ipliksi yapılar için sınırlama yüksek büyütme engel olduğunu kısıtlamasıdır. Bu yöntemin gelecekte yönde gelişmiş görüntü analizi teknikleri (özellikle gürültü azaltma24,25, yüksek dinamik Aralık görüntüleme, Odak yığma26,27ve makine-öğrenme dahil olabilir Yardımlı eşik, segmentasyon ve sınıflandırma28. Büyük görüntü edinme iyileştirme yazılım mekanik aşamaları8 kontrol etmek ve 'Bütün tabağı' mozaik arşiv üretmek dahil olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Ulusal Bilim Vakfı CBET 1336544 bir hibe tarafından desteklenmiştir.
FIJI, R ve Python logoları ile uygun aşağıdaki ticari marka politikaları ile kullanılır:
Python: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ , başı olarak, listelenen CC-BY-SA 4.0 Lisans: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
Fiji: https://imagej.net/Licensing
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Bleach solution | Chlorox | 31009 | For workspace disinfection. |
| 15 mL centrifuge tube with cap | Corning | 430790 | Per sample. |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Corning | 4980-50 | Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing |
| 500 mL Kimax Bottle | Kimble-Chase | 14395-50 | Or otherwise sufficient for agar handling |
| Agar | BD | 214010 | Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample. |
| Data analysis software | N/A | N/A | R or Python are suggested |
| Deionized water | N/A | N/A | Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine. |
| Desktop computer | N/A | N/A | Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient. |
| External hard drive | Seagate | STEB5000100 | Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested. |
| FIJI | NIH | version 1.51d | Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GIT | Open Source | version 2.19.1 or later | Available at: https://git-scm.com/ |
| Image capture software | ToupView | version 3.7.5177 | Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data. |
| Mechanical (X/Y) Stage | OMAX | A512 | Not fully required, but greatly aids image acquisition. |
| Methylene blue | Fisher | M291-100 | Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample. |
| Microscope camera | OMAX | A35140U | Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested. |
| Optical Stage Micrometer | OMAX | A36CALM1 | Or otherwise sufficient for spatial calibration. |
| Petri dish, 100 mm | Fisher | FB0875712 | 1 per sample. |
| PPE | N/A | N/A | Standard lab coat, gloves, and eyewear. |
| Sparmoria macro | NCSU | version 0.2.1 | Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis |
| Stereo/dissecting microscope | Nikon | SMZ-2T | Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD. |
References
- Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. Aerobic granulation: Advances and challenges. Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).
- Adav, S. S., Lee, D. -J., Show, K. -Y., Tay, J. -H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).
- Williams, J. C. Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University. , Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162 (2004).
- Moghadam, B. K. Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation. , Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761 (2012).
- Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor. Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).
- Kelly, R. N., et al. Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems. AAPS Pharm SciTech. 7 (3), Available from: http://www.aapspharmscitech.org E1-E14 (2006).
- Walisko, R., et al. The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).
- Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy. PLoS ONE. 9 (2), e88977 (2014).
- Dias, P. A., et al. Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images. BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64 (2016).
- Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. III Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge. Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).
- Cromey, D. W. Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images. Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).
- Wickham, H. Tidy Data. Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , Available from: http://www.r-project.org (2017).
- van Rossum, G. Python tutorial. , Amsterdam. CS-R9526 (1995).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. FIJI: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Weaver, J. E. SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis. , Available from: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis (2018).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. , National Institute of Health. (2012).
- Sezgin, M., Sankur, B. Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation. Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).
- Kröner, S., Doménech Carbó, M. T. Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images. Powder Technology. 245, 297-313 (2013).
- McKinney, W. Data Structures for Statistical Computing in Python. Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).
- Waskom, M., et al. seaborn: v0.5.0 (November 2014). , (2014).
- Wickham, H. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html (2016).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. Available from: http://ggplot2.org (2009).
- Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. Digital Photography: A Primer for Pathologists. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).
- Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy. Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).
- Eastwood, B. S., Childs, E. C. Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy. Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).
- Bell, A. A., Brauers, J., Kaftan, J. N., Meyer-Ebrecht, D., Aach, T. High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology). 3 (1), Available from: https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/ 170-184 (2009).
- Jain, V., et al. Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks. 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).
