Summary
Denna artikel ger en metod för att isolera ren embryonala vävnader från vaktel och kyckling embryon som kan kombineras för att bilda ex vivo chimära organ.
Abstract
Förmåga att isolera embryonala vävnader var ett viktigt steg för att fastställa vaktel-kyckling chimera systemet, vilket i sin tur har lämnat obestritt bidrag till avtäckningen nyckelprocesser i utvecklingsbiologi.
Är häri beskrivs en optimerad metod för att isolera embryonala vävnader från vaktel och höns av mikrokirurgi och enzymatisk nedbrytning samtidigt bevara sin biologiska egenskaper. Efter isolering, vävnader från båda arterna är associerade på in vitro-organotypic test för 48 h. vaktel och kyckling vävnader kan diskrimineras av olika nukleära funktioner och molekylära markörer så att studiet av den cellulära överhörning mellan heterospecific föreningen i vävnader. Detta tillvägagångssätt är därför ett användbart verktyg för att studera komplexa vävnad interaktioner i utvecklingsprocesser med högdynamiska rumsliga modifieringar, såsom de som inträffat under faryngala morfogenes och bildandet av framtarmen endoderm-derived organ. Detta experimentella tillvägagångssätt utvecklades först för att studera de epiteliala-mesenkymala interaktionerna tidigt skede-av tymus bildandet. I detta, den endoderm-derived blivande thymic rudiment och mesoderm-derived mesenchyme, var isolerade från vaktel och kyckling embryon, respektive.
De omkringliggande vävnaderna förmåga att generera organ kan testas ytterligare genom ympning dem på det chorioallantoic membranet (CAM) av en kyckling embryo. CAM ger näringsämnen och gas utbyte till explanterad vävnader. Efter 10 dagars ovo utveckling, kan chimär organ analyseras i de skördade bladsticklingar av konventionella morfologiska metoder. Detta förfarande kan också studera vävnadsspecifika bidrag under organ kan bildas, från dess ursprungliga utveckling (in vitro-utveckling) till slutskedet av organogenesen (i ovo utveckling).
Slutligen, förbättrad isolering metoden också ger tredimensionellt (3D) bevarade embryonala vävnader, som också kan användas för högupplösta topografisk analys av vävnadsspecifika-genuttryck mönster.
Introduction
I början av 1970, har en elegant vaktel-kyckling chimera-systemet utvecklats av Le Douarin, öppna nya vägar för att förstå rollen av cellmigration och cellulära interaktioner under utveckling1,2. Modellen som utformades på förutsättningen att cellen utbyte mellan de två arterna avsevärt inte skulle störa embryogenes, bekräftade senare när används för att studera många utvecklingsprocesser, inklusive bildandet av nervsystemet och den hematopoetiska system1. Tar den senare som ett exempel, de cykliska vågorna av hematopoetiska progenitorceller kolonisera den thymic epitelial rudiment observerades först använder vaktel-kyckling chimera system3. För det var tymus, endoderm av de tredje och fjärde faryngala påsarna (3/4PP), blivande territorium mekaniskt och enzymatiskt isolerad från vaktel (q) embryon på 15 till 30 - somite Stadium [embryonala dag (E) 1,5-E2.5]. Dessa stadier motsvarar kyckling hamburgare och Hamilton4 (HH) - arrangerar 12-17. Förfaranden som isolering började med användning av trypsin att enzymatiskt sära endoderm från den bifogade mesenchyme. Isolerade endoderm var ympade in i somatopleura regionen av en värd kyckling (c) embryo på E3-E3.5 (HH-stadier 20-21). Detta heterologa mesenchyme ansågs ”tillåtande” thymic epitel utvecklingen bidrar också till orgel bildandet3. Efteråt, infiltrerat successiva vågor av kyckling värd blodburna stamceller vaktel givare thymic epitelial motstyckena bidrar till brässen bildas i värd embryo3.
Mer nyligen, en modifierad version av detta synsätt var också visat sig vara viktigt för att studera epitelial-mesenkymala interaktioner tidigt skede-thymus bildandet5. I detta avseende var vävnaderna som är inblandade i bildandet av ektopisk bräss i chimära embryon3 isolerad, båda från givare och värd embryon, och tillhörande ex vivo. Ett förbättrat protokoll användes för att isolera vaktel 3/4PP endoderm (E2.5-E3) och kyckling somatopleura mesoderm (E2.5-E3). Kort, embryonala vävnader var isolerade av mikrokirurgi och omfattas av in vitro-pankreatin matsmältningen. Dessutom var villkoren för enzymatisk nedbrytning, temperatur och tid för inkubation optimerad enligt vävnadstyp och utvecklingsstadier (tabell 1).
Nästa, isolerade vävnader var förenade i en organotypic i vitro system för 48 h, som tidigare rapporterats5,6. In vitro-föreningen av vävnader härmar de lokala cellulära interaktioner i embryot, övervinna vissa begränsningar av invivo manipulation. Detta system är särskilt användbart för att studera cellulära interaktioner i komplexa morfogena händelser, såsom utveckling av faryngeal apparaten.
Varje vävnad i thymus histogenesis bidrag, liksom möjligheten för föreningen heterospecific att generera en bräss kan vara ytterligare utforskas med hjälp av CAM metodik, tidigare detaljerade5,7,8. Kortfattat, var odlade vävnader ympade på CAM cE8 embryon och får utvecklas i ovo för 10 dagar. Sedan utvärderades bräss bildandet av Morfologisk analys i de skördade bladsticklingar. Som i den klassiska vaktel-kyckling studier3koloniserades vaktel thymic epitelet av hematopoetiska stamceller (HPCs) härrör från kyckling embryot, som senare visades att bidra till orgel utveckling9,10 . HPCs migrerade från embryot till ektopisk chimära tymus genom den högt vaskulariserad CAM5,7,8. Vaktel härledda thymic epitel kan identifieras genom immunhistokemi med artspecifika antikroppar (dvs. QCPN - MAb vaktel perinukleära), övervinna behovet vävnadsspecifika molekylära markörer.
Denna experimentella metod, tillåter som den tvåstegsstrategi som rapporterats i tidigare publikation8, moduleringen av signalvägar genom regelbunden administrering av farmakologiska agenter under in vitro- och ovo utveckling. Dessutom kan bladsticklingar skördas vid någon tidpunkt av de experiment8.
Slutligen, isolering protokollet här detaljerade tillåter bevarandet av de naturliga egenskaperna och 3D-arkitekturen av embryonala vävnader, särskilt användbart för detailing jordbaserad gen-uttryck mönster av embryonala territorier annars otillgängliga av konventionella metoder. Dessutom kan transkriptom analys metoder, inklusive RNA-seq eller microarrays, också tillämpas i isolerade vävnader utan att genetiska markörer samtidigt som den ger en vävnadsspecifika hög genomströmning ”omics” analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla dessa experiment följa djurens vård och etiska riktlinjer vid Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. befruktade vaktel och kyckling ägg inkubation
- Plats befruktade ägg av japansk vaktel (Coturnix coturnix japonica) i en 38 ° C befuktade inkubator för 3 dagar. Ruva äggen (ägg trubbiga änden) uppåt i luftkammaren.
Obs: Den befuktade miljön uppnås genom att placera en vattenbehållare längst ned i inkubatorn. - Inkubera befruktade ägg kyckling (Gallus gallus) i 2,5 dagar i en 38 ° C befuktade inkubator. Ruva äggen i horisontellt läge och markera ovansidan med en bit av träkol för att identifiera platsen för embryo.
Obs: Börja med 40 vaktelägg och 60 kyckling ägg vid fastställandet av detta experiment.
2. isolering av vaktel endoderm som innehåller den blivande domänen i thymic rudiment
Obs: Använd en horisontell LAF och steriliserade instrument och material för ägg manipulation förfaranden i sterila förhållanden.
- Ta bort embryonala regionen som innehåller en presumtiv territorium thymic rudiment, faryngala bågen regionen som innehåller 3rd och 4th valv (3/4PAR), som beskrev7,8.
- Fyll en stor borosilikatglas skål (100 x 50 mm, 100 cm3) med 60 mL kall fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Med hjälp av böjd sax, tryck och skär ett cirkulärt hål i skalet av en vaktel ägg som har inkuberats i 3 dagar. Gör hålet på motsatta sidan av ägget trubbiga och överföra äggulan (med embryot) i bunken med kall PBS.
- Ta bort embryot från äggulan genom att skära vitelline membranet externt till extraembryonala fartyg med böjd sax.
- Med hjälp av tunna pincett, överföring embryot till en liten skål (60 x 30 mm, 15 cm3) fylld med 10 mL kall PBS.
- Med en skimmer, flytta embryot till en 100 mm petriskål med en svart bas (se Tabell för material) innehållande 10 mL kall PBS och placera den under ett stereomikroskop.
- Dissekera den 3/4PAR, som tidigare beskrivits8.
- Aspirera de 3/4PAR och överföring till en glasskål tre fjärdedelar fylld med kall PBS med 2 mL steril Pasteur pipett.
- Isolera endoderm innehållande thymic rudiment (3/4PP endoderm) presumtiva territorium enzymatisk nedbrytning med pankreatin.
- Med hjälp av spateln och tunn pincett, överföring av 3/4PAR till en glasskål tre fjärdedelar fylld med kall pankreatin (8 mg/mL; 1:3 utspädning av 25 mg/mL med kall PBS).
- Inkubera i 1 h på is för enzymatisk nedbrytning.
Obs: Tiden för enzymatisk nedbrytning beror på scenen av utveckling (tabell 1). - Placera glas skålen under stereomikroskopet (40 x-60 x förstoring) att isolera endoderm från den 3/4PAR.
Obs: Håll alla ytor och lösningar kallt under proceduren. Ändra till en ny kall pankreatin lösning om det tar lång tid att dissekera vävnader (> 15 min). Som en belysning källa, använda LED-lampor som införlivas i stereomikroskopet eller optiska fibrer, med tanke på den begränsade värmebelastning. - För att isolera endoderm från omgivande vävnader, Använd två rostfria microscalpels i PIN-hållare.
Obs: Använd microscalpels med en diameter mellan 0,1 mm och 0,2 mm och nickel pin innehavare med en käke öppnandet diameter 0 mm till 1 mm.- Ta först bort neuralrörsdefekter och mesoderm bifogas den dorsala ytan av faryngeal endoderm.
- Med ryggsidan upp, noggrant lossa och ta bort mesenchyme mellan faryngala valven och exponera faryngala Prillorna. Utföra denna procedur på båda sidor av de 3/4PAR.
- Ta bort hjärtat röret och den mesenchyme som omger de främre påsarna.
- Med den ventrala Sidan upp, skär ektodermet 2nd och 3rd faryngala valv och ta försiktigt bort den mesenchyme kopplad till påsarna. Upprepa proceduren på andra sidan av de 3/4PAR. I detta skede bör det synas den sköldkörtel rudiment.
- Ta bort alla återstående mesenkymala celler bifogas faryngala endoderm med de två microscalpels.
- Göra ett tvärgående snitt mellan 2nd och 3rd PP, separera faryngala endoderm innehållande 3rd och 4th påsar från den främre delen av endoderm har den sköldkörtel rudiment och 2nd faryngala påse.
- Med hjälp av spateln och tunn pincett, överföring isolerade 3/4PP endoderm till en glasskål tre fjärdedelar fylld med 100% kallt fetalt bovint serum (FBS).
- Hålla glas skålen med isolerade vävnader på is under utarbetandet av in vitro-test. Alternativt, isolerade vävnader kan bevaras tredimensionellt och jordbaserad analyseras för gen-uttryck.
3. isolering av kyckling somatopleura mesoderm
Obs: Utföra ägg manipulation förfaranden i sterila förhållanden med hjälp av en horisontell LAF och steriliserade instrument och material.
- Ta bort embryonala territorium som innehåller somatopleura mesoderm i nivå med thoraxsegmenten 19-24 (ss19-24).
- Ta bort kyckling ägg från inkubatorn efter 2,5 dagars inkubation.
- Med böjd sax, öppna ett litet hål i skalet. Sätt en nål och aspirera 2 mL albumin med en 10 mL spruta för att sänka albumin volym inuti ägget och förebygga skador av embryot (som finns nedanför den Markera regionen skalet). Kassera de aspirerade albumin.
- Skär en rund hål (upp till två tredjedelar av den övre ytan) i regionen markerade i skalet med böjd sax.
- Skär vitelline membranet externt till embryoniskt fartyg medan du håller embryot med tunn pincett.
- Under ett stereomikroskop, placera embryot i en 100 mm petriskål med en svart bas innehållande 10 mL kall PBS.
Obs: Använd ett stereomikroskop från denna punkt fram för progressiva förstoring av microsurgery förfaranden. - Använd fyra tunna insekt stift för att hålla embryot till botten av plattan. Placera stiften i regionen embryoniskt bildar en fyrkantig form.
- Utför två snitten mellan thoraxsegmenten 19 och 24 tvären till embryo-axeln och passerar alla embryo territorium, med wecker ögat sax.
- Släppa avsnittet embryo, ss19-24, skära marginell embryonala kanterna.
- Aspirera på ss19-24 vävnader och överföring till en glasskål tre fjärdedelar fylld med kall PBS med 2 mL steril Pasteur pipett.
- Isolera lateral mesoderm från somatopleura regionen (ss19-24) genom enzymatisk nedbrytning med pankreatin (8 mg/mL; 1:3 utspädning av 25 mg/mL med kall PBS).
- Med hjälp av spateln och tunn pincett, överföring skålen ss19-24 vävnaderna att ett glas tre fjärdedelar fylld med kall pankreatin lösning.
- Inkubera i 30 min på is för enzymatisk nedbrytning.
- Under stereomikroskopet, isolera mesoderm från omgivande vävnader med hjälp av två microscalpels i en hållare.
Obs: Håll alla ytor och lösningar kallt under proceduren. Ändra till en ny kall pankreatin lösning om det tar lång tid att dissekera vävnader (> 10 min.). Som en belysning källa, använda LED-lampor som införlivas i stereomikroskopet eller optiska fibrer, med tanke på den begränsade värmebelastning. - Under mesoderm isolering, först ta bort ektodermet på ytan följt av försiktig avlossning av ventralt ligger splancnopleura vävnader.
- Släpp höger lateral mesoderm av somatopleura genom att skära det i en parallell rörelse till neuralrörsdefekter.
- Upprepa mesoderm separation av vänster sida av embryot.
Notera: Se långsam microscalpel rörelser under denna procedur. De exponerade extra-cellulära matrix proteinerna fastnar vävnader och instrument som förhindrar vätska rörelser. - Med hjälp av spateln och tunn pincett överföring isolerade mesoderm till en glasskål tre fjärdedelar fylld med kall FBS.
- Hålla glas skålen med isolerade vävnader på is under utarbetandet av in vitro-test.
4. In vitro organotypic assay: heterospecific sammanslutning av vaktel 3/4PP endoderm och mesoderm kyckling somatopleura
- Förbereda odlingssubstratet med RPMI-1640 medium kompletteras med 10% FBS och 1% penna/Strep3,5.
- Placera ett metallgaller i en 35 mm petriskål med 5 mL odlingsmedium.
Obs: Ta bort överskottet av vätska till nivå medium ytan med toppen av rutnätet. - Med hjälp av tunna pincett, doppa ett membranfilter i odlingsmediet och sedan placera den på toppen av nätet för att ha en yta i kontakt med luft.
Obs: En fjärdedel av området membran (med 13 mm diameter) är tillräcklig för föreningen vävnad. - Under stereomikroskopet, associera isolerade vävnader på toppen av membranfiltret. Först överföra 3/4PP endoderm (steg 2) från glas skålen med mild glidande med hjälp av en transplantation sked (eller spatel) och tunn pincett. Upprepa proceduren för isolerade mesoderm (steg 3).
Obs: Med hjälp av en microscalpel, blanda vävnader för att maximera dess association. - Placera försiktigt de omkringliggande vävnaderna i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 för 48 h. odlade vävnader kan ympas på chorioallantoic membran (CAM).
Obs: Ektopisk organ kan bildas i CAM var tidigare detaljerade8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet beskrivs en metod för att isolera aviär embryonala vävnader som ska användas i flera cellulär och utvecklingsbiologi tekniska metoder. Denna metod var tidigare anställd att studera epitelial-mesenkymala interaktioner under tidiga stadier av tymus bildandet5. Häri, visas nya resultaten i figur 1 och figur 2, med liknande metoder.
Figur 1 . Representativa resultat av genuttryck studie av tredimensionellt bevarade faryngala endoderm innehållande presumtiva territorium av bräss rudiment. Schematisk framställning av faryngeal apparater och isolerade endoderm som innehåller 2PP, 3PP och 4PP (vid cE3.5 eller qE3) (A). Hela-mount in situ hybridisering med BMP7 (B) och Sonic Hedgehog (C) av isolerade endoderm på cE3.5. Stark hybridisering signaler av BMP7 och Sonic Hedgehog pekade av vita pilspetsar i endoderm 2PP och 3PP (B) och centrala svalget (C), respektive. A, främre; cE, kyckling embryonala dag; L, vänster; P, bakre; PP, faryngala påse; qE, vaktel embryonala dag; R, höger. Skala barer, 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 1 är en schematisk ritning av endoderm isolerade från svalget på qE3 (och cE3.5) (figur 1A) och jordbaserad uttrycket av två endoderm-relaterade gener, sonic hedgehog11,12 och BMP713 i den isolera vävnaden. Förfaranden som helhet-mount in situ hybridisering utfördes som tidigare beskrivits5,7. Uttrycket av BMP7 upptäckts i endoderm 2PP och 3PP och uteslutna från centrala svalget och 4PP (sonden var vänligt tillhandahålls av Elisabeth Dupin) (figur 1B). Sonic igelkotten var däremot upptäcks i endoderm i centrala svalget och uteslutna från påsar7 (figur 1 C).
Figur 2 . Representativa resultat för ex vivo bildandet av chimära organ. Schematisk bild av den experimentella metod som används för att utveckla vaktel-kyckling chimära thymi (A). Kort, isolerade vaktel 3/4PP endoderm (qE3) associerades in vitro-kyckling somatopleura mesoderm (cE2.5) för 48 h. 48 h odlade vävnader var sedan ympade på CAM (cE8) och får utvecklas i ovo för ytterligare 10 dagar. Seriell avsnitt av CAM-derived bladsticklingar (B-G) analyserades av konventionella histologi (B och C) och immunohistokemi (D - G). I B och C (högre förstoring av B), var bilden färgad med H & E. I D och E (högre förstoring av D), bilden var immunodetected med QCPN antikropp och counterstained med Gills hematoxylin. I F och G (högre förstoring av F), bilden var immunodetected med anti Pan CK antikropp och counterstained med Gills hematoxylin. Svart pilen huvuden pekar på stark brun immunfärgning av QCPN (E) och Pan CK (G). Se Tabell för material för bild förvärv Detaljer. Ca, brosk; EP, epitelet; PP, faryngala påse; SoM, glatt muskulatur. Skala barer: 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 visar experimentell design används för att utveckla ex vivo vaktel-kyckling chimära organ. Föreningen heterospecific av vävnader odlades för 48 h följt av ovo utveckling i 10 dagar (figur 2A). Thymi bildades CAM-derived bladsticklingar identifierades av konventionella histologi. Tymus presenteras normalt morfologiska egenskaper med välutvecklade medulla och cortex fack (figur 2B, C). Seriell avsnitt av bladsticklingar behandlades ytterligare immuncytokemi (figur 2D- G), som beskrev5,7. Den QCPN - MAb vaktel perinukleära (figur 2D, E) och anti pan cytokeratin (CK) (figur 2F, G) antikroppar användes som markörer för vaktel (artspecifika) och epitelceller, respektive. Chimära bräss visade QCPN+ thymic epitelceller (figur 2D, E), retikulära arkitektur (figur 2F, G) och koloniseringen av lymfoida celler (QCPN-) av givare ursprung (kyckling).
| Isolerade vävnad | Utvecklingsstadium | Koncentration | Temperatur | Inkubationstid |
| Svalget endoderm | q E2 - E2.5 | 8 mg/mL | På is | 45 – 60 min. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| q E3 | 8 mg/mL | På is | 60 - 90 min. | |
| c E3.5 | ||||
| q E4 | 8 mg/mL | På is | 90 min. | |
| c E4.5 | ||||
| Somatopleura mesoderm | q E2 - E2.5 | 8 mg/mL | På is | 30 – 50 min. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| c, kyckling; E, embryonala dag; q, vaktel. | ||||
Tabell 1: Villkor för enzymatisk nedbrytning under embryonala vävnader isolering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det förfarande för isolering av embryonal vävnad som anges här har förbättrats från tidigare tekniker för att producera vaktel-kyckling chimära embryon i olika biologiska sammanhang3,5,6.
Denna metod är lämplig att isolera ren embryonala vävnader utan att genetisk manipulation eller användning av vävnad-specifika markörer, som ofta är obestämd, begränsa användningen av genetiskt modifierade djurmodeller. Det kan användas för att studera epitelial-mesenkymala interaktioner under utveckling, med förmågan att isolera ren vävnader att vara den begränsande faktorn. Exempelvis som utveckling fortskrider, vävnader blir tjockare, mer kompakt och fästa till andra närliggande vävnader så att separationen är svårare. Proceduren isolering är därför olämpliga för senare stadier av utveckling, nämligen slutet-organogenes.
Denna metod är unik att studera genuttryck i 3D-bevarade embryonala vävnader. För att säkerställa 3D-integritet isolerade vävnader, bör instrument, material och lösningar hållas vid låga temperaturer under hela processen.
Förfarandet vävnad lokalt är också ett viktigt steg som bygger, inte bara på försiktig inrättandet av de experimentella förhållandena (t.ex. temperatur och varaktighet av enzymatisk nedbrytning, som exemplifieras i tabell 1), men också på den tidskrävande praktisk utbildning. Detta förfarande kräver tålamod och öva. Om operatören förlorar hänvisningarna i regionen att vara dissekeras, kommer att minskar stereoskop förstoringen (20 x) ge en övergripande iakttagelse som hjälper nästa flytta beslut.
48 h i vitro steg fastställdes för att främja cellulära interaktioner mellan olika embryonala vävnader, medan den i ovo vävnad som vuxit i CAM stöder långsiktiga utveckling och chimära orgel bildandet av föreningen heterospecific av vävnader 5. in vitro-vävnader anslutningarna kan övervinna vissa begränsningar i vivo manipulationer. Exempelvis lokala förvaltningen av droger eller tillväxtfaktorer (med pärlor) i regioner av embryot annars otillgängliga i vivo, kan enkelt utföras med denna in vitro-metod. Detta har tidigare visat för att efterlikna lokal vävnadsreaktion interaktioner under organ kan bildas i svalget region5.
Skörd bladsticklingar växer i CAM5,7,8 är mindre tidskrävande och är en enkel metod att spåra explants jämfört med metoder för att samla in vävnader ympade på kroppen väggen chimära embryon3. Dessutom CAM kan transplanteras med celler och vävnader från andra icke-fågelarter, och det har använts framgångsrikt i flera experimentella sammanhang, från utveckling till cancer14,15. Till exempel CAM analysen användes tidigare i möss-in i-kyckling xenograft studier16 och används ofta för att testa mänskliga tumörer celler15invasiv kapacitet.
Nyligen, en elegant studie med mänskliga-in i-kyckling xenograft validerat kyckling embryot som en modell att testa och utforska tidig mänsklig utveckling17. I framtiden, ska det bli intressant att utforska den metod som beskrivs med hjälp av SAR sammanslutning av vävnader, vilket kan ge ytterligare tillvägagångssätt mus och utvecklande studier på människa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma att Isabel Alcobia för den kritiska behandlingen av manuskript, Mário Henriques för video berättande samt Vitor Proa från tjänsten histologi av Instituto de Histologia e Biologia gör skattemyndigheten, Rio de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, för teknisk support. Vi är särskilt tacksamhetsskuld till Paulo Caeiro och Hugo Silva från det Unidade de audiovisuais (audiovisuella enheten), Rio de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa för deras enastående engagemang för produktionen av denna video. Vi erkänner Leica Microsystems för vänligt att ge ett stereoskop utrustad med en video-system och Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A för att bidra med vaktel befruktade ägg. Detta arbete stöds av Rio de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
