Summary
Denne artikel indeholder en metode til at isolere ren embryonale væv fra vagtler og kylling embryoner, der kan kombineres til at danne ex vivo kimære organer.
Abstract
Kapacitet til at isolere embryonale væv var et vigtigt skridt til oprettelse af vagtler-kylling chimera system, som igen har givet ubestridte bidrag til afsløringen nøgleprocesser i udviklingsmæssige biologi.
Heri er beskrevet en optimeret metode til at isolere embryonale væv fra vagtler og kyllinger af mikrokirurgi og enzymatiske fordøjelsen samtidig bevare sin biologiske egenskaber. Efter isolering, væv fra begge arter er forbundet i en in vitro organotypic analyse for 48 h. vagtler og kylling væv kan blive diskrimineret ved forskellige nukleare funktioner og molekylære markører tillader undersøgelse af det cellulære cross-talk mellem heterospecific sammenslutning af væv. Denne tilgang er derfor et nyttigt redskab til at studere komplekse væv interaktioner i udviklingsprocesser med højdynamiske rumlige ændringer, såsom dem, der forekommer under svælg morfogenese og dannelsen af foregut endoderm-afledte organer. Denne eksperimentelle tilgang blev først udviklet for at studere de epitel-mesenchymale interaktioner i tidlige stadier af thymus dannelse. I denne, endoderm-afledte potentielle thymic rudiment og mesoderm-afledte udkom, blev isoleret fra vagtler og kylling embryoner, henholdsvis.
De tilknyttede væv evne til at generere organer kan testes yderligere ved at pode dem ind på chorioallantoic membranen (CAM) af en kylling embryo. Cam-Modulet giver næringsstoffer og giver gasbørser til eksplanterede væv. Efter 10 dage i ovo udvikling, kan de kimære organer analyseres på de høstede explants af konventionelle morfologiske metoder. Denne procedure giver også mulighed for at studere væv-specifikke bidrag under orgel dannelse, fra sin første udvikling (in vitro-udvikling) til de sidste faser af organogenesis (i ovo udvikling).
Endelig metoden bedre isolering også indeholder tre dimensioner (3D) bevaret embryonale væv, der kan også bruges til høj opløsning topografiske analyse af væv-specifikke genekspression mønstre.
Introduction
I begyndelsen af 1970 ' erne, blev en elegant vagtler-kylling chimera system udviklet af Le Douarin, åbne nye muligheder for at forstå rollen i celle migration og cellulære interaktioner under udvikling1,2. Modellen blev udtænkt på den forudsætning, at celle udveksling mellem de to arter væsentligt ikke ville forstyrre embryogenese, senere bekræftet når bruges til at studere adskillige udviklingsprocesser, herunder dannelsen af den nervøse og den hæmatopoietisk systemer1. Under sidstnævnte som et eksempel, de cykliske bølger af hæmatopoietisk stamfaderen koloniserer det thymic epitelial rudiment blev først observeret ved hjælp af vagtler-kylling chimera system3. For at, blev den potentielle område af thymus, endoderm af tredje og fjerde svælg poser (3/4PP), mekanisk og enzymatisk isoleret fra vagtler (q) embryoner på 15 til 30 - somite Stadium [embryonale dag (E) 1,5-E2.5]. Disse faser svarer til kylling Hamburger og Hamilton4 (HH) - faser 12-17. Isolationsprocedurer startede med brug af trypsin at enzymatisk adskille endoderm fra den vedlagte udkom. Den isolerede endoderm blev podet ind i somatopleura regionen en vært kylling (c) embryon på E3-E3.5 (HH-faser 20-21). Denne heterolog udkom blev betragtet som "eftergivende" thymic epitel udvikling bidrager også til orgel dannelse3. Bagefter, infiltreret successive bølger af kylling vært blodbårne stamceller vagtler donor thymic epitelial modstykket bidrager til thymus dannelse i vært embryo3.
For nylig, en modificeret version af denne tilgang blev også bevist for at være vigtige for at studere epitel-mesenchymale interaktioner i tidlige stadier af thymus dannelse5. I denne henseende var det væv, der er involveret i dannelsen af ektopiske brissel i kimære embryoner3 isoleret, begge fra donor og vært embryoner, og forbundet ex vivo. En forbedret protokol blev brugt til at isolere vagtler 3/4PP endoderm (E2.5-E3) og kylling somatopleura mesoderm (E2.5-E3). Kort, embryonale væv blev isoleret af mikrokirurgi og in vitro-pancreatin fordøjelsen. Også, enzymatisk fordøjelse, temperatur og tid til inkubation var optimeret vævstype og udviklingsstadiet (tabel 1).
Næste, isoleret væv blev forbundet i en organotypic i vitro system for 48 h, som tidligere rapporteret5,6. In vitro-sammenslutningen af væv efterligner de lokale cellulære vekselvirkninger i embryo, at overvinde visse begrænsninger af in vivo manipulation. Dette system er særligt nyttige til at studere cellulær interaktioner i komplekse morphogenic begivenheder, såsom udvikling af svælg apparatet.
Hvert væv i thymus histogenesis bidrag, samt mulighed for foreningen heterospecific til at generere en thymus kan være yderligere udforsket brug af CAM metodologi, tidligere detaljerede5,7,8. Kortfattet, blev kulturperler væv podet på CAM cE8 embryoner og lov til at udvikle i ovo for 10 dage. Derefter, thymus dannelse blev evalueret af morfologisk analyse i de høstede explants. Som i den klassiske vagtler-kylling studier3, blev vagtler thymic epitel koloniseret af hæmatopoietisk stamceller (HPCs) afledt af kylling embryo, som senere viste sig at bidrage til orgel udvikling9,10 . HPCs overflyttet fra embryonet til ektopisk kimære thymus gennem stærkt vaskulariserede CAM5,7,8. Vagtler afledte thymic epitel kan identificeres ved hjælp af Immunhistokemi bruger artsspecifikke antistoffer (dvs. QCPN - MAb vagtler PeriNuclear), at overvinde behovet for væv-specifikke molekylære markører.
Denne eksperimentelle metode, tillader som den totrinsløsning, rapporterede i forrige publikation8, graduering af signalstoffet veje af regelmæssig indgift af farmakologiske midler under in vitro og i ovo udvikling. Explants kan også høstes på ethvert tidspunkt i løbet af eksperimentet8.
Endelig tillader isolation protokollen her detaljerede bevarelsen af de naturlige egenskaber og 3D-arkitektur i embryonale væv, især nyttigt for detaljering in situ genekspression mønstre af embryonale territorier ellers utilgængelige af konventionelle metoder. Derudover kan transkriptom analyse tilgange, herunder RNA-seq eller microarrays, også anvendes i isolerede væv uden at kræve genetiske markører samtidig en væv-specifikke høj overførselshastighed "omik" analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle disse eksperimenter følge dyrs pleje og etiske retningslinjer de-Centro Académico de Medicina Lisboa.
1. befrugtet vagtler og kylling æg inkubation
- Sted befrugtede æg af japanske vagtler (Coturnix coturnix japonica) i en 38 ° C befugtet inkubator for 3 dage. Inkuber æg (æg stump ende) vender opad i luftkammer.
Bemærk: Befugtet miljøet opnås ved at placere en vandbeholder i bunden af varmeskabet. - Inkuber befrugtede æg af fjerkræ (Gallus gallus) i 2,5 dage i en 38 ° C befugtet inkubator. Inkuber æg i en vandret position og markere den øverste side ved hjælp af et stykke trækul til at identificere embryo placeringen.
Bemærk: Start med 40 vagtelæg og 60 hønseæg ved udarbejdelsen af dette eksperiment.
2. isolering af vagtler endoderm indeholdende den potentielle domæne af thymic rudiment
Bemærk: Brug en vandret laminar flow hætte og steriliserede instrumenter og materialer til æg manipulation procedurer under sterile forhold.
- Fjerne den embryonale region indeholdende den formodede område af thymic rudiment, svælg arch regionen indeholder de 3rd og 4th buer (3/4PAR), som beskrevet7,8.
- Fyld en stor borsilikatglas skål (100 mm x 50 mm, 100 cm3) med 60 mL af kolde fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Med hjælp fra buet saks, tryk og skære et cirkelformet hul i skallen af en vagtel æg, der har været inkuberet i 3 dage. Lave hul på den modsatte side af ægget stumpe og overføre æggeblomme (med Foster) til skål med koldt PBS.
- Fjerne embryonet fra blommesækken ved at skære den vitelline membran eksternt til ekstra embryonale fartøjer, der anvender buet saks.
- Ved hjælp af tynde pincet, overføre embryonet til en lille skål (60 mm x 30 mm, 15 cm3) fyldt med 10 mL koldt PBS.
- Med en hulske, flytte embryonet til et 100 mm petriskål med en sort base (Se Tabel af materialer) indeholdende 10 mL koldt PBS og placere den under et stereomikroskop.
- Dissekere 3/4PAR, som tidligere beskrevet8.
- Aspirat 3/4PAR og overførsel til en glasskål tre fjerdedele fyldt med koldt PBS ved hjælp af en 2 mL sterilt Pasteur pipette.
- Isolere endoderm indeholdende den formodede område af thymic rudiment (3/4PP endoderm) af Enzymatisk nedbrydning med pancreatin.
- Med hjælp fra spatel og tynde pincet, overførsel 3/4PAR til en glasskål tre fjerdedele fyldt med koldt pancreatin (8 mg/mL, 1:3 fortynding af 25 mg/mL med kolde PBS).
- Inkuber i 1 time på isen for Enzymatisk nedbrydning.
NOTE: Tid af Enzymatisk nedbrydning afhænger af udviklingstrin (tabel 1). - Placer glasfad under stereomikroskopet (40 x-60 x forstørrelse) at isolere endoderm fra 3/4PAR.
Bemærk: Hold alle overflader og løsninger kold under denne procedure. Skift til en ny kold pancreatin løsning hvis det tager lang tid at dissekere væv (> 15 min). Som en belysning kilde, bruge LED lys indarbejdet i stereomikroskopet eller i de optiske fibre, overvejer begrænset varmebehov. - For at isolere endoderm fra det omgivende væv, skal du bruge to rustfri microscalpels i pin indehavere.
Bemærk: Brug microscalpels med en diameter mellem 0,1 mm og 0,2 mm og nikkel pin indehavere med en kæbe åbning diameter på 0 mm til 1 mm.- Først fjerne det neurale rør og mesoderm knyttet til den dorsale overflade af svælg endoderm.
- Med den dorsale side op, forsigtigt løsne og fjerne udkom mellem svælg buer og udsætte svælg poser. Udføre denne procedure på begge sider af 3/4PAR.
- Fjern hjertet tube og udkom omkring de forreste poser.
- Med den ventrale side op, skære ectoderm 2nd og 3rd svælg buer og fjern forsigtigt de udkom knyttet til poser. Gentag denne procedure på anden siden af 3/4PAR. På dette stadium bør skjoldbruskkirtlen rudiment ses.
- Fjern eventuelle resterende mesenchymale celler knyttet til den svælg endoderm med de to microscalpels.
- Gøre et tværgående snit mellem de 2nd og 3rd PP, skaber den svælg endoderm, som indeholder de 3rd og 4th poser fra den forreste del af endoderm skjoldbruskkirtlen rudiment og 2nd svælg posen.
- Med hjælp fra spatel og tynde pincet, overførsel af isolerede 3/4PP endoderm til en glasskål tre fjerdedele fyldt med 100% kolde føtal bovint serum (FBS).
- Holde glasfad med isoleret væv på isen under udarbejdelsen af in vitro assay. Alternativt, isoleret væv kan bevares tre dimensioner og in situ analyseret for gen-udtryk.
3. isolering af kylling somatopleura mesoderm
Bemærk: Udføre æg manipulation procedurer i sterile forhold ved hjælp af en vandret laminar flow hætte og steriliserede instrumenter og materialer.
- Fjerne den embryonale område indeholdende somatopleura mesoderm på niveau med somites 19-24 (ss19-24).
- Fjerne kylling æg fra rugemaskinen efter 2,5 dages inkubation.
- Med buet saks, skal du åbne et lille hul i skallen. Indsætte en nål og Opsug 2 mL af albumin med en 10 mL sprøjte til at sænke albumin volumen inde i ægget og forebygge skader af embryonet (findes under den markerede område af skallen). Kassér den indsugning albumin.
- Skære en cirkulær hul (op til to tredjedele af top areal) i regionen markant af skallen ved hjælp af buet saks.
- Skære vitelline membranen eksternt for extraembryonic fartøjer mens du holder fosteret med tynde pincet.
- Under et stereomikroskop, placere embryo i en 100 mm petriskål med en sort base, som indeholder 10 mL koldt PBS.
Bemærk: Brug et stereomikroskop fra dette punkt fremad for progressive forstørrelse af mikrokirurgi procedurer. - Bruge fire tynde insekt stifter for at holde fosteret til bunden af pladen. Placer tapperne i regionen extraembryonic danner en kvadratisk form.
- Udføre to snit mellem somites 19 og 24 paa tvaers til embryo akse og passerer alle embryo område, ved hjælp af wecker øje saks.
- Frigive afsnittet embryo, ss19-24, ved at skære marginale embryonale kanter.
- Aspirat ss19-24 væv og overførsel til en glasskål tre fjerdedele fyldt med koldt PBS ved hjælp af en 2 mL sterilt Pasteur pipette.
- Isolere den laterale mesoderm fra somatopleura-regionen (ss19-24) af Enzymatisk nedbrydning med pancreatin (8 mg/mL, 1:3 fortynding af 25 mg/mL med kolde PBS).
- Ved hjælp af spatel og tynde pincet, overførsel fad ss19-24 væv til et glas tre fjerdedele fyldt med koldt pancreatin løsning.
- Inkuber i 30 min på isen for Enzymatisk nedbrydning.
- Under stereomikroskopet, isolere mesoderm fra det omgivende væv ved hjælp af to microscalpels i en holder.
Bemærk: Hold alle overflader og løsninger kold under denne procedure. Skift til en ny kold pancreatin løsning hvis det tager lang tid at dissekere væv (> 10 min.). Som en belysning kilde, bruge LED lys indarbejdet i stereomikroskopet eller i de optiske fibre, overvejer begrænset varmebehov. - Under mesoderm isolation, først fjerne ectoderm på overfladen efterfulgt af omhyggelig detachment af de ventrally beliggende splancnopleura væv.
- Slip den højre laterale mesoderm af somatopleura ved at skære det i en parallel bevægelse til neuralrøret.
- Gentag mesoderm adskillelse af venstre side af embryoet.
Bemærk: Sørg langsom microscalpel bevægelser i løbet af denne procedure. De udsatte ekstra-cellulære matrix proteiner holde sig til væv og instrumenter at forebygge flydende bevægelser. - Ved hjælp af spatel og tynde pincet overførsel isolerede mesoderm til en glasskål tre fjerdedele fyldt med koldt FBS.
- Holde glasfad med isoleret væv på isen under udarbejdelsen af in vitro assay.
4. In vitro organotypic assay: heterospecific sammenslutning af vagtler 3/4PP endoderm og kylling somatopleura mesoderm
- Forberede næringssubstratet med RPMI-1640 medium suppleret med 10% FBS og 1% Pen/Strep3,5.
- Placere et metal gitter i en 35 mm petriskål med 5 mL af næringssubstratet.
Bemærk: Fjern overskydende væske niveau det medium overflade med toppen af gitteret. - Ved hjælp af tynde pincet, dyppe et membranfilter i substratet og derefter placere den på toppen af nettet til at have en overflade i kontakt med luft.
Bemærk: En fjerdedel af området membran (med 13 mm i diameter) er tilstrækkelig for foreningen væv. - Under stereomikroskopet, knytte isoleret væv på toppen membranfiltret. Først overføre 3/4PP endoderm (trin 2) fra glasfad af blid glidende ved hjælp af en transplantation ske (eller spatel) og tynd pincet. Gentag denne procedure for den isolerede mesoderm (trin 3).
Bemærk: Ved hjælp af en microscalpel, bland væv for at maksimere sin forening. - Omhyggeligt placere tilknyttede væv i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 for 48 h. kulturperler væv kan være podet på den chorioallantoic membran (CAM).
Bemærk: Ektopisk orgel dannelse i CAM var tidligere detaljerede8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskriver en metode til at isolere aviær embryonale væv skal anvendes i flere cellulære og udviklingsmæssige biologi tekniske tilgange. Denne metode var tidligere ansat til at studere epitel-mesenchymale interaktioner i tidlige stadier af thymus dannelse5. Heri, er nye resultater vist i figur 1 og figur 2, ved hjælp af lignende metoder.
Figur 1 . Repræsentative resultater af genekspression undersøgelse af tre dimensioner bevaret svælg endoderm indeholdende den formodede område af thymus rudiment. Skematisk fremstilling af svælg apparatur og isolerede endoderm indeholdende 2PP, 3PP og 4PP (på cE3.5 eller qE3) (A). Hele-mount in situ hybridisering med BMP7 (B) og Sonic Hedgehog (C) af isolerede endoderm på cE3.5. Stærk hybridisering signaler BMP7 og Sonic Hedgehog påpeget af hvide pilespidser i endoderm af 2PP og 3PP (B) og centrale svælget (C), henholdsvis. A, forreste; cE, kylling embryonale dag; L, venstre; Pedersen, posterior; PP, svælg posen; qE, vagtler embryonale dag; Rasmussen, højre. Skalere barer, 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 1 er en skematisk tegning af endoderm isoleret fra svælget på qE3 (og cE3.5) (figur 1A) og in situ udtryk for to endoderm-relaterede gener, sonic hedgehog11,12 og BMP713 i det isolerede væv. Hele-mount in situ hybridisering procedurer blev udført som tidligere beskrevet5,7. Udtryk for BMP7 blev opdaget i endoderm af 2PP og 3PP og udelukket fra de centrale svælget og 4PP (sonden var venligst leveret af Elisabeth Dupin) (figur 1B). Omvendt, sonic hedgehog blev opdaget i endoderm af centrale svælget og udelukket fra poser7 (figur 1 C).
Figur 2 . Repræsentative resultater af ex vivo dannelsen af kimære organer. Skematisk fremstilling af den eksperimentelle tilgang til udvikling af vagtler-kylling kimære thymi (A). Kort, isolerede vagtler 3/4PP endoderm (qE3) var tilknyttet in vitro-kylling somatopleura mesoderm (cE2.5) for 48 h. 48 h kulturperler væv blev derefter podet på CAM (cE8) og lov til at udvikle i ovo for yderligere 10 dage. Seriel sektioner af CAM-afledte explants (B-G) blev analyseret af konventionelle histologi (B og C) og Immunhistokemi (D til G). I B og C (højere forstørrelse af B), var diaset plettet med H & E. I D og E (højere forstørrelse af D), diaset blev immunodetected med QCPN antistof og counterstained med Gills hæmatoxylin. I F og G (højere forstørrelse af F), diasset var immunodetected med anti-Pan CK antistof og counterstained med Gills hæmatoxylin. Sort pilespidser peg på stærk brun immunfarvning af QCPN (E) og Pan CK (G). Se Tabel af materialer for erhvervelse billeddetaljer. Ca, brusk; EP, epitel; PP, svælg posen; SoM, glatte muskulatur. Skalere barer: 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 viser den eksperimentelle design bruges til at udvikle ex vivo vagtler-kylling kimære organer. Heterospecific foreningen af væv var dyrkes in vitro-for 48 h efterfulgt af ovo udvikling i 10 dage (figur 2A). Thymi dannet i CAM-afledte explants blev identificeret ved konventionelle histologi. Thymus præsenteret normale morfologiske træk med veludviklede medulla og cortex rum (figur 2B, C). Seriel dele af explants blev yderligere behandlet for immuncytokemi (figur 2D- G), som beskrevet5,7. QCPN - MAb vagtler perinuclear (figur 2D, E) og anti-pan cytokeratin (CK) (figur 2F, G) antistoffer blev brugt som markører for vagtler (artsspecifikke) og epitelceller, henholdsvis. Den kimære thymus viste QCPN+ thymic epitelceller (figur 2D, E), retikulære arkitektur (figur 2F, G) og kolonisering af lymfoide celler (QCPN-) af donor oprindelse (kylling).
| Isoleret væv | Udviklingstrin | Koncentration | Temperatur | Inkubationstiden |
| Svælget endoderm | q E2 - E2.5 | 8 mg/mL | På is | 45-60 min. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| q E3 | 8 mg/mL | På is | 60 - 90 min. | |
| c E3.5 | ||||
| q E4 | 8 mg/mL | På is | 90 min. | |
| c E4.5 | ||||
| Somatopleura mesoderm | q E2 - E2.5 | 8 mg/mL | På is | 30-50 min. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| c, kylling; E, embryonale dag; q, vagtler. | ||||
Tabel 1: Betingelser af Enzymatisk nedbrydning under embryonale væv isolation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proceduren embryonale væv isolation detaljeret her blev forbedret fra tidligere teknikker til at fremstille vagtler-kylling kimære embryoner i forskellige biologiske sammenhænge3,5,6.
Denne fremgangsmåde er egnet til at isolere ren embryonale væv uden genetisk manipulation eller brug af væv-specifikke markører, som ofte er ubestemt, begrænse anvendelsen af genetisk modificerede dyremodeller. Det kan bruges til at studere epitel-mesenchymale interaktioner under udvikling, med evnen til at isolere ren væv bliver den begrænsende faktor. For eksempel, som udviklingen skrider frem, væv bliver tykkere, mere kompakt og tillægger andre nærliggende væv, således at deres adskillelse er vanskeligere. Denne isolation procedure er derfor uegnet til senere faser af udvikling, nemlig sen-organogenesis.
Denne metode er enestående at studere genekspression i 3D-bevaret embryonale væv. For at sikre de isolerede væv 3D-integritet, bør instrumenter, materialer og løsninger opbevares ved lave temperaturer under hele processen.
Væv microdissection procedure er også et afgørende skridt, der bygger ikke kun på omhyggelig oprettelsen af de eksperimentelle betingelser (som temperatur og varighed af Enzymatisk nedbrydning, som eksemplificeret i tabel 1), men også på de tidskrævende hands-on træning. Denne procedure kræver tålmodighed og praksis. Hvis erhvervsdrivende mister henvisninger til regionen til at blive dissekeret, vil faldende Stereoskopet forstørrelse (20 x) give en generel refleksion, der vil hjælpe beslutningen om næste skridt.
48 h i vitro trin blev etableret til fremme cellulære vekselvirkninger mellem forskellige embryonale væv, mens den i ovo væv dyrket i CAM understøtter den langsigtede udvikling og kimære orgel dannelsen af foreningen heterospecific af væv 5. in vitro-væv foreninger kan overvinde visse begrænsninger af in vivo manipulationer. For eksempel, lokal administration af medicin eller vækst-faktorer (ved hjælp af perler) i regioner af embryonet ellers utilgængelige i vivo, let kan udføres ved hjælp af denne in vitro-metode. Dette har tidligere vist for at efterligne lokale væv interaktioner under orgel dannelse i svælg region5.
Høst explants vokser i CAM5,7,8 er mindre tidskrævende og er en simpel metode til at spore explants i forhold til metoder til indsamling af væv podet på kroppen væggen af kimære embryoner3. Derudover CAM kan transplanteres med celler og væv fra andre ikke-fuglearter, og det held har været anvendt i flere eksperimentelle sammenhænge, fra udvikling til kræft14,15. For eksempel, CAM assay, tidligere blev anvendt i mus i kylling xenografts undersøgelser16 og bruges ofte til at teste den invasive kapacitet af menneskelige tumorer celler15.
For nylig, har en elegant undersøgelse med menneskelige i kylling xenograft valideret kylling embryo som en model til at afprøve og udforske tidlige menneskelig udvikling17. I fremtiden vil det være interessant at udforske den metode Heri beskrives ved hjælp af interspecies sammenslutning af væv, som kan give ekstra tilgange til mus og menneskelige udviklingsmæssige undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for Isabel Alcobia kritisk læsning af manuskript, at Mário Henriques for video fortælling og Vitor Proa fra tjenesten histologi af Instituto de Histologia e Biologia gøre Desenvolvimento, humanistiske de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, for teknisk support. Vi er især gæld til Paulo Caeiro og Hugo Silva fra Unidade de audiovisuais (enheden for audiovisuelle medier), humanistiske de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa for deres fremragende indsats for produktionen af denne video. Vi anerkender Leica Microsystems venligst give en Stereoskopet udstyret med en video system og Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A for at bidrage med vagtler befrugtede æg. Dette arbejde blev støttet af humanistiske de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
