Summary
Dieser Artikel enthält eine Methode, um reine embryonalen Gewebe von Wachteln und Hühner-Embryonen zu isolieren, die kombiniert werden können, um ex Vivo Chimären Organe.
Abstract
Die Fähigkeit zur embryonalen Gewebe isolieren war ein wesentlicher Schritt für die Gründung der Wachtel-Huhn Chimera-System, das wiederum unbestritten Beiträge zur Enthüllung Schlüsselprozesse in der Entwicklungsbiologie zur Verfügung gestellt hat.
Hierin ist eine optimierte Methode um embryonale Gewebe von Wachteln und Hühner durch Mikrochirurgie und enzymatische Verdauung unter Beibehaltung seiner biologischen Eigenschaften zu isolieren beschrieben. Nach Isolierung sind Gewebe aus beiden Arten in einem in-vitro-organotypischen Assay für 48 h. Wachtel und Huhn Gewebe können durch unterschiedliche Kernmerkmale und molekulare Marker ermöglicht die Untersuchung der zellulären Übersprechen zwischen diskriminiert werden artfremden Verband der Gewebe. Dieser Ansatz ist daher ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung komplexer Gewebe Wechselwirkungen in Entwicklungsprozessen mit hochdynamischen räumliche Änderungen, wie die auftretenden pharyngealen Morphogenese und die Bildung von der foregut Entoderm abgeleitet Organe. Dieser Versuchsansatz wurde zuerst entwickelt, um die epitheliale-mesenchymale Interaktionen während der frühen Stadien der Thymus Bildung zu untersuchen. In diesem, das Entoderm abgeleitet prospektive Zebrafischembryonen Rudiment und Mesoderm abgeleitet Mesenchym waren bzw. von Wachteln und Hühner-Embryonen, isoliert.
Die Kapazität der damit verbundenen Gewebe, Organe zu generieren kann weiter durch Pfropfung sie auf chorioallantoic Membrane (CAM) von einem Huhn Embryo getestet werden. Die CAM liefert Nährstoffe und Gasaustausch der explantierten Gewebe ermöglicht. Nach 10 Tagen in Ovo Entwicklung können die Chimäre Organe in der geernteten Explantaten morphologische konventionell analysiert werden. Dieses Verfahren ermöglicht auch studieren gewebespezifischen Beiträge während Orgel-Formation, von seiner ersten Entwicklung (in vitro) in der Endphase der Organogenese (bei Ovo-Entwicklung).
Schließlich bietet die verbesserte Isolation-Methode auch dreidimensional (3D) erhalten embryonalen Gewebe, das auch für hochauflösende topografische Analyse der gewebespezifischer Genexpression Muster verwendet werden können.
Introduction
In den frühen 1970er Jahren entwickelte sich eine elegante Wachtel-Huhn-Chimäre-System von Le Douarin, öffnen neue Wege um zu verstehen, die Rolle der Zellwanderung und zellulären Interaktionen während der Entwicklung1,2. Das Modell wurde unter der Prämisse entwickelt, dass Zelle Austausch zwischen den beiden Arten Embryogenese, später bestätigt, wenn verwendet, um die zahlreichen Entwicklungsprozesse, einschließlich die Bildung des Nervensystems und der hämatopoetischen studieren nicht erheblich stören würde Systeme1. Wobei letzteres als Vorbild, die zyklischen Wellen der hämatopoetischen Vorläuferzellen besiedeln die Zebrafischembryonen epithelialen Rudiment wurde erstmals beobachtet mit Hilfe der Wachtel-Huhn Chimäre System3. Dafür war das prospektive Gebiet des Thymus, das Entoderm des dritten und vierten pharyngealen Beutel (3/4PP), in 15 bis 30 - Somiten Stadium [embryonalen Tag (E) 1,5-E2.5] mechanisch und enzymatisch von Wachteln (Q) Embryonen isoliert. Diese Stufen entsprechen Huhn Hamburger und Hamilton4 (HH) - Stufen 12-17. Die Isolierungsmaßnahmen begann mit dem Einsatz von Trypsin enzymatisch das Entoderm aus der beigefügten Mesenchym distanzieren. Das isolierte Entoderm wurde in der Somatopleura Region eines Host Huhn (c) Embryos bei E3-3,5 (HH-Stufen 20-21) veredelt. Diese heterologen Mesenchym galt "permissive" Zebrafischembryonen Epithel Entwicklung tragen auch zur Orgel Formation3. Danach infiltriert aufeinanderfolgende Wellen Huhn Host Blut übertragbare Vorläuferzellen der Wachtel Spender Zebrafischembryonen epithelialen Gegenstück zur Thymus-Bildung in der Host-Embryo-3.
Vor kurzem wurde eine modifizierte Version dieses Ansatzes als auch wichtig für das Studium epitheliale-mesenchymale Interaktionen während der frühen Stadien der Thymus Bildung5erwiesen. In dieser Hinsicht waren beteiligt an der Gründung des ektopische Thymus Chimäre Embryonen3 Gewebe isoliert, beide aus Spender und Host Embryonen und ex Vivo verbunden. Eine verbesserte Protokoll wurde verwendet, um die Wachteln 3/4PP Entoderm (E2.5-E3) und das Huhn Somatopleura Mesoderm (E2.5-E3) zu isolieren. Kurz, wurden embryonale Gewebe isoliert durch Mikrochirurgie und nach Maßgabe der in-vitro-Pankreatin Verdauung. Außerdem wurden die Bedingungen der enzymatischen Verdauung, Temperatur und Zeit der Inkubation nach Gewebetyp und Entwicklungsstadium (Tabelle 1) optimiert.
Als nächstes wurden isolierte Gewebe in ein organotypischen in Vitro System für 48 h, wie bereits berichtet5,6verbunden. Der in-vitro-Verband der Gewebe imitiert die lokalen zellulären Interaktionen im Embryo, einige Einschränkungen der in-vivo Manipulation zu überwinden. Dieses System ist besonders nützlich, um zelluläre Interaktionen in komplexen morphogenen Ereignisse, z. B. die Entwicklung der pharyngealen Vorrichtung zu untersuchen.
Der Beitrag der einzelnen Gewebe im Thymus Histogenese, sowie die Fähigkeit des Vereins artfremden eine Thymus generieren kann weiter erforscht mit Hilfe der CAM-Methodik, zuvor detaillierte5,7,8. Kurz und bündig, waren die kultivierten Gewebe aufgepfropft CAM cE8 Embryonen und erlaubt, in Ovo für 10 Tage zu entwickeln. Dann wurde Thymus Bildung durch morphologische Analyse in der geernteten Explantaten bewertet. Wie in den Altertumswissenschaften Wachtel-Huhn3wurde der Wachtel Zebrafischembryonen Epithel von hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPCs) abgeleitet vom Huhn Embryo, die später gezeigt wurde, beitragen zur Orgel Entwicklung9,10 besiedelt. . Die HPCs migriert vom Embryo, ektopische Chimären Thymus bis stark vaskularisierte CAM5,7,,8. Wachtel abgeleiteten Zebrafischembryonen Epithel von Immunohistochemistry mit Spezies-spezifische Antikörper (d. h. QCPN - MAb Wachtel Perinukleäre), Überwindung der Notwendigkeit einer Gewebe-spezifische molekulare Marker identifiziert werden kann.
Diese experimentelle Methode ermöglicht als die zweistufigen Ansatz in früheren Veröffentlichung8, berichtet die Modulation der Signalwege durch regelmäßige Gabe von pharmakologischen Wirkstoffen bei in-vitro- und in Ovo Entwicklung. Explantaten können auch zu jedem Zeitpunkt des Kurses der Experiment8geerntet werden.
Schließlich ermöglicht die Isolierung Protokoll hier detailliert die Erhaltung der natürlichen Eigenschaften und 3D-Architektur der embryonalen Gewebe, besonders nützlich für die Detaillierung in-situ-gen-Expressionsmuster von embryonalen Territorien ansonsten unzugänglich durch konventionelle Methoden. Transkriptom-Analyse-Ansätze, einschließlich RNA-Seq oder Microarrays, können darüber hinaus auch in isolierten Geweben ohne genetische Marker und bietet gleichzeitig eine gewebespezifische Hochdurchsatz "Omics" Analyse angewendet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle diese Experimente zu folgen, die Pflege der Tiere und ethischen Richtlinien des Centro Académico de Medicina de Lisboa.
(1) befruchtet Wachteln und Huhn-Ei-Inkubation
- Ort befruchtete Eier von der japanischen Wachtel (Coturnix Coturnix Japonica) in einem befeuchteten Inkubator von 38 ° C für 3 Tage. Brüten Sie die Eier (Ei stumpfen Ende) nach oben in die Luftkammer.
Hinweis: Die feuchte Umgebung wird erreicht, indem ein Wasserbehälter an der Unterseite des Inkubators. - Inkubieren Sie befruchtete Eier Huhn (Gallus Gallus) für 2,5 Tage in einem befeuchteten Inkubator von 38 ° C. Brüten Sie die Eier in eine horizontale Position und markieren Sie die Oberseite mit einem Stück Holzkohle um die Embryo-Standort zu ermitteln.
Hinweis: Beginnen Sie mit 40 Wachteleier und 60 Hühnereier Festlegung dieses Experiment.
2. Isolierung der Wachtel Entoderm, enthält die zukünftige Domain Zebrafischembryonen rudiment
Hinweis: Verwenden Sie eine horizontale Laminar-Flow-Kapuze und sterilisierte Instrumente und Materialien für Ei Manipulation Verfahren unter sterilen Bedingungen.
- Die embryonale Region mit mutmaßlichen Gebietder Zebrafischembryonen Rudiment entfernen, die pharyngealen Bogen Region mit 3rd und 4th Bögen (3/4PAR), wie beschrieben7,8.
- Füllen Sie eine große Borosilikat Glasschüssel (100 x 50 mm; 100 cm3) mit 60 mL kalte Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Tippen Sie mit Hilfe der gebogenen Schere auf und schneiden Sie ein kreisrundes Loch in der Schale eine Wachtel Ei, das für 3 Tage inkubiert worden. Machen Sie das Loch auf der gegenüberliegenden Seite des Eies stumpf und übertragen Sie das Eigelb (mit dem Embryo) in die Schüssel mit kaltem PBS zu.
- Entfernen Sie den Embryo aus dem Dotter durch die Dotterhäutchen Membran extern zu extraembryonalen Schiffe mit einer gebogenen Schere schneiden.
- Mit Hilfe von dünnen Zange Transfer des Embryos in einer kleinen Schüssel (60 x 30 mm; 15 cm3) mit 10 mL kaltem PBS gefüllt.
- Mit einem Schaumlöffel, bewegen den Embryo mit einem 100 mm Petrischale mit einem schwarzen Sockel (siehe Tabelle der Materialien), enthält 10 mL kaltem PBS und legen Sie es unter einem Stereomikroskop.
- 3/4PAR, wie zuvor beschrieben8zu sezieren.
- Aspirat 3/4PAR und Transfer in eine Glasschale drei Viertel mit kaltem PBS mit einer 2 mL sterile Pasteurpipette gefüllt.
- Das Entoderm mit mutmaßlichen Gebietder Zebrafischembryonen Rudiment (3/4PP Entoderm) durch enzymatische Verdauung mit Pankreatin zu isolieren.
- Mit Hilfe von Spachtel und dünne Zange Transfer 3/4PAR in einer Glasschale drei Viertel mit kalten Pankreatin (8 mg/mL; 1:3-Verdünnung von 25 mg/mL mit kaltem PBS) gefüllt.
- 1 h auf dem Eis für die enzymatische Verdauung inkubieren.
Hinweis: Die Zeit der enzymatischen Verdauung hängt von der Phase der Entwicklung (Tabelle 1). - Legen Sie die Glasschale unter dem Stereomikroskop (40 x-60 X Vergrößerung), das Entoderm aus 3/4PAR zu isolieren.
Hinweis: Halten Sie alle Flächen und Lösungen kalt während dieses Vorgangs. In einer neuen kalten Pankreatin-Lösung ändern, wenn sehr lange, das Gewebe zu zergliedern (> 15 min). Als eine Lichtquelle verwenden Sie LED-Leuchten im Stereomikroskop oder in der optischen Fasern aufgenommen, in Anbetracht der begrenzten Wärmelast. - Um das Entoderm aus dem umliegenden Gewebe zu isolieren, verwenden Sie zwei Edelstahl-Microscalpels in Pin-Halter.
Hinweis: Verwenden Sie Microscalpels mit einem Durchmesser zwischen 0,1 mm und 0,2 mm und Nickel-Pin-Halter mit einem Kiefer Öffnung von 0 mm bis 1 mm Durchmesser.- Entfernen Sie zuerst das Neuralrohr und Mesoderm an der dorsalen Oberfläche des pharyngealen Entoderm befestigt.
- Mit der dorsalen Seite nach oben vorsichtig lösen Sie und entfernen Sie das Mesenchym zwischen den Rachenraum Bögen und setzen Sie der pharyngealen Beutel. Führen Sie dieses Verfahren auf beiden Seiten 3/4PAR.
- Entfernen Sie das Herz Rohr und das Mesenchym rund um den vorderen Taschen.
- Schneiden Sie mit der ventralen Seite nach oben dem Ektoderm der 2Nd und 3rd pharyngealen Bögen und entfernen Sie vorsichtig das Mesenchym der Beutel befestigt. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der anderen Seite 3/4PAR. In dieser Phase sollte die Schilddrüse Rudiment sichtbar sein.
- Entfernen Sie alle verbleibenden mesenchymalen Zellen an der pharyngealen Entoderm mit zwei Microscalpels befestigt.
- Machen Sie einen transversalen Schnitt zwischen den 2Nd und 3rd PP, Wehre die pharyngealen Entoderm, enthält 3rd und 4th Beutel aus dem vorderen Teil des das Entoderm, die Schilddrüse Rudiment und 2nd pharyngealen Beutel.
- Mit Hilfe von Spachtel und dünne Zange isoliert 3/4PP Entoderm Transfer in eine Glasschale drei Viertel mit 100 % kalt fetalen bovine Serum (FBS) gefüllt.
- Halten Sie die Glasschale mit den isolierten Geweben auf Eis während der Vorbereitung der in-vitro-Assay. Alternativ die isolierte Gewebe dreidimensional erhalten werden können und in-situ auf Genexpression analysiert.
3. Isolation von Huhn Somatopleura mesoderm
Hinweis: Führen Sie Ei Manipulation Verfahren unter sterilen Bedingungen mit einer horizontalen Laminar-Flow-Kapuze und sterilisierte Instrumente und Materialien.
- Entfernen Sie die embryonale Territorium mit der Somatopleura Mesoderm auf der Ebene der Somiten 19-24 (19-24).
- Entfernen Sie das Huhn-Ei aus dem Inkubator, nach 2,5 Tagen Inkubationszeit.
- Öffnen Sie mit einer gebogenen Schere ein kleines Loch in der Schale. Legen Sie eine Nadel und aspirieren Sie 2 mL Albumin mit einer 10 mL Spritze, Albumin Lautstärke innerhalb des Eies und Beschädigung des Embryos (befindet sich unter den markierten Bereich der Schale). Entsorgen Sie die angesaugte Albumin.
- Schneiden Sie eine kreisförmige Bohrung (bis zu zwei Drittel der oberen Fläche) in den markierten Bereich der Schale mit einer gebogenen Schere.
- Schneiden Sie die Dotterhäutchen Membran nach außen zu den extraembryonic Gefäßen während Sie den Embryo mit dünnen Zange halten.
- Legen Sie unter einem Stereomikroskop den Embryo in einem 100 mm Petrischale mit einem schwarzen Sockel mit 10 mL kaltem PBS.
Hinweis: Verwenden Sie ein Stereomikroskop von diesem Punkt vorwärts für progressive Vergrößerung der Mikrochirurgie Verfahren. - Verwenden Sie vier dünne Insekten Pins des Embryos an der Unterseite der Platte zu halten. Legen Sie die Stifte in den extraembryonic Region bilden eine quadratische Form.
- Durchführen Sie zwei Einschnitte zwischen den Somiten 19 und 24 quer zur Achse Embryo und überschreiten alle Embryo-Gebiet, mit einer Schere Wecker Auge.
- Lösen Sie Abschnitt Embryo, 19-24, indem marginal embryonalen Kanten schneiden.
- Absaugen der 19-24 Gewebe und Transfer in eine Glasschale drei Viertel gefüllt mit kaltem PBS mit einer 2 mL sterilen Pasteurpipette.
- Isolieren Sie die seitlichen Mesoderm aus Somatopleura Region (19-24) durch enzymatische Verdauung mit Pankreatin (8 mg/mL; 1:3-Verdünnung von 25 mg/mL mit kaltem PBS).
- Mit Hilfe von Spachtel und dünne Zange, Übertragung Schale 19-24-Gewebe zu einem Glas drei Viertel gefüllt mit kaltem Pankreatin Lösung.
- 30 min auf Eis für die enzymatische Verdauung inkubieren.
- Isolieren Sie unter dem Stereomikroskop das Mesoderm aus dem umliegenden Gewebe mit zwei Microscalpels in einer Halterung.
Hinweis: Halten Sie alle Flächen und Lösungen kalt während dieses Vorgangs. In einer neuen kalten Pankreatin-Lösung ändern, wenn sehr lange, das Gewebe zu zergliedern (> 10 min.). Als eine Lichtquelle verwenden Sie LED-Leuchten im Stereomikroskop oder in der optischen Fasern aufgenommen, in Anbetracht der begrenzten Wärmelast. - Während Mesoderm Isolierung entfernen Sie zunächst das Ektoderm an der Oberfläche, gefolgt von der sorgfältigen Ablösung der ventral befindet sich Splancnopleura Gewebe.
- Lassen Sie das rechten seitliche Mesoderm der Somatopleura durch Schneiden in einer parallelen Bewegung auf das Neuralrohr.
- Wiederholen Sie die Mesoderm Trennung von der linken Seite des Embryos.
Hinweis: Achten Sie Microscalpel Bewegungen während dieses Vorgangs zu verlangsamen. Die exponierten extrazellulären Matrixproteine halten Sie sich an Gewebe und Instrumente fließende Bewegungen zu verhindern. - Mit Hilfe von Spachtel und dünne Zange Übertragung der isolierten Mesoderm in einer Glasschale drei Viertel mit kalten FBS gefüllt.
- Halten Sie die Glasschale mit den isolierten Geweben auf Eis während der Vorbereitung der in-vitro-Assay.
4. In-vitro- organotypischen Assay: artfremden Verband der Wachtel 3/4PP Entoderm und Huhn Somatopleura Mesoderm
- Bereiten Sie das Kulturmedium mit RPMI-1640 Medium mit 10 % FBS und 1 % Pen/Strep3,5ergänzt.
- Platzieren Sie ein Metallgitter in einem 35 mm Petrischale mit 5 mL Kulturmedium.
Hinweis: Entfernen Sie das überschüssige Flüssigkeit, die mittlere Fläche mit dem oberen Rand des Rasters zu ebnen. - Tauchen Sie mit Hilfe von dünnen Pinzette ein Membranfilter in das Kulturmedium ein und dann legen Sie es oben auf das Gitter zu einer Oberfläche in Kontakt mit Luft haben.
Hinweis: Ein Viertel der Membranfläche (mit 13 mm Durchmesser) ist ausreichend für die Gewebe-Association. - Assoziieren Sie unter dem Stereomikroskop die isolierte Gewebe an der Oberseite der Membranfilter. Zuerst das 3/4PP Entoderm (Schritt 2) aus der Glasschale zu übertragen, indem Sie sanft mit Hilfe einer Transplantation Löffel (oder Spachtel) und dünne Zange. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die isolierte Mesoderm (Schritt 3).
Hinweis: Mit Hilfe eines Microscalpel, mischen Sie das Gewebe um die Assoziation zu maximieren. - Legen Sie vorsichtig die damit verbundenen Gewebe in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 48 h. kultivierten Gewebe auf chorioallantoic Membrane (CAM) verpflanzt werden können.
Hinweis: Ektopische Orgel Formation in der CAM war zuvor detaillierte8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Vogelgrippe embryonalen Gewebe in verschiedene Zell- und Entwicklungsbiologie Biologie technische Ansätze zu verwendenden isolieren. Diese Methode wurde früher eingesetzt, um epitheliale-mesenchymale Interaktionen während der frühen Stadien der Thymus Bildung5zu untersuchen. Hier werden neue Ergebnisse in Abbildung 1 und Abbildung 2, mit ähnlichen Ansätzen dargestellt.
Abbildung 1 . Repräsentative Ergebnisse der Genexpression Studie der dreidimensional erhalten pharyngealen Entoderm mit dem mutmaßlichen Gebiet des Thymus Rudiment. Schematische Darstellung der pharyngealen Apparate und isolierten Entoderm mit 2PP, 3PP und 4PP (bei cE3.5 oder qE3) (A). Vollständig-hängen in-situ Hybridisierung mit BMP7 (B) und Sonic Hedgehog (C) der isolierten Entoderm bei cE3.5. Starke Hybridisierung Signale von BMP7 und Sonic Hedgehog wies durch weiße Pfeilspitzen im Entoderm der 2PP und 3PP (B) und zentrale Rachen (C), beziehungsweise. A, anterior; cE, Huhn embryonalen Tag; L links; P, posterior; PP, pharyngealen Beutel; qE, Wachteln embryonalen Tag; R, Recht. Skalieren Sie Bars, 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 1 zeigt eine schematische Zeichnung das Entoderm, isoliert von den Rachenraum zu qE3 (cE3.5) (Abbildung 1A) und die in-situ Ausdruck von zwei Entoderm-Genen, Schalligeles11,12 und BMP713 im isolierten Gewebe. Der ganze Berg in-situ Hybridisierung Verfahren wurden wie zuvor beschrieben5,7durchgeführt. Die Expression von BMP7 wurde in das Entoderm 2PP und 3PP erkannt und ausgeschlossen von der zentralen Pharynx und 4PP (Sonde wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Elisabeth Dupin) (Abbildung 1 b). Umgekehrt war sonic Hedgehog in das Entoderm des zentralen Rachens erkannt und ausgeschlossen von der Beutel7 (Abb. 1 C).
Abbildung 2 . Repräsentative Ergebnisse der ex-Vivo-Bildung von Chimären Organe. Schematische Darstellung der Versuchsansatz verwendet, Wachtel-Huhn Chimären Thymi (A) zu entwickeln. Kurz gesagt, war das isolierte Wachtel 3/4PP Entoderm (qE3) in-vitro-Huhn Somatopleura Mesoderm (cE2.5) für 48 h zugeordnet. 48 h kultiviert Gewebe wurden aufgepfropft CAM (cE8) und erlaubt, in Ovo für weitere 10 Tage zu entwickeln. Serienschnitte von CAM-abgeleitete Explantate (B-G) wurden durch konventionelle Histologie (B und C) und Immunohistochemistry (D bis G) ausgewertet. In B und C (höhere Vergrößerung von B) war die Folie mit H & e gefärbt. In D und E (höhere Vergrößerung von D) die Folie war Immunodetected mit QCPN Antikörper und counterstained mit Gills Hämatoxylin. In F und G (höhere Vergrößerung f) die Folie wurde Immunodetected mit Anti-Pan CK Antikörper und counterstained mit Gills Hämatoxylin. Schwarzer Pfeil Köpfe weisen auf starke braune Immunostaining QCPN (E) und Pan CK (G). Siehe Tabelle der Materialien für Erwerb Bilddetails. Ca, Knorpel; EP, Epithel; PP, pharyngealen Beutel; SoM, glatten Muskulatur. Skalieren Sie Bars: 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 zeigt das Versuchsdesign ex Vivo Wachtel-Huhn Chimären Organe entwickelt. Vereins artfremden Gewebes wurden in-vitro-für 48 h, gefolgt von Ovo-Entwicklung für 10 Tage (Abbildung 2A) angebaut. Thymi CAM abgeleitet Explantaten gegründet wurden durch konventionelle Histologie identifiziert. Der Thymus präsentiert normalen morphologische Merkmale mit gut ausgebauten Medulla und Kortex Fächern (Abb. 2 b, C). Schnittserien der Explantate wurden weiter wie beschrieben5,7Immunocytochemistry (Abb. 2D- G), behandelt. Die QCPN - MAb Wachtel Perinukleäre (Abbildung 2D, E) und Anti-Pfanne Cytokeratin (CK) (Abbildung 2F, G) Antikörper dienten als Marker für Wachteln (Spezies) und Epithelzellen, beziehungsweise. Die Chimäre Thymus zeigte QCPN+ Zebrafischembryonen Epithelzellen (Abb. 2D, E), eine netzartige Architektur (Abbildung 2F, G) und Besiedlung von lymphatischen Zellen (QCPN)-Spender Ursprungs (Huhn).
| Isolierte Gewebe | Entwicklungsstand | Konzentration | Temperatur | Inkubationszeit |
| Rachens Entoderm | Q-E2 - E2.5 | 8 mg/mL | Auf dem Eis | 45 – 60 min. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| Q E3 | 8 mg/mL | Auf dem Eis | 60 - 90 min. | |
| c 3,5 | ||||
| Q E4 | 8 mg/mL | Auf dem Eis | 90 min. | |
| c E4.5 | ||||
| Somatopleura mesoderm | Q-E2 - E2.5 | 8 mg/mL | Auf dem Eis | 30 – 50 min. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| c, Huhn; E, embryonale Tag; Q, Wachtel. | ||||
Tabelle 1: Bedingungen der enzymatischen Verdauung während der embryonalen Gewebe isoliert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Das embryonale Gewebe isoliert Verfahren hier detailliert wurde aus früheren Techniken herstellen Wachtel-Hühnerembryos Chimären in verschiedenen biologischen Zusammenhängen3,5,6verbessert.
Dieser Ansatz eignet sich für reine embryonalen Gewebe ohne Genmanipulation oder die Verwendung von Gewebe-spezifische Marker, die sind oft unbestimmt, Begrenzung der Verwendung von gentechnisch veränderten Tiermodellen zu isolieren. Es kann verwendet werden, um epitheliale-mesenchymale Interaktionen während der Entwicklung mit der Fähigkeit, reine Gewebe der limitierende Faktor isolieren zu studieren. Zum Beispiel fortschreitender Entwicklung Gewebe werden dicker, kompakter und andere benachbarte Gewebe beimessen, so dass ihre Trennung schwieriger ist. Diese Isolierung Verfahren ist daher ungeeignet für die späteren Phasen der Entwicklung, nämlich Ende Organogenese.
Diese Methode ist einzigartig, Genexpression in 3D erhalten embryonalen Gewebe zu studieren. Um die 3D-Integrität der isolierten Gewebe zu gewährleisten, sollten Instrumente, Materialien und Lösungen bei niedrigen Temperaturen im gesamten Prozess gehalten werden.
Das Gewebe Mikrodissektion Verfahren ist auch ein wichtiger Schritt, der nicht nur auf die sorgfältige Einrichtung der Versuchsbedingungen (wie Temperatur und Dauer der enzymatischen Verdauung, wie beispielhaft in Tabelle 1), beruht aber auch auf die zeitraubende Hands-on Training. Dieses Verfahren erfordert Geduld und Übung. Verliert der Betreiber die Referenzen des Bereichs, der seziert werden, liefert verringern die Stereoskop Vergrößerung (20 X) eine ganzheitliche Betrachtung, die die nächste Schritt-Entscheidung helfen wird.
Die 48 h in Vitro Schritt wurde gegründet zur Förderung der zellulären Interaktionen zwischen unterschiedlichen embryonalen Gewebe, während die in Ovo Gewebe gewachsen in der CAM unterstützt die langfristige Entwicklung und Chimären Orgel Bildung des Vereins artfremden Gewebes 5. die in-vitro-Gewebe-Verbände können einige Einschränkungen von in-vivo Manipulationen zu überwinden. Zum Beispiel lokale Verwaltung von Drogen oder Wachstumsfaktoren (mit Perlen) in den Regionen des Embryos sonst unzugängliche in Vivo, können leicht durchgeführt werden mit dieser in-vitro-Methode. Dies hat bisher gezeigt, um lokalen Interaktionen während Orgel Bildung in den Rachenraum Region5zu imitieren.
Ernte Explantaten wächst in CAM5,7,8 ist weniger zeitaufwendig und ist eine einfache Methode zur Verfolgung explants im Vergleich zu Methoden zur Erfassung von Gewebes die Körperwand der Chimäre Embryonen3aufgepfropft. Darüber hinaus CAM kann mit Zellen und Gewebe aus anderen nicht-Vogelarten transplantiert werden, und es wurde erfolgreich in mehreren experimentellen zusammenhängen, von der Entwicklung über Krebs14,15verwendet. Beispielsweise die CAM Assay wurde zuvor in Mäusen in Huhn Xenotransplantate Studien16 angewendet und wird häufig verwendet, um die invasiven Kapazität des menschlichen Tumoren Zellen15testen.
Vor kurzem hat eine elegante Studie mit Menschen in Huhn Xenograft Huhn Embryo als ein Modell zu testen und erkunden frühe menschliche Entwicklung17validiert. In Zukunft wird es interessant sein zu erkunden die Methodik, die hier beschriebenen mit Interspezies Zuordnung von Geweben, die weitere Ansätze der Maus und menschliche Studien zur Verfügung stellen kann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren sind dankbar für die kritische Lektüre des Manuskripts, Isabel Alcobia Mário Henriques für video Erzählung und Vitor Proa aus der Histologie-Service des Instituto de Histologia e Biologia Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa Universidade de Lisboa, für den technischen Support. Wir sind insbesondere verpflichtet, Paulo Caeiro und Hugo Silva aus Unidade de Audiovisuais (Referat audiovisuelle Medien), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa für ihr herausragendes Engagement für die Produktion von diesem Video. Wir anerkennen Leica Microsystems freundlicherweise dafür ein Stereoskop, ausgestattet mit einem Videosystem und Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A. für den Beitrag mit Wachteln Eier befruchtet. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
