Summary
Denne artikkelen inneholder en metode for å isolere ren embryonale vev fra vaktel og kylling embryoer som kan kombineres til skjemaet ex vivo chimeric organer.
Abstract
Kapasitet til å isolere embryonale vev var et viktig skritt for å etablere vaktel-kylling chimera systemet, som i sin tur har gitt ubestridte bidrag til avsløring nøkkelprosesser i utviklingsbiologi.
Her er beskrevet en optimalisert metode for å isolere embryonale vev fra vaktel og kyllinger mikrokirurgi og enzymatiske fordøyelsen, mens bevare sin biologiske egenskaper. Etter isolasjon, vev fra begge arter er knyttet på en i vitro organotypic analysen for 48 h. vaktel og kylling vev kan bli diskriminert distinkte kjernefysiske egenskaper og molekylære markører slik at studiet av den cellulære kryss-snakk mellom heterospecific tilordning av vev. Denne tilnærmingen er derfor et nyttig verktøy for å studere komplekse vev interaksjoner i utviklingsprosesser med svært dynamiske romlige modifikasjoner, som de oppstår under pharyngeal morphogenesis og dannelsen av foregut endoderm-avledet organer. Denne eksperimentelle ble først utviklet for å studere epithelial-mesenchymal interaksjoner i tidlige stadier av thymus formasjon. I dette, den endoderm-avledet potensielle thymic rudiment og mesoderm-avledet mesenchyme, ble isolert fra vaktel og kylling embryoer, henholdsvis.
Kapasiteten til de tilknyttete vev å generere organer kan videre testes av pode dem på chorioallantoic membran (CAM) av en kylling fosteret. CAM gir næringsstoffer og gir gass utvekslinger på explanted vev. Etter 10 dager i ovo utvikling, kan chimeric organer analyseres i høstet explants av konvensjonelle morfologiske metoder. Denne fremgangsmåten kan også studere vev-spesifikke bidrag under orgel formasjon, fra den første utviklingen (i vitro utvikling) til sluttfasen av organogenesen (i ovo utvikling).
Til slutt forbedret isolasjon metoden også gir tredimensjonalt (3D) bevart embryonale vev, som også kan brukes for høy oppløsning topografiske analyse av vev-spesifikke genuttrykk mønstre.
Introduction
I 1970, ble en elegant vaktel-kylling-chimera-systemet utviklet av Le Douarin, åpner nye muligheter for å forstå rollen av celle migrasjon og mobilnettet interaksjoner under utvikling1,2. Modellen ble utviklet på premisset om at cellen utveksling mellom de to artene ikke ville betydelig forstyrre embryogenesis, senere bekreftet når studere mange utviklingsprosesser, inkludert dannelsen av nervøse og den blodkreft systemer1. Tar sistnevnte som et eksempel, syklisk bølger blodkreft progenitors kolonisere thymic epithelial rudiment ble først observert med vaktel-kylling chimera systemet3. For at var potensielle territorium thymus, endoderm av tredje og fjerde pharyngeal poser (3/4PP), mekanisk og enzymatisk isolert fra vaktel (q) embryo på 15 til 30 - somite scenen [embryonale dag (E) 1.5-E2.5]. Disse fasene tilsvarer kylling Hamburger og Hamilton4 (HH) - stadier 12-17. Isolering prosedyrer startet med bruk av trypsin å enzymatisk dissociate endoderm fra den tilknyttede mesenchyme. Den isolerte endoderm ble podet inn i somatopleura regionen en vert kylling (c) embryo på E3-E3.5 (HH-stadier 20-21). Denne heterologous mesenchyme ble ansett som "ettergivende" thymic epitel utvikling bidrar også til orgel formasjon3. Etter infiltrert påfølgende bølger av kylling vert blodbårne progenitor celler vaktel donor thymic epitel motparten bidrar thymus formasjonen i vert embryoet3.
Nylig en modifisert versjon av denne tilnærmingen ble også vist seg for å være viktig for å studere epithelial-mesenchymal interaksjoner i tidlige stadier av thymus formasjon5. I denne forbindelse ble vev involvert i dannelsen av ektopisk thymus i chimeric embryo3 isolert, både fra giver og vert embryoer, og tilhørende ex vivo. En forbedret protokollen ble brukt til å isolere vaktel 3/4PP endoderm (E2.5-E3) og kylling somatopleura mesoderm (E2.5-E3). Kort, embryonale vev ble isolert av mikrokirurgi med i vitro pancreatin fordøyelsen. Også var betingelsene for enzymatisk fordøyelsen, temperatur og tid med inkubering optimalisert vev-type og utviklingsstadiet (tabell 1).
Deretter ble isolert vev assosiert i en organotypic i vitro system for 48t, som tidligere rapportert5,6. I vitro foreningen av vev etterligner de lokale mobilnettet interaksjonene i embryo, overvinne noen begrensninger av i vivo manipulering. Dette systemet er spesielt nyttig å studere mobilnettet interaksjoner i komplekse morphogenic hendelser, for eksempel utvikling av pharyngeal apparatet.
Bidraget fra hver vev i thymus histogenesis og til heterospecific Association til å generere en thymus kan videre utforsket bruke CAM metodikk, tidligere detaljert5,7,8. Konsist, var kulturperler vev podet på CAM av cE8 embryo og bygge i ovo 10 dager. Deretter ble thymus formasjon evaluert av morfologisk analyse i høstet explants. Som de vaktel-kylling Realencyclopädie3, ble vaktel thymic epitel kolonisert av blodkreft stamfar celler (HPCs) fra kylling embryoet, som ble vist å bidra til orgel utvikling9,10 . HPCs overført fra embryoet til ektopisk chimeric thymus gjennom svært vascularized CAM5,7,8. Vaktel avledede thymic epitel kan identifiseres av immunhistokjemi ved hjelp av artsspesifikke antistoffer (dvs. QCPN - MAb vaktel PeriNuclear), overvinne behov for vev-spesifikke molekylære markører.
Denne eksperimentell metode, lar som i two-step rapportert i forrige publikasjonen8, modulering av signal av vanlige administrasjonen av farmakologiske agenter i vitro og ovo utvikling. Explants kan også høstes på noe tidspunkt i løpet av eksperimentet8.
Til slutt, isolasjon protokollen her detaljert tillater bevaring av de naturlige egenskapene og 3D-arkitektur embryonale vev, spesielt nyttig for detaljering i situ genuttrykk mønstre av embryonale territorier ellers utilgjengelig som konvensjonelle metoder. I tillegg kan transcriptome analyse tilnærminger, inkludert RNA-seq eller microarrays, også brukes i isolerte vev uten genetiske markører samtidig som en vev-spesifikke høy gjennomstrømning "omics" analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle disse eksperimentene følger dyr omsorg og etiske retningslinjer på Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. befruktet vaktel og kylling egg inkubasjon
- Sted befruktet egg av japansk vaktel (Coturnix coturnix japonica) i en 38 ° C fuktet inkubator for 3 dager. Ruge egg (egg sløv slutten) vender i luften kammeret.
Merk: Fuktet miljøet er oppnådd ved å plassere en vann beholder nederst i inkubator. - Ruge befruktede egg av kylling (Gallus gallus) for 2,5 dager i en 38 ° C fuktet inkubator. Ruge eggene i vannrett stilling og merke oversiden med en kull til å identifisere fosteret.
Merk: Starte med 40 vaktelegg og 60 kylling egg ved oppretting av dette eksperimentet.
2. isolering vaktel endoderm inneholder potensielle domenet til den thymic rudiment
Merk: Bruk vannrett laminær strømning hette og steriliserte instrumenter og materialer for egg manipulasjon prosedyrer i sterile forhold.
- Fjern embryonale regionen presumptive territoriet til thymic rudiment, pharyngeal arch regionen 3rd og 4th buer (3/4PAR), som beskrevet7,8.
- Fyll en stor Borosilikatglass bolle (100 x 50 mm, 100 cm3) med 60 mL kaldt fosfat-bufret saltholdig løsning (PBS).
- Med hjelp av buet saks, trykk og skjære runde hull i skallet av en vaktel egg har blitt ruget for 3 dager. Lage hull på motsatt side av egg sløv og overføre eggeplomme (med embryoet) til bollen med kaldt PBS.
- Fjerne fosteret fra eggeplomme ved å kutte eggeplomme membranen eksternt for ekstra-embryonale skip med buet saks.
- Med hjelp av tynne tang, overføring embryoet til en liten bolle (60 x 30 mm, 15 cm3) fylt med 10 mL kaldt PBS.
- Med en skimmer, flytte embryoet til et 100 mm Petriskål en svart Base (se Tabell for materiale) inneholder 10 mL kaldt PBS og plassere den under en stereomicroscope.
- Dissekere 3/4PAR, som beskrevet tidligere8.
- Leveringstanken 3/4PAR og overføring til et glass rett tre fjerdedeler fylt med kaldt PBS med en 2 mL steril Pasteur pipette.
- Isolere endoderm inneholder presumptive territoriet til thymic rudiment (3/4PP endoderm) av enzymatisk fordøyelse med pancreatin.
- Med hjelp av spatel og tynn tang, overføring 3/4PAR til et glass rett tre fjerdedeler fylt med kaldt pancreatin (8 mg/mL, 1:3 fortynning av 25 mg/mL med kaldt PBS).
- Inkuber 1t på is enzymatisk fordøyelsen.
Merk: Tiden enzymatisk fordøyelsen avhenger av utviklingstrinn (tabell 1). - Plass glass rett under stereomicroscope (40 x-60 x forstørrelse) å isolere endoderm fra 3/4PAR.
Merk: Holde alle overflater og løsninger kaldt under denne prosedyren. Endre til en ny kald pancreatin løsning hvis tar lang tid å dissekere vev (> 15 min). Som en belysning kilde, kan du bruke LED-lys som er innlemmet i stereomicroscope eller i optisk fiber, vurderer begrenset varme belastningen. - For å isolere endoderm fra omkringliggende vev, bruke to rustfritt stål microscalpels pin holdere.
Merk: Bruke microscalpels med en diameter mellom 0,1 mm og 0.2 mm og nikkel pin holdere jaw åpning diameter 0 mm 1 mm.- Fjerne det medfødte og mesoderm knyttet til dorsal overflaten av den pharyngeal endoderm.
- Med dorsal side opp, nøye fjerne og fjerne mesenchyme mellom pharyngeal buene og utsette pharyngeal poser. Følg denne fremgangsmåten på begge sider av 3/4PAR.
- Fjerne hjertet røret og mesenchyme rundt fremre poser.
- Med ventral side opp, kuttet ektoderm 2nd og 3rd pharyngeal buer og fjern forsiktig mesenchyme knyttet til poser. Gjenta denne prosedyren på den andre siden av 3/4PAR. På dette stadiet skal skjoldbrusk rudiment vises.
- Fjern alle gjenværende mesenchymal celler knyttet til den pharyngeal endoderm med de to microscalpels.
- Gjøre en tverrgående kutt mellom 2nd og 3rd PP, dissociating pharyngeal endoderm inneholder 3rd og 4th poser fra den fremre delen av endoderm thyroid-rudiment og 2nd pharyngeal veske.
- Med hjelp av spatel og tynn tang, overføring av isolerte 3/4PP endoderm til et glass rett tre fjerdedeler fylt med 100% kaldt fosterets bovin serum (FBS).
- Holde glass parabolen med isolert vev på is under utarbeidelsen av i vitro analysen. Alternativt, isolerte vev kan bevares tredimensjonalt og i situ analysert for genuttrykk.
3. isolering av kylling somatopleura mesoderm
Merk: Utføre egg manipulasjon prosedyrer i sterile forhold med vannrett laminær strømning hette og steriliserte instrumenter og materialer.
- Fjerne embryonale territoriet som inneholder den somatopleura mesoderm på nivået av somites 19-24 (ss19-24).
- Fjerne kylling egg settefiskanlegg etter 2,5 dager inkubasjon.
- Med buet saks, åpne et lite hull i skallet. Sett inn en nål og Sug opp 2 mL albumin med en 10 mL sprøyte å senke albumin volum inne i egget og forhindre skade av embryoet (ligger under området markant skallet). Kast den aspirerede albumin.
- Kutte en sirkulær hull (opptil to-tredjedeler av toppen overflaten) i området markant skallet med buet saks.
- Kutte eggeplomme membranen eksternt til extraembryonic fartøyene mens du holder embryoet med tynne tang.
- Under en stereomicroscope, sett embryoet i en 100 mm Petriskål en svart base som inneholder 10 mL kaldt PBS.
Merk: Bruk en stereomicroscope fra dette tidspunktet for progressiv forstørrelse mikrokirurgi prosedyrer. - Bruke fire tynne insekt pinner for å holde embryoet til bunnen av platen. Sett pinnene i regionen extraembryonic danner en firkantet form.
- Utføre to kutt mellom somites 19 og 24 tvers til fosteret aksen og krysset alle embryoet territorium, med wecker øye saks.
- Slipp embryoet delen ss19-24, kutte marginale embryonale kantene.
- Leveringstanken ss19-24 vev og overføring til et glass rett tre fjerdedeler fylt med kaldt PBS med en 2 mL steril Pasteur pipette.
- Isolere den laterale mesoderm fra somatopleura-regionen (ss19-24) av enzymatisk fordøyelse med pancreatin (8 mg/mL, 1:3 fortynning av 25 mg/mL med kaldt PBS).
- Med hjelp av spatel og tynn tang, overføre rett ss19-24 vev til et glass tre fjerdedeler fylt med kaldt pancreatin løsning.
- Inkuber i 30 min på is enzymatisk fordøyelsen.
- Under stereomicroscope, isolere mesoderm fra omkringliggende vev med to microscalpels i en holder.
Merk: Holde alle overflater og løsninger kaldt under denne prosedyren. Endre til en ny kald pancreatin løsning hvis tar lang tid å dissekere vev (> 10 min.). Som en belysning kilde, kan du bruke LED-lys som er innlemmet i stereomicroscope eller i optisk fiber, vurderer begrenset varme belastningen. - Under mesoderm isolasjon, må du først fjerne ektoderm på overflaten etterfulgt av forsiktig avdeling av ventrally ligger splancnopleura vev.
- Utgivelsen rett sideveis mesoderm av somatopleura ved å klippe det i en parallell bevegelse til medfødte.
- Gjenta mesoderm utskillelsen av venstre side av fosteret.
Merk: Kontroller sakte microscalpel bevegelser under denne prosedyren. Utsatte ekstra-mobile matrix proteiner stikke til vev og instrumenter hindre flytende bevegelser. - Med hjelp av spatel og tynn tang overføring den isolerte mesoderm til et glass rett tre fjerdedeler fylt med kaldt FBS.
- Holde glass parabolen med isolert vev på is under utarbeidelsen av i vitro analysen.
4. In vitro organotypic analysen: heterospecific association of vaktel 3/4PP endoderm og kylling somatopleura mesoderm
- Forberede kultur medium med RPMI-1640 medium med 10% FBS og 1% penn/Strep3,5.
- Sett en i 35 mm Petriskål med 5 mL kultur medium.
Merk: Fjerne overflødig væske nivå middels overflaten med toppen av rutenettet. - Med hjelp av tynne tang, dypp filtere membran til kultur medium og deretter plassere den på nettet for å har en overflate med luft.
Merk: En fjerdedel av området membran (med 13 mm diameter) er tilstrekkelig for tilknytningen vev. - Under stereomicroscope, kan du knytte isolert vev på membran filteret. Først overføre 3/4PP endoderm (trinn 2) fra glass rett ved forsiktig skyve ved hjelp av en transplantasjon skje (eller spatula) og tynn tang. Gjenta denne fremgangsmåten for den isolerte mesoderm (trinn 3).
Merk: Med hjelp av en microscalpel, bland vev for å maksimere tilknytningen. - Forsiktig plassere de tilknyttete vev i en fuktet inkubator på 37 ° C med 5% CO2 for 48 h. kulturperler vev kan bli podet på chorioallantoic membranen (CAM).
Merk: Ektopisk orgel formasjon i CAM var tidligere detaljert8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen detaljer en metode for å isolere avian embryonale vev i flere mobilnettet og utviklingspsykologi biologi tekniske tilnærminger. Denne metoden var tidligere ansatt å studere epithelial-mesenchymal interaksjoner i tidlige stadier av thymus formasjon5. Her, er nye resultater vist i figur 1 og figur 2, bruke lignende tilnærminger.
Figur 1 . Representant resultatene av genuttrykk studie av bevart tredimensjonalt pharyngeal endoderm inneholder presumptive området av brisselen rudiment. Skjematisk fremstilling av pharyngeal apparater og isolert endoderm som inneholder 2PP, 3PP og 4PP (på cE3.5 eller qE3) (A). Hele-mount i situ hybridisering med BMP7 (B) og soniske pinnsvin (C) isolert endoderm på cE3.5. Sterk hybridisering signaler BMP7 og soniske pinnsvin pekte hvit pilspisser i endoderm av 2PP og 3PP (B) og sentrale pharynx (C), henholdsvis. A, anterior; cE, kylling embryonale dag; L, venstre; P, bakre; PP, pharyngeal veske; qE, Vaktel embryonale dag; R, høyre. Skalere barer, 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 1 er en skjematisk tegning endoderm isolert fra pharynx på qE3 (og cE3.5) (figur 1A) og i situ uttrykk for to endoderm-relaterte gener, soniske pinnsvin11,12 og BMP713 i isolerte vev. Hele-mount i situ hybridisering prosedyrene ble utført som beskrevet tidligere5,7. Uttrykk for BMP7 ble funnet i endoderm av 2PP og 3PP og ekskludert fra sentrale svelg og 4PP (sonde ble vennlig levert av Elisabeth Dupin) (figur 1B). Derimot ble soniske pinnsvin oppdaget i endoderm av sentrale pharynx og utelukket fra poser7 (figur 1 C).
Figur 2 . Representant resultatene av ex vivo dannelsen av chimeric organer. Skjematisk fremstilling av eksperimentelle fremgangsmåten som brukes til å utvikle vaktel-kylling chimeric thymi (A). Kort, isolerte vaktel 3/4PP endoderm (qE3) var knyttet i vitro kylling somatopleura mesoderm (cE2.5) for 48 timer. 48t kultivert vev ble deretter podet på CAM (cE8) og bygge i ovo ytterligere 10 dager. Seriell deler av CAM-avledet explants (B-G) ble analysert av konvensjonelle histologi (B og C) og immunohistochemistry (D til G). I B og C (høyere forstørrelse av B), var lysbildet farget med H & E. I D og E (høyere forstørrelse av D), lysbildet immunodetected med QCPN antistoffer og counterstained med Gill's hematoxylin. I F og G (høyere forstørrelse av F), lysbildet immunodetected med anti-Pan CK antistoff og counterstained med Gill's hematoxylin. Svart pilespisser pek sterk brun immunostaining QCPN (E) og Pan CK (G). Se Tabellen for materiale for oppkjøpet bildedetaljer. Ca, brusk; EP, epitel; PP, pharyngeal veske; SoM, glatt muskel. Skalere barer: 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 viser eksperimentell design brukt å utvikle ex vivo vaktel-kylling chimeric organer. Heterospecific association of vev var vokst i vitro 48 h etterfulgt av ovo utvikling i 10 dager (figur 2A). Thymi dannet i CAM-avledet explants ble identifisert av konvensjonelle histology. Brisselen presentert normal morfologiske funksjoner med velutviklet marg og cortex rom (figur 2B, C). Seriell deler av explants ble ytterligere behandlet for immunocytochemistry (figur 2D- G), beskrevet5,7. QCPN - MAb vaktel perinuclear (figur 2D, E) og anti-pan cytokeratin (CK) (figur 2F, G) antistoffer ble brukt som markører for vaktel (artsspesifikke) og epitelceller, henholdsvis. Chimeric thymus viste QCPN+ thymic epitelceller (figur 2D, E), reticular arkitektur (figur 2F, G) og kolonisering av lymfoide celler (QCPN-) av donor opprinnelse (kylling).
| Isolert vev | Utviklingsstadium | Konsentrasjon | Temperatur | Inkubasjonstid |
| Svelg endoderm | q E2 - E2.5 | 8 mg/mL | På is | 45-60 minutter. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| q E3 | 8 mg/mL | På is | 60 - 90 min. | |
| c E3.5 | ||||
| q E4 | 8 mg/mL | På is | 90 min. | |
| c E4.5 | ||||
| Somatopleura mesoderm | q E2 - E2.5 | 8 mg/mL | På is | 30-50 minutter. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| c, kylling; E, embryonale dag; q, Vaktel. | ||||
Tabell 1: Forhold enzymatisk fordøyelsen under embryonale vev isolasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Embryonale vev isolasjon prosedyren finnesher ble forbedret fra tidligere metoder for å produsere vaktel-kylling chimeric embryoer i ulike biologiske sammenhenger3,5,6.
Denne tilnærmingen er egnet til å isolere ren embryonale vev uten at genetisk manipulasjon eller bruk av vev-spesifikke markører, som ofte ikke fastslått, begrense bruk av genmodifiserte dyr modeller. Det kan brukes å studere epithelial-mesenchymal interaksjoner under utvikling, muligheten til å isolere ren vev blir den begrensende faktoren. For eksempel, som utvikling utvikler seg, vev blir tykkere, mer kompakt og legge til andre nærliggende vev slik at deres atskillelse er vanskeligere. Denne isolasjon prosedyren er derfor uegnet for senere stadier av utvikling, nemlig slutten-organogenesen.
Denne metoden er unikt å studere genuttrykk 3D bevarte embryonale vev. For å sikre 3D-integriteten til isolerte vev, bør instrumenter, materialer og løsninger holdes ved lave temperaturer gjennom hele prosessen.
Vev microdissection prosedyren er også et avgjørende skritt som bruker, ikke bare forsiktig etableringen av eksperimentelle forhold (som temperatur og varigheten av enzymatisk fordøyelsen, som eksemplifisert i tabell 1), men også på den tidkrevende praktisk opplæring. Denne prosedyren krever tålmodighet og praksis. Hvis operatør mister referansene i regionen være dissekert, gir redusere stereoscope forstørrelse (20 x) en total observasjon som vil hjelpe neste trekk beslutning.
48 h i vitro trinn ble etablert for å fremme mobilnettet samspillet mellom forskjellige embryonale vev, mens det i ovo vev vokst i CAM støtter langsiktig utvikling og chimeric orgel dannelsen av tilknytningen heterospecific vev 5. i vitro vev foreninger kan overvinne noen begrensninger i vivo manipulasjoner. For eksempel, lokal administrasjon av narkotika eller vekstfaktorer (med perler) i områder av embryoet ellers utilgjengelige i vivo, enkelt utføres med denne i vitro. Dette har tidligere vist for å etterligne lokale vev interaksjoner under orgel formasjonen i pharyngeal regionen5.
Explants vokser i CAM5,7,8 er mindre tidkrevende og er en enkel metode for å spore explants sammenlignet med måter å samle inn vev podet på kroppen veggen chimeric embryo3. I tillegg CAM kan være transplantert celler og vev fra andre ikke-avian arter, og det har blitt brukt i flere eksperimentelle sammenhenger, fra utvikling til kreft14,15. For eksempel CAM analysen ble tidligere brukt i mus i kylling xenografts studier16 og brukes ofte til å teste invasiv kapasitet menneskelige svulst cellene15.
Nylig har en elegant studie med mennesker i kylling xenograft validert kylling embryoet som en modell å teste og utforske tidlig menneskelig utvikling17. I fremtiden vil det være interessant å utforske metodikk beskrevet her bruker interspecies sammenslutning av vev, som kan gi flere tilnærminger til musen og menneskelige utviklingsmessige studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlig til Isabel Alcobia for kritisk lesing av manuskriptet, Mário Henriques for video lydkommentarer og Vitor Proa fra tjenesten Histology Instituto de Histologia e Biologia gjøre Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, kundestøtte. Vi er spesielt gjeld til Paulo Caeiro og Hugo Silva fra Unidade de audiovisuais (audiovisuelle enhet), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa for deres enestående engasjement for produksjon av denne videoen. Vi erkjenner Leica Microsystems for vennlig å gi en stereoscope utstyrt med en system og Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, sa for å bidra med vaktelegg befruktede egg. Dette arbeidet ble støttet av Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
