Summary
Este artigo fornece um método para isolar tecidos embrionários puros de codorna e galinha de embriões que podem ser combinados para formar ex vivo de órgãos quimérico.
Abstract
A capacidade de isolar tecidos embrionários foi um passo essencial para o estabelecimento do sistema de codorna-frango Quimera, que por sua vez tem proporcionado contribuições indiscutível para desvelar processos-chave na biologia do desenvolvimento.
Aqui é descrito um método otimizado para isolar tecidos embrionários de codornas e galinhas por microcirurgia e digestão enzimática, preservando suas propriedades biológicas. Após o isolamento, os tecidos de ambas as espécies são associados em um ensaio in vitro de organotypic para 48 h. codorniz e tecidos de frango podem ser discriminados por distintas características nucleares e marcadores moleculares, permitindo o estudo da Cruz-conversa entre celulares heterospecific Associação dos tecidos. Esta abordagem é, portanto, uma ferramenta útil para estudar interações do tecido complexo em processos de desenvolvimento com modificações espaciais altamente dinâmicas, tais como os que ocorrem durante a morfogênese da faringe e a formação do foregut órgãos derivados endoderme. Esta abordagem experimental foi desenvolvida para estudar as interações epitelial-mesenquimal durante os estágios iniciais de formação do timo. Neste, a endoderme-derivado rudimento prospectivo do Timo e derivados mesoderme mesênquima, foram isoladas a partir de embriões de codorna e galinha, respectivamente.
A capacidade dos tecidos associados para gerar órgãos pode ser ainda mais testada por enxertia-los para a membrana corioalantoicas (CAM) de um embrião de galinha. O CAM fornece nutrientes e permite trocas gasosas aos tecidos explantados. Após 10 dias de no desenvolvimento do ovo, os órgãos quiméricoes podem ser analisados nos explantes colhidos pelos métodos convencionais de morfológicos. Este procedimento também permite estudar as contribuições específicas do tecido durante a formação do órgão, de seu desenvolvimento inicial (desenvolvimento in vitro) para as etapas finais da organogênese (no desenvolvimento do ovo).
Finalmente, o método de isolamento melhorada também fornece tridimensional (3D) preservado tecidos embrionários, que também podem ser usados para análise topográfica de alta resolução de padrões de expressão gênica-tecido-específica.
Introduction
Na década de 1970, um sistema de Quimera de codorna-frango elegante foi desenvolvido por Le Douarin, abrindo novas vias para compreender o papel da migração celular e interacções celulares durante o desenvolvimento,1,2. O modelo foi concebido na premissa de que troca de células entre as duas espécies não incomodaria significativamente a embriogênese, confirmada mais tarde quando costumava estudar inúmeros processos de desenvolvimento, incluindo a formação do sistema nervoso e o hematopoiéticas sistemas de1. Tomando este último como um exemplo, as ondas cíclicas de progenitores hematopoiéticos, colonizando o rudimento epitelial tímico foi observado pela primeira vez usando o sistema de codorna-frango Quimera3. Por isso, o território em perspectiva do timo, a endoderme de malotes (3/4PP), terceiros e quarto lugar da faringe foi mecanicamente e enzimaticamente isolado de embriões de codorna (q) 15 a 30 - fase somite [dia embrionário (E) 1.5-E2.5]. Estas fases correspondem a galinha de Hamburger e Hamilton4 (HH) - estágios 12-17. Os procedimentos de isolamento começaram com o uso de tripsina para dissociar enzimaticamente a endoderme da mesênquima anexada. A endoderme isolada foi enxertada na região somatopleura do embrião de galinha (c) anfitrião na E3-E3.5 (HH-estágios 20-21). Este mesênquima heteróloga foi considerada "permissiva" para desenvolvimento de epitélio tímico, contribuindo também para a formação de órgão3. Depois, sucessivas ondas frango progenitor pelo sangue das células do hospedeiro se infiltrou a codorna doador tímicas epiteliais contraparte contribuindo para formação do Timo no embrião do anfitrião3.
Mais recentemente, uma versão modificada desta abordagem também provou-se para ser importante para o estudo de interações epitelial-mesenquimal durante os estágios iniciais de Timo formação5. A este respeito, os tecidos envolvidos na formação do Timo ectópico em embriões quimérico3 foram isolados, tanto a partir de embriões de doador e host e associados ex vivo. Um protocolo melhorado foi usado para isolar a endoderme 3/4PP de codorniz (E2.5-E3) e mesoderme frango somatopleura (E2.5-E3). Brevemente, tecidos embrionários foram isolados por microcirurgia e sujeitas a digestão in vitro pancreatina. Além disso, as condições de digestão enzimática, temperatura e tempo de incubação foram otimizadas de acordo com o tipo de tecido e grau de desenvolvimento (tabela 1).
Em seguida, os tecidos isolados foram associados em um organotypic em vitro sistema durante 48 h, como relatado anteriormente5,6. A associação in vitro de tecidos imita as locais interações celulares no embrião, superar algumas restrições da manipulação in vivo. Este sistema é particularmente útil para estudar interações celulares no complexo morphogenic eventos, tais como o desenvolvimento do aparato da faringe.
A contribuição de cada tecido na histogênese timo, bem como a capacidade da Associação heterospecific para gerar um timo pode ser ainda mais explorado usando a metodologia de CAM, anteriormente detalhadas5,7,8. Sucintamente, os tecidos cultivados foram enxertados o CAM de embriões cE8 e permitiu desenvolver-se em ovo por 10 dias. Então, formação de Timo foi avaliada por análise morfológica nos explantes colhidos. Conforme os estudos clássicos de codorna-galinha3, o epitélio tímico codorna foi colonizado por células progenitoras hematopoiéticas (HPCs), derivadas do embrião de galinha, que mais tarde foi mostrado para contribuir para o desenvolvimento de órgão9,10 . Os HPCs migraram do embrião para o Timo ectópico quimérico através do altamente vascularizado CAM5,7,8. Codorniz epitélio tímico derivado pode ser identificado por imuno-histoquímica utilizando anticorpos espécie-específicos (i.e., QCPN - MAb codorna PeriNuclear), superando a necessidade de marcadores moleculares de tecido-específica.
Esse método experimental, como a abordagem em duas fases, relatada no anterior publicação8, permite a modulação das vias de sinalização regular Administração de agentes farmacológicos durante in vitro e no desenvolvimento do ovo. Além disso, explantes podem ser colhidas em qualquer ponto do tempo do curso do experimento8.
Por último, o protocolo de isolamento aqui detalhado permite a preservação das propriedades naturais e 3D-arquitetura de tecidos embrionários, particularmente útil para o detalhamento de padrões em situ-expressão do gene embrionário territórios caso contrário inacessível por métodos convencionais. Além disso, abordagens de análise do transcriptoma, incluindo RNA-seq ou microarrays, também podem ser aplicadas em tecidos isolados sem a necessidade de marcadores genéticos, proporcionando uma análise de "omics" alto throughput tecido-específica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todas estas experiências sigam os cuidados com animais e diretrizes éticas do Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. fertilizados incubação de ovos de codorna e galinha
- Lugar fertilizado ovos de codornas japonesas (Coturnix japonica coturnix) numa incubadora umidificado de 38 ° C durante 3 dias. Incube os ovos (fim brusco do ovo) virada para cima na câmara de ar.
Nota: O ambiente umidificado é conseguido colocando um recipiente de água na parte inferior da incubadora. - Incube os ovos fertilizados de galinha (Gallus gallus) 2,5 dias numa incubadora umidificado de 38 ° C. Incubar os ovos na posição horizontal e marcar a parte superior usando um pedaço de carvão para identificar a localização do embrião.
Nota: Comece com 40 ovos de codorna e 60 ovos de galinha ao estabelecer esta experiência.
2. isolamento de endoderme codorna que contém o domínio em perspectiva do rudimento do Timo
Nota: Use uma capa de fluxo laminar horizontal e instrumentos esterilizados e materiais para procedimentos de manipulação de ovo em condições estéreis.
- Remover a região embrionária que contém o território presuntivo de rudimento do timo, região arco faríngea, contendo os 3rd e 4th arcos (3/4PAR), como descrito7,8.
- Encha uma tigela grande de vidro de borosilicato (100 x 50 mm; 100 cm3) com 60 mL de solução salina tamponada de fosfato fria (PBS).
- Com a ajuda de uma tesoura curva, toque e cortar um buraco circular no shell de uma codorna ovo que tem sido incubado por 3 dias. Fazer o buraco no lado oposto do ovo sem corte e transferir a gema (com o embrião) para a tigela com PBS frio.
- Remova o embrião da gema cortando a membrana vitelínico externamente aos navios extra embrionários usando tesouras curvas.
- Com a ajuda da pinça fina, transferência do embrião para uma tigela pequena (60 x 30 mm; 15 cm3) preenchido com 10 mL de PBS frio.
- Com uma escumadeira, mover o embrião para uma placa de Petri com uma base preta de 100 mm (ver Tabela de materiais) contendo 10 mL de PBS frio e coloque-o sob um estereomicroscópio.
- Disse o 3/4PAR, como descrito anteriormente8.
- Aspire o 3/4PAR e transferir para um prato de vidro 3/4 cheio de PBS frio usando uma pipeta Pasteur estéril de 2 mL.
- Isole a endoderme contendo o território presuntivo de rudimento do timo (endoderme 3/4PP) por digestão enzimática com pancreatina.
- Com a ajuda de uma espátula e pinça fina, transferência a 3/4PAR para um prato de vidro 3/4 cheio de fria pancreatina (8 mg/mL; diluição de 1:3 de 25 mg/mL com PBS frio).
- Incube durante 1 h no gelo por digestão enzimática.
Nota: O tempo de digestão enzimática depende do estágio de desenvolvimento (tabela 1). - Coloque o prato de vidro sob o microscópio estereoscópico (ampliação de x-60 x 40) para isolar a endoderme do 4PAR/3.
Nota: Mantenha todas as superfícies e soluções frio durante este procedimento. Mudar para uma nova solução de pancreatina frio se demorar muito tempo para dissecar os tecidos (> 15 min). Como uma fonte de iluminação, use luzes LED incorporadas no estereomicroscópio ou nas fibras ópticas, considerando a carga de calor limitada. - Para isolar a endoderme os tecidos circundantes, use dois microscalpels de aço inoxidável em titulares de pino.
Nota: Use microscalpels com um diâmetro entre 0,1 mm e 0,2 mm e detentores de pino de níquel com um diâmetro de abertura do maxilar de 0 mm a 1 mm.- Primeiro remova o tubo neural e mesoderme anexado à superfície dorsal da endoderme da faringe.
- Com o lado dorsal para cima, desanexar e Retire cuidadosamente a mesênquima entre os arcos da faringe e expor as bolsas faríngeas. Execute este procedimento em ambos os lados da 4PAR/3.
- Remova o tubo de coração e a mesênquima circundante anteriores malotes.
- Com o lado ventral para cima, corte do ectoderma dond 2 e 3rd arcos pharyngeal e remova cuidadosamente a mesênquima anexada para malotes. Repita este procedimento do outro lado do 3/4PAR. Nesta fase o rudimento da tireoide deve ser visível.
- Remova qualquer restantes células mesenquimais anexadas a endoderme da faringe com os dois microscalpels.
- Faça um corte transversal entre os 2nd e 3rd PP, dissociando a endoderme da faringe contendo os 3rd e 4th malotes da parte anterior da endoderme tendo o rudimento de tireoide e 2nd bolsa faríngea.
- Com a ajuda de uma espátula e pinça fina, transferência isolada 3/4PP endoderme para um prato de vidro 3/4 cheio de 100% frio fetal de soro bovino (FBS).
- Mantenha o prato de vidro com os tecidos isolados no gelo durante a preparação do ensaio in vitro. Como alternativa, os tecidos isolados podem ser preservados tridimensionalmente e analisadas no local para expressão do gene.
3. isolamento da mesoderme somatopleura de frango
Nota: Ovo de executar procedimentos de manipulação em condições estéreis, usando um capuz de fluxo laminar horizontal e instrumentos esterilizados e materiais.
- Remova o território embrionário contendo a mesoderme somatopleura ao nível dos somitas 19-24 (ss19-24).
- Remova o ovo de galinha da incubadora após 2,5 dias de incubação.
- Com uma tesoura curva, abra um pequeno buraco no shell. Inserir uma agulha e aspirar 2 mL de albumina com uma seringa de 10 mL para diminuir volume dentro do ovo, albumina e impedir os danos do embrião (localizado abaixo da região marcada do reservatório). Descarte a albumina aspirada.
- Cortar uma circular do furo (até dois terços da superfície superior) na região do reservatório com uma tesoura curva marcada.
- Corte a membrana vitelínico externamente aos vasos extraembryonic mantendo o embrião com pinça fina.
- Sob um estereomicroscópio, coloca o embrião em um prato de Petri de 100 mm com uma base preta contendo 10 mL de PBS frio.
Nota: Use um estereomicroscópio desse ponto em diante para ampliação progressiva dos procedimentos de microcirurgia. - Use quatro pinos finos de insetos para manter o embrião à parte inferior da placa. Coloque os pinos na região extraembryonic, formando um quadrado.
- Execute dois cortes entre as somitas 19 e 24 transversalmente ao eixo do embrião e atravessando todo o território embrião, usando tesouras de olho wecker.
- Liberar a seção de embrião, ss19-24, por cortar bordas marginais embrionárias.
- Aspire o ss19-24 tecidos e transferir para um prato de vidro 3/4 cheio de PBS frio usando uma pipeta Pasteur estéril de 2 mL.
- Isole a mesoderme lateral da região somatopleura (ss19-24) por digestão enzimática com pancreatina (8 mg/mL; diluição de 1:3 de 25 mg/mL com PBS frio).
- Com a ajuda de uma espátula e pinça fina, transferência dos tecidos ss19-24 para um copo prato três quartos cheios de solução fria de pancreatina.
- Incube durante 30 min no gelo por digestão enzimática.
- Sob o microscópio estereoscópico, isole a mesoderme os tecidos circundantes, usando duas microscalpels em um suporte.
Nota: Mantenha todas as superfícies e soluções frio durante este procedimento. Mudar para uma nova solução de pancreatina frio se demorar muito tempo para dissecar os tecidos (> 10 min.). Como uma fonte de iluminação, use luzes LED incorporadas no estereomicroscópio ou nas fibras ópticas, considerando a carga de calor limitada. - Durante o isolamento da mesoderme, primeiro remova o ectoderma da superfície seguido por cuidadoso descolamento dos tecidos splancnopleura localizado ventralmente.
- Lançamento da somatopleura por cortá-lo em um movimento paralelo ao tubo neural mesoderme lateral direita.
- Repita a separação de mesoderme do lado esquerdo do embrião.
Nota: Fazer diminuir microscalpel movimentos durante este procedimento. As proteínas de matriz extracelular expostas manter instrumentos impedindo movimentos fluidos e tecidos. - Com a ajuda de uma espátula e pinça fina transferência a mesoderme isolada para um prato de vidro 3/4 cheio de frio FBS.
- Mantenha o prato de vidro com os tecidos isolados no gelo durante a preparação do ensaio in vitro.
4. In vitro organotypic ensaio: Associação de heterospecific de codorna 3/4PP endoderme e mesoderme somatopleura de frango
- Prepare o meio de cultura com RPMI-1640, suplementado com 10% FBS e 1% caneta/Strep3,5.
- Coloque uma grade de metal em um tubo de ensaio com 5 mL de meio de cultura de 35mm.
Nota: Remova o excesso de líquido para nivelar a superfície média com a parte superior da grade. - Com a ajuda da pinça fina, mergulhe um filtro de membrana no meio de cultura e em seguida, coloque-o na parte superior da grade para ter uma superfície em contacto com o ar.
Nota: Um quarto da área da membrana (com 13 mm de diâmetro) é adequado para a associação de tecido. - Sob o microscópio estereoscópico, associe os tecidos isolados na parte superior do filtro de membrana. Primeiro transferir 3/4PP endoderme (passo 2) do prato de vidro, deslizando suave com a ajuda de uma colher de transplante (ou espátula) e fina fórceps. Repita este procedimento para a mesoderma isolada (etapa 3).
Nota: Com a ajuda de um microscalpel, mistura os tecidos para maximizar sua associação. - Coloque cuidadosamente os tecidos associados numa incubadora umidificado a 37 ° C com 5% de CO2 para tecidos cultivadas de 48 h. podem ser enxertados a membrana corioalantoicas (CAM).
Nota: Formação de órgão ectópica no CAM foi anteriormente detalhadas8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O protocolo detalha um método para isolar tecidos embrionários aviária para ser usado em várias abordagens técnicas de biologia celular e do desenvolvimento. Este método foi empregado anteriormente para estudar interações epitelial-mesenquimal durante as fases iniciais de Timo formação5. Neste documento, novos resultados são mostrados na Figura 1 e Figura 2, usando abordagens semelhantes.
Figura 1 . Resultados representativos da expressão genética estudo de tridimensionalmente preservado endoderme da faringe contendo o território presuntivo de rudimento o Timo. Representação esquemática do aparelho faríngeo e endoderme isolado contendo a 2PP, 3PP e 4PP (em cE3.5 ou qE3) (A). Toda a montagem em hibridação in situ com BMP7 (B) e Sonic Hedgehog (C) da endoderme isolada no cE3.5. Os sinais de hibridação forte de BMP7 e Sonic Hedgehog apontaram por pontas de seta brancas na endoderme do 2PP e 3PP (B) e faringe central (C), respectivamente. A, anterior; cE, dia embrionárias de galinha; L, à esquerda; P, posterior; PP, bolsa faríngea; qE, codorna dia embrionário; R, direita. Escala de barras, 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 1 é um desenho esquemático da endoderme isolado da faringe em qE3 (e cE3.5) (Figura 1A) e a expressão in situ de dois genes relacionados com endoderme, sonic hedgehog11,12 e BMP713 no tecido isolado. Os hibridação in situ de toda a montagem procedimentos foram realizados como descrito anteriormente5,7. A expressão de BMP7 foi detectada na endoderme do 2PP e 3PP e excluída da faringe central e 4PP (sonda foi gentilmente fornecido por Elisabeth Dupin) (Figura 1B). Por outro lado, sonic hedgehog foi detectado na endoderme da faringe central e excluído os malotes7 (Figura 1C).
Figura 2 . Resultados representativos de ex vivo formação de órgãos quiméricoes. Representação esquemática da abordagem experimental utilizada para desenvolver thymi quimérico de codorna-galinha (A). Brevemente, a endoderme de 3/4PP codorna isolado (qE3) foi associada in-vitro mesoderme de frango somatopleura (cE2.5) por 48 h. Os tecidos de 48 h cultivada foram então enxertados o CAM (cE8) e permitiu desenvolver-se em ovo por mais de 10 dias. Seriais seções de explantes de CAM-derivado (B-G) foram analisadas pela histologia convencional (B e C) e imuno-histoquímica (D a G). Em B e C (maior ampliação de B), o slide foi manchado com H & E. Em D e E (aumento de D), o slide foi immunodetected com anticorpo QCPN e counterstained com hematoxilina de Gill. Em F e G (maior ampliação de F), o slide foi immunodetected com anticorpo CK anti-Pan e counterstained com hematoxilina de Gill. Seta preta cabeças apontam para forte immunostaining marrom de QCPN (E) e Pan CK (G). Consulte Tabela de materiais para detalhes de aquisição de imagem. CA, cartilagem; EP, epitélio; PP, bolsa faríngea; SoM, músculo liso. Barras de escala: 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 2 mostra o delineamento experimental utilizado para desenvolver ex vivo órgãos quimérico de codorna-galinha. A associação de heterospecific de tecidos foram cultivada in vitro por 48 h, seguida-se no desenvolvimento do ovo por 10 dias (Figura 2A). Thymi formada em CAM-derivado de explantes foram identificados pela histologia convencional. O Timo apresentou características morfológicas normais com compartimentos bem desenvolvidos de córtex e medula (Figura 2B, C). Seriais seções dos explantes foram tratadas mais por imunocitoquímica (Figura 2D- G), como descrito5,7. O QCPN - MAb codorna perinuclear (Figura 2D, E) e anti-pan citoqueratinas (CK) (Figura 2F, G) anticorpos foram utilizados como marcadores de codorna (espécie) e células epiteliais, respectivamente. O Timo quimérico mostrou células epiteliais tímicas QCPN+ (Figura 2D, E), uma arquitetura reticular (Figura 2F, G) e colonização por células linfoides (QCPN-) de origem do doador (frango).
| Isolada de tecido | Estágio de desenvolvimento | Concentração | Temperatura | Período de incubação |
| Endoderme da faringe | q E2 - E2.5 | 8 mg/mL | No gelo | 45 – 60 min. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| q E3 | 8 mg/mL | No gelo | 60 - 90 min. | |
| c E3.5 | ||||
| q E4 | 8 mg/mL | No gelo | 90 min. | |
| c e 4.5 | ||||
| Somatopleura mesoderme | q E2 - E2.5 | 8 mg/mL | No gelo | 30 – 50 min. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| c, frango; E, um dia embrionário; q, codorna. | ||||
Tabela 1: Condições de digestão enzimática durante o isolamento de tecidos embrionários.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O procedimento de isolamento de tecido embrionário detalhado aqui foi melhorado de técnicas anteriores para produzir embriões quiméricoes de codorna-frango em diferentes contextos biológicos3,5,6.
Essa abordagem é apropriada isolar tecidos embrionários puros sem a necessidade de manipulação genética ou o uso de marcadores de tecido-específica, que muitas vezes são indeterminadas, limitando o uso de modelos de animais geneticamente modificados. Ele pode ser usado para estudar interações epitelial-mesenquimal durante o desenvolvimento, com a capacidade de isolar os tecidos puros, sendo o fator limitante. Por exemplo, como progride de desenvolvimento, os tecidos tornam-se mais espessa, mais compacto e anexar a outros tecidos vizinhos, tal que sua separação é mais difícil. Este procedimento de isolamento é, portanto, inadequado para estágios posteriores de desenvolvimento, ou seja atrasado-organogênese.
Este método é exclusivo para estudar a expressão gênica em 3D-preservados de tecidos embrionários. Para garantir a integridade dos tecidos isolados 3D, instrumentos, materiais e soluções devem ser mantidas a baixas temperaturas durante todo o processo.
O procedimento de microdissection tecido também é um passo crítico que depende, não só a criação cuidadosa das condições experimentais (como temperatura e duração da digestão enzimática, como exemplificado na tabela 1), mas também sobre o treinamento hands-on time-consuming. Este procedimento exige paciência e prática. Se o operador perde as referências da região para serem dissecados, diminuindo a ampliação de estereoscópio (20 x) irá fornecer uma observação geral que irá ajudar a próxima decisão de movimento.
Estabeleceu-se a 48 h em vitro passo para promover as interacções celulares distintos tecidos embrionários, enquanto o ovo em tecidos cultivados em câmara suporta o desenvolvimento a longo prazo e formação de órgão quimérico da Associação heterospecific de tecidos 5. as associações de tecidos in vitro podem superar algumas limitações de manipulações em vivo. Por exemplo, a administração local de drogas ou fatores de crescimento (usando grânulos) nas regiões do embrião inacessível na vivo, pode ser facilmente executada usando esta abordagem in vitro. Isto tem mostrado anteriormente para imitar as interações de tecido local durante a formação do órgão na região faríngea5.
Colheita de explantes crescendo na CAM5,7,8 é menos demorada e é um método simples para rastrear explants quando comparado aos métodos de recolha de tecidos enxertados na parede do corpo dos embriões quimérico3. Além disso, o CAM pode ser transplantado com células e tecidos de outras espécies de aves, e tem sido utilizado com sucesso em vários contextos experimentais, de desenvolvimento de câncer14,15. Por exemplo, o ensaio de CAM foi anteriormente aplicado em camundongos-em-frango xenografts estudos16 e é frequentemente usado para testar a capacidade invasiva das células de tumores humanos15.
Recentemente, um estudo elegante com humanos-em-frango xenoenxertos validou o embrião da galinha como um modelo para testar e explorar precoce desenvolvimento humano17. No futuro, será interessante explorar a metodologia descrita neste documento usando a associação entre espécies de tecidos, que pode proporcionar abordagens adicionais para o mouse e estudos do desenvolvimento humanos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores são gratos à Isabel Alcobia para a leitura crítica do manuscrito, a Mário Henriques para a narração e para Vitor Proa do serviço de histologia do Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, para suporte técnico. Estamos particularmente agradecidos a Paulo Caeiro e Hugo Silva da Unidade de audiovisuais (unidade do Audiovisual), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa para seu compromisso excepcional para a produção deste vídeo. Reconhecemos a Leica Microsystems para gentilmente fornecendo um estereoscópio equipado com um sistema de vídeo e a Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A. por contribuir com codorna fertilizado ovos. Este trabalho foi apoiado pela Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
