Summary
Эта статья предоставляет метод для изоляции чисто эмбриональных тканей из перепелов и курица эмбрионов, которые могут быть объединены в ex vivo химерных органов.
Abstract
Способность изолировать эмбриональных тканей является важным шагом для создания системы Химера перепела курица, которая в свою очередь неоспоримый вклад в открытие ключевых процессов в биологии развития.
Здесь будет описано оптимизированный метод для изоляции эмбриональных тканей из перепелов и куры микрохирургии и ферментативного пищеварения при сохранении его биологических свойств. После изоляции тканей из обоих видов связаны в assay в пробирке organotypic за 48 ч. перепела и курица тканей могут подвергаться ядерной особенностями и молекулярных маркеров, позволяя изучение клеточных кросс беседы между неспецифический Ассоциация тканей. Таким образом, этот подход является полезным инструментом для изучения взаимодействия сложных тканей в процессы развития с высокодинамичные пространственные изменения, например тех, кто во время глоточные морфогенеза и формирование Передняя кишка эндодермы производные органы. Этот экспериментальный подход был впервые разработан для изучения эпителия мезенхимальных взаимодействий во время ранних стадиях формирования тимуса. В этом, энтодермы производные перспективных тимуса рудимент и мезодермы производных мезенхимы, были изолированы от перепела и куриного эмбриона, соответственно.
Связанные тканей способность генерировать органов может быть далее проверена путем прививки их на chorioallantoic мембрану (CAM) куриного эмбриона. CAM позволяет обмена газа в explanted ткани и питательных веществ. После 10 дней в развитии ovo химерных органы могут быть проанализированы в заготовленной эксплантов обычные Морфологические методы. Эта процедура также позволяет изучать ткани конкретных взносов во время формирования органа, от его первоначальной разработки (в лабораторных условиях развития) на заключительных этапах органогенеза (в развитии ovo).
Наконец, метод улучшения изоляции также предоставляет трехмерно (3D) сохранились эмбриональных тканей, которые могут также использоваться для высокого разрешения топографический анализ экспрессии генов ткани конкретных моделей.
Introduction
В начале 1970-х элегантный перепела курица Химера система была разработана Le Douarin, открывая новые возможности для понимания роли миграции клеток и клеточных взаимодействия во время разработки1,2. Модель была разработана исходя из того, что клетки обмен между двумя видами не будет значительно нарушить эмбриогенеза, позднее подтвердили, когда используется для изучения многочисленных процессов развития, включая формирование нервной и Кроветворная системы1. Принимая последний, как например, циклические гемопоэтических прародителей, колонизируя тимуса эпителиальные рудимент был впервые наблюдать волны с помощью системы перепела курица Химера3. Для этого перспективные территории тимуса, энтодермы третий и четвертый глоточные Чехлы (3/4PP), был механически и ферментативно изолирован от перепела (q) эмбрионов на 15-30 - Сомит стадии [1,5 E2.5 эмбриональных день (E)]. Эти этапы соответствуют куриный гамбургер и Хэмилтон4 (HH) - 12-17 этапов. Процедуры изоляции началась с использованием трипсина ферментативно не присоединяться энтодермы от прилагаемый мезенхимы. Изолированные энтодермы был привитые в регионе somatopleura эмбриона курицы (c) разместить на E3-E3.5 (HH-этапы 20-21). Этот гетерологичных Мезенхима считался «разрешительный» для развития тимуса эпителия, также способствующих формирования органа3. Потом последовательные волны Куриные хост кровь прогениторных клеток проникли перепелиные доноров тимуса эпителиальные двойники способствует формированию тимуса в принимающей эмбриона3.
Совсем недавно модифицированную версию этого подхода также было доказано, чтобы быть важным для изучения эпителия мезенхимальных взаимодействий во время ранних стадиях формирования тимуса5. В этом отношении ткани, участвует в формировании внематочная тимуса в эмбрионов химерных3 были изолированы, оба от доноров и принимающих эмбрионы и связанные ex vivo. Улучшенная протокол был использован для изолировать энтодермы Перепелиные 3/4PP (E2.5-E3) и куриные somatopleura мезодермы (E2.5-E3). Вкратце эмбриональных тканей были изолированы, микрохирургии и при условии соблюдения в пробирке Панкреатин пищеварение. Кроме того условия ферментативного пищеварения, температура и время инкубации были оптимизированы по ткани типа и стадии развития (Таблица 1).
Далее изолированные тканей были связаны в organotypic в системе in vitro в течение 48 часов, как сообщалось ранее5,6. В пробирке Ассоциация тканей имитирует местной сотовой взаимодействий в эмбрион, преодолеть некоторые ограничения в естественных условиях манипуляции. Эта система особенно полезна для изучения клеточных взаимодействия в сложных морфообразующих события, такие как развитие глоточные аппарата.
Вклад каждого ткани тимуса Гистогенез, а также способность неспецифический ассоциации для создания тимуса может быть изучены с использованием методологии CAM, ранее подробные5,,78. Лаконично культивированный тканей были привитым CAM Уэ8 эмбрионов и позволило разработать в ovo на 10 дней. Затем тимус формирования была оценена морфологического анализа в заготовленной эксплантов. Как в классических исследований куриные перепелиные3перепелиные тимуса эпителия была колонизирована гемопоэтических предшественников клетки (HPCs), полученные из куриного эмбриона, который позднее был показан вносить орган развития9,10 . HPCs мигрировали из эмбриона внематочная химерных тимуса через5,высоко васкуляризированной CAM,7,,8. Перепелка, производные тимуса эпителия может быть идентифицирован иммуногистохимии, используя вегетационных антитела (т.е., QCPN - МАБ перепелиные PeriNuclear), преодоление потребность тканей конкретных молекулярных маркеров.
Этот экспериментальный метод, как сообщалось в предыдущие публикации8, двухэтапный подход позволяет модуляции сигнальных путей регулярные администрации фармакологических агентов во время в пробирке и в развитии ovo. Кроме того эксплантов могут быть собраны в любой момент времени курс эксперимент8.
И наконец Протокол изоляции здесь подробно позволяет сохранение природных свойств и 3D-архитектура эмбриональных тканей, особенно полезно для детализации структуры на местах экспрессии генов эмбриональных территорий в противном случае недоступны обычные методы. Кроме того транскриптом анализ подходов, включая РНК seq или microarrays, может также применяться в отдельных тканях не требуя генетических маркеров, обеспечивая анализ «омику» ткани конкретных высокой пропускной способности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эти эксперименты следовать ухода за животными и этические принципы Medicina де истории Centro de Lisboa.
1. перепела и куриные яйца инкубации оплодотворенной
- Место оплодотворенные яйца японского перепела (перепела перепела japonica) в увлажненные инкубатор 38 ° C в течение 3 дней. Инкубируйте яйца (яйцо тупой конец) вверх в воздушные камеры.
Примечание: Увлажненный окружающей среды достигается путем размещения контейнер воды в нижней части инкубатора. - Инкубируйте оплодотворенные яйца куриные (Gallus gallus) 2,5 дней в 38 ° C увлажненные инкубатора. Инкубировать яйца в горизонтальном положении и Марк верхней стороне, используя кусок древесного угля для определения местоположения эмбриона.
Примечание: Начать с 40 перепелиные яйца и 60 Куриные яйца, при установлении этого эксперимента.
2. изоляция перепелиные энтодермы, содержащий перспективных домен тимуса рудимент
Примечание: Используйте горизонтальные Ламинарный шкаф и стерилизовать инструменты и материалы для процедур обработки яйцо в стерильных условиях.
- Удаление эмбриональных области, содержащие территории предполагаемого тимуса рудимент, глоточные арка региона, содержащий 3rd и 4й арки (3/4PAR), как описано в7,8.
- Заполните чашу большой боросиликатное стекло (100 мм х 50 мм; 100 см3) с 60 мл холодного фосфат буфер солевой раствор (PBS).
- С помощью изогнутые ножницы коснитесь и вырезать круглое отверстие в корпусе перепелиные яйца, инкубировали в течение 3 дней. Сделайте отверстие на противоположной стороне яйцо тупым и передачи желток (с эмбриона) в миску с холодной PBS.
- Удалите эмбриона от желтка, резка vitelline мембраны внешне экстра эмбриональных судов с использованием изогнутые ножницы.
- С помощью тонкой щипцы передачи эмбриона в небольшой миске (60 x 30 мм, 15 см3) заполнены с 10 мл холодного PBS.
- С скиммера, переместить эмбриона в 100 мм Петри с черным основанием (см. Таблицу материалы) содержащие 10 мл холодного PBS и поместите его под стереомикроскопом.
- Вскрыть 3/4PAR, как описано выше8.
- Аспирационная 3/4PAR и передачи в стеклянную посуду три четверти заполнены с холодной PBS с помощью 2 мл стерильные пипетки Пастера.
- Изолируйте энтодермы, содержащий территории предполагаемого тимуса рудимент (3/4PP эндодермы) путем ферментативного пищеварения с Панкреатин.
- С помощью шпателя и тонкий щипцы передачи 3/4PAR стекло блюдо три четверти заполнены с холодной Панкреатин (8 мг/мл; разбавления 1:3, 25 мг/мл с холодной PBS).
- Инкубируйте 1 час на льду для ферментативного пищеварения.
Примечание: Время ферментативного пищеварения зависит от стадии развития (Таблица 1). - Установите стеклянную посуду под стереомикроскопом (40 x-60 крат), чтобы изолировать энтодермы от 3/4PAR.
Примечание: Сохраняйте все поверхности и решения холодной во время этой процедуры. Изменить в новое решение холодной Панкреатин, если слишком много времени для рассечения тканей (> 15 мин). Качестве источника освещения используйте светодиодные огни включены в стереомикроскопом или оптических волокон, учитывая ограниченные тепловой нагрузки. - Чтобы изолировать энтодермы от окружающих тканей, используйте две из нержавеющей стали микроскальпели в Держатели PIN-код.
Примечание: Используйте микроскальпели диаметром от 0,1 мм – 0,2 мм и никель ПИН Держатели с челюсть открытия диаметром 0 мм до 1 мм.- Сначала удалите нервной трубки и мезодермы, на спинной поверхности глотки энтодермы.
- С спинной стороне вверх тщательно отсоединения и удаления Мезенхима между глотки арки и разоблачить глоточные чехлы. Выполните эту процедуру на обеих сторонах 3 4PAR.
- Удаление сердце трубки и мезенхимы, вокруг передней чехлы.
- С вентральной стороне вверх вырезать эктодермы 2nd и 3rd глоточные арки и тщательно удалить мезенхимы, придает чехлы. Повторите эту процедуру на другой стороне 3/4PAR. На данном этапе рудимент щитовидной железы должны быть видны.
- Удалите любые оставшиеся мезенхимальных клеток, придает глоточные энтодермы с двумя микроскальпели.
- Сделать поперечный разрез между 2-й и 3rd PP, отделения глоточные энтодермы, содержащий 3rd и 4й Чехлы из передней части энтодермы, рудимент щитовидной железы и 2nd глоточной сумке.
- С помощью шпателя и тонкий щипцы передачи изолированных энтодермы 3/4PP стекло блюдо три четверти заполнены с 100% холодной плода бычьим сывороточным (ФБС).
- Держите стеклянную посуду с изолированной тканей на льду во время подготовки в пробирке assay. Кроме того изолированные тканей могут сохраняться трехмерно и на месте проанализированы для выражения гена.
3. изоляция курица somatopleura мезодермы
Примечание: Выполнение яйцо процедур обработки в стерильных условиях, с использованием горизонтальной Ламинарный шкаф и стерилизации инструментов и материалов.
- Удаление эмбриональных территории, содержащие somatopleura мезодермы на уровне сегменты 19-24 (ss19-24).
- Удаление куриное яйцо из инкубатора после 2,5 дней инкубации.
- Изогнутые ножницы откройте небольшое отверстие в корпусе. Вставьте иглу и аспирационная 2 мл альбумина с 10 мл шприц для снижения альбумина объем внутри яйца и предотвращения повреждения зародыша (находится ниже регионе заметно оболочки). Отменить без наддува альбумина.
- Циркуляр вырезать отверстие в регионе заметно консоли с помощью изогнутые ножницы (до двух третей площади верхней поверхности).
- Вырежьте vitelline мембраны внешне extraembryonic сосудов, удерживая эмбриона тонким пинцетом.
- Под стереомикроскопом место эмбриона в 100 мм Петри с черная база, содержащая 10 мл холодного PBS.
Примечание: Используйте стереомикроскопом от этой точки вперед для прогрессивного увеличения микрохирургии процедур. - Используйте четыре тонкие штыри насекомых провести эмбриона в нижней части пластины. Место контакты в регионе extraembryonic, образуя квадратную форму.
- Выполнение двух разрезов между 19 и 24 поперечно к оси эмбриона сегменты и пересекает всю территорию эмбриона, ножницами Веккер глаз.
- Релиз разделе эмбриона, ss19-24, резка маргинальных эмбриональных края.
- Аспирационная ss19-24 тканей и передачи в стеклянную посуду три четверти заполнены с холодной PBS с помощью 2 мл стерильные пипетки Пастера.
- Изолируйте боковой мезодермы из района somatopleura (ss19-24), ферментативного пищеварения с Панкреатин (8 мг/мл; разбавления 1:3, 25 мг/мл с холодной PBS).
- С помощью шпателя и тонкий щипцы, передачи ss19-24 тканей на стакан блюдо три четверти заполнены раствором холодной Панкреатин.
- Инкубируйте 30 мин на льду для ферментативного пищеварения.
- Под стереомикроскопом изолируйте мезодермы от окружающих тканей, с использованием двух микроскальпели в держатель.
Примечание: Сохраняйте все поверхности и решения холодной во время этой процедуры. Изменить в новое решение холодной Панкреатин, если слишком много времени для рассечения тканей (> 10 мин.). Качестве источника освещения используйте светодиодные огни включены в стереомикроскопом или оптических волокон, учитывая ограниченные тепловой нагрузки. - Во время изоляции мезодермы сначала удалите эктодермы на поверхности после тщательного отряд вентрально расположен splancnopleura тканей.
- Релиз правой боковой мезодермы somatopleura путем разрезания его в параллельное движение к нервной трубки.
- Повторите разделение мезодермы в левой части зародыша.
Примечание: Убедитесь, медленно microscalpel движений во время этой процедуры. Матрица подвергается внеклеточных белков прилипает к ткани и инструментов предотвращения движения жидкости. - С помощью лопаточки и тонкий щипцы передачи изолированных мезодермы стеклянную посуду три четверти заполнены с холодной FBS.
- Держите стеклянную посуду с изолированной тканей на льду во время подготовки в пробирке assay.
4. В пробирке organotypic проба: неспецифический Ассоциация Перепелиные 3/4PP энтодермы и мезодермы курица somatopleura
- Подготовка питательной среды с среднего RPMI 1640, дополненная 10% FBS и 1% перо/Strep3,5.
- Установите металлическую сетку в 35 мм Петри с 5 мл питательной среды.
Примечание: Удалите избыток жидкости до уровня средней поверхности с верхней части сетки. - С помощью тонкой щипцы окунуть мембранный фильтр в питательной среды и затем поместите его в верхней сетке, чтобы иметь одну поверхность при контакте с воздухом.
Примечание: Одна четверть области мембраны (с 13 мм диаметром) является достаточным для ассоциации ткани. - Под стереомикроскопом свяжите изолированных тканей верхней части мембраны фильтра. Сначала передачи 3/4PP эндодермы (шаг 2) из стеклянную посуду с нежным скольжения с помощью трансплантации ложкой (или шпателем) и тонкого щипцами. Повторите эту процедуру для изолированных Мезодерма (шаг 3).
Примечание: С помощью microscalpel, сочетание тканей, чтобы максимизировать свои ассоциации. - Осторожно поместите связанные тканей в увлажненные инкубатора при 37 ° C с 5% CO2 на 48 ч. искусственный тканей можно привитым chorioallantoic мембраны (CAM).
Примечание: Внематочная орган формирования в CAM был ранее подробные8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол подробно метод, чтобы изолировать птичьего эмбриональных тканей для использования в нескольких сотовых и развития биологии технических подходов. Этот метод был ранее работал учиться эпителия мезенхимальных взаимодействий во время ранних стадиях формирования тимуса5. Здесь новые результаты показаны на рис. 1 и рис. 2, с использованием аналогичных подходов.
Рисунок 1 . Представитель результаты экспрессии генов изучение трехмерно сохраняются глоточный энтодермы, содержащий территории предполагаемого из тимуса рудимент. Схематическое представление глоточные аппарата и изолированных энтодермы, содержащий 2PP, 3PP и 4PP (на cE3.5 или qE3) (A). Целом гора гибридизации in situ с BMP7 (B) и Sonic ежа (C) из изолированных энтодермы на cE3.5. Сильный гибридизации сигналов BMP7 и Еж Соник указал на белые стрелки в энтодермы 2PP и 3PP (B) и Центральный глотки (C), соответственно. A, передней; cE, куриного эмбриона день; L, слева; P, задняя; PP, глоточной сумке; qE, перепелиные эмбриональных день; R, право. Масштаб баров, 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 1 представлена схематический чертеж энтодермы, изолированных от глотки в qE3 (и cE3.5) (рис . 1A) и на месте выражение двух генов, связанных с энтодермы, Еж Соник11,12 и BMP713 в изолированных ткани. Целом гора в гибридизации situ процедуры были выполнены как описано5,7. Выражение BMP7 был обнаружен в энтодермы 2PP и 3PP и исключены из Центральной глотки и 4PP (зонд был любезно предоставляемый Elisabeth Дюпен) (рис . 1B). И наоборот Еж Соник был обнаружен в энтодермы Центральной глотки и исключены из Чехлы7 (Рисунок 1 C).
Рисунок 2 . Представитель результаты ex vivo формирования химерных органов. Схематическое представление экспериментальный подход, используемый для разработки перепела курица химерных thymi (A). Кратко изолированные Перепелиные 3/4PP эндодермы (qE3) было связано в пробирке с Мезодерма курица somatopleura (cE2.5) за 48 ч. 48 ч культивированный тканей были затем привитым CAM (Уэ8) и позволило разработать в ovo для дальнейшего 10 дней. Серийный разделы CAM-производные эксплантов (B-G) были проанализированы иммуногистохимия (D - G) и обычных гистологии (B и C). В B и C (увеличение B) слайд был окрашенных с H & E. В D и E (увеличение D) слайд был immunodetected с QCPN антител и counterstained с Джилл в гематоксилином. F и G (увеличение F) слайд был immunodetected с CK антитела анти Пан и counterstained с Джилл в гематоксилином. Черная стрелка главы указывают на сильное коричневый иммуноокрашивания QCPN (E) и Пан CK (G). Смотрите Таблицу материалы приобретение деталей изображения. CA, хряща; EP, эпителия; PP, глоточной сумке; Сом, гладких мышц. Масштаб бары: 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 изображает экспериментальный дизайн, используется для разработки ex vivo перепела курица химерных органов. Неспецифический ассоциации тканей были выращены в лабораторных условиях в течение 48 часов, следуют в развитии ovo на 10 дней (рисунок 2A). Thymi, образованная в CAM-производные эксплантов были определены обычных гистологии. Тимуса представил нормальной морфологические особенности с развитой продолговатого мозга и коры отсеков (Рисунок 2Б, C). Серийный разделы эксплантов были далее лечение immunocytochemistry (Рисунок 2D- G), как описано в5,7. QCPN - MAb перепелиные perinuclear (Рисунок 2D, E) и анти Пан Цитокератины (CK) (Рисунок 2F, G) антитела были использованы в качестве маркеров для перепелов (вегетационных) и эпителиальных клеток, соответственно. Химерных вилочковой железы показал тимуса эпителиальные клетки QCPN+ (Рисунок 2D, E), ретикулярных архитектуры (Рисунок 2F, G) и колонизации лимфоидных клеток (QCPN-) доноров происхождения (курица).
| Изолированные ткани | Стадии разработки | Концентрация | Температура | Инкубационный период |
| Глотки эндодермы | q E2 - E2.5 | 8 мг/мл | На льду | 45-60 мин. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| q E3 | 8 мг/мл | На льду | 60 - 90 мин. | |
| c E3.5 | ||||
| q E4 | 8 мг/мл | На льду | 90 мин. | |
| c E4.5 | ||||
| Somatopleura мезодермы | q E2 - E2.5 | 8 мг/мл | На льду | 30 – 50 мин. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| c, курицы; E, эмбриональных день; q, перепела. | ||||
Таблица 1: Условия ферментативного пищеварения при изоляции эмбриональных тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
От предыдущих методов для создания химерных перепела куриных эмбрионах в различных биологических условиях3,5,6была улучшена процедура изоляции эмбриональных тканей, подробно здесь.
Этот подход подходит для изоляции чисто эмбриональной ткани без генетических манипуляций или использование тканей специфических маркеров, которые часто неопределенного, ограничивая использование генетически модифицированных животных моделей. Он может использоваться для изучения эпителия мезенхимальных взаимодействия во время разработки, с возможность изолировать чистой ткани является ограничивающим фактором. Например по мере развития, ткани становятся толще, более компактной и прикрепить в другие соседние ткани, таким образом, что их разделение является более сложным. Таким образом, эта процедура изоляция непригодна для более поздних стадиях развития, а именно конца органогенеза.
Этот метод является уникальным для изучения экспрессии генов в 3D-сохранены зародышевых тканях. Для обеспечения 3D-целостности отдельных тканей, инструменты, материалы и решения должны храниться при низких температурах на протяжении всего процесса.
Процедура microdissection ткани также является важным шагом, который опирается не только на тщательно создание экспериментальных условий (например, температуры и продолжительности ферментативного пищеварения, как свидетельствует в таблице 1), но и на длительной практической подготовки. Эта процедура требует терпения и практики. Если оператор теряет ссылки региона будут расчленены, уменьшение масштаба стереоскоп (20 x) обеспечит общее замечание, что поможет решению следующий шаг.
48 ч в vitro шаг был создан для содействия сотовой взаимодействия отдельных эмбриональных тканей, а в ovo ткани, выращенных в CAM поддерживает долгосрочное развитие и формирование химерных органа ассоциации неспецифический тканей 5. Ассоциации в пробирке тканей может преодолеть некоторые ограничения в естественных условиях манипуляций. Например, в местной администрации наркотиков или факторов роста (с использованием бисера) в регионах эмбриона, недоступные в естественных условиях, могут быть легко выполнены с использованием этого подхода в пробирке. Это показал ранее для имитации взаимодействия местных тканей во время формирования органа в глотки региона5.
Заготовка эксплантов, растущих в Кулачок5,,78 меньше времени и что простой способ отслеживать эксплантах по сравнению с методами сбора ткани, привитым стенки тела эмбрионов химерных3. Кроме того CAM можно пересадить с клетки и ткани от других видов, нептичьи, и она успешно используется в нескольких экспериментальных контекстах, от разработки до рака14,15. К примеру CAM ранее применялась в мышей в курица ксенотрасплантатов исследования16 и часто используется для тестирования инвазивного потенциала человека опухоли клетки15.
Недавно элегантный исследование с человека в курица ксенотрансплантата проверила куриного эмбриона как модель для тестирования и изучения раннего развития человека17. В будущем это будет интересно изучить методологии, здесь описаны с помощью межвидовой ассоциации тканей, которые может предоставить дополнительные подходы к мыши и человеческого развития исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Изабель Alcobia для критического чтения рукописи, Марио Энрикес для видео повествования и Vitor Proa от службы гистология Instituto de Histologia e Biologia делать Desenvolvimento, прослушал де Medicina де Lisboa, Universidade de Lisboa, для технической поддержки. Мы признательны особенно Паулу Caeiro и Уго Силва из Unidade de audiovisuais (аудиовизуальных единица), прослушал де Medicina де Lisboa, Universidade de Lisboa за их выдающуюся приверженность производства этого видео. Мы признаем Leica Microsystems за любезно предоставление стереоскоп, оборудовано системой видео и для Interaves - Sociedade Агро-Pecuária, С.А. вклад с перепелиным оплодотворенных яиц. Эта работа была поддержана прослушал де Medicina де Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
