Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Иодид желтый флуоресцентный белок разрыв соединения межклеточные связи Assay

Published: February 1, 2019 doi: 10.3791/58966
Automatic Translation
1, 1
1College of Pharmacy, Yonsei Institute of Pharmaceutical Sciences, Yonsei University

Summary

Здесь мы представляем протокол для Роман разрыв соединения межклеточные связи assay предназначен для высокопроизводительного скрининга разрыв соединения модулирующих химических веществ для обнаружения наркотиков и токсикологические оценки.

Abstract

Разрыв соединения (GJs) являются каналы клеточной мембраны, которые позволяют диффузии молекул меньше 1 кДа между соседними ячейками. Как они физиологических и патологических ролей, существует необходимость высокопроизводительного скрининга (HTS) анализов для выявления GJ модуляторы в наркотиками открытий и токсикологии анализов. Роман йодид желтый флуоресцентный белок разрыв соединения межклеточные связи (I-рекламы ЯФП-GJIC) пробирного удовлетворяет эту потребность. Это на основе ячеек пробирного, включая доноров и акцепторов клетки, которые разработаны для стабильно Экспресс вариант желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП), чьи флуоресценции чутко закаленном йодида, или SLC26A4, иодид транспортер, соответственно. Когда йодида добавляется к смешанной культуре клеток двух типов, они ввести клеток донора через SLC26A4 транспортер и диффузного в прилегающих акцептора клетки через GJs где они утолить рекламы ЯФП флуоресценции. Рекламы ЯФП флуоресценции измеряется от скважины в кинетическую режиме. GJ деятельность отражает скорость тушения рекламы ЯФП. Assay надежный и быстрый, чтобы использоваться для Хайтс Протокол assay рекламы ЯФП-GJIC с использованием LN215 клеток, клеток глиомы человека, описал.

Introduction

Разрыв соединения (GJs) выступать в качестве межклеточного каналы, чтобы разрешить распространение малых молекул < 1 кДа таких питательных веществ, метаболитов и сигнальных молекул между соседними ячейками. Соединительной элементы включают hemichannel или Коннексоны в каждой ячейке, и каждый Коннексоны представляет собой шесть connexins (Cxs)1. GJs и Cxs были использованы в токсикологии анализов канцерогенных веществ таких как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), которые являются GJ ингибиторы2,3,4. Нарушена GJIC был связан с nongenotoxic канцерогенез5,6. Как потенциальной терапевтической цели ГДЖ участие было сообщено в частности подтипы изъятий7,8, защита от сердца и мозга ишемии/реперфузии травмы9, мигрень с аурой10, лекарственно индуцированные травма печени6,11и ранозаживляющее12. Высокопроизводительного скрининга (HTS) анализы необходимы для выявления GJ-модулирующих химических веществ или антител для обнаружения наркотиков, для анализов токсикологии и выявления роман сотовой регуляторы активности GJ. HTS анализов может также использоваться для расследования связей структура активность GJ модуляторы2,13,,1415.

Некоторые GJIC анализы включают переноса красителя или двойной патч зажим методов. Люцифер желтый чемпион (LY) и Флуорексон acetoxymethyl эфира (Флуорексон ам) были использованы в красителях передача анализов. Клетки не проницаемой для LY, который вводится путем микроинъекции, лом загрузки или электропорации. Раз внутри клетки, LY распространяется на соседние клетки через GJs и GJ деятельность assayed масштабы миграции LY16. Флуорексон-ам анализов обычно включают в себя разрыв флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание17,18. Флуорексон-ам является клеток permeant красителем, который внутриклеточно преобразован в непроницаемой Флуорексон внутренней эстеразы. Assay требует Конфокальный микроскоп для наблюдения за передачей Флуорексон ам в клетку от окружающих его после лазерной Фотообесцвечивание. Если функциональные GJs присутствуют, Флуорексон ам в соседних ячейках входит photobleached клеток и флуоресценции восстанавливается. GJ активность assayed по степени восстановления флуоресценции клеток photobleached. Анализы на красителях передача кропотливая и требует много времени или низкой чувствительности. Зажим двойной патч является электрофизиологических метод, который измеряет соединительной проводимости. Это относительно чувствительных, с прямая зависимость проводимости на количество открытых GJs19; Однако она является технически сложным, трудоемким и дорогим20. Assay рекламы ЯФП-GJIC был разработан для использования в Хайтс

Рисунок 1 иллюстрирует компоненты и действия рекламы-ЯФП GJIC assay, который использует акцептора клетки, выражая вариант рекламы ЯФП йодид чувствительных, H148Q и I152L (QLрекламы ЯФП) и клеток донора, выражая йодида транспортера (SLC26A4)21 . Две мутации, перевозимых рекламы ЯФПQL позволяют тушения флуоресценции йодида22. Йодиды добавляются к совместно культивируемых акцептора и клеток донора; не вводите акцептора клетки, они принимаются до настоящего SLC26A4 транспортеры на клеток донора. Йодиды в клеток донора диффундируют через функционирование GJs в прилегающих акцептора клетки, где они утоляют рекламы ЯФПQL флуоресценции. Если GJs закрыты или заблокированы ингибиторы, йодида нельзя ввести акцептора клетки, чтобы утолить флуоресценции. GJ деятельность отражает скорость тушения рекламы ЯФПQL . Процедура анализа GJIC рекламы-ЯФП сложным ни много времени. Он совместим с HTS и может использоваться для проверки воздействия большого числа соединений на ГДЖ активность в течение относительно короткого периода. Он требует только акцептора и клеток донора и два сбалансированных солевых растворов. Протокол, в описанный ниже основывается на LN215 клетки, чьи основные Cx-Cx4321. LN215-рекламы ЯФПQL рецепторов и LN215-я− доноров клеток были порожденных трансдукция с lentiviruses, выражая рекламы ЯФПQL или SLC26A421,23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. поколение lentiviruses, выражая рекламы ЯФПQL и SLC26A4

  1. Растут HEK293T человеческих эмбриональных почечных клеток до 80% confluency на 100 мм культуры пластин. Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) дополнены плода бычьим сывороточным 10%, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл является питательной среды, используемые протоколом для поддержания HEK293T и другие клетки, указанных ниже.
  2. 6-ну культуры пластины пальто, добавив 2 мл 0,005% раствора стерильную поли L-лизин (PLL) для каждой скважины на 10 мин аспирационная PLL решения и ополосните поверхность два раза с 2 мл стерильной воды.
  3. Мойка HEK293T клетки с 10 мл фосфата буфер солевой раствор (PBS) и лечения монослои клеток в каждое блюдо 100 мм с 2 мл 0,25% раствора трипсина ЭДТА при 37 ° C на 3 мин добавить 5 мл питательной среды и Ресуспензируйте клетки.
  4. Подсчитать ячейки в Горяева и регулировка плотности суспензии клеток до 250.000 клеток/мл в питательной среды и добавьте 500000 клеток в 2 мл питательной среды для каждого лизин покрытием хорошо плит 6-хорошо. Инкубировать клетки в увлажненные 5% CO2/95% воздуха атмосферы при 37 ° C в течение 24 часов и затем замените культурной среде DMEM без пенициллина и стрептомицина.
  5. В 1,5 мл трубку Разбавьте 20 мкл Реагента трансфекции с 500 мкл DMEM без сыворотки или антибиотики. Осторожно перемешать, закупорить и дать постоять 5 мин при комнатной температуре.
  6. Тем временем, Пипетка 250 мкл DMEM в каждый из двух 1.5 мл пробирок и затем добавить 1500 нг pLVX Энн-рекламы ЯФПQL или pLenti6P-SLC26A4, 1225 нг psPAX2 и 375 нг pMD2.G каждому. Два лентивирусные плазмид были ранее описанных21. Добавить 250 мкл разбавленного трансфекции реагента в каждую пробирку плазмида, осторожно перемешать и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре.
  7. После 20 минут добавьте 500 мкл Реагента и плазмиды комплексов трансфекции в 1,5 мл пробирок каплям для каждой культуры пластины Шаг 1.4 и микс, тряся пластину и обратно. Инкубируйте клетки при 37 ° C в CO2 инкубатора для 12 h.
  8. Замените носитель 2,5 мл свежей среды и проинкубируйте дополнительных 48 ч. Затем место пластину культуры на льду для 5 минут чтобы кондиционером среду, содержащую человека, охлажденные поддерживать инфективности.
  9. Сбор средств массовой информации, содержащие lentiviruses и передать 15 мл конические трубы. Центрифуга на 3000 x g при 4 ° C на 3 мин, а затем удалите плавающей HEK293T клетки из супернатанта, фильтрации на 0,4 мкм.
  10. Храните носитель, содержащий lentiviruses на 4 ° C для использования в течение 2 дней. Для последующего использования храните 200 мкл аликвоты −80 ° C.

2. LN215-рекламы ЯФПQL и LN215 поколения-я− клеток лентивирусные трансдукция

  1. Растут LN215 клеток в культуре тарелки 100 мм до 80%, confluency в среде DMEM, дополненная 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) 100 ед/мл пенициллин и 100 мкг/мл стрептомицина, как описано выше.
    Примечание: Если рекламы ЯФП-GJIC assay проводится с помощью различных ячеек строки, используйте соответствующие питательной среды. LN215-рекламы ЯФПQLи LN215-я– клетки могут быть предоставлены Фондом университет-промышленность, Йонсейского университета. Пожалуйста, свяжитесь с соответствующей автором.
  2. Один день до трансдукции, мыть дважды с 10 мл PBS, ячейками с 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА при 37 ° C на 3 мин Ресуспензируйте клетки в 5 мл питательной среды с 10 мл Серологические Пипетки и регулировка плотности 50 000 клеток/мл. Добавьте 20 000 ячеек в 400 мкл средств массовой информации в каждой скважине 24-ну культуры пластины для лечения не вирус, рекламы ЯФПQL, и SLC26A4 клетки.
  3. После 24 ч инкубации при 37 ° C передают два колодца, заменив питательной среды с 400 мкл смесь 1:1 pLVX Энн-рекламы ЯФПQL или pLenti6P-SLC26A4 Лентивирусы и свежей питательной среды, дополняется Полибрен в конечной концентрации 4 мкг/мл. Для элементов управления не вирус замените питательной среды.
  4. Инкубации клеток при 37 ° C на 15 h, аспирационная носитель, содержащий lentiviruses, добавить свежей питательной среды и инкубации клеток для дополнительного 72 ч.
    Предупреждение: Для предотвращения заражения человека между скважинами, используйте новые советы или пипетки для каждой скважины при аспирационная питательной среды, содержащие Лентивирусы или распределять свежий роста среднего.
  5. Мыть каждый хорошо дважды с 0,5 мл PBS, ячейками с 300 мкл трипсина-ЭДТА на 3 мин Ресуспензируйте клетки в 2 мл питательной среды и пластины в шести ну культуры пластин с 2 мкг/мл puromycin.
  6. Культура клетки в средствах массовой информации, содержащие 2 мкг/мл puromycin, до тех пор, пока все ячейки в элементе управления хорошо мертвы (круглые или плавающей когда наблюдается в Микроскоп), который обычно занимает неделю. Обновите культуры средств массовой информации, содержащие puromycin каждый день в период отбора. Если LN215-рекламы ЯФПQL или LN215-я– культур стали притока до завершения отбора, передачи клетки до 100 мм пластины и продолжить выбор как шаг 2,5.

3. Подготовка необходимых для assay решений

  1. Подготовка 500 мл раствора C (10 мм HEPES, 140 мм NaCl, глюкоза 10 мм, 5 мм KCl, 1 мм MgCl2и 1 мм CaCl2) и 500 мл раствора (10 мм HEPES, 140 мм Най, глюкоза 10 мм, 5 мм KCl и 1 мм CaCl2).
  2. Отрегулируйте пэ-аш обоих решений 7.4 с 1 N NaOH, стерилизовать решения путем фильтрации на 0,4 мкм для хранения. Хранить при 4 ° C до 1 месяца. Перед использованием проверьте pH.

4. покрытие LN215-рекламы ЯФПQL и LN215-я− клетки

  1. Культура LN215-рекламы ЯФПQL и LN215-я− клетки в 100 мм пластин отдельно в питательной среды для охвата населения, необходимые для анализа. LN215-рекламы ЯФПQL и LN215-я− клетки в 40% и 80% confluency в 100 мм пластин, соответственно, достаточно для assay 96-луночных пластины.
  2. Один день до проведения рекламы-ЯФП GJIC assay, мыть каждой пластины культуры 100 мм с 10 мл ФСБ. Лечить каждый плита с 2 мл 0,25% раствора трипсина ЭДТА и инкубировать и при 37 ° C за 5 мин Ресуспензируйте ячеек в каждой пластинке в 4 мл питательной среды и передаче 15 мл конические трубы.
  3. Пелле клетки центрифугированием на 1000 x g на 3 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле каждой ячейки с 5 мл питательной среды. Разбейте любой ячейки сгустки в отдельные клетки, закупорить вверх и вниз примерно в 20 раз с 10 мл Серологические Пипетки.
  4. Подсчитать ячейки в Горяева и разбавленных клетки в культуре среднего сделать суспензий клеток LN215-рекламы ЯФПQL на 80000 клеток/мл и LN215-я− на 160 000 клеток/мл.
  5. Микс 7 мл LN215-рекламы ЯФПQL и 7 мл LN215-я− клеточных суспензий в водоеме. Добавьте 100 мкл смеси в каждой скважине плиты культуры 96-луночных клеток с помощью многоканальных дозаторов.
    Примечание: Чтобы добавить 100 мкл смеси в каждой скважине 96-луночных ячейки листа, необходимо около 10 мл суспензии смешанных клеток. Рекомендуется сделать больше суспензию клеток, чем необходимо.
  6. Инкубировать клетки в увлажненный воздуха /95% 5% CO2при 37 ° C в течение 24 ч. LN215-рекламы ЯФПQL и LN215-я−клеточной культуры должно быть 100% притока, когда проводится assay.

5. проведение рекламы-ЯФП GJIC assay

Примечание: Использование флуоресцентным микроскопом с 20 кратным увеличением и GFP фильтр для проверки пластины 96-Ну чтобы там нет скопления LN215-рекламы ЯФПQL или LN215-SLC26A4 клеток и что культуры клеток, полностью вырожденная и хорошо распространяется до проведение анализа.

  1. По крайней мере 30 минут, прежде чем делать пробу, включите Гонав и 37 ° c.
  2. Мыть трубы автоматического инжектора с 3 мл 70% этанола, 3 мл дистиллированной воды, а затем 3 мл раствора со скоростью потока 300 мкл/сек.
  3. Теплый C - и я решения до 37 ° C в водяной бане.
    Примечание: Каждый раз при необходимости 100 мкл каждого решения для каждой скважины 96-луночных пластины около 10 мл каждого решения необходим для калибровочных. Еще 10 мл раствора я-необходима для грунтования каждой пластины (в общей сложности 20 мл) и еще 25 мл раствора C необходим для мытья каждой пластины (в общей сложности 35 мл).
  4. Аспирационная среднего роста или инвертировать пластины, очистить его; вытряхнуть остаточного среднего.
    Примечание: Остаточные плода бычьим сывороточным в СМИ роста вызывает фон флуоресценции и снижение в Пробирной качества.
  5. Мкл 200 C-решения для каждой скважины из водоема с помощью многоканальных дозаторов. Аспирационная C-раствор или инвертировать пластину пустые и вытряхнуть остаточного решения.
  6. Добавьте 50 мкл мкл C-раствор, 1 мкл 2,5 мм химических запасов (см. таблицу 1) или диметилсульфоксид (ДМСО) как средство, а затем 50 мкл мкл C-решение для каждой скважины с многоканальные пипетки.
    Примечание: Большинство реагентов в библиотеке химических растворяются в ДМСО и до 1% (v/v) допускается в большинстве на основе ячеек анализов24. ДМСО имеет более высокую плотность, чем вода, реагентов, растворенных в ДМСО, как правило, спуститься на дно при добавлении к культуре тарелка скважин, которая беспокоит концентрации пробирного решений. Это можно обойти путем добавления 50 мкл C-раствор, реагенты в ДМСО и 50 мкл C - решение в порядке. Последние 50 мкл раствора C предназначен для смешивания.
  7. Инкубируйте клетки при 37 ° C в воздухе, а не 5% CO2. Время инкубации могут быть изменены, но 10 мин обычно достаточно для ионного канала модуляторы действовать.
  8. Во время инкубации, установите программу чтения Гонав придать 100 мкл-решения для каждой скважины в 1 s и для измерения флуоресценции 10 s s промежутки 0.4. Установите читателю читать флуоресценции снизу. Рекомендуется инъекции скорость составляет 135 мкл/s. набор длина волны возбуждения 485 Нм и чтения выбросов на 520 Нм.
    Примечание: Подробные параметры для программ Считыватель микропланшетов заключаются в следующем.
    1. Нажмите кнопку Управление протоколами .
    2. Нажмите кнопку создать . Выберите Интенсивность флуоресценции в разделе метод измерения и Хорошо режим в чтении раздел режим. Затем нажмите кнопку ОК . Появится новая вкладка.
    3. В Основные параметры меню, установите волны возбуждения 485 Нм и выбросов на 520 Нм. Выберите Снизу оптической читать флуоресценции со дна. Время для начала задать измерение «0 s», количество интервалов для быть «25», количество вспышек в колодец и интервал, чтобы быть «20» и интервал времени, чтобы быть «0,4 s».
    4. В меню Макет выберите нарисуйте область пластины для чтения.
    5. В Концентрации/тома/Shacking меню установите Считыватель микропланшетов придать 100 мкл-решения для каждой скважины с 135 мкл/s скорость впрыска.
      Примечание: Избегайте быстрее скорости впрыска, потому что они могут привести к отряд клеток.
    6. В меню время впрыска , установить время начала впрыска 1 s. Затем нажмите кнопку Начать измерение .
  9. После инкубации Поместите пластины для 96-луночных микропланшетов читателя и начать измерения, нажав кнопку Начать измерения снова.

6. Расчет GJIC деятельности

  1. Вычислить проценты рекламы ЯФПQL закалки и GJIC деятельности23
    Рекламы ЯФПQL закалки (%) =Equation 1
    GJIC активность (%) =Equation 2
    Примечание: В принципе, GJIC активности должен рассчитываться от разницы процентных рекламы ЯФП флуоресценции в скважинах с акцептором клеток и клеток донора и акцептор ячейка соответствующей только скважин. Однако, как LN215-рекламы ЯФПQL клетки показывают, незначительным рекламы ЯФП закалки, иодид после 10 s, мы не берем на фоне рекламы ЯФП закалки во внимание при проведении HTS с помощью LN215-рекламы ЯФПQL и LN215-я– клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Двадцать девять 96-луночных культуры пластины были использованы для экрана 2,320 химических веществ для определения романа Модуляторы GJIC рекламы-ЯФП GJIC анализа с использованием LN215-рекламы ЯФПQL и LN215-я− клетки. На рисунке 2показаны результаты, полученные с табличкой представитель. Процент рекламы ЯФП флуоресценции в каждой скважине показана как линейную диаграмму в Рисунок 2A и процент GJIC активности в каждом хорошо показано в графе бар в рисунке 2B. Негативные и позитивные элементы управления и 80 химических веществ, которые были экранированы приводятся в таблице 1. Каждый хорошо обращались 25 мкм соединения для 10 мин тербинафина полностью препятствует GJIC и homosalate тормозится примерно 50% GJIC. Тербинафина было подтверждено как ингибитор GJ. Его доза реакция, обратимость и другие экспериментальные результаты были опубликованы в другом месте23.

Figure 1
Рисунок 1 : Компоненты и действия рекламы-ЯФП assay GJIC (A) представляют акцептор желтого и темно желтый пятиугольники клетки, выражая рекламы ЯФПQL до и после закалки. Черный пятиугольники являются клеток донора, выражая SLC26A4. Синие полосы являются GJs и красные SLC26A4 транспортеры. Розовый круги, йодиды. При GJs (Верхняя панель), йодиды проходят через SLC26A4 и введите в ячейку доноров. Йодиды мигрировать прилегающих акцептора клетки через GJs. йодиды закалочная рекламы ЯФП флуоресценции клеток акцептора. Если GJs закрыты (Нижняя панель), йодиды, введя клеток донора нельзя переместить в соседние клетки акцептора и сохраняются только в клетках доноров. После добавления йодиды (B) Фазовый контраст и флуоресцентных изображений при выполнении рекламы ЯФП-GJIC assay рекламы ЯФП флуоресценции клеток акцептора не снижается значительно. Когда акцептора и доноров клеток были покрытием в соотношении 1:1, рекламы ЯФПQL закалки наблюдалась в 1 мин, после йодиды были добавлены (Верхняя панель). Когда только акцептора клетки были покрытием, иодид лечения за 1 мин не привело к значительным рекламы ЯФПQL закалки21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Представитель HTS результатов, используя assay рекламы ЯФП-GJIC (A) суспензии из смеси 1:2 LN215-рекламы ЯФПQL и LN215-я− клетки были покрытием и инкубированы на 24 часа, как описано в протоколе раздела 4. Клетки были затем промывают и относились с транспортного средства или химических веществ в протокол раздела 5. Все химические вещества дубликатах как 25 мкм образцы из запасов решения 2,5 мм в ДМСО на 10 мин. Каждый хорошо содержал 1 мкл ДМСО и 100 мкл C-решения. Первой и последней строк пластины были переданы отрицательной (автомобиль) и положительный (carbenoxolone) элементов управления. Остальные 80 скважин были использованы для химических веществ, перечисленных в таблице 1. После лечения рекламы ЯФП-GJIC assay было проведено скважины, как протокол раздела 5. Доля рекламы ЯФП флуоресценции в каждой скважине на каждый раз, когда нормализуется к значению 2 s и заговор против времени. Линии на рисунке представляют изменения в рекламы ЯФП флуоресценции в каждой скважине. Рекламы ЯФП флуоресценции в большинстве хорошо 10 s варьировались от 70% до 80%. Тербинафина и homosalate были потенциальных хитов за ГДЖ ингибиторы (B) Гистограмма показывает процент GJIC активность каждого из 96 скважин. Процент GJIC деятельность была рассчитана как показано в шаге 6.1 протокол и изобразить в гистограмме против хорошо чисел. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Хорошо № Позиция Химическая Хорошо № Позиция Химическая
1 A01 ДМСО 49 E01 ДМСО
2 A02 difloxacin гидрохлорид 50 E02 пропофол
3 A03 Бетаметазон валерат 51 E03 Олеандомицин фосфат
4 A04 Эритромицин 52 E04 Миансерин гидрохлорид
5 A05 Cyproheptadine гидрохлорид 53 E05 валсартан
6 A06 Лиотиронин 54 E06 Salsalate
7 A07 теофиллин 55 E07 Гидрокортизон
8 A08 tolnaftate 56 E08 rifaximin
9 A09 Trimethobenzamide гидрохлорид 57 E09 adrenolone гидрохлорид
10 A10 Цефамандол nafate 58 E10 имиквимод
11 A11 Диметиловый фумарат 59 E11 Ноноксинол-9
12 A12 CBX 60 E12 CBX
13 B01 ДМСО 61 F01 ДМСО
14 B02 Пирацетам 62 F02 ranolazine
15 B03 глюконацетон 63 F03 danthron
16 B04 azlocillin натрия 64 F04 acedapsone
17 B05 Холина хлорид 65 F05 Atomoxetine гидрохлорид
18 B06 аторвастатина кальция 66 F06 desoxycorticosterone ацетат
19 B07 oxyphencyclimine гидрохлорид 67 F07 Трамадол гидрохлорид
20 B08 пропафенон гидрохлорид 68 F08 Тербинафина гидрохлорид
21 B09 Флуконазол 69 F09 Топирамат
22 B10 Ловастатин 70 F10 Гемифлоксацин мезилат
23 B11 Блеомицин (блеомицин b2 показано) 71 F11 правастатина натрия
24 B12 CBX 72 F12 CBX
25 C01 ДМСО 73 G01 ДМСО
26 C02 Ацесульфам калия 74 G02 levalbuterol гидрохлорид
27 C03 Тенипозид 75 G03 Метформин гидрохлорид
28 C04 дубильной кислоты 76 G04 Pregabalin
29 C05 carprofen 77 G05 Топотекан гидрохлорид
30 C06 Гидроксихлорохин сульфат 78 G06 phenoxybenzamine гидрохлорид
31 C07 Пентоксифиллин 79 G07 arecoline гидробромид
32 C08 mepivacaine гидрохлорид 80 G08 Мепартрицин
33 C09 nilutamide 81 G09 Пантопразол
34 C10 аминолевулиновой кислоты гидрохлорид 82 G10 Лоперамида гидрохлорид
35 C11 анирацетам 83 G11 Podofilox
36 C12 CBX 84 G12 CBX
37 D01 ДМСО 85 H01 ДМСО
38 D02 metaxalone 86 H02 Леводопа
39 D03 chloroguanide гидрохлорид 87 H03 ethisterone
40 D04 Кларитромицин 88 H04 Энрофлоксацин
41 D05 modaline сульфат 89 H05 пахикарпин сульфат
42 D06 protirelin 90 H06 тестостерона пропионат
43 D07 Теобромин 91 H07 пиридостигмин бромид
44 D08 Росиглитазон малеат 92 H08 энилконазол сульфат
45 D09 Лозартан 93 H09 Бетаметазона натрия фосфат
46 D10 homosalate 94 ОТЕЛЬ H10 azaserine
47 D11 salicylanilide 95 H11 acrisorcin
48 D12 CBX 96 H12 CBX

Таблица 1. Перечень химических веществ, в этом исследовании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Assay рекламы ЯФП-GJIC может использоваться для HTS, потому что это надежный, быстрый и недорогой. HTS assay считается надежной Если Z'-фактор превышает 0,525. Смотреть Zhang et al. для описания статистического анализа, используемый для оценки пригодности HTS анализов25. Когда LN215 клетки были использованы, Z'-фактор > 0.5 без оптимизации анализа. Если используются другие типы клеток в assay и его Z'-фактор < 0.5, надежность может быть улучшена путем расширения пробирного время21. LN215 и ХОС, клетки человека остеосаркома, s необходимо только 10 клеток для получения Z'-фактор > 0.521. Assay требует только акцептора и доноров клеток, я решение и C-решение. Не требуется никаких дополнительных реагентов, например ЛЫ и Флуорексон ам. Еще одним преимуществом этот assay GJIC является, что он измеряет общее GJIC активность клеток в одной скважины, что приводит к низкой изменчивости между хорошо. Микроинъекции, разрыв флуоресценции восстановление после Фотообесцвечивание (FRAP) и двойной патч зажим анализов ячейки в области Оксиметрический анализ может существенно повлиять на измерение. Хотя лом загрузки анализов оценки GJIC на относительно большой площади, процедура соскоб загрузки может привести к значительной изменчивости26.

Ниже приводятся важнейшие шаги для успешного проведения пробирного рекламы ЯФП-GJIC. PH в C - и я решения должны быть скорректированы до 7,4 перед каждым использованием. Рекламы ЯФПQL флуоресценции сильно влияет рН, а также галогениды22. РН разница между двумя решениями может привести к ошибочной изменения в рекламы ЯФП флуоресценции после добавления I-решения. Доноров и акцепторов клетки должны полностью отделить перед обшивкой. Скопления клеток донора или акцептора нарушить assay. Совокупность смешанные культуры должна быть 100% увеличить формирования GJs между ячейками. Отношение купюроприемника на клеток донора также влияет на результаты анализа как описано Lee et al. 21. как только акцептора клетки имеют рекламы ЯФП флуоресценции, соотношение и расположение акцептора и доноров клеток можно легко проверить с флуоресцентным микроскопом до проведения анализа. Важно мыть Сопредседатель культуры с C-решением, чтобы удалить остаточные среднего до лечения с транспортного средства или химических веществ. Остаточные сыворотки или фенола Красного из питательной среды может быть источником фон флуоресценции или нежелательные флуоресценции утоления, соответственно. Таким образом они могут прервать рекламы ЯФП-GJIC assay. Факторы роста в FBS может также препятствовать GJIC27. С другой стороны сыворотка голода может в конечном итоге привести апоптоз28, который также может быть ускорен путем химической обработки. По нашему опыту акцептора и донорские клетки были здоровыми, после лечения наиболее экранированный химических веществ на 25 мкм в C-раствор без сыворотки на 10 мин. Некоторые химические вещества не были токсичных даже после лечения в течение 4 ч. Как изменяется химическая токсичность, состояние клетки должны быть тщательно проверены при необходимости лечения за более длительные периоды. Если клетки не являются здоровыми, очевидное сокращение рекламы ЯФП флуоресценции, которое происходит в течение 1 s после того, как введение я решения может привести от клеток отряда. Что может быть подтверждено микроскопические наблюдения участников хорошо.

Ячеек, которые используются в assay рекламы ЯФП-GJIC должны отвечать нескольким требованиям. Они должны выразить GJs эндогенно или индуцированного форме GJs. Как каналы, состоящий из Cx43 почти не менее проницаемой для атомной катионы и анионы29, йодиды может мигрировать через каналы в GJIC рекламы-ЯФП в LN215 клетках. Если каналы Cx в клетках интерес имеют низкий йодида проницаемости, но свободно позволяют диффузии Ca2 +, рекламы ЯФП-GJIC assay может оказаться невозможным. Отсутствие активности поглощение йодида является требованием. Клетки, которые быстро Экспресс функциональная анион каналы и поглощение йодида не подходят для этого анализа. Рост клеток является еще одним требованием. Акцептора и донорские клетки генерируются трансдукции lentiviruses, выражая рекламы ЯФПQL или SLC26A4 и выбор с puromycin для по крайней мере 1 неделя19. Клетки, которые растут медленно или имеют ограниченный рост, такие как первичный гепатоцитов, не подходят для этого анализа. Адгезии клеток на поверхности изделия пластмассовые культура также имеет важное значение. Клетки, которые не придерживаются твердо, таких как клетки HEK293, легко отсоединяется введением я-решения. Это могут быть преодолены путем покрытия 96-луночных пластины с PLL перед обшивкой. Однако покрытие пластин утомительный шаг, и избежать этих типов клеток рекомендуется. В принципе, Главные ячейки как астроциты, гепатоцитов и кератиноцитов, токсически, физиологически и фармакологически более актуальным, чем раковые клетки как глиомы, Гепатома и базально-клеточная карцинома клетки. Однако их ограниченного роста ставки делают их неприменимыми для assay. Будущие достижения в культуре клеток, которые позволяют рост начальных клеток, которые отвечают вышеуказанным требованиям для более длительных периодов, расширит токсикологические, физиологические и фармакологические оценок, возможно с этот assay.

Рекламы-ЯФП GJIC assay может использоваться не только для HTS, но и для определения ли тип ячейки эндогенно выражает функциональных GJs. Если клетки не имеют GJs, Закалочные стоимость рекламы ЯФПQL наблюдается в cocultured акцептора и клеток донора не будет отличаться от той, которая наблюдается при только акцептора клетки были покрытием. Если существует значительная разница в тушения ставок, оригинальных клеток выразить функциональных GJs. Как разница имеет тенденцию к увеличению с течением времени, как показано на рисунке 2A, этот assay имеет большую чувствительность обнаружения слабых GJIC активность, чем лом загрузки или разрыв FRAP анализов. Данные времени курс, доза-реакция и оценке обратимости GJ модуляторы можно получить с Пробирной рекламы ЯФП-GJIC23,30. Вызывая выражение Cx интерес в клетки лишены функциональных GJs и затем генерации доноров и акцепторов рекламы-ЯФП конкретных Cx-GJIC анализов может быть установленным23. Этот assay таким образом делает возможным определить значения IC50 химического вещества на определенном типе Cx.

Как и большинство HTS анализов рекламы ЯФП-GJIC assay может производить ложных положительных результатов, возникающие в результате изменений в SLC26A4, рекламы ЯФПQLили проницаемость клеточных йодида. Как ложные GJ торможение может привести от ингибитирование SLC26A4 или десенсибилизации рекламы ЯФПQL йодида, каждый потенциальный ингибитор GJ должны быть проверены с использованием клеток, которые коэкспрессируют рекламы ЯФПQL и SLC26A4. Если потенциальные ингибиторы GJ SLC26A4 блокатор или рекламы ЯФП desensitizer, рекламы ЯФП закалки гасится. Напротив ингибитор истинный GJ не влияет на рекламы ЯФП закалки. Электрофизиологические методы или очищенного рекламы ЯФПQL может различать SLC26A4 блокаторы и рекламы ЯФП desensitizers. GJ активаторы, которые информирования рекламы ЯФП йодида или увеличения проницаемости йодида каналам анион, Cx hemichannels, или неспецифических токсические эффекты также даст ложные положительные результаты. Следует определить, ли потенциальные GJ активаторы расширения рекламы ЯФП закалки, когда только акцептора клетки покрыты. Если химическое вещество ориентирующей рекламы ЯФПQL или увеличивает проницаемость йодида, то это увеличит рекламы ЯФПQL закалки в акцепторной клеточных культур без доноров. В других GJ анализов, таких как лом загрузки или FRAP или с помощью очищенный протеин рекламы ЯФПQL можно выделить два типа ложных GJ активаторы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано базовой программы исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством образования (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 и 2018R1A6A1A03023718).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate SPL 30096
Calcium chloride (CaCl2) Sigma C5670 I-solution
D-(+)-Glucose Sigma G7021 C-solution, I-solution
Dimethyl sulfoxide (DMSO) sigma 276855
HEPES Sigma RES6003H-B7 C-solution, I-solution
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 transfection reagent
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) Sigma M2393 C-solution
Microplate reader  BMG LabTech  POLARstar Omega 415-1618
pMD2.G  Addgene #12259
Polybrene sigma H9268
Poly-L-lysine solution sigma P4707
Potassium chloride (KCl) Sigma P5405 C-solution, I-solution
psPAX2  Addgene  #12260
Puromycin Dihydrochloride sigma P8833
Sodium chloride (NaCl) Sigma S5886 C-solution, I-solution
Sodium hyroxide (NaOH) Sigma S2770
Sodium Iodide (NaI) Sigma 383112 I-solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
  2. Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).
  3. U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
  4. Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
  5. Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, suppl 5 191-197 (1993).
  6. Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
  7. Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
  8. Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
  9. Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
  10. Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
  11. Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
  12. Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
  13. Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
  14. Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
  15. Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
  16. el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
  17. Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
  18. Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).
  19. Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
  20. Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
  21. Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
  22. Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
  23. Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
  24. Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  25. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  26. Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
  27. Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
  28. Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
  29. Harris, A. L., Locke, D. Permeability of Connexin Channels. Connexins. , 165-206 (2009).
  30. Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).

Tags

Биология выпуск 144 разрыв соединения разрыв соединения межклеточные связи connexin высокопроизводительного скрининга желтый флуоресцентный белок йодид
Иодид желтый флуоресцентный белок разрыв соединения межклеточные связи Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yeo, J. H., Lee, J. An Iodide-Yellow … More

Yeo, J. H., Lee, J. An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay. J. Vis. Exp. (144), e58966, doi:10.3791/58966 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter