Summary
هنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً للإعداد التجريبية لإجراء تحليل لتقييم سلامة الحمض النووي في الخلايا الجذعية قبل زرع الخلايا.
Abstract
الجذعية والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية لديها إمكانات هائلة كعلاج التجديدي لمختلف الأمراض التنكسية. الحمض النووي هو مستودع البيانات الوراثية في كافة الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية، وسلامتها أمر أساسي لقدرتها على التجدد. الخلايا الجذعية البالغة الخضوع للنشر السريع في مختبرات لتحقيق الأرقام اللازمة للزرع. نمو الخلايا السريع يؤدي إلى فقدان سلامة الحمض النووي والايضات المتراكمة، مثل الأكسجين التفاعلية والكربونيل alkylating وكلاء. زرع هذه الخلايا سيسفر engraftment الفقيرة وتجديد الجهاز المتدهورة. وعلاوة على ذلك، زرع الخلايا التالفة الحمض النووي يؤدي إلى طفرات، عدم الاستقرار الحمض النووي، والشيخوخة الخلوية، وربما تهدد الحياة من الأمراض مثل السرطان. ولذلك، هناك حاجة ملحة لأسلوب مراقبة الجودة لتقييم مدى ملاءمتها للخلية لزرع الأعضاء. هنا، نحن نقدم البروتوكولات خطوة بخطوة لتقييم سلامة الحمض النووي للخلايا الجذعية قبل زرع الخلايا.
Introduction
وتبين الأدلة التجريبية والسريرية أن زرع الخلايا يمكن معتدلة لتحسين أداء البطين الأيسر الهوس من فشله في قلوب1،2،،من34،5 ،،من67،،من89. التطورات الأخيرة قد فتحت زيادة جاذبية الفرص لإنعاش القلب والأوعية الدموية؛ وتشمل هذه التعبير القسري من عوامل إعادة برمجة خلايا جسدية للحث على بلوريبوتينسي وتفرق هذه الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (التوجيهية) في الأنساب القلب مختلفة، ومن المهم كارديوميوسيتي (سم)10، 11 , 12 , 13-المواد الوراثية في كل خلية، بما في ذلك إيبسكس الذي تم إنشاؤه اصطناعياً والمستمدة من اللجنة التوجيهية سم (iPS-سم)، هو الحمض النووي. ويملي التعليمات الوراثية المخزنة في الحمض النووي النمو والتنمية، ووظيفة الخلايا والأنسجة، وأجهزة، والكائنات الحية. الحمض النووي ليست خاملة؛ خلية الأيض، مثل الأكسجين التفاعلية والكربونيل، والأنواع النيتروجين، و alkylating وكلاء يمكن أن الحمض النووي يسبب الضرر في المختبر والمجراه في14،15،،من1617. الأهم من ذلك، يحدث تلف الحمض النووي بداهة في كل خلية، بتواتر كبير. إذا لم يتم تصحيح هذه الأضرار، فإنه سيؤدي إلى طفرة الحمض النووي، والشيخوخة الخلوية، وفقدان سلامة الحمض النووي، والخلية، وربما، من الأمراض، بما في ذلك السرطان تهدد الحياة. لذلك، الإبقاء على سلامة الحمض النووي ضروري لأي خلية، وبخاصة إيبسكس، التي تتمتع بإمكانات هائلة في العيادة.
لتقييم كمية والسلامة لعزل الحمض النووي، تتوفر معدات باهظة الثمن في السوق. ومع ذلك، هناك أية أساليب بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتقييم سلامة الحمض النووي في الخلايا دون عزل الخلايا. وعلاوة على ذلك، تدهور الحمض النووي الناجم عن المستخدم أثناء عزل الحمض النووي أحد العوائق الرئيسية في استخدام هذه الأساليب. هلام خلية واحدة التفريد (المعروفة بمقايسة المذنب)18،19 و γH2A.X إيمونولابيلينج8 التقنيات هي النهج الأساسية في مختبرات البحوث لتقييم الأضرار في الحمض النووي. هذان الأسلوبان لا تتطلب معدات باهظة الثمن أو عزل الحمض النووي لتحليل الحمض النووي سلامة8،،من2021. منذ ذلك الحين، تم إجراء هذه التقنيات مع خلايا كاملة؛ الحمض النووي/رنا/البروتين تدهور المستحثة بالمستخدم أثناء إعداد عينة لن يؤثر على هذه البروتوكولات. هنا، لتقييم أضرار الحمض النووي والحمض النووي الضرر ردا في الساق والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية، ونحن نقدم البروتوكولات خطوة بخطوة لتنفيذ كلا المذنب المقايسة و γH2A.X إيمونولابيلينج. وعلاوة على ذلك، الجمع بين هذين النهجين، نقترح إجراء تقييم السذاجة التي يمكن استخدامها لتقييم مدى ملاءمتها للخلية لزرع الأعضاء.
مقايسة المذنب، أو خلية واحدة جل التفريد، تدابير فواصل الحمض النووي في الخلايا. يتم تفكيك الخلايا المضمنة في [اغروس] انصهار منخفضة بشكل نوكليويدس التي تحتوي على الحمض النووي سوبيركويليد. عند التفريد، ترحيل قطع صغيرة من الحمض النووي مجزأة وقطع خيوط الحمض النووي عن طريق المسام [اغروس]، حين دنا سليمة، بسبب حجمها الهائل بالاقتران مع البروتين المصفوفة، سيكون هجرة مقيدة. يحاكي نمط الحمض النووي الملون تحت مجهر fluorescence مذنب. رأس المذنب يحتوي على الحمض النووي سليمة وهو يتألف من أجزاء الذيل وكسر خيوط الحمض النووي. ويمكن قياس جزء صغير أضرار الحمض النووي بشدة الأسفار من تلف الحمض النووي (ذيل المذنب) بالنسبة إلى كثافة الحمض النووي (رأس المذنب) سليمة. يمكن حساب هذه اللحظة ذيل معلمة كما هو مبين في الشكل 1.
أضرار الحمض النووي يؤدي إلى الفسفرة هستون H2A. X (γH2A.X) في Ser139 التي مؤنزم ATM و ATR الحمض النووي-PK. الفسفرة وتجنيد H2A. X في فواصل حبلا الحمض النووي يسمى استجابة تلف الحمض النووي (DDR) ويحدث سريعاً بعد أن تلف الحمض النووي. وفي أعقاب هذه العملية، والقبض على نقطة تفتيش بوساطة دورة الخلية والحمض النووي هي بدأت عمليات إصلاح. بعد الانتهاء الناجح لإصلاح الحمض النووي، ديفوسفوريلاتيد γH2A.X وإبطال من فوسفاتاسيس. لفترات طويلة ومتعددة فواصل حبلا الحمض النووي يؤدي إلى تراكم البؤر γH2A.X في الحمض النووي. وهذا يشير إلى عدم التمكن من إصلاح أضرار الحمض النووي وسلامة الحمض النووي للخلية. يمكن تحديد هذه البؤر γH2A.X في الحمض النووي، ويمكن حساب عدد البؤر التسريح وإعادة الإدماج باستخدام البروتوكول في الباب 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-المذنب بالانزيم
-
إعداد كاشف
- لنقطة انصهار منخفضة [اغروس]، ضع 500 ملغ من ذوبان منخفضة [اغروس] في 100 مل من الحمض النووي-/المياه خالية من الجيش الملكي النيبالي. حرارة الزجاجة في فرن ميكروويف حتى يذوب [اغروس]. ضع الزجاجة في حمام مائي 37 درجة مئوية إلى حين الحاجة.
ملاحظة: لمزيد من القراءة، انظر ازكويتا et al., الذين درسوا آثار تركيز [اغروس] في وقت الاسترخاء الحمض النووي والتفريد عدة عوامل23. - تمييع صبغ الحمض النووي سيبر الخضراء في المخزن المؤقت تريس يدتا (TE) بنسبة المضيفين للحصول على 1 × يعمل الحل صبغ الأسهم. هذه الصبغة حساسة للضوء، لذا قم بتخزينها في مكان مظلم.
- للمخزن المؤقت لتحلل الخلية، حل 100 مل من المخزن المؤقت لتحلل (2.5 م كلوريد الصوديوم، يدتا م 0.1، 10 مم تريس، 1% Triton X-100) في المياه (دي ح2س). ثم إضافة هيدروكسيد الصوديوم م 10 لضبط درجة الحموضة إلى 10.0. تبريد المخزن المؤقت إلى 4 درجات مئوية.
- القلوية الحمض النووي-تفكيك/التفريد تشغيل المخزن المؤقت، حل ل 1 لحل القلوية (0.3 M هيدروكسيد مايو الصوديوم، 1 مم يدتا) في ح دي2سين بارد المخزن المؤقت إلى 4 درجات مئوية. تأكد من الرقم الهيدروجيني > 13.
- للشرائح المذنب بريكواتيد، وضع بضع قطرات من 0.5% [اغروس] على شريحة زجاجية. استخدام سطح مستو من شريحة أخرى، انتشرت على الفور، [اغروس] تشكل طبقة رقيقة من طلاء [اغروس].
ملاحظة: الجاف للشرائح قبل استخدام. - لزراعة الخلايا المتكاملة، بإيجاز خلايا iPS الثقافة في الطابق السفلي-غشاء-ماتريكس-المغلفة (انظر الجدول للمواد) ثقافة لوحات في mTESR1 الثقافة المتوسطة حتى يتم التوصل إلى كونفلوينسي.
ملاحظة: واستخدمت خلايا الإنسان القلب-تنتجها الخلايا الليفية-المستمدة من البرامج المتكاملة في هذا البروتوكول. إعادة برمجة اشتقاق خلايا iPS وشروط الثقافة يرد في المقالات الأخيرة من أعمالنا البحث مجموعة12،13،21.
- لنقطة انصهار منخفضة [اغروس]، ضع 500 ملغ من ذوبان منخفضة [اغروس] في 100 مل من الحمض النووي-/المياه خالية من الجيش الملكي النيبالي. حرارة الزجاجة في فرن ميكروويف حتى يذوب [اغروس]. ضع الزجاجة في حمام مائي 37 درجة مئوية إلى حين الحاجة.
-
إعداد نموذج
- تجاهل المتوسطة الثقافة وغسل الخلايا. فصل الخلايا باستخدام حل مفرزة (انظر الجدول للمواد). أغسل بيليه الخلية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وريسوسبيند الخلايا في برنامج تلفزيوني في 1 × 105 خلايا/مل.
-
إعداد شرائح العينة
ملاحظة: نفذ الخطوات التالية لتجنب الأضرار التي يسببها الضوء فوق البنفسجي خلية في ظروف الإضاءة المنخفضة.- ميكس 10 ميكروليتر من تعليق خلية وميكروليتر 90 من حل [اغروس] (01:10 نسبة) في أنبوب. ضع الأنبوبة في حمام مائي 37 درجة مئوية للحيلولة دون ترسيخ [اغروس].
- مزيج الحلول دون إدخال فقاعات الهواء و "الماصة؛" 70 ميكروليتر/بقعة على شريحة المذنب بريكواتيد. استخدام تلميح ماصة، ينتشر الخليط [اغروس] خلية تشكل طبقة رقيقة. ضع الشريحة في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- في حاوية، تغرق تماما الشريحة الموجودة في المخزن المؤقت لتحلل الباردة. وضع الحاوية في الظلام في 4 درجات مئوية عن ح 1.
- يستعاض عن المخزن المؤقت تحلل بحل القلوية الباردة. تأكد من أن الشرائح مغمورة تماما. وضع الحاوية في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
-
التفريد
- ضع الشريحة في خزان التفريد أفقي. ملء الخزان بالتفريد القلوية الباردة المخزن المؤقت حتى الشرائح مغمورة تماما. تطبيق الجهد في الخامس 1/سم لمدة 15 إلى 30 دقيقة.
ملاحظة: مجموع الجهد = المسافة بين أقطاب x 1 الخامس - في حاوية، تغرق تماما الشريحة في البرد دي H2o. بعد 2 دقيقة، إزالة دي ح2س وإضافة جديدة دي ح2سين كرر هذه الخطوة.
- يستعاض عن دي ح2س بالبرد 70% إيثانول. الانتظار 5 كحد أدنى بلطف إزالة الشريحة ولا إمالة عليه وندعه أيردري.
- مرة واحدة المجففة، إضافة 100 ميكروليتر من صبغ الحمض المخفف لكل بقعة. الانتظار 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدام عامل تصفية فيتك مجهر ابيفلوريسسينسي، التقاط صور من 50 إلى 100 المذنبات في مجموع كل عينة.
- ضع الشريحة في خزان التفريد أفقي. ملء الخزان بالتفريد القلوية الباردة المخزن المؤقت حتى الشرائح مغمورة تماما. تطبيق الجهد في الخامس 1/سم لمدة 15 إلى 30 دقيقة.
-
حساب للنتائج وتحليل الصور
- للتهديف المذنبات، تستخدم في "المعاهد الوطنية للصحة" في (المعاهد الوطنية للصحة) إيماجيج مع المذنب الإنزيم المساعد (تحميل إيماجيج هنا: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; تحميل البرنامج المساعد هنا: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
ملاحظة: ويأتي البرنامج المساعد مع تعليمة PDF التي تحتوي على كافة التفاصيل لإجراء التحليل. بالإضافة إلى ذلك، تظهر لقطات تحليل المذنب في الشكل 2 ألف-جيم. صور المذنب الممثل لعنصر التحكم وميتوتريكسات (دوكسو)-يرد في الشكل 3 ألف-جيمالخلايا المعالجة المتكاملة والتحديد الكمي للمذنبات.
- للتهديف المذنبات، تستخدم في "المعاهد الوطنية للصحة" في (المعاهد الوطنية للصحة) إيماجيج مع المذنب الإنزيم المساعد (تحميل إيماجيج هنا: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; تحميل البرنامج المساعد هنا: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
2. رد تلف الحمض النووي
- إعداد العينات، والكاشف
- لثقافة خلية المتكاملة-سم، ثقافة المؤسسة-سم الخلايا في الطابق السفلي-غشاء-ماتريكس-المغلفة (انظر الجدول للمواد) لوحات الثقافة في المتوسط ربمي تكملة مع B-27 (CMM) حتى يتم التوصل إلى كونفلوينسي.
ملاحظة: واستخدمت كارديوميوسيتيس الإنسان-أي بي إس-خلية-المستمدة في هذا البروتوكول. يمكن الاطلاع على البروتوكول المتعلق بتمايز خلايا iPS في cardiomyocytes في المقالات الأخيرة من أعمالنا البحث مجموعة12،13،21. - البذور CMs iPS في شرائح الدائرة.
- تجاهل المتوسطة الثقافة من آبار iPS-سم. تغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- أضف 1 مل التربسين 0.25% من كل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 5 الاختيار لوحة تحت مجهر للخلايا المفرزة. أضف 1 مل CMM لوقف التربسين.
- وضع تعليق خلية في أنبوب 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و 200 x ز. تجاهل على المديين المتوسط وإضافة 1 مل CMM ريسوسبيند الخلايا. عد الخلايا وضبط عدد الخلايا للحصول على 20 × 105 خلايا في 1.6 مل CMM.
- بذور الشريحة 200 ميليلتر من تعليق الخلية الواحدة من الدائرة 8-جيدا جيدا (انظر الجدول للمواد). انقر فوق الشريحة بلطف لانتشار الخلايا حول البئر واحتضان عند 37 درجة مئوية.
- لعلاج سم iPS ميتوتريكسات، تجاهل المتوسطة الثقافة من آبار iPS-سم. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. علاج الخلايا مع 1 ميكرومتر ميتوتريكسات و CMM ل 4 h. نضح المتوسطة وتغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
- لحظر المخزن المؤقت، وإعداد 10 مل محلول ألبومين المصل البقري (BSA) يحتوي على جيش صرب البوسنة 3% و 0.05% X-100 تريتون. لإعداد 10 مل من المخزن المؤقت لحظر، إضافة 1 مل مصل حمار العادية إلى 9 مل من استعداد جيش صرب البوسنة الحل.
- لحل جسم الأولية، إضافة 1 ميكروليتر من H2A أرنب المضادة والرمات--هيستون. × جسم (Ser139) إلى 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت لحظر.
- لهذا المزيج جسم الثانوية، إضافة ميكروليتر 1 كل مترافق fluorochrome جسم الأرنب المضادة الثانوي و DAPI وفالويدين fluorochrome مترافق إلى 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت لحظر.
- لثقافة خلية المتكاملة-سم، ثقافة المؤسسة-سم الخلايا في الطابق السفلي-غشاء-ماتريكس-المغلفة (انظر الجدول للمواد) لوحات الثقافة في المتوسط ربمي تكملة مع B-27 (CMM) حتى يتم التوصل إلى كونفلوينسي.
- إيمونولابيلينج
- تغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكروليتر من طازجة 4% بارافورمالدهيد (PFA) لكل بئر. إصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت حظر كل بئر وكتلة لمدة 30 دقيقة في قاعة هوميديفيد في درجة حرارة الغرفة. إزالة المخزن المؤقت حظر وإضافة 200 ميكروليتر من حل جسم الأولية. احتضان لمدة 45 دقيقة في غرفة مظلمة، هوميديفيد في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكروليتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوية. احتضان لمدة 45 دقيقة في غرفة مظلمة، هوميديفيد في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. يغسل مع دي ح2س قبل تركيب لهم مع أنتيفادي. ضع كوفيرجلاس وتخزين الشرائح في الظلام في 4 درجات مئوية.
- استخدام مجهر ابيفلوريسسينسي، أخذ الصور ثلاثة إلى خمسة حقول عشوائية العينة، كما هو موضح في الشكل 4A، والمضي قدما إلى تحليل الصور.
- عد البؤر التسريح وإعادة الإدماج
- تنزيل وتثبيت سيلبروفيلير24 (http://cellprofiler.org).
- ملاحظة: تم إجراء معالجة الصور في هذه الدراسة باستخدام سيلبروفيلير الإصدار 2.1.1. دروس عن سيلبروفيلير التي تم استخدامها ويمكن الاطلاع على أماكن أخرى (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & قائمة = PL7CC87670239B4D10). في حالة استخدام إصدار أحدث من سيلبروفيلير، خط الأنابيب قد تتطلب تعديلات طفيفة.
- تحميل خط أنابيب punctae_gH2AX.cpipe. حدد ملف > استيراد > خط الأنابيب من الملف واختر punctae_gH2AX.cpipe.
- السحب والإفلات المجلد الذي يحتوي على الصور المكتسبة من بؤر γH2A.X إلى الإطار قائمة الملفات في المقطع وحدات الإدخال/صور للتحليل (الشكل 5A). ثم اتبع التعليمات كما هو موضح في الشكل 5 ألف-L.
- تعيين المعلمات التالية للصور:
- اسحب الصورة المرجوة للتحليل إلى القائمة ملف. ضمن وحدات الإدخال، حدد الصور (انظر الشكل 5A لإعدادات الوحدة النمطية). في وحدات الإدخال، حدد البيانات الفوقية (انظر الشكل 5B لإعدادات الوحدة النمطية). في وحدات الإدخال، حدد ناميساندتيبيس (انظر الشكل 5 لإعدادات الوحدة النمطية).
- الفئات، حدد لا. في وحدات التحليل، حدد كولورتوجراي (انظر الشكل 5 لإعدادات الوحدة النمطية).
- في وحدات التحليل، حدد السلس (انظر الشكل 5E إعدادات الوحدة النمطية).
ملاحظة: هذه القيمة قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل، استناداً إلى دقة الصورة. - في وحدات التحليل، حدد إيدينتيفيبريماريوبجيكتس (انظر الشكل 5F لإعدادات الوحدة النمطية).
ملاحظة: تحسين هذه القيم تأكد من تحديد نواة كاملة. بعد هذه الخطوة، قد تتخلف الكمبيوتر. - في وحدات التحليل، حدد السلس (انظر الشكل 5 لإعدادات الوحدة النمطية).
ملاحظة: هذه القيمة قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل، استناداً إلى دقة الصورة. - في وحدات التحليل، حدد انهانسيورسوبريسفيتوريس (انظر الشكل 5 ح لإعدادات الوحدة النمطية).
- في وحدات التحليل، حدد إيدينتيفيبريماريوبجيكتس (انظر الشكل 5I لإعدادات الوحدة النمطية).
ملاحظة: تحسين هذه القيم للتأكد من بونكتاي تم تحديدها. بعد هذه الخطوة، قد تتخلف الكمبيوتر مرة أخرى.- في وحدات التحليل، حدد ريلاتيوبجيكتس (انظر الشكل 5 ياء لإعدادات الوحدة النمطية). في وحدات التحليل، حدد كلاسيفيوبجيكتس (انظر الشكل 5 ك لإعدادات الوحدة النمطية). في وحدات التحليل، حدد اكسبورتوسبريدشيت (انظر الشكل 5 لتر لإعدادات الوحدة النمطية).
- انقر فوق تحليل الصور في أسفل اللوحة اليمنى إجراء تحليل للصورة. عند الانتهاء الناجح للتحليل، يتم إنشاء العديد من الصور (الشكل 6A-F).
ملاحظة: وينبغي للمستخدمين حفظ هذه الصور للرجوع إليها في المستقبل. - ملاحظة الملف.csv الذي يحتوي على البيانات الكمية لمزيد من التحليل التي تم إنشاؤها وحفظها في الموقع المناسب على الكمبيوتر. في جدول يسمى MyExpt_Image، والأعمدة B و D سيكون عدد الأنوية التي قد إلى خمسة وأكثر بونكتاي، على التوالي. إضافة الأعمدة B و D للحصول على إجمالي عدد الأنوية.
- كرر الخطوة 2.3.3-2.3.8 لجميع الصور (تغيير اسم الملف MyExpt_ قبل كل تحليل). ويمكن إجراء قطع لتقييم سلامة الحمض النووي، كما هو مبين في الشكل 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استزراع الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent، وتلف الحمض النووي ولحظة الذيل، التي كانت تستخدم كمقياس لسلامة الحمض النووي، حللت بمقايسة المذنب. كانت جزءا لا يتجزأ من نقطة انصهار منخفضة [اغروس] خلايا iPS ووضعها على شريحة زجاجية. وعولج الخلايا، ثم، مع تحلل المخزن المؤقت، تليها حلاً قلوية، للحصول على الحمض النووي سوبيركويليد. كانت اليكتروفوريسيد نوكليويدس وكانت تصور المذنبات بصبغ الحمض النووي (الشكل 1A-د). ثم حللت المذنبات مع إيماجيج، باستخدام البرنامج المساعد مقايسة المذنب (الشكل 2 أ-ج).
وعولج الخلايا البشرية المتكاملة مع دوكسو للحث على ضرر الحمض النووي، ويمكن استخدامها كعنصر إيجابي. ميكروجرافس الممثل للمذنبات من خلايا iPS نونتريتيد وتعامل دوكسو مبينة في الشكل 3 ألف. تم العثور على كمية القاعدية من تلف الحمض النووي في خلايا iPS، أعرب كجزء من الحمض النووي لحظة الضرر والذيل. ومع ذلك، المتوقع دوكسو العلاج زيادة الضرر الحمض النووي في خلايا iPS ك (الشكل 3، ج). وهذا يبين أن مقايسة المذنب يمكن استخدامها لتقييم سلامة الحمض النووي ليس فقط في خلايا جسدية18،19 ولكن أيضا في الخلايا الجذعية pluripotent21.
حديثا متباينة cardiomyocytes iPS (iPS-سم)، iPS-المهاجرة مثقف عن 6 أشهر (ثقافة طويلة [PC])، وأي بي إس-المهاجرة تعامل مع دوكسو تعرضوا إلى إيمونولابيلينج γH2A.X. الممثل ميكروجرافس من إيمونولابيلينج γH2A.X مبينة في الشكل 4A (أدنى-التكبير) و الشكل 4B (أعلى التكبير). عدد البؤر γH2A.X (البؤر DDR) (بونكتاي) في كل نواة كمياً، باستخدام سيلبروفيلير مع وحدات أنابيب مخصصة (الشكل 5A-L). النسبة المئوية للخلايا التي إيجابية بالنسبة γH2A.X تصنف في نوى مع صفر إلى خمسة بونكتاي ونوى مع أكثر من 10 بونكتاي. في مراقبة البرامج المتكاملة-سم، كان أكثر من 90% الخلايا أقل من خمس بؤر التسريح وإعادة الإدماج كل النوى، وإجمالي أقل من 10% الخلايا أكثر من ست بؤر التسريح وإعادة الإدماج كل الأنوية (الشكل 4، تحكم [Ctrl]). أي بي إس-المهاجرة مثقف لمدة 6 أشهر كان أقل من الخلايا 90% مع أقل من خمس بؤر التسريح وإعادة الإدماج كل النوى، وما مجموعة أكثر من 13 في المائة الخلايا كان أكثر من ست بؤر التسريح وإعادة الإدماج كل الأنوية (الشكل 4، جهاز الكمبيوتر)، بينما أظهرت تعامل دوكسو iPS-سم أقل من 80% الخلايا مع ليه s من خمس بؤر التسريح وإعادة الإدماج كل النوى، وما مجموعة حوالي 24% الخلايا كان أكثر من ست بؤر التسريح وإعادة الإدماج كل الأنوية (الشكل 4، دوكسو). هذه البيانات تبين بوضوح أن الثقافة خلية فترة طويلة والعلاج دوكسو حمل أضرار الحمض النووي كبيرة في البرامج المتكاملة-المهاجرة وليست مناسبة لزرع الخلايا.
رقم 1: التخطيطي مقايسة المذنب. (A) مزيج تعليق خلية مع نقطة انصهار منخفضة [اغروس] و (ب) وضعه على شريحة زجاجية. (ج) تعامل مع المخزن المؤقت لتحلل الخلية، تليها حلاً قلوية، والحصول على نوكليويدس التي تحتوي على الحمض النووي سوبيركويليد. (د) اليكتروفوريسي ووصمة عار الحمض النووي صبغ الحمض النووي سيبر الخضراء. (ﻫ) التخطيطي سليمة (يسار) وتلف الحمض النووي (حق، شكل المذنب). (و) صيغة لحساب جزء من لحظة الضرر وذيل الحمض النووي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الحمض النووي الضرر وذيل الكمي لحظة قبل إيماجيج- (أ-ج) لقطات من إيماجيج، مع البرنامج المساعد تحليل المذنب عرض مجموعة مختارة من الرأس المذنب والذيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: ميتوتريكسات يدفع ضرر الحمض النووي في الخلايا البشرية المتكاملة- (أ) الحمض النووي الضرر في تعامل ميتوتريكسات (دوكسو) وخلايا iPS نونتريتيد (مراقبة)، تحليل باستخدام مقايسة المذنب. (ب) جزء من تلف الحمض النووي (n = 3) ولحظة الذيل (ج) (n = المذنبات 63) كمياً باستخدام مقايسة المذنب. المعاملة مع ميتوتريكسات، عامل إينتيركالاتينج الحمض النووي، زيادة كبيرة في جزء لحظة الضرر وذيل الحمض النووي في خلايا iPS. البيانات هي وسائل ± sem. *ف < 0.05، الطالب في مزاوج تي-اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: استجابة تلف الحمض النووي في cardiomyocytes المستمدة من البرامج المتكاملة- (A) الحمض النووي الضرر استجابة علامة γH2A.X حددها الفلورة في تعامل ميتوتريكسات (دوكسو) ونونتريتيد (مراقبة) iPS-كارديوميوسيتيس، فضلا عن إطالة الثقافة المتكاملة-كارديوميوسيتيس (PC). (ب) التكبير أعلى من γH2A.X (بونكتاي الخضراء) وسم في مواقع تلف الحمض النووي في البرامج المتكاملة-البؤر CMs. (ج) "التحديد الكمي للتسريح وإعادة الإدماج"، تحليلها باستخدام سيلبروفيلير مع وحدات أنابيب مخصصة. تكون البيانات يعني ± التنمية المستدامة؛ n = 3 إلى 4. ف < 0.05، الطالب في مزاوج تي-اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الآلي تحليل الحمض النووي استجابة الأضرار التي سيلبروفيلير- (أ-ل) لقطات من سيلبروفيلير مع الإعدادات المحددة لاستيراد الصور، وتحديد الآلي والتحديد الكمي بونكتاي γH2A.X في البرامج المتكاملة-سم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: الآلي تحليل الحمض النووي استجابة الأضرار التي سيلبروفيلير- (أ-و) صور البيانات المتولدة عن سيلبروفيلير عند انتهاء تحليل الصورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سلامة الحمض النووي يصور سلامة الخلية. الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي تضررت كثيرا في الإجهاد وتفقد سلامتها في نهاية المطاف. سلامة الجذعية والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية التي تنتشر غرض الزرع الرئيسي للخلايا لأداء وظيفتها المطلوبة. زرع خلايا بتلف الحمض النووي سيؤدي في معدل انجرافتمينت الفقيرة والأداء في الخلية8،20. ولذلك، فحص سلامة الحمض النووي قبل زرع الخلايا بروتوكول مراقبة الجودة اللازمة. هنا يصف لنا هما النهج الفعالة من حيث التكلفة، إلا وهي المذنب المقايسة و γH2A.X الفلورة العلامات، لتقييم أضرار الحمض النووي ونوعية الجذعية والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية.
سببا رئيسيا للشيخوخة الخلوية يعتقد أن تراكم الأضرار الحمض النووي في الخلايا. باستخدام مقايسة المذنب، حلل أبو بكر وآخرون تلف الحمض النووي في الشباب ومسن الليفية الجلدية البشرية22. سابقا، وقد أظهرنا أن القلب خالية من تلف الحمض النووي زرع الخلايا السلف معزولة عن ماوس p53 محوره وراثيا زاد معدل انجرافتمينت في الجهاز المضيف8. في الآونة الأخيرة، أظهرنا دور الملك transactivation p53 في آليات إصلاح الأضرار في الحمض النووي في الخلايا البشرية المتكاملة21. في كلتا الدراستين، أننا قد استخدمت كلا الفلورة المقايسة و γH2A.X المذنب وسم منهجيات لتقييم الأضرار الحمض النووي في الخلايا الجذعية. كلا من هذه الأساليب فعالة من حيث التكلفة، ويمكن تنفيذها مع معدات مختبر الأساسية. مشكلة مزعجة حرجة التي مررنا بها غالباً ترسيخ [اغروس] في الماصة وأنابيب. يمكننا التغلب على هذه المشكلة التي بريوارمينج جميع الأنابيب ونصائح قبل بيبيتينج [اغروس]. بينما مقايسة المذنب يستغرق مدة تصل إلى 2 يوما لإكمال، يمكن أن تكتمل إجراءات التوسيم الفلورة γH2A.X الأمثل في تحت ح 4.
الثقافات الخلية البشرية المتكاملة مع أكثر من 10% ضرر الحمض النووي، يقاس بمقايسة المذنب، لا كفاءة يفرق في cardiomyocytes (البيانات لا تظهر) في المختبر. مقايسة المذنب حساسة وحيوية في تقييم الأضرار الحمض النووي في الخلايا الجذعية. ومع ذلك، تقييم سلامة الحمض النووي في خلايا معينة، مثل كارديوميوسيتيس المستمدة من البرامج المتكاملة، مرهقة بمقايسة المذنب بسبب طبيعة الخلايا. يتم إثراء في cardiomyocytes تروبونين والبروتينات ساركوميريك والبروتينات يفرزها المصفوفة خارج الخلية. يشوه هذه الهياكل المعقدة لجعل سوبيركويليد الحمض النووي وفي إمكانية تكرار نتائج موضع تساؤل. الأهم من ذلك، 25% إلى 40% كارديوميوسيتيس البشرية الانيبيبات25، وتتفاوت هذه النسب في cardiomyocytes المستمدة من البرامج المتكاملة. نظراً لتعطل جدار الخلية في مقايسة المذنب، يستحيل تقييم دقيق للنسبة المئوية للخلايا التالفة الحمض النووي. ولذلك، في حالة iPS-المهاجرة، الفلورة γH2A.X الإجراء وضع العلامات لتقييم أضرار الحمض النووي بديل التبسيط مقايسة المذنب.
بناء على هذه النتائج وتلك من المنشورات السابقة لدينا مجموعة8،،من2021، نقترح أن، إذا كان هناك أكثر من 10% ضرر الحمض النووي، تقييم مقايسة المذنب، أو أقل من 90 في المائة من الخلايا يكون صفر إلى خمسة التسريح وإعادة الإدماج وينبغي تنحيته البؤر، ثم الثقافة لزرع الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل وأيده في الجزء الوطني للقلب والرئة والدم المعهد المنح RO1-HL-99507, HL-114120، HL-131017، HL138023، و UO1-HL-134764 (على تشانغ جيه)، و "جمعية القلب الأمريكية العلمية التنمية منحة" 17SDG33670677 (إلى ر. كانابان).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
References
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
- Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
- Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
- Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
- Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
- Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
- Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
- Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
- Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
- Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
- Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
- Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
- Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
- Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
- Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).
