Summary
Her gir vi en detaljert beskrivelse av en eksperimentelle oppsett for en analyse av vurdering av DNA integritet i stamceller før cellen transplantasjon.
Abstract
Stilk og stem-cell-derived celler har enorme potensial som en regenererende terapi for ulike degenerative sykdommer. DNA er Stabburet genetisk data i alle celler, inkludert stamceller, integriteten er grunnleggende for regenerativ evnen. Stamceller gjennomgår rask overføring i laboratorier for å oppnå de nødvendige numrene for transplantasjon. Akselerert cellevekst fører til tap av DNA integritet av akkumulert metabolitter, som reaktive oksygen, karbonyl og alkylating agenter. Transplantere disse cellene vil resultere i fattig engraftment og fornyelse av den forverrede orgelet. Videre transplanting DNA-skadet cellene fører til mutasjoner, DNA ustabilitet, mobilnettet senescence, og muligens livstruende sykdommer som kreft. Derfor er det et umiddelbart behov for en kvalitetskontroll-metoden for å evaluere cellens egnethet for transplantasjon. Her gir vi trinnvise protokoller for vurdering av DNA integritet stamceller før cellen transplantasjon.
Introduction
Experimental og klinisk bevis viser at cellen transplantasjon moderat kan forbedre venstre ventrikkel kontraktile ytelsen av sviktende hjerter1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Nylige fremskritt har åpnet tiltalende ytterligere muligheter for hjerte gjenfødelse; Disse inkluderer tvunget uttrykket omprogrammering faktorer i somatiske celler å indusere pluripotency og skille disse indusert pluripotent stamceller (iPSC) i ulike cardiac linjene, viktigere cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. arvelige materialet i hver celle, inkludert kunstig generert iPSCs og iPSC-avledet CM (iPS-CM), er DNA. Den genetiske instruksjoner lagret i DNA dikterer vekst, utvikling og funksjon av celler, vev, organer og organismer. DNA er ikke inert; celle metabolitter, som reaktive oksygen, karbonyl og nitrogen arter, og alkylating agenter kan forårsake DNA skade i vitro og in vivo14,15,16,17. Viktigere, oppstår DNA skade intuitivt i hver celle, med en betydelig frekvens. Hvis disse skader ikke korrigeres, vil det føre til DNA mutasjon, mobilnettet senescence, tap av DNA og celle integritet og muligens sykdommer, inkludert livstruende kreft. Derfor er beholder DNA integritet avgjørende for en celle, spesielt iPSCs, som har et enormt potensial i klinikken.
For vurdering av antall og isolert genomisk DNA, er dyrt utstyr tilgjengelig på markedet. Det er imidlertid ingen enkel og kostnadseffektiv metoder å vurdere DNA integritet i celler uten å isolere cellene. Videre er bruker-indusert DNA fornedrelse under DNA isolasjon en av de største ulempene ved disse metodene. Encellede gel geleelektroforese (kjent som kometen analysen)18,19 og γH2A.X immunolabeling8 teknikkene er grunnleggende metoder i laboratorier for å vurdere DNA skade. Disse to metodene krever ikke dyrt utstyr eller isolert genomisk DNA å analysere DNA integritet8,20,21. Siden er disse teknikkene utført med hele celler. bruker-indusert DNA/RNA/protein fornedrelse under eksempel utarbeidelsen påvirker ikke disse protokollene. Her, for å vurdere DNA skade og DNA skade respons i stammen og stem-cell-derived celler, gir vi trinnvise protokoller for å utføre både comet analysen og γH2A.X immunolabeling. Videre foreslår vi kombinere disse to tilnærmingene, en naiv vurdering som kan brukes til å evaluere cellens egnethet for transplantasjon.
Comet analysen, eller encellede gel geleelektroforese, måler DNA pauser i celler. Celler i lav-smeltende agarose er lysed til skjemaet nucleoids som inneholder supercoiled DNA. På geleelektroforese vandrer små biter av fragmentert DNA og brutt DNA tilnærmingene gjennom agarose porene, mens intakt DNA, sine enorme og deres Bøyning med matrix protein, vil ha en begrenset overføring. Mønsteret av farget DNA under fluorescens mikroskop etterligner en komet. Comet hodet inneholder intakt DNA og halen er består av fragmenter og brutt DNA tilnærmingene. Brøkdel av DNA skade kan måles ved fluorescens intensiteten av skadet DNA (kometen hale) i forhold til intakt DNA (comet leder) intensiteten. Parameteren hale øyeblikket kan beregnes som vist i figur 1.
DNA skade induserer fosforylering av histone H2A. X (γH2A.X) på Ser139 av ATM, ATR og DNA-PK kinaser. Den fosforylering og rekruttering av H2A. X på DNA strand bryter kalles DNA skade svar (DDR) og skjer raskt etter DNA er skadet. Etter denne prosessen, checkpoint-mediert celle syklus arrestasjon og DNA reparasjon prosesser er igangsatt. Etter en vellykket gjennomføring av DNA-reparasjon, er γH2A.X dephosphorylated inaktivert av phosphatases Langvarig og flere DNA strand bryter føre til opphopning av γH2A.X foci i DNA. Dette angir cellens manglende evne til å reparere DNA-skader og tap av DNA integritet. Disse γH2A.X foci i DNA kan identifiseres ved og antall DDR foci kan telles ved hjelp av protokollen i § 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. comet analysen
-
Forberedelse av reagenser
- For lav-smelte-punkt agarose, sett 500 mg av lav-smeltende agarose i 100 mL DNA- / RNA-gratis vann. Varme flasken i en mikrobølgeovn til agarose oppløses. Plass flasken i en 37 ° C vannbad inntil nødvendig.
Merk: For videre lesing, kan du se Azqueta et al., som studerte effekten av agarose konsentrasjon på DNA-avslapping tid og flere geleelektroforese faktorer23. - Fortynn SYBR grønne DNA fargestoff i Tris-EDTA (TE) Buffer i 1:10,000 forholdet å få en 1 x arbeider lager fargestoff løsning. Dette fargestoffet er lys-sensitive, så lagre det i et mørkt sted.
- For lyseringsbuffer celle oppløse 100 mL lyseringsbuffer (2,5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100) i deionisert vann (DI H2O). Legg deretter til 10 M NaOH justerer pH verdien til 10.0. Cool buffer til 4 ° C.
- For alkaliske DNA-avslapping og geleelektroforese kjører bufferen, oppløse 1 L alkalisk løsning (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA) i DI H2O. Cool buffer til 4 ° C. Kontroller at pH > 13.
- Precoated comet lysbilder, plasser noen dråper 0,5% agarose på et glass lysbilde. Umiddelbart, bruker den flate overflaten på et annet lysbilde, spre agarose danner et tynt lag med agarose belegg.
Merk: Tørr lysbildene før du bruker. - For iPS cellekultur, kort kultur iPS celler i kjelleren-membran-matrix-belagt (se Tabell for materiale) kultur plater i mTESR1 kultur medium til confluency er nådd.
Merk: Menneskelige-hjerte-fibroblast-avledet iPS celler ble brukt i denne protokollen. Aktuelle artikler fra vår forskning gruppe12,13,21beskrives omprogrammering av iPS celle avledning kultur.
- For lav-smelte-punkt agarose, sett 500 mg av lav-smeltende agarose i 100 mL DNA- / RNA-gratis vann. Varme flasken i en mikrobølgeovn til agarose oppløses. Plass flasken i en 37 ° C vannbad inntil nødvendig.
-
Eksempel forberedelse
- Forkaste kultur medium og vask cellene. Distansere cellene med løsgjøring løsning (se Tabell for materiale). Vask celle pellets med fosfat-bufret saltvann (PBS) og resuspend cellene i PBS på 1 x 105 celler/mL.
-
Eksempel lysbilde forberedelse
Merk: Gjør følgende under dårlige lysforhold å unngå UV-lys-indusert celleskader.- Bland 10 μL celle fjæring og 90 μL agarose løsning (1:10 ratio) i et rør. Sett røret i et 37 ° C vannbad å hindre at agarose styrket.
- Bland løsninger uten introdusere luftbobler og Pipetter 70 μL/sted på precoated comet lysbildet. Bruke en pipette tips, spre celle agarose blandingen danner et tynt lag. Sett lysbildet i 4 ° C i 15 min.
- I en container, helt Senk lysbildet i kalde lyseringsbuffer. Plass beholderen i mørket ved 4 ° C i 1 time.
- Erstatt lyseringsbuffer med kaldt alkalisk løsning. Kontroller at lysbildene er helt neddykket. Plass beholderen i mørket på 4 ° C i 30 min.
-
Geleelektroforese
- Plass lysbildet i en vannrett geleelektroforese tank. Fyll tanken med kaldt alkalisk geleelektroforese buffer til lysbildene helt senkes. Bruke spenningsnivået 1 V/cm i 15-30 min.
Merk: Totalt spenning = avstand mellom elektrodene x 1 V - I en container, helt Senk lysbildet i kalde DI H2O. Etter 2 min, fjerner DI H2O og legge frisk DI H2O. Gjenta dette trinnet.
- Erstatte DI H2O med kaldt 70% etanol. Vent 5 min. forsiktig fjerne lysbildet, ikke vippe den, og la den air-dry.
- Når tørket, tilsett 100 μL utvannet DNA fargestoff hver spot. Vente 15 minutter ved romtemperatur. Bruke filtere FITC i en epifluorescence mikroskop, ta bilder av 50 til 100 kometer totalt per prøve.
- Plass lysbildet i en vannrett geleelektroforese tank. Fyll tanken med kaldt alkalisk geleelektroforese buffer til lysbildene helt senkes. Bruke spenningsnivået 1 V/cm i 15-30 min.
-
Bildeanalyse og beregning av resultatene
- Scoring av kometer, bruker den National Institutes of Health (NIH) ImageJ med comet analysen plugin (Last ned ImageJ her: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; laste ned plugin her: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
Merk: Plugin kommer med en PDF-instruksjon som inneholder alle detaljer til å utføre analyse. I tillegg er skjermbilder av kometen analysen vist i Figur 2A-C. Representant comet bilder av kontroll og doksorubicin (Doxo)-behandlet iPS celler og kvantifisering av kometene er vist i Figur 3A-C.
- Scoring av kometer, bruker den National Institutes of Health (NIH) ImageJ med comet analysen plugin (Last ned ImageJ her: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; laste ned plugin her: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
2. DNA skade svar
- Prøve og reagens forberedelse
- For en iPS-CM cellekultur, kultur iPS-CM celler i kjelleren-membran-matrix-belagt (se Tabell for materiale) kultur plater i RPMI medium supplert med B-27 (CMM) før confluency er nådd.
Merk: Menneskelige-iPS-cell-derived cardiomyocytes ble brukt i denne protokollen. Protokollen for iPS celledifferensiering inn cardiomyocytes finnes i aktuelle artikler fra vår forskning gruppe12,13,21. - Frø iPS-CMs i kammeret lysbilder.
- Kast kultur mediet iPS-CM brønnene. Vask cellene tre ganger med PBS.
- Legg 1 mL av 0,25% trypsin per brønn og ruge ved 37 ° C i 5 min. sjekk platen under et mikroskop for cellen avdeling. Legg 1 mL av CMM å stoppe trypsin.
- Sett celle suspensjon i en 15 mL rør og sentrifuge for 5 min på 4 ° C og 200 x g. Forkaste mediet, legger 1 mL av CMM og resuspend celler. Telle celler og justere celletall for å få 20 x 105 celler i 1.6 mL CMM.
- Frø 200 µL av cellen suspensjon per brønn av 8-vel chamber Skyv (se Tabell for materiale). Trykk lysbildet forsiktig å spre cellene rundt brønnen og ruge på 37 ° C.
- For iPS-CM doksorubicin behandling, forkaste kultur mediet iPS-CM brønnene. Vask cellene med PBS. Behandle cellene med 1 μM doksorubicin og CMM for 4 h. Sug opp mediet og vaske cellene med PBS.
- For blokkering bufferen, forberede 10 mL av bovin serum albumin (BSA) løsning som inneholder 3% BSA og 0,05% Triton X-100. For å forberede 10 mL blokkerer bufferen, legge til 1 mL av normal esel serum 9 mL av BSA løsningen.
- Tilsett 1 μL av anti-kanin phospho-histone H2A for det primære antistoff. X (Ser139) mot 200 μL blokkerer bufferen.
- Tilsett 1 μL hver fluorochrome-konjugerte anti-kanin sekundære antistoff, DAPI og fluorochrome-konjugerte phalloidin 200 μL blokkerer bufferen for sekundær antistoff blanding.
- For en iPS-CM cellekultur, kultur iPS-CM celler i kjelleren-membran-matrix-belagt (se Tabell for materiale) kultur plater i RPMI medium supplert med B-27 (CMM) før confluency er nådd.
- Immunolabeling
- Vask cellene tre ganger med PBS og tilsett 200 μL av nylagde 4% paraformaldehyde (PFA) i hver brønn. Fastsette celler for 20 min i mørket ved romtemperatur. Vask cellene med PBS.
- Fjern PBS og legge 200 μL av blokkering buffer per godt og blokk for 30 min i en fuktet kammer ved romtemperatur. Fjern blokkering bufferen og legge 200 μL av primære antistoff løsning. Inkuber for 45 min i en mørk, fuktet kammer ved romtemperatur. Deretter vaskes brønnene tre ganger med PBS.
- Fjern PBS og legge 200 μL av sekundær antistoff blanding. Inkuber for 45 min i en mørk, fuktet kammer ved romtemperatur. Deretter vaskes brønnene tre ganger med PBS. Vask med DI H2O før montering dem med antifade. Plasser en coverglass og lagre lysbilder i mørket på 4 ° C.
- Bruker en epifluorescence mikroskop, ta tre til fem bilder av tilfeldige felt per utvalg, som vist i figur 4Aog videre til bildeanalyser.
- Telling av DDR fokuspunktene
- Dataoverføre og installere CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).
- Merk: Bildebehandling i denne studien ble utført CellProfiler versjon 2.1.1. Opplæring for CellProfiler som kan bli funnet andre steder (liste & https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk = PL7CC87670239B4D10). Hvis en nyere versjon av CellProfiler brukes, kreve mindre tilpasninger i rørledningen.
- Last ned rørledningen punctae_gH2AX.cpipe. Velg fil > Import > rørledning fra filen og velg punctae_gH2AX.cpipe.
- Dra-og-slipp mappen som inneholder ervervet bilder av γH2A.X foci vinduet fillisten i delen Input moduler/bilder for analyse (figur 5A). Følg deretter instruksjonene som vist i Figur 5A-L.
- Angi følgende parametere for bildene:
- Dra ønsket bilde for analyse til fillisten. Under Input moduler, velg bilder (se figur 5A for modulen innstillinger). Velg Metadata i Input moduler(se figur 5B for modulen innstillinger). Input moduler, velg NamesAndTypes (se figur 5C for modulen innstillinger).
- Grupper, velger du ingen. Analyse moduler, velg ColorToGray (se figur 5 d for modulen innstillinger).
- Analyse moduler, velg glatt (se figur 5E for modulen innstillinger).
Merk: Denne verdien må være optimalisert, avhengig av bildeoppløsningen. - Analyse moduler, velg IdentifyPrimaryObjects (se figur 5F for modulen innstillinger).
Merk: Optimalisere disse verdiene for å sikre hele kjernen er valgt. Etter dette trinnet kan datamaskinen henge. - Analyse moduler, velg glatt (se figur 5G for modulen innstillinger).
Merk: Denne verdien må være optimalisert, avhengig av bildeoppløsningen. - Analyse moduler, velg EnhanceOrSuppressFeatures (se figur 5 H for modulen innstillinger).
- Analyse moduler, velg IdentifyPrimaryObjects (se figur 5I for modulen innstillinger).
Merk: Optimalisere disse verdiene for å Kontroller at punctae er valgt. Etter dette trinnet kan datamaskinen henge igjen.- Analyse moduler, velg RelateObjects (se figur 5J for modulen innstillinger). Analyse moduler, velg ClassifyObjects (se figur 5 K for modulen innstillinger). Analyse moduler, velg ExportToSpreadsheet (se figur 5 L for modulen innstillinger).
- Klikk Analysere bilder på nedre venstre panel å utføre bildeanalyser. På en vellykket gjennomføring av analysen, genereres flere bilder (Figur 6A-F).
Merk: Brukere bør lagre disse bildene for fremtidig referanse. - Merk CSV-filen som inneholder kvantitative data for videre analyse som genereres og lagret i riktig plassering på datamaskinen. I regnearket kalt MyExpt_Imagevil kolonne B og D ha antall atomkjerner som har opp til fem og mer punctae, henholdsvis. Legg til kolonne B og D for å få antall kjerner.
- Gjenta trinn 2.3.3 - 2.3.8 for alle bilder (endre filnavnet MyExpt_ før hver analyse). Tomter kan gjøres for å vurdere DNA integritet, som vist i figur 4C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Menneskelige indusert pluripotent stamceller ble kultivert og DNA skade og hale øyeblikket, som ble brukt som et mål på DNA integritet, ble analysert av kometen analysen. iPS celler var innebygd i lav-smelte-punkt agarose og plassert på et glass lysbilde. Cellene ble, deretter behandlet med lyseringsbuffer, etterfulgt av en alkalisk løsning, hente supercoiled DNA. Nucleoids var electrophoresed og kometer var visualisert av DNA dye (figur 1A-D). Kometene var, da analysert med ImageJ, bruker comet analysen plugin (figur 2A-C).
Menneskelige iPS celler ble behandlet med Doxo å indusere DNA skade og skal brukes som en positiv. Representant micrographs av kometer fra Doxo-behandlet og nontreated iPS celler vises i figur 3A. En basal mengde DNA skade ble funnet i iPS celler, uttrykt som en brøk av DNA skade og hale øyeblikk. Men forventet Doxo behandling økte DNA skaden iPS celler som (figur 3BC). Dette viser at kometen analysen kan brukes å vurdere DNA integritet ikke bare i somatiske celler18,19 , men også i pluripotent stamceller21.
Fersk differensiert iPS cardiomyocytes (iPS-CMs), iPS-CMs kultivert for 6 måneder (langvarig kultur [PC]) og iPS-CMs behandlet med Doxo ble utsatt for γH2A.X immunolabeling. Representant micrographs av γH2A.X immunolabelling er vist i figur 4A (nedre-forstørrelse) og figur 4B (høyere-forstørrelse). Antall γH2A.X foci (DDR foci) (punctae) i hver kjerne er kvantifisert, CellProfiler med egendefinerte rørledning moduler (figur 5A-L). Prosentandelen av celler som er positivt for γH2A.X klassifiseres i kjerner med null til fem punctae og kjerner med mer enn 10 punctae. Kontroll iPS-CM, mer enn 90% av cellene hadde mindre enn fem DDR foci per kjerner, og totalt på mindre enn 10% av cellene hadde mer enn seks DDR foci per kjerner (figur 4C, kontroll [Ctrl]). iPS-CMs kultivert for 6 måneder hadde mindre enn 90% celler med mindre enn fem DDR foci per kjerner, og totalt mer enn 13% av cellene hadde mer enn seks DDR foci per kjerner (figur 4C, PC), mens Doxo-behandlet iPS-CM viste mindre enn 80% av cellene med les s enn fem DDR foci per kjerner, og totalt ca 24% av cellene hadde mer enn seks DDR foci per kjerner (figur 4C, Doxo). Dataene viser tydelig at langvarig cellekultur og Doxo behandling indusere betydelig DNA skade i iPS-CMs og er ikke egnet for cellen transplantasjon.
Figur 1: skjematisk av kometen analysen. (A) blanding celle suspensjon med lav-smelte-punkt agarose og (B) plasser den på et glass lysbilde. (C) behandle den med cellen lyseringsbuffer, etterfulgt av en alkalisk løsning å få nucleoids som inneholder supercoiled DNA. (D) Electrophorese og flekken DNA bruker SYBR grønne DNA fargestoff. (E) skjematisk intakt (venstre) og skadet DNA (høyre, comet figur). (F) formel for å beregne en brøkdel av DNA skade og hale øyeblikket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: DNA skade og hale øyeblikk kvantifisering av ImageJ. (A-C) Skjermbilder av ImageJ, med comet analyse plugin viser et utvalg av kometen hode og hale. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: doksorubicin induserer DNA skade i menneskelig iPS celler. (A) DNA skade i doksorubicin-behandlet (Doxo) og nontreated (kontroll) iPS celler, analysert ved hjelp av kometen analysen. (B) brøkdel av DNA skade (n = 3) og (C) hale øyeblikk (n = 63 kometer) kvantifisert bruker comet analysen. Behandling med doksorubicin, en DNA-intercalating agent, betydelig økt brøkdel av DNA skade og hale øyeblikk i iPS celler. Data er betyr ± SEM. *P < 0,05, Student er unpaired t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: DNA skade respons i iPS-avledet cardiomyocytes. (A) DNA skade svar markør γH2A.X identifisert av immunofluorescence i doksorubicin-behandlet (Doxo) og nontreated (kontroll) iPS-cardiomyocytes, samt langvarig kultur iPS-cardiomyocytes (PC). (B) høyere forstørrelsen av γH2A.X (grønt punctae) merking ved DNA skade i iPS-CMs. (C) kvantifisering av DDR foci, analysert ved hjelp av CellProfiler med egendefinerte rørledning moduler. Data er betyr ± SD; n = 3 til 4. P < 0,05, Student er unpaired t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: automatisert DNA skade svar analyse av CellProfiler. (A-L) Skjermbilder av CellProfiler med angitte innstillingene for å importere bildene, og automatisert identifikasjon og kvantifisering av γH2A.X punctae i iPS-CMs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: automatisert DNA skade svar analyse av CellProfiler. (A-F) Dataavbildninger generert av CellProfiler bilde analysen er ferdig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA integritet skildrer celle integritet. Celler med skadet DNA er ofte i stress, og til slutt mister sin integritet. Integriteten til stammen og stem-cell-derived celler som blir propagated å transplantasjon er rektor for cellene å utføre ønsket arbeidet. Transplanting celler med skadet DNA vil resultere i en dårlig engraftment hastighet og ytelse av cellen8,20. Derfor er undersøke DNA integritet før cellen transplantasjon en nødvendig kvalitet kontrollprotokoll. Her beskriver vi to kostnadseffektive måter, nemlig den kometen analysen og γH2A.X immunofluorescence merking, for å vurdere DNA skade og kvaliteten på stammen og stilk-cellen-avledet celler.
En viktig årsak til cellulære aldring antas å være akkumulering av DNA skade i celler. Bruker comet analysen, analysert Al-Baker et al. DNA skade i unge og senescent menneskelig dermal fibroblaster22. Tidligere har vi vist at transplanting DNA skade-gratis cardiac progenitor celler isolert fra en p53 transgene mus økt rate av engraftment i vert orgel8. Vi har nylig vist rollen p53 transactivation domenet i DNA skade reparasjon mekanismer i menneskelig iPS celler21. I både studier, har vi ansatt både comet analysen og γH2A.X immunofluorescence merking metoder for å vurdere skaden DNA stamceller. Begge disse metodene er kostnadseffektive og kan utføres med grunnleggende laboratorieutstyr. En irriterende kritisk problem som vi ofte oppleves er agarose styrket i pipette og rør. Vi overvinne problemet av prewarming alle rør og tips før pipettering agarose. Mens comet analysen tar opp til 2 dager å fullføre, kan optimalisert γH2A.X immunofluorescence merking prosedyren gjennomføres på under 4 h.
Menneskelige iPS cellekulturer med mer enn 10% DNA skade, målt ved comet analysen, ikke effektivt noe i cardiomyocytes (data ikke vist) i vitro. Comet analysen er følsom og dynamisk vurdere DNA skade i stamceller. Men er DNA integritet vurderinger i bestemte celler, for eksempel iPS-avledet cardiomyocytes, tungvint av kometen analysen på grunn av cellene. Cardiomyocytes er beriket med troponin og sarcomeric proteiner utskilles ekstracellulær matrix proteiner. Denaturing disse komplekse strukturer å gjøre supercoiled er DNA og dens reproduserbarhet tvilsom. Viktigst, 25% til 40% av menneskelig cardiomyocytes er binucleated25, og disse prosenter varierer i iPS-avledet cardiomyocytes. Siden cellen vegg avbrytes i comet analysen, er nøyaktig vurdering av prosentandelen av DNA-skadet celler umulig. Derfor i iPS-CMs er γH2A.X immunofluorescence merking prosedyren for å vurdere DNA skade et enkelt alternativ for comet analysen.
Basert på disse resultatene, og de fra tidligere publikasjoner av vår gruppe8,20,21, vi foreslår at hvis det er mer enn 10% DNA skade, vurdert av kometen analysen eller mindre enn 90% av cellene ha null til fem DDR fokus og kultur burde bli diskvalifisert for cellen transplantasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet var støttes delvis av nasjonale hjerte, lunge og blod Institute tilskudd RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 og UO1-HL-134764 (å J. Zhang) og American Heart Association vitenskapelige Development Grant 17SDG33670677 (til R. Kannappan).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
References
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
- Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
- Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
- Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
- Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
- Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
- Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
- Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
- Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
- Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
- Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
- Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
- Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
- Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
- Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).
