Summary
I detta protokoll, vi visar hur du föder Astyanax mexicanus vuxna, höja larverna, och utföra hela-mount immunohistokemi på efter larver fisk att jämföra fenotyperna av yta och cave morphotypes.
Abstract
Floden och grotta-anpassad populationer av Astyanax mexicanus visar skillnader i morfologi, fysiologi och beteende. Forskning inriktad på att jämföra vuxna former har avslöjat den genetiska grunden för några av dessa skillnader. Mindre är känt om hur befolkningen skiljer sig efter larver skeden (vid uppkomsten av utfodring). Sådana studier kan ge insikt i hur släktet överleva genom vuxenlivet i deras naturliga miljö. Metoder för att jämföra efter larver utveckling i laboratoriet kräver standardiserade vattenbruk och utfodring regimer. Här beskriver vi hur man skall höja fisk på en diet av näringsrika rotifers i icke-recirkulerande vatten för upp till två veckor efter befruktning. Vi visar hur du samla efter larver fisk från plantskolan systemet och utföra hela-mount immunfärgning. Immunfärgning är ett attraktivt alternativ till transgenens uttryck analys för att undersöka utveckling och genfunktion i A. mexicanus. Plantskolan metoden kan också användas som ett standardprotokoll för upprättande av densitet-matchade populationer för tillväxt till vuxna.
Introduction
Den mexikanska tetra, Astyanax mexicanus, är en enda art av fisk som finns som river-bostad populationer (surface fisk) och ett antal grottboende populationer (släktet) uppkallad efter de grottor som de bebor (dvs Tinaja, Molino, Pachón). Ett växande antal forskare använder A. mexicanus att undersöka de genetiska och utvecklingsmässiga baserna av beteendemässiga1,2,3,4, metabola5,6 ,7,8, och morfologiska utveckling9,10,11. Tillgängliga resurser för studier av A. mexicanus ingår ett sekvenserat och kommenterad genomet12; transkriptom13; utvecklingsmässiga mellanlagring tabell14; och metoder för avel15,16,17, skapa transgenics18och redigera gener19. Spridning av ytterligare verktyg och uppdaterade standardprotokoll kommer att påskynda tillväxten av släktet forskarvärlden (se denna metoder samling20).
Vårt mål är att lägga till de befintliga repertoaren av verktyg genom att tillhandahålla en robust metod för att bedöma gen aktivitet i situ i efter larver A. mexicanus, på ett sätt som är jämförbart mellan laboratorier. Det finns två utmaningar för att uppnå detta mål. Först, det finns ett behov av standardiserade regimer för kläckning och att höja fisk mellan laboratorier, som skillnader i parametrar såsom utfodring och densitet påverkar tillväxt och mognad, därmed påverkar gen aktivitet. För det andra finns det ett behov för ett standardiserat men anpassningsbara metod för att undersöka mönster av genen aktivitet i efter larver fisken. Vi tar upp dessa frågor här, att upprätta standardpraxis för att höja fisk till efter larval arrangerar och införa ett robust hela-mount immunhistokemi (IHC) protokoll för att bedöma genuttryck i A. mexicanus.
Vi visar först hur du föder fisken genom naturliga lekområden och identifiera befruktade ägg. Beskrivna nästa är hur man kläcka befruktade ägg (larver) och överföra dem till plantskolan behållare, där de underhålls på en densitet 20 fisk per behållare för två veckor utan recirkulerande eller ändra vattnet. På 5-dagar efter befruktning, fisken har utvecklats efter larval arrangerar (längre med en äggula leverans) och tillhandahålls alger matad Brachionus bläcksvamp (rotifers) som en näringsrik födokälla som inte kräver daglig påfyllning. Denna metod ger konsekvent tillväxtparametrarna för larver och efter larver utveckling.
För att bedöma geners funktion, visar vi hur du ta bort fisken från plantskolan behållare och utföra hela-mount IHC. IHC metoden presenteras är anpassad från protokoll som utvecklats för användning med Danio rerio21 och är effektiv för att pröva antigener i alla A. mexicanus vävnader testade, inklusive hjärnan, tarmarna och bukspottkörteln. IHC är ett snabbare alternativ till att generera transgena djur för undersökning av genuttryck och protein lokalisering. Detta protokoll kommer att vara användbart för studier som syftar till att odla A. mexicanus och jämföra fenotyperna av surface fisk och släktet efter larver skeden.
Protocol
De förfaranden som beskrivs i detta protokoll har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid Harvard Medical School.
1. avel
Obs: Det finns flera publicerade metoder för avel15,16,17,20 som också skulle kunna användas i detta steg. Innan avel, vuxna fiskar bibehålls på en 10:14 ljus: mörk cykel vid 23 ° C och matas en pellet kost (se tabellen för material) en gång dagligen. Fisk kan uppvuxna i ett recirkulerande system med mekanisk filtrering och UV sterilisering. Avel kan också ske i statisk (icke-recirkulerande) tankar, men fisk bör inte lämnas i en statisk tank för mer än 3 dagar, som snabbt försämrar vattenkvaliteten.
- Fyll en 5 gal tank med fisk-klara vatten (dechlorinated vatten anpassas: pH = 7,1 +/-2, ledningsförmåga = 900 +/-150 µS, temperatur = 23 ° C).
- Placera plast mesh (se material) i botten av tanken. Om avel i statiska tankar, anbringa en varmvattenberedare till sidan av tanken. Om avel i en recirkulerande system, placera en varmvattenberedare i systemet sumpen.
Obs: Plastnät förhindrar vuxna att konsumera ägg. - Plats en kvinnliga och två manliga A. mexicanus fisk som är större än 1 år gammal i tanken. Låt fisken att acklimatisera i 30 min.
- Ställa in temperaturen i värmaren till 24 ° C (eller 1 ° C varmare än start temperaturen).
- Efter 24 h, öka temperaturen med 1 ° C.
- Efter 24 h, öka temperaturen med 1 ° C. Kontrollera tankarna dagligen för ägg genom en fotoblixt i botten av tanken. Undanhålla fisken från mat under denna 3-dagars period.
- Om leken inte har varit inducerad efter 3 dagar, stänga av värmaren och låt vattnet till rumstemperatur (RT) innan du flyttar fisken till deras ursprungliga tank.
2. kläckning befruktade ägg
- När äggen har identifierats i en avel tank, ta bort vuxna och plastnät och minska vatten till ett djup av 10 cm med en bägare eller cup.
Obs: För att uppskatta tiden för lek, använda överföring pipett att placera flera ägg i en petriskål och visa dem med ett stereomikroskop avgöra den scen14 och uppskatta tiden för befruktning. - Flytta tanken till en bekväm arbetsyta och ta bort alla ogenomskinliga ägg eller avföring, lämnar bara de genomskinliga, bördiga ägg i tanken.
Anmärkning: Antalet fertila ägg kan registreras vid denna tid. - Fyll tanken med fisk-klara vatten (se steg 1.1) och lägga till 6-7 droppar av metylenblått i tanken när vattnet fylls.
Obs: Metylenblått slutliga koncentration är cirka 1,5 ppm. - Lägga till en värmare och akvarium bubbelflaskan (bifogas en luftpump, med en regulator) tanken.
- Ställa in värmaren till 24 ° C och justera airstream regulatorn för att producera en skonsam ström av bubblor.
- Placera en cover på tanken för att bibehålla vattentemperaturen.
Obs: Äggen bör börja kläckning inom 24 h av lekbeståndets tiden.
3. överföring av kläckta larver till plantskolan behållare
- Tillsätt 20 g salt (se material) 8 L i fisk-klara vatten (se steg 1.1) och rör tills upplöst. Fyll varje 1,5 L plantskola behållare (se material) med 1 L det förberedda vattnet.
- Använd en överföring pipett för att flytta kläckta larver i beredda plantskola behållare på en densitet 20 fisk per behållare.
Obs: En strålkastare kan vara användbara för att lokalisera och överföra kläckta larverna. - Efter alla synliga kläckta larverna har tagits bort, agitera vattnet i tanken av omrörning eller blåser vattenstrålar i kanterna och hörnen av tanken med pipetten.
Obs: Detta kommer att hjälpa avslöja larver som missade på första passet. - Kassera oanvänt larver i detta skede använda riktlinjerna av den kontor av laboratoriet välfärd (OLAW). Lägg till natriumhypoklorit i tanken för att uppnå en slutlig koncentration på 6,15%. Vänta minst 5 minuter innan du häller ut i avloppet.
- Märk varje plantskola behållare med datum och tidpunkt för befruktning. Visa plantskola behållare dagligen och fortsätta att ta bort eventuella döda larver.
4. beredning av Rotifer-baserade fiskmat
- Se Tabell för material för information om att erhålla rotifers. Följ det refererade protokollet för att ställa in, underhålla och skörda rotifers22.
- Förbereda fisk mat genom att lägga till 3 mL av alger blandning (se Tabell för material) till 1 L av skördade rotifers. Denna blandning kommer att läggas direkt till plantskolan behållare som en livsmedelsförsörjning.
5. utfodring av efter larver fisk
- När fisken är 5 dagar efter befruktning (dpf), lägga till varje plantskola-behållare 3 mL av fiskmat (bereddes i steg 4.2). På optimal densitet, bör rotifers vara synliga i täta grupper i hörnen av plantskolan behållarna och mindre uppenbar i mitten av behållaren. Tillsätt ytterligare rotifer blandningen tills den lämpliga djurtäthet som har uppnåtts.
- Kontrollera behållare dagligen för förekomsten av rotifers och tillsätt mer om koncentrationen blir utarmat. Fortsätta att ta bort eventuella döda larver.
- När fisken når 14 dpf, flytta dem till en tank som passar med ett recirkulerande system med en täthet av 5 fiskar/L vatten.
Anmärkning: Antalet överlevande efter larver fisk kan registreras vid denna tid.
6. hela-mount immunohistokemi efter larver fisk
- Ta bort efter larver fisk av önskad scenen från mat för 24 h genom att hälla plantskola behållaren som innehåller fisken genom en nylon mesh sil och placera silen i en behållare med ren fisk-klara vatten (se steg 1.1).
Obs: Det är viktigt att ta bort all mat. Även små mängder mat i tarmen är auto-fluorescerande och kommer att påverka imaging. - Samla in och avliva fisken.
Obs: Dödshjälp protokollet bör följa OLAW riktlinjer och godkännas av din institutionella djur vård och användning kommittén. Vi har noterat att tricaine ensam inte avliva efter larver fisk, och fisken börjar röra sig när överförs från tricaine till fixativ om fisken inte hålls också på is.- Förbered tricaine lösning i en bägare genom att lägga till 0,4 g för tricaine-S och 0,8 g natriumbikarbonat 1 L avjoniserat vatten och placera den på isen.
- Häll vatten som innehåller fisken genom en nylon mesh SIL att samla fisk. Försiktigt doppa silen i iskall Tricaine lösning och lämna den på is i 10 min.
- Fixa euthanized fisken.
- Använda en överföring pipett med skuren spets för att överföra fisken till ett koniskt rör.
- Ta bort den Tricaine lösningen med överföring pipett och ersätta med fixativ. Inkubera med gunga.
Obs: Fixativ och fixering tid måste bestämmas utifrån den antikropp som används. 10% formalin lösning (4% formaldehyd, se material) övernattning på 4 ° C är tillräckligt för de antikroppar som anges i Tabellen för material.
Varning: Formalin är giftig och brandfarlig. Använd personlig skyddsutrustning (handskar, labbrock och splash glasögon) och hantera i en kemisk huva. Lösningar som innehåller formalin ska kasseras som riskavfall. - Använda en överföring pipett noggrant bort fixeringsvätskan utan att störa fisken. Lägga till 3 mL av fosfat buffrad koksaltlösning-triton lösning [PBS med 0,1% Triton (PBST), se material] och inkubera i 15 min på RT med gunga.
- Ta bort PBST och ersätta med färsk PBST och inkubera för 15 min. Upprepa detta ”tvättning” en ytterligare gång.
Obs: Fisk kan förvaras i PBS natriumazid 0,02% vid 4 ° C i flera veckor.
- Utför hela-mount immunfärgning.
- Förbereda 50 mL blockerar lösning [PB-0.5% Triton X, 0,2% bovint serumalbumin (BSA), 1% dimetyl sulfoxid (DMSO), 0,02% natriumazid, 5% åsna serum].
FÖRSIKTIGHET: Natriumazid och DMSO är giftiga. Personlig skyddsutrustning (handskar, labbrock och splash skyddsglasögon) bör användas vid hantering. Alla lösningar ska kasseras som riskavfall. - Använd en överföring pipetten för att överföra fisken till en 4 mL injektionsflaska av glas med skruvlock cap. Använd en överföring pipett bort i PBST och lägga till 3 mL blockerar lösning. Inkubera i 1 h på RT med gunga.
- Använd en överföring pipett bort blockerande lösningen och lägga till primär antikropp utspätt i blockering lösning. Inkubera över natten vid rumstemperatur med agitation.
Obs: Lägg till exempel 1: 250 utspädning av anti-HuC/HuD neuronala Protein mus monoklonal antikropp (se Tabell av material för en lista av antikroppar som har använts framgångsrikt i A. mexicanus). En uppsättning av fisk med ingen primär antikropp lagt till bör inkluderas i detta steg. Volymen av antikroppar bör vara tillräckligt för att täcka fisken och för agitation. - Tvätta fisk 3 gånger med PBST som beskrivs i steg 6.3.4. Ersätta PBST med sekundär antikropp utspätt i blockering lösning och inkubera över natten vid RT med agitation.
Obs: Optimal primära och sekundära antikroppar koncentrationer, inkubationstiden och inkubation temperatur bör fastställas för varje antikropp. Övernattning på RT var effektivt för de antikroppar som anges i Tabellen för material. - Tvätta fisk 3 gånger med PBST, med varje tvätt varar 15 min enligt steg 6.3.4.
- Överföra fisken till PBS för kortsiktig lagring innan du fortsätter med att dissekera, montering eller snittning fisken.
- Förbereda 50 mL blockerar lösning [PB-0.5% Triton X, 0,2% bovint serumalbumin (BSA), 1% dimetyl sulfoxid (DMSO), 0,02% natriumazid, 5% åsna serum].
Representative Results
Tabell 1 visar framgång under ett år av avelsdjur yta fisk och Tinaja, Molino och Pachón släktet i statiska avel tankar. Ytan och Pachón leker med befruktade embryon alltid producerat kläckta larver, medan Molino och Tinaja var misslyckade del av tiden (2/6 och 2/18 lekande händelser inte producerar kläckta larver, respektive). Det finns variation i kullen som inte verkar hänföras till ålder av överordnade fisken. Tabell 2 visar det totala antalet kläckta larver som härrör från några av de lekande händelserna, och ålder på den överordnade fisken. I allmänhet, Vi hittade att ytan fisk producerar det största antalet larver per spawn (i genomsnitt 1 550 ± 894, n = 5), följt av Pachón (genomsnittlig 879 ± 680, n = 6), Tinaja (genomsnitt 570 ± 373, n = 11), och Molino (genomsnitt 386 ± 276, n = 3). Antalet larver som produceras är vanligtvis mer än behövs per experiment eller för tillväxt till vuxna. Vi vanligtvis ställa in 6-18 plantskola behållare (120-360 larver) och avliva den återstående fisken.
För att mäta framgången av protokollet plantskola spelade vi antalet kläckta larver och överlevande efter larver fisk från framgångsrika lekbeståndets händelser. Tabell 3 visar data från 1 månad av avel i recirkulerande tankar och inkluderar antalet larver överföras till plantskolan behållare som överlevde till 14 dpf. Under denna månad, överlevnaden varierade från 41-81 procent, vilket resulterar i 65-293 fisk tillgänglig per invånare för experiment eller tillväxt till vuxna.
För att avgöra om hela-mount immunfärgning lyckas, jämförde vi fluorescensen av prover inkuberas med primär antikropp de inkuberas med sekundär antikropp endast. Fluorescerande signalen visas bara i fisk inkuberas med primär antikropp. Vi har använt detta protokoll för att framgångsrikt etikett nervceller10 (figur 1) och bukspottkörtelns celler6 skeden upp till 12,5 dpf i både surface och grotta morphotypes.
Figur 1: Neuron märkning. Hela-mount immunfärgning av A. mexicanus. Bild av 12,5 dpf yta fisk (en) och Pachón släktet (b). Bilden av regionen halva kroppen [kläckta gul kontur visas i a och b] av ytan fisk (c) och Pachón släktet (d) färgas med pan-neuronala antikropp (Hu). (e), Confocal bild av en region av surface fisk inälvan visar enteriska nervceller (Hu) och deras prognoser (acetylerade tubulin). För denna bild, var tarmen dissekeras ut och monteras i medium innehållande DAPI för att färga atomkärnor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| befolkning | försök | lekande händelser | kopplingar |
| yta | 94 | 23 | 23 |
| Molino | 110 | 6 | 4 |
| Pachón | 167 | 13 | 13 |
| Tinaja | 242 | 18 | 16 |
Tabell 1: Sammanfattning av data från ett år av avel A. mexicanus i statiska tankar. Antal avel försök, som följer lekande händelser, och antalet lekande händelser som produceras kläckta larver.
| befolkning | överordnade ålder | kläckta larver |
| yta | 1 år | 989 |
| yta | 1 år | 1050 |
| yta | 3 år | 2214 |
| yta | 3 år | 432 |
| yta | 3 år | 1768 |
| yta | 4 år | 2852 |
| Pachón | 1 år | 1194 |
| Pachón | 1 år | 1933 |
| Pachón | 1,5 år | 371 |
| Pachón | 3 år | 480 |
| Pachón | 4 år | 1190 |
| Pachón | 4 år | 110 |
| Tinaja | 9 månader | 259 |
| Tinaja | 9 månader | 253 |
| Tinaja | 10 månader | 1100 |
| Tinaja | 11 månader | 857 |
| Tinaja | 1 år | 713 |
| Tinaja | 1 år | 853 |
| Tinaja | 1 år | 542 |
| Tinaja | 1,5 år | 360 |
| Tinaja | 1,5 år | 58 |
| Tinaja | 1,5 år | 1100 |
| Tinaja | 4 år | 185 |
| Molino | 2,5 år | 460 |
| Molino | 2,5 år | 619 |
| Molino | 3 år | 81 |
Tabell 2: ungefärlig kvinnliga ålder och antalet kläckta larver från enskilda lekbeståndets händelser från de angivna populationerna av A. mexicanus.
| befolkning | försök | lekande händelser | kopplingar | koppling storlek | larver som överförs till plantskolan koppar | efter larver fisk på 14dpf | överlevnad (%) |
| yta | 4 | 3 | 2 | 576 & 1728 | 360 | 174 | 48 |
| Molino | 4 | 2 | 1 | 228 | 159 | 65 | 41 |
| Tinaja | 4 | 1 | 1 | 1952 | 175 | 93 | 53 |
| Pachón | 4 | 1 | 1 | 1696 | 360 | 293 | 81 |
Tabell 3: Sammanfattning av data från en månads avel A. mexicanus i en recirkulerande system och höja larvaena. Antalet häckande försök, som följer kopplingar lekande händelser, som producerade kläckta larver, Genomsnittligt antal larver per koppling, larver överförs till plantskolan behållare, och efter larver fisk förekommer i plantskolan behållarna efter 14 dagar.
Discussion
A. mexicanus jämföra gen aktivitet mellan ytan och grottan och kräver noggrant kontrollerad miljöparametrar och metoder som kan replikeras över laboratorier. Våra protokoll för att höja A. mexicanus ger konsekvent näringsinnehåll under efter larver utveckling. Efter denna utfodring regim, genfunktion kan jämföras tryggt mellan populationer med robust immunohistokemi protokollet vi presenterar. Här diskuterar vi betydelsen av denna metod och dess begränsningar samt framtida tillämpningar.
För att uppnå täthet-matchade tillväxt, hittade vi att efter larver fisk kan höjas utan recirkulerande vatten för två veckor i 1,5 L behållare på en diet av rotifers. Detta protokoll kan också användas för att höja fisk på ett recirkulerande system. rotifers måste dock läggas dagligen för att kompensera för de förlorade genom tank utflödet. Nykläckta Artemia följande används ofta som en näringskälla i vattenbruk, men vi hittade att använda rotifers har avsevärda fördelar, inklusive: nedsatt pris, förbättrad biosäkerhet, konsekvent kost och bättre vattenkvalitet (se nedan).
Första kostar vecka i förbrukningsvaror 4 dollar för rotifers, jämfört med 14 dollar för Artemia. När det gäller biosäkerhet, rotifers höjs i laboratoriet under kontrollerade förhållanden, medan Artemia samlas från naturen och föremål för naturlig variation i mikrobiell eller patogen innehåll23. Artemia följande näringsämnen sammansättning är dessutom miljömässigt beslutsam och därför inkonsekventa. Följande trivs på sina egna energidiversehandel efter kläckning; de förlorar snabbt näringsvärde när de utvecklar och optimalt bör utfodras till fisken inom flera timmar. Artemia börja utfodra på 12 house efter kläckning, som representerar den första gången som de kunde vara näringsmässigt berikade; dock i detta skede har de blivit för stora för 5 dpf fiskar att konsumera. I jämförelse föda rotifers kontinuerligt Marina mikroalger som resulterar i höga näringsinnehåll oavsett när rotifers skördas. Rotifers är mycket mindre än Artmeia följande (160 vs. 400 µm), vilket gör dem lättare för fisken att fånga och svälja. Efter larver yta fisk och släktet förbrukar rotifers i liknande mängder föreslår ingen skillnad i preferens eller förmåga att fånga de rotifers10.
Slutligen, börja Artemia följande dör i färskt vatten flera timmar efter att ha införts. Överblivet följande kommer att sönderfalla, snabbt minska vattenkvaliteten om de inte avlägsnas manuellt. Ta bort döda Artemia är tidskrävande och farligt för efter larver fisk som inte är mycket större än Artemia och kan vara av misstag tas bort eller skadas. Rotifers kan leva på obestämd tid i plantskolan behållarna och ge mat till fisken vid alla tidpunkter utan avsevärt påverkar vattenkvaliteten.
Medan med rotifers som en näringskälla har avsevärda fördelar, för att bevara rotifer lager, alger måste läggas till kultur systemet dagligen. Detta kan uppnås med en automatisk matare som avstår flytande alger i behållaren rotifer kultur (se Tabell för material). Rotifers måste också skördas från detta upplägg varje 24-48 timmar för att bevara hälsan i kulturen. Forskare att odla fisk mycket sällan (en gång om året, till exempel) och är inte berörda med att göra jämförelser mellan populationerna i efter larval arrangerar kanske föredrar Artemia som en näringskälla, eftersom de inkapslade embryona kan kläckas när som helst.
Vi rekommenderar att spårning av antalet kläckta och överlevande larver att övervaka framgången för kläckning och tillväxt. Om de flesta embryon eller larverna dör, kan det bero på bakterie- eller svampinfektioner kontaminering. Det rekommenderas att övervaka vattenkvaliteten i fisk-klar vattnet och sterilisera all utrustning med 70% etanol. Plantskolan behållare kan återanvändas efter de rengörs och steriliseras. För att minimera risken för sjukdom, är det också kritiska bort eventuella döda fiskar från plantskolan behållare och inte lägga till rotifers innan 5 dpf, när fisken börjar äta.
A. mexicanus är könsmogna vid ungefär ett år gammal. Detta är en begränsning för att generera transgena A. mexicanus jämfört Danio rerio (Sebrafisken) som klarar att föda upp 10-12 veckor24. Immunhistokemi (IHC) är en alternativ metod att undersöka genuttryck och protein lokalisering. Protokollet beskrivs här kan anpassas vid varje steg och används för att upptäcka antigener i någon vävnad av intresse. Det är viktigt att Observera dock att vissa vävnader kan vara svårt att visualisera i ytan fisk på grund av pigmentering (en barriär som inte finns i unpigmented släktet), som kan påverka tolkningen av jämförande studier. För att lösa detta potentiella problem, kan yta fisk pigment blekas efter fixering med 3% väteperoxid.
IHC kräver framgångsrika vävnad fixering, blockering och antikropp penetration. Metoder för varje varierar beroende på vilken vävnad och protein av intresse. Fixativ och fixering tiden måste bevara cell arkitektur samtidigt som den antigen epitop. För detta protokoll, vi använder en korslänkande fixativ (PARAFORMALDEHYD) och utelämna en denatureringen fixativ (t.ex. metanol eller aceton). Vi hittade att inkubation i aceton minskade antikropp signal för neuronal och bukspottskörteln markörer. Det blockerande steget är nödvändigt att förhindra att antikroppar bindning till icke-målproteiner i vävnaden. Denna metod använder en kombination av normala serum (5%) och BSA (0,2%) i den blockerande lösningen. Den blockerande lösningen innehåller antikroppar och proteiner som binder till reaktiva platser på proteiner i vävnaden, minskande icke-specifik bindning av primära och sekundära antikroppar.
För att uppnå antikropp penetration, måste vävnaden vara permeabilized. Detta kan uppnås med rengöringsmedel eller denatureringen lösningsmedel men måste optimeras för att bevara den antigen epitop. Våra protokoll använder en kombination av Triton och dimetyl sulfoxid (DMSO). Triton och DMSO ingår under de blockering och antikropp inkubationsstegen i koncentrationer på 0,5% och 1%, respektive. Använder denna koncentration, har vi observerat färgning i hjärnan, bukspottkörteln, tarmen och muskler, vilket tyder på att det är sannolikt effektiv för penetration av alla vävnader. Fiskstorlek kan också påverka penetration. Detta protokoll har inte testats på fisk som är större än 14 dagar gamla (cirka 7 mm i längd). Om du vill felsöka färgning, rekommenderas det att ändra fixering, blockering och antikropp penetration stegen. Det är också viktigt att undersöka sekvens bevarande av immunogen med A. mexicanus proteinet av intresse med hjälp av de tillgängliga genom25.
A. mexicanus är en utmärkt modell att undersöka evolutionen som populationer av samma art som har utvecklats i dramatiskt olika miljöer kan jämföras direkt i laboratoriet. Standard djurhållning protokoll, både inom och mellan laboratorier, är nödvändig för att förstå de biologiska skillnaderna mellan surface fisk och släktet. Vår artikel ger en metod för att undersöka utvecklingen och gen aktivitet i efter larver fisk utsätts för konsekvent tillväxt parametrar.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av anslag från National Institutes of Health [HD089934, DK108495].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
References
- Carlson, B. M., Klingler, I. B., Meyer, B. J., Gross, J. B. Genetic analysis reveals candidate genes for activity QTL in the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. PeerJ. 6, e5189 (2018).
- Chin, J. S. R., Gassant, C. E., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 319-327 (2018).
- Lloyd, E., Olive, C., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 328-337 (2018).
- Tabin, J. A., Aspiras, A., et al. Temperature preference of cave and surface populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 338-344 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Riddle, M. R., Aspiras, A. C., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Tang, J. L. Y., Guo, Y., et al. The developmental origin of heart size and shape differences in Astyanax mexicanus populations. Developmental Biology. 441 (2), 272-284 (2018).
- Riddle, M. R., Boesmans, W., Caballero, O., Kazwiny, Y., Tabin, C. J. Morphogenesis and motility of the Astyanax mexicanus gastrointestinal tract. Developmental Biology. 441 (2), 285-296 (2018).
- Gore, A. V., Tomins, K. A., et al. An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration. Nature Ecology & Evolution. 2 (7), 1155-1160 (2018).
- McGaugh, S. E., Gross, J. B., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, (2014).
- Gross, J. B., Furterer, A., Carlson, B. M., Stahl, B. A. An Integrated Transcriptome-Wide Analysis of Cave and Surface Dwelling Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), e55659 (2013).
- Hinaux, H., Pottin, K., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pachón Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through natural spawning. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Borowsky, B. R. Handling Astyanax mexicanus Eggs and Fry. CSH Protocols. , (2008).
- Stahl, B. A., Gross, J. B. A Comparative Transcriptomic Analysis of Development in Two Astyanax Cavefish Populations. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (6), 515-532 (2017).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax Transgenesis and Husbandry. How Cavefish Enters the Laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PloS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- JoVE. Current methods in Astyanax mexicanus research. , Available from: https://www.jove.com/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch (2018).
- Heanue, T. A., et al. A Novel Zebrafish ret Heterozygous Model of Hirschsprung Disease Identifies a Functional Role for mapk10 as a Modifier of Enteric Nervous System Phenotype Severity. PLoS Genetics. 12 (11), (2016).
- Reed Mariculture Culturing Rotifers in Small Systems (Home or Lab). , Available from: http://reedmariculture.com/support_rotifers_culturing.php (2018).
- Riddle, M. R., Baxter, B. K., Avery, B. J. Molecular identification of microorganisms associated with the brine shrimp Artemia franciscana. Aquatic Biosystems. 9 (1), (2013).
- Tsang, B., et al. Breeding Zebrafish: A Review of Different Methods and a Discussion on Standardization. Zebrafish. 14 (6), 561-573 (2017).
- Cave fish assembly and gene annotation. , Available from: http://useast.ensembl.org/Astyanax_mexicanus/Info/Annotation (2018).
