Summary
En este protocolo, demostrar cómo criar a adultos Astyanax mexicanus , criar las larvas y realizar montaje conjunto immunohistochemistry en post-larvaria pescado a los fenotipos de superficie y morfotipos de la cueva.
Abstract
Río y cueva adaptada a las poblaciones de Astyanax mexicanus muestran diferencias en morfología, fisiología y comportamiento. Investigación se centró en comparar formas adultas ha revelado las bases genéticas de algunas de estas diferencias. Poco se sabe sobre cómo las poblaciones difieren en las formas larvales (en el inicio de la alimentación). Este tipo de estudios puede proporcionar la penetración en cómo cavefish sobrevive hasta la edad adulta en su ambiente natural. Métodos para comparar el desarrollo post-larvario en el laboratorio requieren acuicultura estandarizada y regímenes de alimentación. Aquí describimos cómo criar peces una dieta a base de rotíferos de ricos en nutrientes en el agua sin recirculación para hasta post fertilización de dos semanas. Demostramos cómo recoger peces post-larvaria de este sistema de vivero y realizar montaje conjunto immunostaining. Inmunotinción es una alternativa atractiva para el análisis de la expresión del transgen para la investigación desarrollo y funciones de los genes en a. mexicanus. El método de vivero también puede utilizarse como un protocolo estándar para establecer poblaciones de densidad comparable de crecimiento en adultos.
Introduction
El tetra mexicano, Astyanax mexicanus, es una sola especie de peces que existen como poblaciones ribereñas (superficie peces) y un número de poblaciones cavernícolas (cavefish) nombrada de las cuevas que habitan (es decir, Tinaja, Molino, Pachón). Un número creciente de investigadores está usando a. mexicanus a investigar las bases genéticas y del desarrollo del comportamiento1,2,3,4, metabólicos5,6 ,7,8y evolución morfológica9,10,11. Recursos disponibles para los estudios de a. mexicanus incluyen un genoma secuenciado y anotado12; transcriptoma13; desarrollo provisional tabla14; y métodos de cría15,16,17, crear transgénicos18edición genes19. Difusión de herramientas adicionales y protocolos actualizados acelerará el crecimiento de la comunidad de investigación cavefish (ver esta colección de métodos20).
Nuestro objetivo es agregar al repertorio existente de herramientas proporciona un método robusto para evaluar el gen actividad en situ en post-larvaria a. mexicanus, de una manera comparable entre laboratorios. Hay dos desafíos para alcanzar esta meta. En primer lugar, hay una necesidad de regímenes estandarizados para incubar y criar los peces entre los laboratorios, como las diferencias en parámetros tales como la alimentación y la densidad afectan el crecimiento y maduración, de tal modo que afectan la actividad de los genes. En segundo lugar, hay una necesidad de un método estandarizado pero adaptable para examinar patrones de actividad de los genes en los peces las larvas. Abordamos estas cuestiones aquí, establecer las prácticas habituales de crianza peces post larvales y la introducción de un protocolo robusto montaje conjunto de inmunohistoquímica (IHQ) para la evaluación de expresión génica en a. mexicanus.
Primero demostramos cómo criar los peces a través de desove natural e identificar los huevos fertilizados. Siguiente describe es cómo incubar huevos fertilizados (larvas) y transferirlos a contenedores de vivero, donde se mantienen a una densidad de 20 peces por contenedor por dos semanas sin recirculación ni cambiar el agua. En la fertilización post de 5 días, los peces han desarrollado poste-larval etapas (que ya no tiene un suministro de yema de huevo) y se proporcionan alimentados con algas Brachionus plicatilis (rotíferos) como fuente de alimento rico en nutrientes que no requieren reposición diaria. Este método proporciona parámetros de crecimiento constante para el desarrollo de larvario y post larvario.
Para evaluar la función del gene, demostramos cómo quitar el pescado de los envases del vivero y realizar montaje en conjunto IHC. El método IHC se ha adaptado de protocolos desarrollados para su uso con Danio rerio21 y es eficaz para el examen de antígenos en los tejidos de a. mexicanus probados, incluyendo el cerebro, el intestino y el páncreas. IHC es una alternativa más rápida a la generación de animales transgénicos para el examen de expresión génica y la localización de la proteína. Este Protocolo será útil para estudios destinados a cultivo de a. mexicanus y la comparación de los fenotipos de los peces superficiales y cavefish en etapas poste-larvales.
Protocol
Los procedimientos descritos a lo largo de este protocolo han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en la Harvard Medical School.
1. cría
Nota: Existen varios métodos publicados para15,16,17,20 que también podría ser utilizado en esta etapa de la cría. Antes de la cría, los peces adultos se mantienen en un 10:14 luz: oscuridad ciclo a 23 ° C y alimentados con una dieta de pellets (ver tabla de materiales) una vez al día. Pescado puede ser criado en un sistema de recirculación con filtración mecánica y esterilización ultravioleta. Cría también puede lograrse en tanques estáticos (sin recirculación), pero pescado debe no dejarse en un tanque estático por más de 3 días, como la calidad del agua se degrada rápidamente.
- Llenar un tanque de 5 galones con agua de pescado preparado (declorada agua ajustado a: pH = 7.1 +-2, conductividad = 900 +-150 μs, temperatura = 23 ° C).
- Colocar plástico malla (ver materiales) en la parte inferior del tanque. Si cría en tanques estáticos, colocar un calentador de agua al lado del tanque. Si se cría en un sistema de recirculación, colocar un calentador de agua en el sumidero del sistema.
Nota: La malla de plástico impide que los adultos consumir huevos. - Lugar una hembra y dos machos a. mexicanus de los pescados de más de 1 año de edad en el tanque. Permita que el pescado se adapte durante 30 minutos.
- Ajuste la temperatura del calentador a 24 ° C (o 1 ° C más caliente que la temperatura inicial).
- Después de 24 h, aumentar la temperatura 1 ° C.
- Después de 24 h, aumentar la temperatura 1 ° C. Comprobar diariamente los depósitos de huevos alumbrando con una linterna en la parte inferior del tanque. Retener los peces de alimentos durante este período de 3 días.
- Si después de 3 días no ha inducido de desove, apague el calentador y permita que el agua volver a temperatura ambiente (RT) antes de mover los peces a su tanque original.
2. Incubar huevos fertilizados
- Una vez que los huevos se identifican en un tanque de cría, eliminar los adultos y la malla de plástico y reducir el agua a una profundidad de 10 cm utilizando un vaso o una taza.
Nota: Para calcular el tiempo de desove, utilizar una pipeta para poner varios huevos en un plato de Petri y ve con un estereomicroscopio para determinar la etapa14 y estimar el momento de la fecundación. - Hacia el tanque de una superficie de trabajo cómoda y eliminar huevos opacos o heces, dejando solo los huevos translúcidos, fértil en el tanque.
Nota: El número de huevos fértiles se puede grabar en este momento. - Llene el tanque con peces-listo de agua (ver paso 1.1) y agregar 6-7 gotas de azul de metileno al tanque como el agua llena.
Nota: La concentración final de azul de metileno es de aproximadamente 1,5 ppm. - Agregue un borboteador de acuario (conectado a una bomba de aire, con un regulador) y el calentador al tanque.
- Ajuste la temperatura a 24 ° C y ajuste el regulador de corriente de aire para producir un chorro suave de las burbujas.
- Coloque una tapa en el tanque para ayudar a mantener la temperatura del agua.
Nota: Los huevos deben comenzar dentro de 24 h de la época de desove de la trama.
3. transferencia de larvas eclosionadas a contenedores de vivero
- Añadir 20 g de sal (ver materiales) 8 L de listo para peces de agua (vea el paso 1.1) y revolver hasta que se disuelva. Llene cada recipiente de 1,5 L vivero (ver materiales) con 1 L de agua preparada.
- Utilice una pipeta de transferencia para mover las larvas eclosionadas en los envases de preparados infantiles a una densidad de 20 peces por contenedor.
Nota: Un proyector que puede ser útil para localizar y transferir las larvas eclosionadas. - Después de han extraído todas las larvas eclosionadas visibles, agitar el agua en el tanque de agitación, o soplar chorros de agua en los bordes y las esquinas del tanque con la pipeta.
Nota: Esto le ayudará a revelar las larvas que faltaron en la primera pasada. - Disponer de larvas no utilizadas en esta etapa utilizando las directrices de la oficina de bienestar laboratorio (OLAW). Añadir hipoclorito de sodio al tanque para alcanzar una concentración final de 6.15%. Espere al menos 5 minutos antes de verter por el fregadero.
- Marcar cada recipiente de vivero con la fecha y hora de la fertilización. Ver envases de cuarto de niños diariamente y continuar quitar cualquier larvas muertas.
4. elaboración de base de rotíferos de pescado
- Véase Tabla de materiales para obtener información sobre la obtención de rotíferos. Seguir el protocolo de referenciado para establecer, mantener y cosechar los rotíferos22.
- Preparar pescado alimentos añadiendo 3 mL de una mezcla de algas (véase Tabla de materiales) para 1 L de rotíferos cosechados. Esta mezcla se añadirá directamente a los envases del vivero como un suministro de alimentos.
5. alimentación de post larvas peces
- Cuando los peces son 5 días post fertilización (dpf), añadir 3 mL de alimento para peces (preparado en el paso 4.2) para cada envase de cuarto de niños. A la densidad óptima, rotíferos deben ser visible en grupos densos en las esquinas de los envases del vivero y menos evidente en el centro del contenedor. Agregue la mezcla de rotíferos adicional hasta alcanzar la densidad adecuada.
- Revise los recipientes diariamente para la presencia de rotíferos y añadir más si la concentración llega agotada. Continuar quitar cualquier larvas muertas.
- Cuando los peces alcanzan 14 PD, moverlos a un tanque con un sistema de recirculación con una densidad de 5 peces/L de agua.
Nota: El número de supervivientes post-larvas peces puede grabarse en este momento.
6. whole-mount Immunohistochemistry de post larvas peces
- Pescado post-larvaria quitar del escenario deseado del alimento para 24 h vertiendo el contenedor de vivero que contiene el pescado a través de un nylon de malla tamiz y poner el colador en un recipiente con agua limpia pescado listo (vea el paso 1.1).
Nota: Es esencial para quitar toda la comida. Incluso pequeñas cantidades de alimentos en el intestino son auto-fluorescente e influirán en la proyección de imagen. - Recoger y eutanasia a los peces.
Nota: El protocolo de eutanasia debe seguir directrices OLAW y ser aprobado por su Institucional Animal cuidado y uso. Hemos observado que tricaine solo no eutanasia post-larvaria peces y los peces empiezan a moverse cuando transfiere de Metanosulfonato a fijador si los peces no se guardan también en el hielo.- Metanosulfonato de solución en un vaso de precipitados añadiendo 0,4 g de tricaine-S y 0,8 g de bicarbonato de sodio en 1 L de agua desionizada y coloque en hielo.
- Vierta el agua que contiene el pescado a través de un colador de malla de nylon para recoger los peces. Sumerja el filtro en solución de Metanosulfonato helada y dejar en hielo durante 10 minutos.
- Fijar los eutanasia de peces.
- Utilizar una pipeta con una punta de corte para transferir el pescado a un tubo cónico.
- Eliminar el Metanosulfonato de solución con una pipeta de transferencia y reemplazar con fijador. Incubar con mecedora.
Nota: Tiempo de fijador y la fijación debe determinarse basado en el anticuerpo usado. solución de formalina al 10% (formaldehído al 4%, ver los materiales) durante la noche a 4 ° C es adecuado para los anticuerpos aparecen en la Tabla de materiales.
PRECAUCIÓN: Formol es tóxico e inflamable. Usar equipo de protección personal (guantes, bata y gafas resistentes a salpicaduras) y el mango en una campana química. Soluciones que contengan formol deben eliminarse como residuos peligrosos. - Utilizar una pipeta para extraer cuidadosamente el fijador sin molestar a los peces. Añadir 3 mL de fosfato tamponada con solución salina-triton [PBS con 0,1% Triton (SAFT), ver materiales] e incubar por 15 min a temperatura ambiente con mecedora.
- SAFT de quitar y reemplazar con SAFT fresco e incubar por 15 min repetirlo una vez más de "lavado".
Nota: El pescado puede almacenarse en PBS con azida de sodio 0,02% a 4 ° C durante varias semanas.
- Realizar el montaje conjunto immunostaining.
- Preparar 50 mL de solución [PB-0.5% Triton X, 0.2% albúmina de suero bovino (BSA), 1% de dimetilsulfóxido (DMSO), 0,02% de azida de sodio, 5% de suero de burro] de bloqueo.
PRECAUCIÓN: Azida de sodio y DMSO son tóxicos. Cuando maneje, puede usarse equipo de protección personal (guantes, bata y gafas resistentes a salpicaduras). Cualquier solución debe desecharse como residuos peligrosos. - Utilizar una pipeta para transferir el pescado a un frasco de vidrio de 4 mL con tapón de tapa de rosca. Utilizar una pipeta para quitar la SAFT y añadir 3 mL de solución de bloqueo. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente con mecedora.
- Utilice una pipeta de transferencia para eliminar la solución de bloqueo y añadir anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo. Incubar durante una noche a temperatura ambiente con agitación.
Nota: por ejemplo, añadir la dilución de 1: 250 de Neuronal proteína Anticuerpo Monoclonal de ratón anti-HuC/HuD (véase Tabla de materiales para obtener una lista de los anticuerpos que se han utilizado con éxito en a. mexicanus). Un conjunto de peces con ningún anticuerpo primario agregado debe ser incluido en este paso. Volumen de anticuerpos debe ser suficiente para cubrir el pescado y permitir la agitación. - Lavar el pescado 3 veces con SAFT como se describe en el paso 6.3.4. Reemplace SAFT con anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo e incubar durante una noche a temperatura ambiente con agitación.
Nota: La concentración óptima del anticuerpo primario y secundario, tiempo de incubación y temperatura de incubación deben determinarse para cada anticuerpo. Noche en RT era eficaz para los anticuerpos aparecen en la Tabla de materiales. - Lavar el pescado 3 veces con SAFT, con cada lavado dura 15 minutos como se describe en el paso 6.3.4.
- Transferir el pescado a PBS para almacenamiento a corto plazo antes de proceder con la disección, montaje o Seccionando el pescado.
- Preparar 50 mL de solución [PB-0.5% Triton X, 0.2% albúmina de suero bovino (BSA), 1% de dimetilsulfóxido (DMSO), 0,02% de azida de sodio, 5% de suero de burro] de bloqueo.
Representative Results
La tabla 1 muestra éxito durante un año de crianza de peces de superficie y Tinaja, Molino y Pachón cavefish en tanques de cultivo estático. Superficie y desova Pachón con embriones fertilizados producidos siempre nacieron larvas, mientras que Molino y Tinaja eran fracasado algunas veces (2/6 y 2/18 eventos de desove no producen larvas eclosionadas, respectivamente). Hay variación en el tamaño del embrague que no parece atribuirse a la edad de los peces de los padres. La tabla 2 muestra el número total de larvas eclosionadas resultantes de algunos de los eventos de desove y la edad de los peces de los padres. En general, se encontró que peces de superficie producen el mayor número de larvas por spawn (promedio de 1.550 ± 894, n = 5), seguido por Pachón (promedio ± 879 680, n = 6), Tinaja (promedio ± 570 373, n = 11) y Molino (promedio ± 386 276, n = 3). El número de larvas producidas es típicamente más que son necesarias por el experimento o de crecimiento en adultos. Por lo general establecer contenedores de vivero 6-18 (120-360 larvas) y eutanasia los restantes peces.
Para medir el éxito del Protocolo de vivero se registró el número de larvas eclosionadas y peces sobrevivientes post-larvaria de exitosos eventos de desove. Tabla 3 muestra los datos de 1 mes de crianza en tanques de recirculación e incluye el número de larvas transferidos a contenedores de vivero que sobrevivieron a 14 PD. Durante este mes, la tasa de supervivencia osciló entre 41-81 por ciento, dando como resultado pescado 65-293 por habitantes para experimentos o de crecimiento en adultos.
Para determinar si todo Monte immunostaining tiene éxito, se comparó la fluorescencia de las muestras que se incubaron con el anticuerpo primario que se incubaron con el anticuerpo secundario solamente. La señal fluorescente sólo es visible en los peces que se incubaron con el anticuerpo primario. Hemos utilizado este protocolo etiqueta neuronas10 (figura 1) y las células pancreáticas6 en etapas hasta 12.5 dpf en tanto a la superficie y morfotipos de la cueva.
Figura 1: neurona etiquetado. Conjunto montaje immunostaining de a. mexicanus. Imagen de 12,5 PD superficie peces (un) y Pachón cavefish (b). Imagen de la región de la mitad del cuerpo [rayada amarillo contorno se muestra en (a) y (b)] de los peces de superficie (c) y Pachón cavefish (d) teñidos con anticuerpos pan neuronal (Hu). (e) Confocal imagen de una región de las neuronas entéricas mostrando del intestino de peces de superficie (Hu) y sus proyecciones (tubulina acetilada). Esta imagen, el intestino se diseca y montado en medio con DAPI para teñir los núcleos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| población | los intentos de | eventos de desove | embragues |
| superficie | 94 | 23 | 23 |
| Molino | 110 | 6 | 4 |
| Pachón | 167 | 13 | 13 |
| Tinaja | 242 | 18 | 16 |
Tabla 1: Resumen de datos de un año de crianza A. mexicanus en tanques estáticos. Número de cría los intentos, dando como resultado eventos de desove y número de eventos que producen de desove nacieron las larvas.
| población | edad de los padres | larvas eclosionadas |
| superficie | 1 año | 989 |
| superficie | 1 año | 1050 |
| superficie | 3 años | 2214 |
| superficie | 3 años | 432 |
| superficie | 3 años | 1768 |
| superficie | 4 años | 2852 |
| Pachón | 1 año | 159° |
| Pachón | 1 año | de 1933 |
| Pachón | 1.5 años | 371 |
| Pachón | 3 años | 480 |
| Pachón | 4 años | 1190 |
| Pachón | 4 años | 110 |
| Tinaja | 9 meses | 259 |
| Tinaja | 9 meses | 253 |
| Tinaja | 10 meses | 1100 |
| Tinaja | 11 meses | 857 |
| Tinaja | 1 año | 713 |
| Tinaja | 1 año | 853 |
| Tinaja | 1 año | 542 |
| Tinaja | 1.5 años | 360 |
| Tinaja | 1.5 años | 58 |
| Tinaja | 1.5 años | 1100 |
| Tinaja | 4 años | 185 |
| Molino | 2.5 años | 460 |
| Molino | 2.5 años | 619 |
| Molino | 3 años | 81 |
Tabla 2: aproximada edad femenina y el número de larvas eclosionadas de eventos de desove individuales de las indicadas poblaciones de A. mexicanus.
| población | los intentos de | eventos de desove | embragues | tamaño de la nidada | larvas transferidas a tazas de guardería | post larvas peces en 14dpf | supervivencia (%) |
| superficie | 4 | 3 | 2 | 576 y 1728 | 360 | 174 | 48 |
| Molino | 4 | 2 | 1 | 228 | 159 | 65 | 41 |
| Tinaja | 4 | 1 | 1 | 1952 | 175 | 93 | 53 |
| Pachón | 4 | 1 | 1 | 1696 | 360 | 293 | 81 |
Tabla 3: Resumen de datos de un mes de la cría de a. mexicanus en un sistema de recirculación y criar las larvas. Número de intentos, dando por resultado la cría desove eventos, embragues que producen larvas eclosionadas, número promedio de larvas por embrague, larvas transferidas a contenedores de vivero los peces las larvas presentes en los envases del vivero después de 14 días.
Discussion
Comparando la actividad de los genes entre superficie y cueva a. mexicanus requiere cuidadosamente controlados parámetros ambientales y los métodos que pueden ser replicados a través de laboratorios. Nuestro protocolo para elevar a. mexicanus proporciona contenido nutricional constante durante el desarrollo de las larva. Siguiendo este régimen de alimentación, funciones de los genes pueden compararse con confianza entre las poblaciones mediante el protocolo de inmunohistoquímica robustos que presentamos. Aquí discutimos la importancia de este método así como sus limitaciones y futuras aplicaciones de.
Para lograr el crecimiento de densidad comparable, se encontró que peces post-larvaria pueden ser levantado sin recirculación de agua para dos semanas en envases de 1,5 L en una dieta de rotíferos. Este protocolo también puede utilizarse para criar peces en un sistema de recirculación; sin embargo, deben añadirse diariamente rotíferos para compensar los perdidos a través de la salida del tanque. Nauplios de Artemia recién eclosionadas se utilizan como fuente de alimento en la acuicultura, pero se encontró que el uso de rotíferos tiene considerables ventajas, entre ellas: reducción de precio, mejor bioseguridad, nutrición constante y mejor calidad del agua (véase abajo).
En primer lugar, el costo semanal en consumibles es de 4 dólares para rotíferos, comparados con 14 dólares para Artemia. Sobre bioseguridad, rotíferos son criados en el laboratorio bajo condiciones controladas, mientras que la Artemia se recogen de la naturaleza y sujetos a variación natural microbiana o patógeno contenido23. Además, la composición en nutrientes de nauplios de Artemia son ambientalmente determinado y por lo tanto incompatibles. Nauplios de prosperan en sus propios almacenes de la energía después de la eclosión; rápidamente pierden valor nutritivo como se desarrollan y óptimo debe ser alimentados a los peces dentro de varias horas. Artemia comenzar alimentación en casa 12 post eclosión, que representa la primera vez que podría enriquecer nutricionalmente; sin embargo, en esta etapa se han convertido en demasiado grande para 5 peces de PD consumir. En comparación, rotíferos continuamente se alimentan de microalgas marinas, dando por resultado alto contenido nutriente independientemente de cuando se cosechan los rotíferos. Rotíferos son mucho más pequeños que Artmeia nauplios (160 vs 400 micrones), lo que facilita para los peces a capturar y tragar. Cavefish y pescado superficial post larva consume rotíferos en cantidades similares, no sugiriendo ninguna diferencia en la preferencia o la capacidad de capturar los rotíferos10.
Por último, nauplios de Artemia comienzan morir en agua varias horas después de ser introducido. Sin comer nauplios decaerá rápidamente disminuyendo la calidad del agua si no son retiradas manualmente. Quitar muerto Artemia es lento y peligroso para post larvas peces que no son mucho más grandes que la Artemia y pueden accidentalmente eliminar o heridos. Rotíferos pueden vivir indefinidamente en los contenedores de vivero y proporcionar alimento a los peces todo el tiempo sin afectar significativamente la calidad del agua.
Mientras que utilizando rotíferos como una fuente de alimentación tiene ventajas considerables, para mantener las algas comunes, rotíferos debe agregarse al sistema de cultura diariamente. Esto puede lograrse con un alimentador automático que dispensa las algas líquidas en el recipiente de cultivo de rotíferos (véase Tabla de materiales). Rotíferos deben también ser cosechados de esta configuración cada 24-48 horas para mantener la salud de la cultura. Los investigadores que crían peces muy poca frecuencia (una vez al año, por ejemplo) y no se ocupan de hacer comparaciones entre las poblaciones en las etapas poste-larvales pueden preferir Artemia como fuente de alimento, ya que los embriones enquistados pueden ser tramados en cualquier momento.
Se recomienda seguimiento el número de larvas nacidas y sobrevivientes para supervisar el éxito de eclosión y el crecimiento. Si la mayoría de los embriones o larvas muere, puede ser debido a la contaminación bacteriana o micótica. Se recomienda monitorear la calidad del agua del agua de pescado preparado y esterilizar cualquier equipo con etanol al 70%. Contenedores de vivero pueden reutilizarse después de limpiar y esterilizar. Para minimizar el riesgo de la enfermedad, también es importante retirar cualquier pez muerto de los envases del vivero y no añadir rotíferos antes PD 5, cuando los peces comienzan a comer.
A. mexicanus están sexualmente maduros en aproximadamente un año de edad. Esto es una limitación para la generación de transgénicos a. mexicanus en comparación con Danio rerio (pez cebra) que son capaces de criar a los 10-12 semanas24. Inmunohistoquímica (IHC) es un método alternativo para investigar la expresión de genes y la localización de la proteína. El protocolo descrito aquí puede ser adaptado a cada paso y utilizado para detectar antígenos en los tejidos de interés. Es importante tener en cuenta que algunos tejidos pueden ser más difíciles de visualizar en superficie peces debido a la pigmentación (una barrera que no existe en cavefish no pigmentado), que pueden influir en la interpretación de los estudios comparativos. Para abordar este problema potencial, pigmento de la superficie del pescado puede ser blanqueada después de la fijación usando peróxido de hidrógeno 3%.
IHC requiere fijación de tejido exitosa, bloqueo y penetración de anticuerpos. Métodos de cada una varían dependiendo del tejido y la proteína de interés. El tiempo de fijador y la fijación debe preservar arquitectura celular manteniendo el epitopo del antígeno. De este protocolo, utilizamos un fijador Cross-linking (paraformaldehído) y omitir un fijador de desnaturalización (tales como metanol o acetona). Encontramos que la incubación en acetona disminuido señal de anticuerpos para marcadores neuronales y pancreáticos. El paso de bloqueo es esencial para prevenir anticuerpos de unión a proteínas no objetivo en el tejido. Este método utiliza una combinación de suero normal (5%) y BSA (0,2%) en la solución de bloqueo. La solución de bloqueo contiene anticuerpos y proteínas que se unen a los sitios reactivos en proteínas en el tejido, disminuyendo la Unión inespecífica de los anticuerpos primarios y secundarios.
Para lograr penetración de anticuerpos, el tejido debe ser permeabilized. Esto puede lograrse con detergentes o solventes desnaturalización pero debe optimizarse para preservar el epitopo del antígeno. Nuestro protocolo utiliza una combinación de Tritón y el dimetil sulfóxido (DMSO). Tritón y DMSO se incluyen durante los pasos de incubación bloqueo y anticuerpo a concentraciones de 0.5% y 1%, respectivamente. Con esta concentración, hemos observado manchas en el cerebro, páncreas, intestino y músculo, lo que sugiere que es probablemente eficaz para la penetración de todos los tejidos. Tamaño de los peces también puede influir la penetración. Este protocolo no ha sido probado en peces mayores de 14 días de edad (aproximadamente 7 mm de longitud). Para solucionar problemas de coloración, se recomienda modificar los pasos de penetración fijación, bloqueo y anticuerpo. También es importante examinar la conservación de la secuencia del inmunógeno con la proteína de a. mexicanus de interés utilizando el genoma disponible25.
A. mexicanus es un excelente modelo para investigar la evolución como las poblaciones de la misma especie que ha evolucionado en ambientes radicalmente diferentes pueden compararse directamente en el laboratorio. Protocolos de cría estándar, tanto dentro como entre los laboratorios, son esenciales para la comprensión de las diferencias biológicas entre peces de superficie y cavefish. El artículo proporciona un método para examinar el desarrollo y actividad de los genes en post larvas peces expuestos en parámetros de crecimiento constante.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los institutos nacionales de salud [HD089934, DK108495].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
References
- Carlson, B. M., Klingler, I. B., Meyer, B. J., Gross, J. B. Genetic analysis reveals candidate genes for activity QTL in the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. PeerJ. 6, e5189 (2018).
- Chin, J. S. R., Gassant, C. E., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 319-327 (2018).
- Lloyd, E., Olive, C., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 328-337 (2018).
- Tabin, J. A., Aspiras, A., et al. Temperature preference of cave and surface populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 338-344 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Riddle, M. R., Aspiras, A. C., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Tang, J. L. Y., Guo, Y., et al. The developmental origin of heart size and shape differences in Astyanax mexicanus populations. Developmental Biology. 441 (2), 272-284 (2018).
- Riddle, M. R., Boesmans, W., Caballero, O., Kazwiny, Y., Tabin, C. J. Morphogenesis and motility of the Astyanax mexicanus gastrointestinal tract. Developmental Biology. 441 (2), 285-296 (2018).
- Gore, A. V., Tomins, K. A., et al. An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration. Nature Ecology & Evolution. 2 (7), 1155-1160 (2018).
- McGaugh, S. E., Gross, J. B., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, (2014).
- Gross, J. B., Furterer, A., Carlson, B. M., Stahl, B. A. An Integrated Transcriptome-Wide Analysis of Cave and Surface Dwelling Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), e55659 (2013).
- Hinaux, H., Pottin, K., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pachón Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through natural spawning. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Borowsky, B. R. Handling Astyanax mexicanus Eggs and Fry. CSH Protocols. , (2008).
- Stahl, B. A., Gross, J. B. A Comparative Transcriptomic Analysis of Development in Two Astyanax Cavefish Populations. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (6), 515-532 (2017).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax Transgenesis and Husbandry. How Cavefish Enters the Laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PloS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- JoVE. Current methods in Astyanax mexicanus research. , Available from: https://www.jove.com/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch (2018).
- Heanue, T. A., et al. A Novel Zebrafish ret Heterozygous Model of Hirschsprung Disease Identifies a Functional Role for mapk10 as a Modifier of Enteric Nervous System Phenotype Severity. PLoS Genetics. 12 (11), (2016).
- Reed Mariculture Culturing Rotifers in Small Systems (Home or Lab). , Available from: http://reedmariculture.com/support_rotifers_culturing.php (2018).
- Riddle, M. R., Baxter, B. K., Avery, B. J. Molecular identification of microorganisms associated with the brine shrimp Artemia franciscana. Aquatic Biosystems. 9 (1), (2013).
- Tsang, B., et al. Breeding Zebrafish: A Review of Different Methods and a Discussion on Standardization. Zebrafish. 14 (6), 561-573 (2017).
- Cave fish assembly and gene annotation. , Available from: http://useast.ensembl.org/Astyanax_mexicanus/Info/Annotation (2018).
