Summary
In dit protocol, we laten zien hoe fokken Astyanax mexicanus volwassenen, verhogen van de larven en geheel-mount immunohistochemistry op post larvale vissen te vergelijken van de fenotypen van oppervlak en grot morphotypes uitvoeren.
Abstract
Rivier en grot-aangepast populaties van Astyanax mexicanus tonen verschillen in morfologie, fysiologie en gedrag. Onderzoek gericht op het vergelijken van volwassen vormen is gebleken dat de genetische basis van sommige van deze verschillen. Minder is gekend over hoe de bevolking in post larvale stadia (aan het begin van de voeding verschillen). Dergelijke studies kunnen inzicht geven in hoe cavefish door middel van volwassenheid in hun natuurlijke omgeving overleven. Methoden voor het vergelijken van post larvale ontwikkeling in het laboratorium vereisen gestandaardiseerde aquacultuur en voeding regimes. Hier beschrijven we hoe te vissen op een dieet van voedselrijke raderdiertjes in niet-opnieuw circuleren water voor maximaal twee weken bericht bevruchting verhogen. We laten zien hoe na larvale vissen van deze kwekerij systeem verzamelen en geheel-mount immunokleuring uitvoeren. Immunokleuring is een aantrekkelijk alternatief voor transgenic expressie analyse voor het onderzoeken van de ontwikkeling en genfunctie in A. mexicanus. De kwekerij-methode kan ook worden gebruikt als een standaardprotocol voor vaststelling van dichtheid-matched populaties groei tot volwassenen.
Introduction
De Mexicaanse tetra, Astyanax mexicanus, is een soort vis die zijn ingesteld als rivier-woning populaties (oppervlakte vis) en een aantal grot-woning populaties (cavefish) vernoemd naar de grotten die ze bewonen (dat wil zeggen, Tinaja, Molino, Pachón). Een groeiend aantal onderzoekers gebruikt A. mexicanus te onderzoeken van de genetische en ontwikkelingsstoornissen grondslagen van gedrags1,2,3,4, metabole5,6 ,7,8, en morfologische evolutie9,10,11. Beschikbare middelen voor studies van A. mexicanus omvatten een gesequenceerd en geannoteerde genoom12; transcriptome13; Developmental tijdelijke tabel14; en methoden voor het kweken van15,16,17, maken transgenics18, en bewerken van genen19. Verspreiding van extra hulpmiddelen en bijgewerkte standaardprotocollen versnelt de groei van de onderzoeksgemeenschap cavefish (zie deze methoden collectie20).
Ons doel is om toe te voegen aan het bestaande repertoire van hulpmiddelen door het verstrekken van een robuuste methode voor de beoordeling van gene activiteit in situ in post larvale A. mexicanus, op een wijze vergelijkbaar tussen laboratoria. Er zijn twee uitdagingen aan dit doel te bereiken. Ten eerste, er is behoefte aan een gestandaardiseerde regelingen voor broedeieren en het verhogen van de vis tussen laboratoria, als de verschillen in parameters, zoals voeding en dichtheid van invloed zijn op groei en rijping, waardoor de invloed van gen activiteit. Ten tweede, is er een behoefte aan een gestandaardiseerde nog flexibele methode voor de behandeling van de patronen van activiteit van het gen in de post larvale vissen. We kwesties deze hier, tot de oprichting van standaardprocedures voor het verhogen van de vis na larvale stadia en de invoering van een robuust geheel-mount immunohistochemistry (IHC)-protocol voor de beoordeling van de genexpressie in A. mexicanus.
Eerst laten we zien hoe RAS de vis via natuurlijke paaien en identificeren van bevruchte eieren. Beschreven volgende is hoe bevruchte eieren (larven) en deze overbrengen naar kwekerij containers, waar zij worden gehandhaafd bij een dichtheid van 20 vissen per container voor twee weken zonder opnieuw circuleren of wisseling van het water. Op 5-dagen post bevruchting, de vis hebben ontwikkeld na larvale stadia (niet langer het hebben van een dooier levering) en algen-gevoed Brachionus plicatilis (raderdiertjes) als een voedselrijke voedselbron waarvoor geen dagelijkse aanvulling worden verstrekt. Deze methode biedt consistente groeiparameters voor larvale en post larvale ontwikkeling.
Om te beoordelen genfunctie, laten we zien hoe de vis verwijderen van kwekerij containers en het uitvoeren van geheel-mount IHC. De methode van de IHC gepresenteerd is aangepast vanuit protocollen ontwikkeld voor gebruik met Danio rerio21 en is effectief voor de behandeling van antigenen in alle A. mexicanus weefsels getest, inclusief de hersenen, de darm en de alvleesklier. IHC is een sneller alternatief voor het genereren van transgene dieren voor onderzoek van de expressie van genen en eiwitten localisatie. Dit protocol zal zitten nuttig voor studies gericht op groeiende A. mexicanus en vergelijken van de fenotypen van oppervlakte vissen en cavefish post larvale stadia.
Protocol
De procedures die worden beschreven in dit protocol zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan de Harvard Medical School.
1. fok
Opmerking: Er zijn verschillende gepubliceerde methoden voor het kweken van15,16,17,20 die ook worden bij deze stap gebruikt kunnen. Voorafgaand aan het fokken, volwassen vis worden bijgehouden op een 10:14 licht: donker cyclus bij 23 ° C en gevoed een pellet-dieet (Zie tabel van materialen) eens dagelijks. Vis kan worden gekweekt in een recirculatie systeem met mechanische filtratie en UV-sterilisatie. Fok kan ook worden bereikt in statische (niet-opnieuw circuleren) tanks, maar vis mag niet worden overgelaten in een statische tank voor meer dan 3 dagen, zoals waterkwaliteit snel degradeert.
- Een 5 gal tank vullen met vis-klaar water (dechlorinated water aangepast aan: pH = 7.1 +/-2, geleidbaarheid = 900 +/-150 µS, temperatuur = 23 ° C).
- Plaatsen van kunststof gaas (Zie materialen) in de bodem van de tank. Als fokkerij in statische tanks, brengt een boiler aan de kant van de tank. Als fokkerij in een recirculatie systeem, plaatst u een boiler in het Carter van het systeem.
Opmerking: De Netwave voorkomt volwassenen consumeren van eieren. - Plaats één vrouwtje en twee mannelijke A. mexicanus vissen van meer dan 1 jaar oud in de tank. Laat de vis te acclimatiseren gedurende 30 minuten.
- Stel de temperatuur van de kachel op 24 ° C (of 1 ° C warmer dan de begin temperatuur).
- Na 24u, verhogen de temperatuur van 1 ° C.
- Na 24u, verhogen de temperatuur van 1 ° C. Controleer de tanks dagelijks voor eieren door een zaklamp schijnen in de bodem van de tank. Weigeren de vis uit voedsel tijdens deze 3-daagse periode.
- Als kuitschieten heeft niet geïnduceerd na 3 dagen, uitschakelen van de kachel en laat het water terug te keren naar kamertemperatuur (RT) voordat hij de vis naar hun oorspronkelijke tank.
2. uitbroeden eieren bevrucht
- Zodra de eieren zijn geïdentificeerd in een tank van fokken, de volwassenen en netwave verwijderen en verminderen van het water tot een diepte van 10 cm met behulp van een bekerglas of kopje.
Opmerking: Voor het inschatten van tijd voor het kuitschieten, gebruik een pipet overdracht om meerdere eieren in een petrischaal te plaatsen en ze bekijken met een stereomicroscoop om te bepalen van de etappe14 en schatten van het moment van bevruchting. - De tank naar een handige werkoppervlak en verwijder ondoorzichtige eieren of uitwerpselen, waardoor alleen de doorschijnend, vruchtbare eieren in de tank.
Opmerking: Het aantal vruchtbare eieren kan opgenomen worden op dit moment. - Vul de tank met vis-klaar water (zie stap 1.1) en 6-7 druppels methyleenblauw aan de tank toevoegen als het water vult.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van methyleenblauw is ongeveer 1,5 ppm. - Een kachel en aquarium waskolf (verbonden aan een luchtpomp, met een regulator) toevoegen aan de tank.
- De kachel ingesteld op 24 ° C en aanpassen van de airstream regulator om te produceren een zachte stroom van belletjes.
- Plaats een cover op de tank te helpen handhaven van de temperatuur van het water.
Opmerking: De eieren moeten uitkomen binnen de 24 uur van de paai tijd gaan.
3. overdracht van uitgekomen larven aan kwekerij Containers
- 20 gram zout toevoegen (Zie materiaal) tot en met 8 L van vis-klaar water (zie stap 1.1) en roer tot het is opgelost. Vul elke 1,5 L kwekerij-container (Zie materiaal) met 1 L van het bereid water.
- Gebruik een pipet overdracht naar uitgekomen larven bereid kwekerij tanks bij een dichtheid van 20 vissen per container.
Opmerking: Een koplicht kan nuttig zijn de uitgekomen larven te vinden zijn. - Nadat al het zichtbare uitgekomen larven zijn verwijderd, het water in de tank door roeren, en/of water jets blazen in de randen en hoeken van de tank met de pipet doorroeren.
Opmerking: Dit zal helpen onthullen larven die werden gemist op de eerste pass. - Verwijdering van ongebruikte larven in dit stadium met behulp van de richtsnoeren van het kantoor van laboratorium welzijn (OLAW). Natriumhypochloriet aan de tank om een eindconcentratie van 6,15% toevoegen. Wacht ten minste 5 minuten voordat het gieten in de gootsteen.
- Label elke container kwekerij met de datum en tijd van de bevruchting. Bekijk kwekerij containers dagelijks en verdergaat met het verwijderen van alle dode larven.
4. voorbereiding van de Raderdieren gebaseerde vis eten
- Zie Tabel van materialen voor informatie over het verkrijgen van raderdiertjes. Volg het waarnaar wordt verwezen protocol om te zetten, te onderhouden en oogst raderdiertjes22.
- Vis bereiden voedsel door toevoeging van 3 mL van het mengsel van de algen (Zie Tabel van materialen) tot 1 L van geoogste raderdiertjes. Dit mengsel wordt rechtstreeks naar de kwekerij containers toegevoegd als een voedselvoorziening.
5. voeding van post larvale vissen
- Wanneer de vissen zijn 5 dagen post bevruchting (dpf), voeg 3 mL van vis gerechten (in stap 4.2) naar elke container kwekerij. Bij de optimale dichtheid moet raderdiertjes zichtbaar in dichte groepen op de hoeken van de kwekerij containers, en minder herkenbaar in het midden van de container. Voeg extra Raderdieren mengsel totdat de juiste dichtheid bereikt.
- Controleer de containers dagelijks voor de aanwezigheid van raderdiertjes en voeg meer als de concentratie wordt uitgeput. Verdergaat met het verwijderen van alle dode larven.
- Wanneer vis 14 dpf bereiken, verplaatst naar een tank die passen bij een recirculatie systeem bij een dichtheid van 5 vis per liter water.
Opmerking: Het aantal overlevende na larvale vissen kan opgenomen worden op dit moment.
6. geheel-mount Immunohistochemistry van post larvale vissen
- Verwijderen na larvale vissen van de gewenste fase van voedsel gedurende 24 uur door het gieten van de container van de kinderkamer met de vis via een nylon mesh zeef en het plaatsen van de zeef in een container met water schoon vis-klaar (zie stap 1.1).
Opmerking: Het is essentieel om alle van het voedsel te verwijderen. Zelfs kleine hoeveelheden voedsel in de darm zijn auto-belichting fluorescerende en beeldvorming zal beïnvloeden. - Verzamelen en euthanaseren van de vis.
Opmerking: Het euthanasie-protocol OLAW-richtlijnen moet volgen en door uw institutionele Animal Care en gebruik Comité worden goedgekeurd. We hebben gemerkt dat tricaïne alleen niet post larvale vissen euthanaseren doet, en de vissen beginnen te bewegen wanneer overgedragen van tricaïne naar fixeerspray als de vis niet ook op ijs worden gehouden.- Bereid tricaïne-oplossing in een bekerglas door 0.4 g tricaïne-S en 0.8 g natriumbicarbonaat toe te voegen aan 1 liter gedeïoniseerd water en plaats deze op het ijs.
- Giet het water met de vissen door een zeef van nylon mesh voor het verzamelen van de vis. Zachtjes dompelen de zeef in de ijskoude tricaïne oplossing en laat het op ijs gedurende 10 minuten.
- Bevestig de euthanized vis.
- Gebruik een pipet overdracht met een gesneden tip overbrengen van de vis naar een conische buis.
- Verwijder de tricaïne oplossing met een pipet overdracht en vervang met fixeer. Incubeer met rockende.
Opmerking: Fixeer en fixatie tijd moet worden bepaald op basis van het antilichaam gebruikt. 10% formaline-oplossing (4% formaldehyde, zie materialen) 's nachts bij 4 ° C is voldoende voor de antilichamen die zijn vermeld in de Tabel van materialen.
Let op: Formaline is giftig en brandbaar. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, laboratoriumjas en splash bril) en verwerken in een chemische kap. Oplossingen met formaline ingeleverd worden als gevaarlijk afval. - Gebruik een pipet overdracht om zorgvuldig de fixeer zonder verstoring van de vis. Voeg 3 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing-triton oplossing [PBS met 0,1% Triton (PBST), Zie materialen] en incubeer gedurende 15 minuten op RT met rockende.
- PBST verwijderen en vervangen door verse PBST en incubeer voor 15 min. Herhaal dit "wassen" van één extra tijd.
Opmerking: Vis kunnen worden opgeslagen in PBS met 0,02% natriumazide bij 4 ° C voor enkele weken.
- Geheel-mount immunokleuring uitvoeren
- 50 mL van het blokkeren van de oplossing [PB-0.5% Triton X, 0,2% bovien serumalbumine (BSA), 1% dimethylsulfoxide (DMSO), natriumazide 0,02%, 5% ezel serum] voor te bereiden.
Let op: Natriumazide en DMSO zijn giftig. Persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, laboratoriumjas en splash bril) moet worden gebruikt bij de behandeling. Ieder oplossingen ingeleverd worden als gevaarlijk afval. - Gebruik een pipet overdracht overbrengen van de vis naar een 4 mL glazen ampul met schroef-top dop. Gebruik een pipet overdracht verwijderen de PBST en voeg 3 mL oplossing blokkeren. Incubeer gedurende 1 uur bij RT met rockende.
- Gebruik een pipet overdracht verwijderen de blokkerende oplossing en toevoegen van primair antilichaam verdunde oplossing te blokkeren. Na een nacht bebroeden bij kamertemperatuur met agitatie.
Opmerking: bijvoorbeeld toevoegen 1:250 verdunning van anti-HuC/HuD neuronale eiwitten muis monoklonaal antilichaam (Zie Tabel van materialen voor een lijst van antilichamen die met succes zijn gebruikt in A. mexicanus). Een set van vis met geen primair antilichaam toegevoegd moet worden opgenomen bij deze stap. Volume van antilichaam moet genoeg om te dekken van de vis en toestaan voor agitatie. - Was de vis 3 keer met PBST zoals beschreven in stap 6.3.4. PBST vervangen door secundair antilichaam verdund in het blokkeren van de oplossing en na een nacht bebroeden bij RT met agitatie.
Opmerking: Optimale primaire en secundaire antilichaam concentraties en incubatietijd, incubatietemperatuur moeten worden bepaald voor elke antilichaam. Overnachting in RT was effectief voor de antilichamen die zijn vermeld in Tabel van materialen. - De vis 3 keer met PBST, met elke duurzame 15 min zoals beschreven in stap 6.3.4 wash te wassen.
- De vis: Transfer naar PBS voor korte termijn opslag voordat u verdergaat met het ontleden, montage en segmenteren van de vis.
- 50 mL van het blokkeren van de oplossing [PB-0.5% Triton X, 0,2% bovien serumalbumine (BSA), 1% dimethylsulfoxide (DMSO), natriumazide 0,02%, 5% ezel serum] voor te bereiden.
Representative Results
Tabel 1 toont succes gedurende één jaar fokken oppervlakte vis en Tinaja, Molino en Pachón cavefish in statische fokken tanks. Oppervlak en Pachón spawns met bevruchte embryo's altijd geproduceerd uitgekomen larven, terwijl Molino en Tinaja niet succesvol deel van de tijd waren (2/6 en 2/18 kuitschieten gebeurtenissen niet produceren uitgekomen larven, respectievelijk). Er is variatie in omvang van de koppeling die niet lijkt te worden toegeschreven aan de leeftijd van de bovenliggende vis. Tabel 2 toont het totale aantal uitgekomen larven die voortvloeien uit sommige van de paaitijd gebeurtenissen, en de leeftijd van de bovenliggende vis. In het algemeen, vonden we dat oppervlakte vissen het grootste aantal larven per spawn produceren (gemiddelde 1550 ± 894, n = 5), gevolgd door Pachón (gemiddelde 879 ± 680, n = 6), Tinaja (gemiddelde 570 ± 373, n = 11), en Molino (gemiddelde 386 ± 276, n = 3). Het aantal larven geproduceerd is meestal meer dan nodig zijn per experiment of voor groei tot volwassenen. We meestal zetten 6-18 kwekerij containers (120-360 larven) en de resterende vis euthanaseren.
Voor het meten van het succes van het protocol van de kwekerij vastgelegd we het aantal uitgekomen larven en overlevende na larvale vissen uit succesvolle paai gebeurtenissen. Tabel 3 worden gegevens weergegeven uit 1 maand van het fokken in het opnieuw circuleren van tanks en het aantal larven overgedragen aan kwekerij containers die tot 14 dpf overleefde omvat. Tijdens deze maand, is de overlevingskans varieerde van 41-81 procent, wat resulteert in 65-293 vis beschikbaar per bevolking voor experimenten of groei tot volwassenen.
Om te bepalen als geheel-mount immunokleuring succesvol is, vergeleken we de fluorescentie van monsters geïncubeerd met primair antilichaam die geïncubeerd met secundair antilichaam alleen. De fluorescerende signaal is alleen zichtbaar in de vis geïncubeerd met primair antilichaam. We hebben dit protocol gebruikt om met succes label neuronen10 (Figuur 1) en alvleesklier cellen6 stadia tot 12,5 dpf in beide oppervlak en grot van morphotypes.
Figuur 1: Neuron labeling. Geheel-mount immunokleuring van A. mexicanus. Afbeelding van 12,5 dpf oppervlakte vis (een) en Pachón cavefish (b). Beeld van de mid lichaam regio [gearceerde gele overzicht weergegeven in (a) en (b)] van oppervlakte vissen (c) en Pachón cavefish (d) gekleurd met pan-neuronale antilichaam (Hu). (e) Confocal beeld van een regio van de oppervlakte vissen darm weergegeven: darmen neuronen (Hu) en hun prognoses (geacetyleerd tubuline). Voor deze afbeelding, was de darm ontleed uit en gemonteerd in medium met DAPI om vlekken van de kernen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| bevolking | pogingen | kuitschieten evenementen | klauwen |
| oppervlak | 94 | 23 | 23 |
| Molino | 110 | 6 | 4 |
| Pachón | 167 | 13 | 13 |
| Tinaja | 242 | 18 | 16 |
Tabel 1: samenvatting van de gegevens van één jaar van het fokken A. mexicanus in statische tanks. Nummer van het fokken probeert, als gevolg van gebeurtenissen, paaien en aantal kuitschieten gebeurtenissen die geproduceerd uitgekomen larven.
| bevolking | bovenliggende leeftijd | gearceerde larven |
| oppervlak | 1 jaar | 989 |
| oppervlak | 1 jaar | 1050 |
| oppervlak | 3 jaar | 2214 |
| oppervlak | 3 jaar | 432 |
| oppervlak | 3 jaar | 1768 |
| oppervlak | 4 jaar | 2852 |
| Pachón | 1 jaar | 1194 |
| Pachón | 1 jaar | 1933 |
| Pachón | 1,5 jaar | 371 |
| Pachón | 3 jaar | 480 |
| Pachón | 4 jaar | 1190 |
| Pachón | 4 jaar | 110 |
| Tinaja | 9 maanden | 259 |
| Tinaja | 9 maanden | 253 |
| Tinaja | 10 maanden | 1100 |
| Tinaja | 11 maanden | 857 |
| Tinaja | 1 jaar | 713 |
| Tinaja | 1 jaar | 853 |
| Tinaja | 1 jaar | 542 |
| Tinaja | 1,5 jaar | 360 |
| Tinaja | 1,5 jaar | 58 |
| Tinaja | 1,5 jaar | 1100 |
| Tinaja | 4 jaar | 185 |
| Molino | 2,5 jaar | 460 |
| Molino | 2,5 jaar | 619 |
| Molino | 3 jaar | 81 |
Tabel 2: onderlinge aanpassing van de vrouwelijke leeftijd en aantal uitgekomen larven van afzonderlijke paai gebeurtenissen van de aangegeven populaties van A. mexicanus.
| bevolking | pogingen | kuitschieten evenementen | klauwen | de grootte van de koppeling | larven overgedragen aan kwekerij cups | post larvale vissen op 14dpf | voortbestaan (%) |
| oppervlak | 4 | 3 | 2 | 576 & 1728 | 360 | 174 | 48 |
| Molino | 4 | 2 | 1 | 228 | 159 | 65 | 41 |
| Tinaja | 4 | 1 | 1 | 1952 | 175 | 93 | 53 |
| Pachón | 4 | 1 | 1 | 1696 | 360 | 293 | 81 |
Tabel 3: overzicht van gegevens vanaf een maand van het fokken van A. mexicanus in een het opnieuw circuleren systeem en het verhogen van de larven. Nummer van het fokken van pogingen, die het gevolg koppelingen kuitschieten evenementen, die geproduceerd uitgekomen larven, gemiddeld aantal larven per koppeling, larven overgedragen aan de kwekerij containers, and post larvale vissen aanwezig in de kwekerij containers na 14 dagen.
Discussion
Vergelijken van gene activiteit tussen oppervlak en grot vereist A. mexicanus zorgvuldig gecontroleerde Omgevings parameters en methoden die kunnen worden gerepliceerd naar laboratoria. Onze protocol voor het verhogen van A. mexicanus biedt consistente voedingsinhoud tijdens post larvale ontwikkeling. Na dit voeding regime, genfunctie gerust kan worden vergeleken tussen populaties met behulp van het protocol van de robuuste immunohistochemistry we presenteren. Hier bespreken we de betekenis van deze methode, alsmede haar beperkingen en toekomstige toepassingen.
Om te bereiken dichtheid-matched groei, vonden we dat na larvale vissen kan worden verhoogd zonder water gedurende twee weken in 1,5 L containers op een dieet van raderdiertjes opnieuw circuleren. Dit protocol kan ook worden gebruikt om de vis op een recirculatie systeem; raderdiertjes moeten echter dagelijks worden toegevoegd om te compenseren die verloren gaat door de tank uitstroom. Nieuw gearceerde Artemia naupliën worden vaak gebruikt als een bron van voedsel in de aquacultuur, maar we vonden dat het gebruik van raderdiertjes aanzienlijke voordelen heeft, waaronder: verminderde prijs, betere bioveiligheid, consistent voeding en betere kwaliteit van het water (zie hieronder).
Ten eerste, de wekelijkse kosten in verbruiksartikelen is 4 dollar voor raderdiertjes, in vergelijking met 14 dollar voor Artemia. Inzake bioveiligheid, raderdiertjes zijn gerezen in het laboratorium onder gecontroleerde omstandigheden, terwijl Artemia worden verzameld uit het wild en onder voorbehoud van natuurlijke variatie in microbiële of pathogen inhoud23. Daarnaast zijn de nutriënten samenstelling van Artemia naupliën milieu bepaald en derhalve onverenigbaar. Naupliën gedijen op hun eigen winkels van energie na het uitkomen; ze los snel voedingswaarde als ze ontwikkelen en optimaal voor de vis binnen enkele uren moeten worden gevoed. Artemia beginnen voederen op 12 huis na broedeieren, die de eerste keer dat ze kunnen ervan uit voedingsoogpunt worden verrijkt; echter, in dit stadium zijn ze te groot voor 5 dpf vis te consumeren. Ter vergelijking: raderdiertjes continu als waardplanten mariene microalgen resulterend in hoge gehalte aan nutriënten ongeacht wanneer de raderdiertjes zijn geoogst. Raderdiertjes zijn veel kleiner dan Artmeia naupliën (160 vs. 400 micron), waardoor ze gemakkelijker voor de vis te vangen en te slikken. Post larvale oppervlakte vissen en cavefish verbruiken raderdiertjes in vergelijkbare hoeveelheden geen verschil in voorkeur of vermogen voor inneming de raderdiertjes10suggereren.
Ten slotte, Artemia naupliën beginnen sterven in zoet water enkele uren na wordt ingevoerd. Opgegeten naupliën zal vergaan, snel afnemende kwaliteit van het water als ze niet handmatig worden verwijderd. Het verwijderen van dode Artemia is tijdrovend en gevaarlijk voor post larvale vissen die niet veel groter dan Artemia en kunnen per ongeluk zijn verwijderd of gewond. Raderdiertjes kunnen wonen voor onbepaalde tijd in de kwekerij containers en dienen als voedsel voor de vis te allen tijde zonder aanzienlijk beïnvloedende waterkwaliteit van het.
Terwijl raderdiertjes gebruiken als een bron van voedsel aanzienlijke voordelen heeft, om de Raderdieren voorraad, algen moet worden toegevoegd aan het systeem van cultuur dagelijks. Dit kan worden bereikt met een automatische feeder die vloeibare algen in de Raderdieren-cultuur-container uitdeelt (Zie Tabel van materialen). Raderdiertjes moeten ook elke 24-48 uur worden geoogst van deze set-up om te handhaven van de gezondheid van de cultuur. Onderzoekers die RAS vis zeer zelden (eenmaal per jaar, bijvoorbeeld) en zijn niet betrokken bij het maken van vergelijkingen tussen de bevolkingen in post larvale stadia kunt Artemia als een bron van voedsel, aangezien de encysted van de embryo's op elk gewenst moment kunnen worden uitgebroed.
Het is raadzaam om voor het bijhouden van het aantal gearceerde en overlevende larven te controleren van het succes van broedeieren en groei. Als het merendeel van de embryo's of larven sterven, kan dit worden veroorzaakt door bacteriële of schimmel verontreiniging. Het is raadzaam om te controleren de kwaliteit van het water van het vis-klaar water en steriliseren van apparatuur met 70% ethanol. Kwekerij containers kunnen opnieuw worden gebruikt nadat zij zijn gereinigd en gesteriliseerd. Om risico van ziekte, is het ook cruciaal voor het verwijderen van alle dode vissen uit de kwekerij containers en raderdiertjes vóór 5 dpf, niet toe te voegen wanneer de vis begint te eten.
A. mexicanus zijn geslachtsrijp op ongeveer één jaar oud. Dit is een beperking voor het genereren van transgene A. mexicanus ten opzichte van Danio rerio (zebravis) die in staat is om te fokken op 10-12 weken24zijn. Immunohistochemistry (IHC) is een alternatieve methode om de onderzoeken van de expressie van genen en eiwitten localisatie. Het protocol hier beschreven kan worden aangepast bij elke stap en gebruikt voor het opsporen van antigenen in elk weefsel van belang. Het is belangrijk op te merken echter dat sommige weefsels moeilijker wellicht te visualiseren in oppervlakte vissen als gevolg van pigmentatie (een barrière die niet in unpigmented cavefish bestaat), die invloed op de interpretatie van het vergelijkende studies hebben kunnen. Om dit potentiële probleem, kan oppervlakte vissen pigment worden gebleekt na fixatie met 3% waterstofperoxide.
IHC vereist succesvolle weefsel fixatie, blokkeren en antilichaam penetratie. Methoden voor elk is afhankelijk van het weefsel en de proteïne van belang. Het fixeer en fixatie tijd moet cel het platform met behoud van de antigeen-epitoop behouden. Voor dit protocol, wij gebruiken een cross-linking fixatief (paraformaldehyde) en het weglaten van een denatureren fixatief (zoals methanol of aceton). We vonden dat incubatie in aceton verminderd antilichaam signaal voor markeringen voor neuronale en alvleesklier. De blokkerende stap is van essentieel belang te voorkomen dat antilichamen bindende naar doelsoort eiwitten in het weefsel. Deze methode gebruikt een combinatie van normale serum (5%) en BSA (0,2%) in de blokkerende oplossing. De blokkerende oplossing bevat antilichamen en eiwitten die zich aan reactieve sites op eiwitten in het weefsel binden, niet-specifieke binding van de primaire en secundaire antilichamen aan het afnemen.
Om te bereiken antilichaam penetratie, moet het weefsel worden permeabel. Dit kan worden bereikt met detergentia of denatureren oplosmiddelen, maar moet worden geoptimaliseerd voor het behoud van de antigeen-epitoop. Ons protocol gebruikt een combinatie van Triton en dimethyl sulfoxide (DMSO). Triton en DMSO zijn opgenomen tijdens de blokkering en antilichaam-incubatie stappen bij concentraties van 0,5% en 1%, respectievelijk. Met behulp van deze concentratie, hebben we waargenomen in de hersenen, pancreas, darm en spier, kleuring suggereren dat er waarschijnlijk effectief voor penetratie van alle weefsels. De grootte van de vis kan ook van invloed zijn penetratie. Dit protocol is niet getest op vis die groter dan 14 dagen oud (ongeveer 7 mm lengte zijn). Om op te lossen vlekken, is het aanbevolen om de fixatie, blokkeren en antilichaam penetratie stappen wijzigen. Het is ook belangrijk om te onderzoeken van de instandhouding van de volgorde van de immunogeen met de A. mexicanus -proteïne van belang met behulp van de beschikbare genoom25.
A. mexicanus is een uitstekend model te onderzoeken evolutie zoals populaties van dezelfde soort die geëvolueerd in de drastisch verschillende omgevingen kunnen rechtstreeks worden vergeleken in het laboratorium. Standaard veehouderij protocollen, zowel binnen als tussen laboratoria, zijn essentieel voor het begrijpen van de biologische verschillen tussen oppervlakte vissen en cavefish. Ons artikel biedt een methode om te controleren van de ontwikkeling en de activiteit van het gen in post larvale vissen blootgesteld aan consistente groeiparameters.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Institutes of Health [HD089934, DK108495].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
References
- Carlson, B. M., Klingler, I. B., Meyer, B. J., Gross, J. B. Genetic analysis reveals candidate genes for activity QTL in the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. PeerJ. 6, e5189 (2018).
- Chin, J. S. R., Gassant, C. E., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 319-327 (2018).
- Lloyd, E., Olive, C., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 328-337 (2018).
- Tabin, J. A., Aspiras, A., et al. Temperature preference of cave and surface populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 338-344 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Riddle, M. R., Aspiras, A. C., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Tang, J. L. Y., Guo, Y., et al. The developmental origin of heart size and shape differences in Astyanax mexicanus populations. Developmental Biology. 441 (2), 272-284 (2018).
- Riddle, M. R., Boesmans, W., Caballero, O., Kazwiny, Y., Tabin, C. J. Morphogenesis and motility of the Astyanax mexicanus gastrointestinal tract. Developmental Biology. 441 (2), 285-296 (2018).
- Gore, A. V., Tomins, K. A., et al. An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration. Nature Ecology & Evolution. 2 (7), 1155-1160 (2018).
- McGaugh, S. E., Gross, J. B., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, (2014).
- Gross, J. B., Furterer, A., Carlson, B. M., Stahl, B. A. An Integrated Transcriptome-Wide Analysis of Cave and Surface Dwelling Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), e55659 (2013).
- Hinaux, H., Pottin, K., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pachón Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through natural spawning. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Borowsky, B. R. Handling Astyanax mexicanus Eggs and Fry. CSH Protocols. , (2008).
- Stahl, B. A., Gross, J. B. A Comparative Transcriptomic Analysis of Development in Two Astyanax Cavefish Populations. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (6), 515-532 (2017).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax Transgenesis and Husbandry. How Cavefish Enters the Laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PloS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- JoVE. Current methods in Astyanax mexicanus research. , Available from: https://www.jove.com/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch (2018).
- Heanue, T. A., et al. A Novel Zebrafish ret Heterozygous Model of Hirschsprung Disease Identifies a Functional Role for mapk10 as a Modifier of Enteric Nervous System Phenotype Severity. PLoS Genetics. 12 (11), (2016).
- Reed Mariculture Culturing Rotifers in Small Systems (Home or Lab). , Available from: http://reedmariculture.com/support_rotifers_culturing.php (2018).
- Riddle, M. R., Baxter, B. K., Avery, B. J. Molecular identification of microorganisms associated with the brine shrimp Artemia franciscana. Aquatic Biosystems. 9 (1), (2013).
- Tsang, B., et al. Breeding Zebrafish: A Review of Different Methods and a Discussion on Standardization. Zebrafish. 14 (6), 561-573 (2017).
- Cave fish assembly and gene annotation. , Available from: http://useast.ensembl.org/Astyanax_mexicanus/Info/Annotation (2018).
