Summary
I denne protokollen, vi viser hvordan du rase Astyanax mexicanus voksne, heve larvene, og utføre hele-mount immunohistochemistry på post larver fisk å sammenligne av fenotyper overflate og hule morphotypes.
Abstract
Elv og hule-tilpasset bestander av Astyanax mexicanus viser forskjeller i morfologi, fysiologi og atferd. Forskningen fokusert på å sammenlikne voksen skjemaer har avdekket genetisk grunnlag for noen av disse forskjellene. Mindre er kjent om hvordan de skiller seg på post larver stadier (ved utbruddet av fôring). Slike studier kan gi innsikt i hvordan cavefish overleve til voksen alder i sitt naturlige miljø. Metoder for sammenligning av post larver utvikling i laboratoriet krever standardisert akvakultur og fôring regimer. Her beskriver vi hvordan å heve fisk på en diett av næringsrike Wrotek i ikke-resirkulering vann i opptil to uker innlegg befruktning. Vi viser hvordan å samle etter larver fisk fra barnehage systemet og utføre hele-mount immunostaining. Immunostaining er et attraktivt alternativ til transgene uttrykk analyse for å undersøke utvikling og gen funksjon i A. mexicanus. Metoden barnehage kan også brukes som en standardprotokoll for å etablere tetthet-matchet befolkninger veksten i voksne.
Introduction
Den meksikanske tetra, Astyanax mexicanus, er en enkelt fiskearter som finnes som elven-bolig populasjoner (overflate fisk) og en rekke hule-bolig populasjoner (cavefish) oppkalt etter hulene de bor (dvs. Tinaja, Molino, Pachón). Et økende antall forskere bruker A. mexicanus å undersøke genetiske og utviklingsmessige baser atferdsmessige1,2,3,4, metabolske5,6 ,7,8, og morfologiske utviklingen9,10,11. Ressurser for studier av A. mexicanus inkluderer en sekvensert og kommenterte genomet12; transcriptome13; utviklingsmessige oppsetning tabell14; og metoder for oppdrett15,16,17, opprette transgenics18og redigere gener19. Formidling av flere verktøy og oppdatert standardprotokoller vil akselerere veksten av cavefish forskningen fellesskapet (se denne metoder samling20).
Vårt mål er å legge til eksisterende repertoaret av verktøy ved å tilby en robust metode for å vurdere genet aktivitet i situ i post larver A. mexicanus, på en måte som er sammenlignbare mellom laboratorier. Det er to utfordringer for å nå dette målet. Først, det er behov for standardisert regimer til klekking og heve fisken mellom laboratorier, som forskjeller i parameterne for eksempel fôring og tetthet påvirker vekst og modning, og dermed påvirker genet aktivitet. Andre er det behov for en standardisert men tilpasningsdyktige metode for å undersøke mønstre av gen-aktivitet i post larver fisken. Vi løse disse problemene her, etablere vanlig praksis for heve fisk til post larver stadier og innføre en robust hele-mount immunohistochemistry (IHC) protokoll for å vurdere genuttrykk i A. mexicanus.
Først viser vi hvordan å avle fisken gjennom naturlig gyting og identifisere befruktede egg. Beskrevet neste er hvordan Luke befruktede egg (Larvene) og overføre dem til barnehage beholdere, der de vedlikeholdes på en tetthet 20 fisk per container i to uker uten resirkulering eller endre vannet. Ved 5-dagers post befruktning, fisken har utviklet til post larver stadier (ikke lenger har en eggeplomme tilførsel) og tilbys alger-matet Brachionus plicatilis (Wrotek) som en næringsrik mat som ikke krever daglig påfyll. Denne metoden gir konsekvent vekst parametre for larver og post larver.
For å vurdere gen funksjon, viser vi hvordan du fjerner fisken fra barnehage beholdere og utføre hele-mount IHC. Metoden IHC presentert er tilpasset fra protokoller utviklet for bruk med Danio rerio21 og er effektiv for å undersøke antigener i alle A. mexicanus vev testet, inkludert hjernen, tarmen og bukspyttkjertelen. IHC er et raskere alternativ til å generere transgene dyr for undersøkelse av genuttrykk og protein lokalisering. Denne protokollen vil være nyttig for studier vokser A. mexicanus og sammenligning av fenotyper overflate fisk og cavefish på post larver stadier.
Protocol
Fremgangsmåtene i hele denne protokollen er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Harvard Medical School.
1. avl
Merk: Det finnes flere publiserte metoder for oppdrett15,16,17,20 som kan også brukes på dette trinnet. Tidligere å formering, voksen fisk vedlikeholdes på en 10:14 lys: mørke syklus på 23 ° C og matet en diett av pellets (se tabell for materiale) gang daglig. Fisk kan bred i et resirkulerende system mekanisk filtration og UV sterilisering. Avl kan også gjøres i statiske (ikke-resirkulering) tanker, men fisk bør ikke stå i en statisk tank i mer enn 3 dager, som vannkvalitet raskt brytes.
- Fyll en 5 gal tank med fisk-klare vann (dechlorinated vann tilpasset: pH = 7.1 +/-2, ledningsevne = 900 + / 150 µS, temperatur = 23 ° C).
- Plassere plast mesh (se materialer) i bunnen av tanken. Hvis avl statisk stridsvogner, påføre en vannvarmer ved siden av tanken. Hvis oppdrett i et resirkulerende system, sette en vannvarmer i systemet bunnpannen.
Merk: Plast mesh hindrer voksne forbruker egg. - Plass en kvinne og to mannlige A. mexicanus fisk større enn 1 år gammel i tanken. Tillat fisken å acclimate i 30 min.
- Angi temperaturen i ovnen til 24 ° C (eller 1 ° C varmere enn Start temperaturen).
- Etter 24 timer, øke temperaturen 1 ° c.
- Etter 24 timer, øke temperaturen 1 ° c. Sjekk tankene daglig for egg av skinnende en lommelykt i bunnen av tanken. Holde fisken fra mat i denne 3-dagers perioden.
- Hvis gyting ikke har blitt indusert etter 3 dager, slå av ovnen og la vannet tilbake til romtemperatur (RT) før fisken til deres opprinnelige tank.
2. klekking befruktede egg
- Når egg identifiseres i en avl tank, fjerne voksne og plast mesh og redusere vann til en dybde på 10 cm bruker et beger eller cup.
Merk: For å beregne tid gyting, bruke en overføring pipette plassere flere egg i en Petriskål og vise dem med en stereomicroscope trinn14 og beregne tidspunktet for befruktning. - Flytte tanken til en praktisk arbeidsflate og fjerne ugjennomsiktig egg eller avføring, forlater bare gjennomsiktig, fruktbare egg i tanken.
Merk: Antall fruktbare egg kan registreres på denne tiden. - Fyll tanken med fisk-klare vann (se trinn 1.1) og legge til 6-7 dråper methylene blåfarge tanken som fyller vann.
Merk: Den siste konsentrasjonen av methylene blåfarge er ca 1,5 ppm. - Legge til en ovn og akvariet bubbler (festet til en luften pumpe, med en regulator) tanken.
- Sett ovnen til 24 ° C og justere airstream regulator for å produsere en svak strøm av bobler.
- Plass en cover på tanken å opprettholde temperaturen.
Merk: Eggene skal begynne klekking innen 24 timer av gyting tiden.
3. overføring av skravert Larvene til barnehage beholdere
- Legge til 20 g salt (se materialer) å 8 L av fisk-klare vann (se trinn 1.1) og rør til oppløst. Fyll hver 1,5 L barnehage beholder (se materialer) med 1 L forberedt på vannet.
- Bruk en overføring pipette for å flytte skravert larver i forberedt barnehage containere på en tetthet 20 fisk per container.
Merk: Hodelykt kan være nyttig å finne og overføre skravert larvene. - Etter alle synlige skravert Larvene er fjernet, røre vannet i akvariet røring, og/eller blåse vannstråler i kanter og hjørner av tanken med pipette.
Merk: Dette vil hjelpe avdekke larver som var savnet i første omgang. - Kast ubrukte larver på dette stadiet ved hjelp av retningslinjene for Office laboratorium velferd (OLAW). Legge til natriumhypokloritt tanken å oppnå en siste konsentrasjon på 6.15%. Vent minst 5 minutter før strømme ned i vasken.
- Label hver barnehage beholder med dato og klokkeslett for befruktning. Vis barnehage beholdere daglig og fjerne alle døde larver.
4. forberedelse av Rotifer-baserte fiskefôr
- Se Tabellen for materiale for å få Wrotek. Følg refererte protokollen for å konfigurere, vedlikeholde og høste Wrotek22.
- Klargjøre fisk mat ved å legge til 3 mL alger blanding (se Tabell of Materials) til 1 L høstet Wrotek. Denne blandingen legges direkte til barnehage containere som en matforsyningen.
5. fôring av nye larver fisk
- Når fisken er 5 dager legge befruktning (dpf), legge 3 mL fiskefôr (forberedt i trinn 4.2) til hver barnehage beholder. På den optimale tettheten, bør Wrotek være synlig i tette grupper på hjørnene av barnehage beholdere og mindre tydelig i midten av beholderen. Legge til ekstra rotifer blanding til riktig tettheten er nådd.
- Sjekk beholdere daglig for tilstedeværelsen av Wrotek og legge til flere hvis konsentrasjonen blir oppbrukt. Fortsette å fjerne alle døde larver.
- Når fisk nå 14 dpf, flytte dem til en tank med en resirkulerende system på en tetthet på 5 fisk/L vann.
Merk: Antall overlevende etter larver fisk kan registreres på denne tiden.
6. hele-mount Immunohistochemistry etter larver fisk
- Fjern etter larver fisk av ønskede scenen fra mat for 24 h ved å helle barnehage beholderen som inneholder fisken gjennom en nylon maske sil og plassere silen i en beholder med rent fisk-klare vannet (se trinn 1.1).
Merk: Det er viktig å fjerne all maten. Selv små mengder mat i tarmen er auto-fluorescerende og vil påvirke bildebehandling. - Samle og euthanize fisken.
Merk: Euthanasia protokollen bør følge OLAW retningslinjer og godkjennes av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. Vi har bemerket at tricaine alene ikke euthanize etter larver fisk, og fisken begynner å flytte når overført fra tricaine til bindemiddel hvis fisken ikke er også holdt på is.- Forberede tricaine løsning i et beaker ved å legge 0,4 g av tricaine-S og 0,8 g av natrium bikarbonat til 1 L deionisert vann, og plassere den på is.
- Hell vannet inneholder fisken gjennom en nylon maske sil å samle fisken. Forsiktig dukke silen i iskalde Tricaine løsning og la den på is 10 min.
- Fastsette euthanized fisken.
- Bruke en overføring pipette med et kutt tips overføre fisken til en konisk rør.
- Fjerne Tricaine løsningen med en overføring pipette og erstatte med bindemiddel. Inkuber med rock.
Merk: Bindemiddel og fiksering må bestemmes basert på antistoffer brukes. 10% formalin løsning (4% formaldehyd, se materialer) overnatting på 4 ° C er tilstrekkelig for antistoffer oppført i Tabell for materiale.
FORSIKTIG: Formalin er giftige og brennbare. Bruk personlig verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk og splash briller) og håndtere i kjemisk hette. Løsninger som inneholder formalin bør behandles som spesialavfall. - Bruk en overføring pipette nøye fjerne bindemiddel uten å forstyrre fisken. Legge 3 mL fosfat bufret saltholdig-triton løsning [PBS med 0,1% Triton (PBST), se materialer] og Inkuber i 15 min på RT med rock.
- Fjern PBST og erstatte med fersk PBST og ruge for 15 min. Gjenta "vaske" en ekstra tid.
Merk: Fisk kan lagres i PBS inneholder 0.02% Natriumazid på 4 ° C i flere uker.
- Utføre hele-mount immunostaining.
- Forberede 50 mL av blokkering løsning [PB-0.5% Triton X, 0,2% bovin serum albumin (BSA), 1% dimethyl sulfoxide (DMSO), 0.02% Natriumazid, 5% esel serum].
Advarsel: Natriumazid og DMSO er giftig. Personlig verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk og splash briller) bør brukes ved håndtering. Alle løsninger bør behandles som spesialavfall. - Bruk en overføring pipette overføre fisken til en 4 mL hetteglass med skrukork cap. Bruke en overføring pipette å fjerne PBST og legge 3 mL blokkerer løsning. Inkuber 1t på RT med rock.
- Bruke en overføring pipette å fjerne blokkering løsningen og legge primære antistoff fortynnet i blokkering løsning. Ruge over natten i romtemperatur med agitering.
Merk: For eksempel legge 1:250 fortynning av anti-høgskolen/HuD Neuronal Protein musen monoklonalt antistoff (se Tabell for materiale for en liste av antistoffer som har blitt brukt i A. mexicanus). Et sett med fisk med ingen primære antistoff lagt bør inkluderes i dette trinnet. Volumet av antistoff bør være nok til å dekke fisken og tillate agitasjon. - Vaskes fisken 3 ganger med PBST som beskrevet i trinn 6.3.4. Erstatt PBST med sekundær antistoff fortynnet i blokkering løsning og ruge over natten på RT med agitering.
Merk: Optimal primære og sekundære antistoff konsentrasjoner inkubasjonstiden og inkubasjon temperatur bør fastsettes for hver antistoff. Overnatting på RT var effektive for antistoffer i Tabellen for materiale. - Vaskes fisken 3 ganger med PBST, med hver vask varer 15 min som beskrevet i trinn 6.3.4.
- Overføre fisken til PBS for korte lagringstiden før du fortsetter med dissekere, montering eller snitting fisken.
- Forberede 50 mL av blokkering løsning [PB-0.5% Triton X, 0,2% bovin serum albumin (BSA), 1% dimethyl sulfoxide (DMSO), 0.02% Natriumazid, 5% esel serum].
Representative Results
Tabell 1 viser suksess i ett år av formering overflate fisk og Tinaja og Molino Pachón cavefish i statisk avl tanker. Overflate og Pachón gyter med befruktet embryo alltid produsert klekkes larvene, mens Molino og Tinaja var mislykket noen av tiden (2/6 og 2/18 gyting hendelser ikke produserer skravert larvene, henholdsvis). Det er variasjoner i clutch størrelse som ikke vises skal knyttes til alder av overordnede. Tabell 2 viser totalt antall skravert larver som følge av noen av de gyting hendelsene, og alderen av overordnede. Generelt, vi fant at overflate fisk produserer flest Larvene per gyte (gjennomsnittlig 1550 ± 894, n = 5), etterfulgt av Pachón (gjennomsnittlig 879 ± 680, n = 6), Tinaja (gjennomsnittlig 570 ± 373, n = 11), og Molino (gjennomsnittlig 386 ± 276, n = 3). Antall Larvene produsert er vanligvis mer enn trengs per forsøk eller vekst til voksne. Vi vanligvis satt opp 6-18 barnehage beholdere (120-360 Larvene) og euthanize gjenværende fisken.
For å måle suksessen til barnehage protokollen registrerte vi skravert larver og overlevende etter larver fisk fra vellykkede gyting hendelser. Tabell 3 viser data fra 1 måned avl i resirkulering tanker og inkluderer antall larver overføres til barnehage beholdere som overlevde til 14 dpf. Under denne måneden varierte overlevelse 41-81 prosent, noe som resulterer i 65-293 fisk tilgjengelig per befolkningen for eksperimenter eller vekst til voksne.
For å avgjøre hvis hele-mount immunostaining, sammenlignet vi fluorescens prøver inkubert med primære mot de inkubert med sekundær antistoff bare. Fluorescerende signalet er bare synlig i fisk inkubert med primære antistoff. Vi har brukt denne protokollen å merke neurons10 (figur 1) og bukspyttkjertelen celler6 på stadier opp 12.5 dpf i begge overflate og hule morphotypes.
Figur 1: Nevron merking. Hele-mount immunostaining av A. mexicanus. Bilde av 12.5 dpf overflate fisk (en) og Pachón cavefish (b). Bilde av regionen midt kroppen [skravert gule disposisjon vises i (a) og (b)] overflate fisk (c) og Pachón cavefish (d) beiset med pan-nevrale antistoff (Hu). (e) Confocal bilde av en region av overflate fisk tarmen viser enteric neurons (Hu) og deres anslag (acetylated tubulin). For dette bildet var tarmen dissekert ut og montert i medium som inneholder DAPI til stain kjerner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| befolkningen | forsøk | gyting hendelser | clutcher |
| overflate | 94 | 23 | 23 |
| Molino | 110 | 6 | 4 |
| Pachón | 167 | 13 | 13 |
| Tinaja | 242 | 18 | 16 |
Tabell 1: Sammendrag av data fra ett år av formering A. mexicanus i statisk tanker. Antall avl forsøk, resulterer gyting arrangementer, og antall gyting hendelser som produserte klekkes larvene.
| befolkningen | overordnede alder | skraverte larver |
| overflate | 1 år | 989 |
| overflate | 1 år | 1050 |
| overflate | 3 år | 2214 |
| overflate | 3 år | 432 |
| overflate | 3 år | 1768 |
| overflate | 4 år | 2852 |
| Pachón | 1 år | 1194 |
| Pachón | 1 år | 1933 |
| Pachón | 1,5 år | 371 |
| Pachón | 3 år | 480 |
| Pachón | 4 år | 1190 |
| Pachón | 4 år | 110 |
| Tinaja | 9 måneder | 259 |
| Tinaja | 9 måneder | 253 |
| Tinaja | 10 måneder | 1100 |
| Tinaja | 11 måneder | 857 |
| Tinaja | 1 år | 713 |
| Tinaja | 1 år | 853 |
| Tinaja | 1 år | 542 |
| Tinaja | 1,5 år | 360 |
| Tinaja | 1,5 år | 58 |
| Tinaja | 1,5 år | 1100 |
| Tinaja | 4 år | 185 |
| Molino | 2,5 år | 460 |
| Molino | 2,5 år | 619 |
| Molino | 3 år | 81 |
Tabell 2: omtrentlig kvinnelige alder og antall skravert larver fra gyting enkelthendelser fra angitte bestander av A. mexicanus.
| befolkningen | forsøk | gyting hendelser | clutcher | clutch størrelse | larver overføres til barnehage kopper | etter larver fisk på 14dpf | overlevelse (%) |
| overflate | 4 | 3 | 2 | 576 & 1728 | 360 | 174 | 48 |
| Molino | 4 | 2 | 1 | 228 | 159 | 65 | 41 |
| Tinaja | 4 | 1 | 1 | 1952 | 175 | 93 | 53 |
| Pachón | 4 | 1 | 1 | 1696 | 360 | 293 | 81 |
Tabell 3: Sammendrag av data fra en måned av avl A. mexicanus i en resirkulering system og øke larvene. Antall avl forsøk, resulterer clutcher gyting hendelser, som produserte skravert larvene, gjennomsnittlig antall Larvene per clutch, larver overføres til barnehage beholdere og post larver fisk stede i barnehage beholdere etter 14 dager.
Discussion
Sammenligne genet aktivitet mellom overflate og hule krever A. mexicanus nøye kontrollert miljø parametere og metoder som kan replikeres over laboratorier. Våre protokollen for å øke A. mexicanus gir konsekvent næringsinnhold larvestadiet post. Etter denne fôring regimet, gen funksjon kan være trygt forhold mellom bestander ved hjelp av robuste immunohistochemistry protokollen presenterer vi. Her kan vi diskutere betydningen av denne metoden så vel som dens begrensninger og framtidige applikasjoner.
For å oppnå tetthet-matchet vekst, fant vi at etter larver fisk kan heves uten resirkulering vann i to uker i 1,5 L containere på en diett av Wrotek. Denne protokollen kan også brukes til å heve fisk på en resirkulerende system. imidlertid må Wrotek legges daglig for å kompensere for de tapt gjennom tank strøm. Nyklekte Artemia nauplii er brukt som matkilde i akvakultur, men vi fant at bruker Wrotek har betydelige fordeler, inkludert: redusert pris, forbedret biosikkerhet, konsekvent ernæring og bedre vannkvalitet (se nedenfor).
Første er ukentlige kostnaden i forbruksvarer 4 dollar for Wrotek, sammenlignet med 14 dollar for Artemia. Om biosikkerhet, Wrotek er oppvokst i laboratoriet under kontrollerte forhold, mens Artemia er samlet fra naturen med naturlig variasjon i mikrobiell eller patogen innhold23. I tillegg er næringsrike sammensetningen av Artemia nauplii miljømessig bestemt og derfor inkonsekvent. Nauplii trives på sine egne energi butikker etter; de miste raskt næringsverdi som de utvikler og optimalt burde være matet til fisken i flere timer. Artemia begynne fôring på 12 house etter klekking, som representerer første gang at de kunne bli ernæringsmessig beriket; men på dette stadiet har de blitt for stor for 5 dpf fisk å konsumere. Sammenligning innmating Wrotek kontinuerlig på marine mikroalger resulterer i høyt næringsinnhold uansett når Wrotek høstes. Wrotek er mye mindre enn Artmeia nauplii (160 vs 400 mikron), noe som gjør dem lettere for fisken å fange og svelge. Etter larver overflate fisk og cavefish bruker Wrotek i lignende mengder antyder ingen forskjell i preferanse eller evne til å fange Wrotek10.
Til slutt, begynne Artemia nauplii dør i ferskvann flere timer etter introduseres. Oppspore nauplii vil forfalle, raskt redusere vannkvaliteten hvis de ikke fjernes manuelt. Fjerner døde Artemia er tidkrevende og farlig for post larver fisken det er ikke mye større enn Artemia og kan være et uhell fjernet eller skadet. Wrotek kan leve på ubestemt tid i barnehage beholdere og skaffe mat til fisken til enhver tid uten viktig innvirkningen vannkvalitet.
Mens bruke Wrotek som matkilde har betydelige fordeler og å opprettholde rotifer lager, alger legges til kultur-systemet daglig. Dette kan oppnås med en automatisk arkmater som dispenses flytende alger i beholderen rotifer kultur (se Tabell for materiale). Wrotek må også bli høstet dette oppsettet hver 24-48 timer for å opprettholde helsen til kulturen. Forskere som rase fisk ofte (hvert år, for eksempel) og er ikke opptatt av å gjøre sammenligninger mellom befolkningen på post larver stadier kan foretrekker Artemia som matkilde, siden de encysted embryoene kan være klekket samtidig.
Vi anbefaler sporing antall skravert og overlevende larvae å av klekking og vekst. Hvis de fleste embryo eller Larvene dør, kan det skyldes bakterier og sopp forurensning. Det anbefales å overvåke vannkvaliteten fisk-klare vannet og sterilisere utstyr med 70% etanol. Barnehage beholdere kan brukes på nytt når de er renset og sterilisert. For å minimere risikoen for sykdom, er det også viktig å fjerne alle død fisk fra barnehage beholdere og ikke legge Wrotek før 5 dpf Når fisken begynner å spise.
A. mexicanus er kjønnsmoden ved ca ett år gammel. Dette er en begrensning for generering av transgene A. mexicanus forhold til Danio rerio (sebrafisk) som kan rase på 10-12 uker24. Immunohistochemistry (IHC) er en alternativ metode å undersøke genuttrykk og protein lokalisering. Protokollen beskrevet her kan tilpasses på hvert trinn og brukes til å oppdage antigener i noen vev rundt. Det er viktig å merke seg at noen vev kan være vanskelig å visualisere i overflate fisk på grunn av pigmentering (en barriere som ikke finnes i unpigmented cavefish), som kan påvirke tolkningen av komparative studier. For å løse dette potensielle problemet, kan overflate fisk pigment være bleket etter fiksering bruker 3% hydrogenperoksid.
IHC krever vellykket vev fiksering, blokkering og antistoff penetrasjon. Metoder for hver varierer avhengig av vev og protein av interesse. Bindemiddel og fiksering tiden må beholde celle arkitektur samtidig antigen epitope. For denne protokollen, vi bruker en cross-linking bindemiddel (paraformaldehyde) og utelater et denaturing bindemiddel (som metanol eller aceton). Vi fant at inkubasjon i aceton redusert antistoff signalet for markører neuronal og bukspyttkjertelen. Det blokkerende trinnet er avgjørende for å hindre antistoffer fra binding ikke mål proteiner i vevet. Denne metoden bruker en kombinasjon av normal serum (5%) og BSA (0,2%) i blokkering løsningen. Blokkerer løsningen inneholder antistoffer og proteiner som binder reaktive områder på proteiner vev, reduseres uspesifisert binding av primære og sekundære antistoffer.
Oppnå antistoff gjennomtrengning, må vevet være permeabilized. Dette kan oppnås med vaskemidler eller denaturing løsemidler, men må være optimalisert for å bevare antigen epitope. Våre protokollen bruker en kombinasjon av Triton og dimethyl sulfoxide (DMSO). Triton og DMSO er inkludert i de blokkerer og antistoff inkubasjon trinnene i konsentrasjoner på 0,5% og 1%, henholdsvis. Bruker denne konsentrasjonen, har vi observert flekker i hjernen, bukspyttkjertelen, tarmen og muskler, antyder at det er sannsynlig effektiv for penetrasjon av alle vev. Fisk størrelse kan også påvirke penetrasjon. Denne protokollen er ikke testet på fisken som er større enn 14 dager gamle (ca 7 mm i lengde). Feilsøk flekker anbefales det å endre fiksering, blokkering og antistoff penetrasjon trinnene. Det er også viktig å undersøke sekvens bevaring av immunogen med A. mexicanus protein rundt bruker tilgjengelige genomet25.
A. mexicanus er en utmerket modell å undersøke utvikling som bestander av samme art som har utviklet seg i forskjellig miljøer kan sammenlignes direkte i laboratoriet. Standard dyrehold protokoller, både innenfor og mellom laboratorier, er nødvendig for å forstå de biologiske forskjellene overflate fisk og cavefish. Vår artikkel inneholder en metode for å undersøke utvikling og gene aktivitet i post larver fisken eksponert konsekvent vekst parametre.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health [HD089934, DK108495].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
References
- Carlson, B. M., Klingler, I. B., Meyer, B. J., Gross, J. B. Genetic analysis reveals candidate genes for activity QTL in the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. PeerJ. 6, e5189 (2018).
- Chin, J. S. R., Gassant, C. E., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 319-327 (2018).
- Lloyd, E., Olive, C., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 328-337 (2018).
- Tabin, J. A., Aspiras, A., et al. Temperature preference of cave and surface populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 338-344 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Riddle, M. R., Aspiras, A. C., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Tang, J. L. Y., Guo, Y., et al. The developmental origin of heart size and shape differences in Astyanax mexicanus populations. Developmental Biology. 441 (2), 272-284 (2018).
- Riddle, M. R., Boesmans, W., Caballero, O., Kazwiny, Y., Tabin, C. J. Morphogenesis and motility of the Astyanax mexicanus gastrointestinal tract. Developmental Biology. 441 (2), 285-296 (2018).
- Gore, A. V., Tomins, K. A., et al. An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration. Nature Ecology & Evolution. 2 (7), 1155-1160 (2018).
- McGaugh, S. E., Gross, J. B., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, (2014).
- Gross, J. B., Furterer, A., Carlson, B. M., Stahl, B. A. An Integrated Transcriptome-Wide Analysis of Cave and Surface Dwelling Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), e55659 (2013).
- Hinaux, H., Pottin, K., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pachón Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through natural spawning. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Borowsky, B. R. Handling Astyanax mexicanus Eggs and Fry. CSH Protocols. , (2008).
- Stahl, B. A., Gross, J. B. A Comparative Transcriptomic Analysis of Development in Two Astyanax Cavefish Populations. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (6), 515-532 (2017).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax Transgenesis and Husbandry. How Cavefish Enters the Laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PloS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- JoVE. Current methods in Astyanax mexicanus research. , Available from: https://www.jove.com/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch (2018).
- Heanue, T. A., et al. A Novel Zebrafish ret Heterozygous Model of Hirschsprung Disease Identifies a Functional Role for mapk10 as a Modifier of Enteric Nervous System Phenotype Severity. PLoS Genetics. 12 (11), (2016).
- Reed Mariculture Culturing Rotifers in Small Systems (Home or Lab). , Available from: http://reedmariculture.com/support_rotifers_culturing.php (2018).
- Riddle, M. R., Baxter, B. K., Avery, B. J. Molecular identification of microorganisms associated with the brine shrimp Artemia franciscana. Aquatic Biosystems. 9 (1), (2013).
- Tsang, B., et al. Breeding Zebrafish: A Review of Different Methods and a Discussion on Standardization. Zebrafish. 14 (6), 561-573 (2017).
- Cave fish assembly and gene annotation. , Available from: http://useast.ensembl.org/Astyanax_mexicanus/Info/Annotation (2018).
