Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

رفع "تترا المكسيكي" مكسيكي أستياناكس لتحليل تعمل بوستلارفال والجامعة-جبل إيمونوهيستوتشيميستري

doi: 10.3791/58972 Published: December 28, 2018

Summary

في هذا البروتوكول، لشرح كيفية تولد مكسيكي أستياناكس الكبار، ورفع اليرقات، وأداء الجامعة-جبل immunohistochemistry على الأسماك اليرقات بعد مقارنة تعمل سطح، وكهف مورفوتيبيس.

Abstract

النهر والسكان تكييف كهف مكسيكي أستياناكس إظهار الاختلافات في مورفولوجيا وفسيولوجيا وسلوك. وقد كشفت الأبحاث التي ركزت على المقارنة بين أشكال الكبار الأساس الوراثي لبعض هذه الاختلافات. يعرف عن كيفية اختلاف السكان في مراحل ما بعد اليرقات (في بداية التغذية). مثل هذه الدراسات قد توفر نظرة ثاقبة كيف cavefish البقاء على قيد الحياة من خلال مرحلة البلوغ في بيئتهم الطبيعية. طرق مقارنة التنمية ما بعد اليرقات في المختبر تتطلب الموحد تربية الأحياء المائية ونظم التغذية. هنا ونحن تصف كيفية رفع الأسماك على اتباع نظام غذائي الروتيفر الغنية بالمغذيات في المياه غير تعميم لتصل إلى أسبوعين بعد الإخصاب. ونحن لشرح كيفية جمع الأسماك اليرقات بعد من هذا النظام الحضانة وأداء الجامعة-جبل إيمونوستينينج. إيمونوستينينج بديل جذاب لتحليل التعبير التحوير لتحقق التنمية ووظيفة الجينات في ألف مكسيكي. يمكن أيضا استخدام الأسلوب الحضانة كبروتوكول قياسي لإقامة السكان كثافة مطابقة للنمو في البالغين.

Introduction

تترا المكسيكية، أستياناكس مكسيكي، هو نوع واحد من الأسماك موجود كالسكان تعيش في نهر (الأسماك السطحية) وعدد من السكان تعيش في كهف (cavefish) المسمى للكهوف التي تسكنها (أي تنجا، مولينو، Pachón). تستخدم عددا متزايداً من الباحثين مكسيكي (أ) التحقيق في الأسس الوراثية والتنمية السلوكية1،2،،من34، الأيضية5،6 ،،من78، وتطور مورفولوجية9،،من1011. الموارد المتاحة لإجراء دراسات مكسيكي (أ) تشمل جينوم متسلسلة والمشروح12؛ الترنسكربيتوم13؛ الإنمائية التدريج الجدول14؛ والأساليب لتربية15،،من1617، خلق الوراثي18، وتحرير الجينات19. نشر أدوات إضافية وتحديث البروتوكولات القياسية سيسرع نمو مجتمع البحوث كافيفيش (انظر هذا أساليب جمع20).

أن هدفنا إضافة مرجع القائمة أدوات بتوفير وسيلة قوية لتقييم الجينات النشاط في الموقع في فترة ما بعد اليرقات مكسيكي (أ)، بطريقة قابلة لمقارنة بين المختبرات. هناك اثنين من التحديات لتحقيق هذا الهدف. أولاً، هناك حاجة لنظم موحدة لتفريخ وتربية الأسماك بين المختبرات، تؤثر الاختلافات في معلمات مثل التغذية وكثافة النمو والنضج، وبالتالي تؤثر على نشاط الجينات. وثانيا، هناك حاجة لطريقة موحدة غير قابلة للتكيف لدراسة أنماط النشاط الجيني في الأسماك اليرقات بعد. علينا أن نعالج هذه المسائل هنا، إرساء ممارسات قياسية لتربية الأسماك في مراحل ما بعد اليرقات وإدخال بروتوكول قوية الجامعة-جبل إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) لتقييم التعبير الجيني في ألف مكسيكي.

ونحن أولاً لشرح كيفية تربية الأسماك عن طريق التفريخ الطبيعي والتعرف على البيض المخصب. وصف القادم كيفية يفقس البيض المخصب (اليرقات) ونقلها إلى حاويات الحضانة، حيث أنها تمسك في كثافة الأسماك 20 للحاوية الواحدة لمدة أسبوعين دون تعميم أو تغيير الماء. 5-يوما بعد الإخصاب، الأسماك تطورت إلى مراحل ما بعد اليرقات (لم يعد وجود إمدادات صفار) وتقدم تغذية الطحالب Brachionus بليكاتيليس (الروتيفر) كمصدر لغذاء الغنية بالمغذيات التي لا تتطلب التجديد اليومي. يوفر هذا الأسلوب معلمات النمو المطرد للتنمية اليرقات وما بعد اليرقات.

لتقييم وظيفة الجينات، نحن لشرح كيفية إزالة الأسماك من الحاويات الحضانة وأداء الجامعة-جبل المدينة. الأسلوب المدينة قدم هو مقتبس من البروتوكولات التي وضعت للاستخدام مع دانيو rerio21 وفعالة لفحص مولدات المضادات في جميع الأنسجة مكسيكي (أ) اختبار، بما في ذلك في الدماغ والأمعاء والبنكرياس. المدينة بديل أسرع لتوليد الحيوانات المحورة وراثيا لدراسة التعبير الجيني والتعريب البروتين. هذا البروتوكول سيكون مفيداً للدراسات الرامية إلى زراعة ألف مكسيكي ومقارنة تعمل من الأسماك السطحية وكافيفيش في مراحل ما بعد اليرقات.

Protocol

عليها الإجراءات الوارد ذكرها في هذا البروتوكول "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في مدرسة هارفارد الطبية.

1-تربية

ملاحظة: هناك العديد من الطرق المنشورة لتربية15،16،،من1720 التي يمكن أن تستخدم أيضا في هذه الخطوة. قبل تربية، تتم المحافظة على الأسماك الكبار في 10:14 دورة في 23 درجة مئوية وتغذت بيليه الضوء: الظلام (انظر الجدول للمواد) مرة واحدة يوميا. يمكن إكثار الأسماك في نظام مغلق مع الترشيح الميكانيكية وتعقيم الأشعة فوق البنفسجية. يمكن أيضا تحقيق تربية في خزانات ثابتة (غير تعميم)، ولكن الأسماك لا ينبغي أن يترك في خزان ثابت لأكثر من 3 أيام، كما أن نوعية المياه ويتحلل بسرعة.

  1. ملء خزان غال 5 مع المياه جاهزة للأسماك (الكلور المياه تعديلها إلى: درجة الحموضة = 7.1 +/-2، الموصلية = 900 +/--150 المايكروثانيه، درجة الحرارة = 23 درجة مئوية).
  2. ضع البلاستيك مش (انظر المواد) في الجزء السفلي من الخزان. إذا كانت تربية في خزانات ثابتة، إلصاق سخان مياه إلى جانب الدبابة. إذا تربية في نظام مغلق، وضع سخان مياه في مستنقع النظام.
    ملاحظة: يمنع مش البلاستيك البالغين من استهلاك البيض.
  3. مكان واحد الإناث والذكور اثنين ألف مكسيكي الأسماك أكبر من 1 سنة إلى الخزان. السماح للأسماك إلى تأقلم مدة 30 دقيقة.
  4. تعيين درجة حرارة السخان إلى 24 درجة مئوية (أو 1 درجة مئوية أكثر دفئا من درجة حرارة البدء).
  5. بعد 24 ساعة، زيادة درجة الحرارة 1 درجة مئوية.
  6. بعد 24 ساعة، زيادة درجة الحرارة 1 درجة مئوية. التحقق من أن الدبابات يوميا للبيض بالساطع مضيا في الجزء السفلي من الخزان. حجب الأسماك من الأغذية خلال هذه الفترة 3 أيام.
  7. إذا لم تم فعل التفريخ بعد 3 أيام، إيقاف تشغيل السخان والسماح للمياه للعودة إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل نقل الأسماك إلى دبابتهم الأصلي.

2-تفقيس بيض المخصب

  1. حالما يتم تحديد البيض في خزان لتربية، إزالة الكبار ومش البلاستيك، وتقليل الماء على عمق 10 سم باستخدام كوب أو كأس.
    ملاحظة: لتقدير الوقت للتفريخ، استخدام ماصة نقل لوضع البيض عدة في طبق بتري وعرضها مع ستيريوميكروسكوبي تحديد المرحلة14 وتقدير وقت الإخصاب.
  2. نقل الدبابات إلى سطح عمل مريحة وإزالة أي البيض مبهمة أو البراز، تاركاً فقط البيض الشفاف والخصبة في الخزان.
    ملاحظة: يمكن تسجيل عدد البيض الخصبة في هذا الوقت.
  3. ملء الخزان مع جاهزة للأسماك المياه (راجع الخطوة 1، 1) وإضافة 6-7 قطرات من الميثيلين الأزرق إلى الخزان المياه تملأ.
    ملاحظة: يكون التركيز النهائي من الميثيلين الأزرق حوالي 1.5 جزء في المليون.
  4. إضافة سخان وحوض السمك ببلير (متصلة مضخة الهواء، مع منظم) إلى الخزان.
  5. تعيين السخان إلى 24 درجة مئوية، وضبط منظم نبراس لإنتاج تيار لطيف من الفقاعات.
  6. ضع غطاء على خزان للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة الماء.
    ملاحظة: ينبغي أن يبدأ البيض الفقس خلال 24 ساعة وقت التفريخ.

3. نقل اليرقات مظلل إلى حاويات الحضانة

  1. أضف 20 غ من الملح (انظر المواد) 8 لتر من الأسماك جاهزة للمياه (راجع الخطوة 1، 1) ويحرك حتى يذوب. ملء كل حاوية الحضانة 1.5 لتر (انظر المواد) مع 1 لتر الماء المعدة.
  2. استخدام ماصة نقل لنقل اليرقات فقست داخل الحاويات المعدة الحضانة في كثافة الأسماك 20 للحاوية الواحدة.
    ملاحظة: كشافات يمكن أن تكون مفيدة لتحديد موقع ونقل اليرقات مظلل.
  3. بعد أن أزيلت جميع اليرقات مظلل مرئية، تحرض المياه في الخزان بالتحريك، و/أو تهب الماء المتدفق إلى حواف وزوايا الخزان مع الماصة.
    ملاحظة: هذا سوف يساعد الكشف عن اليرقات التي ضاعت على التمرير أولاً.
  4. التخلص من اليرقات غير المستخدمة في هذه المرحلة باستخدام المبادئ التوجيهية لمكتب رعاية مختبر (أولاو). إضافة هيبوكلوريت الصوديوم إلى خزان لتحقيق تركيز نهائي 6.15%. انتظر على الأقل 5 دقائق قبل يصب أسفل الحوض.
  5. قم بتسمية كل حاوية الحضانة مع تاريخ ووقت الإخصاب. عرض الحاويات الحضانة اليومية والاستمرار في إزالة أي يرقات ميتة.

4-إعداد الطعام الأسماك المستندة إلى دولابية

  1. انظر الجدول للمواد للحصول على معلومات حول كيفية الحصول على الروتيفر. يتبع البروتوكول المشار إليه إعداد وصيانة، وحصاد الروتيفر22.
  2. إعداد الأسماك الغذاء بإضافة 3 مل مزيج الطحالب (انظر الجدول للمواد) إلى 1 لتر الروتيفر المقطوع. هذا الخليط سوف تضاف مباشرة إلى حاويات الحضانة إمدادات غذاء.

5-تغذية الأسماك اليرقات بعد

  1. عند الأسماك 5 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية)، إضافة 3 مل من الأسماك الغذاء (أعد في الخطوة 4، 2) لكل حاوية الحضانة. في الكثافة المثلى، ينبغي أن يكون الروتيفر مرئية في مجموعات كثيفة في الزوايا الحاويات الحضانة، وأقل وضوحاً في وسط الحاوية. إضافة خليط دولابية إضافية حتى تم التوصل إلى كثافة مناسبة.
  2. فحص الحاويات يوميا لوجود الروتيفر وإضافة المزيد إذا كان التركيز يحصل على النضوب. الاستمرار في إزالة أي يرقات ميتة.
  3. عندما تصل الأسماك إلى 14 إدارة الشرطة الاتحادية، نقلها إلى خزان لتتناسب مع نظام مغلق في كثافة الأسماك 5/لتر من المياه.
    ملاحظة: يمكن تسجيل العدد من الباقين على قيد الحياة بعد اليرقات السمكية في هذا الوقت.

6-كل-جبل Immunohistochemistry الأسماك اليرقات بعد

  1. إزالة الأسماك اليرقات بعد انتهاء المرحلة المطلوبة من الغذاء مقابل 24 ساعة بصب الحضانة الحاوية التي تحتوي على الأسماك من خلال نايلون مش مصفاة ووضع في المصفاة في وعاء مع مياه نظيفة جاهزة للأسماك (راجع الخطوة 1، 1).
    ملاحظة: من الضروري إزالة جميع المواد الغذائية. حتى كميات صغيرة من المواد الغذائية في القناة الهضمية السيارات-الفلورسنت وستؤثر على التصوير.
  2. جمع و euthanize الأسماك.
    ملاحظة: ينبغي أن يتبع المبادئ التوجيهية أولو البروتوكول القتل الرحيم والموافقة برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة. وقد لاحظنا أن تريكيني وحدها لا euthanize ما بعد اليرقات السمكية والأسماك تبدأ في التحرك عند نقلها من تريكيني إلى مثبت إذا كانت الأسماك لا تبقى أيضا على الجليد.
    1. إعداد حل تريكيني في كوب بإضافة ز 0.4 من تريكيني-S و g 0.8 من بيكربونات الصوديوم إلى 1 لتر مياه، ووضعه على الجليد.
    2. صب الماء التي تحتوي على الأسماك من خلال مصفاة مش نايلون لجمع الأسماك. بلطف تغرق في المصفاة في المثلج تريكيني الحل وترك الأمر على الجليد لمدة 10 دقائق.
  3. إصلاح الأسماك euthanized.
    1. استخدام ماصة نقل مع تلميح قص لنقل الأسماك إلى أنبوب مخروطي.
    2. إزالة الحل تريكيني مع ماصة نقل واستبدال مع مثبت. احتضان مع هزاز.
      ملاحظة: يجب تحديد الوقت مثبت والتثبيت استناداً إلى جسم المستخدم. 10% محلول الفورمالين (4% فورمالدهايد، انظر مواد) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية كافية للأجسام المضادة المدرجة في الجدول للمواد.
      تنبيه: الفورمالين السامة والقابلة للاشتعال. ارتداء معدات الوقاية الشخصية (قفازات ومعطف مختبر، ونظارات دفقة) والتعامل معها في غطاء كيميائية. وينبغي التخلص منها المحاليل المحتوية على الفورمالين كنفايات خطرة.
    3. استخدام ماصة نقل بعناية إزالة مثبت دون إزعاج الأسماك. أضف 3 مل فوسفات مخزنة المالحة-تريتون الحل [برنامج تلفزيوني مع 0.1% تريتون (ببست)، انظر المواد] واحتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت مع هزاز.
    4. إزالة ببست واستبدال مع ببست الطازجة واحتضانها لتكرار 15 دقيقة هذا "غسل" مرة أخرى.
      ملاحظة: يمكن تخزين الأسماك في برنامج تلفزيوني يتضمن أزيد الصوديوم 0.02 في المائة عند 4 درجة مئوية لعدة أسابيع.
  4. أداء الجامعة-جبل إيمونوستينينج.
    1. إعداد 50 مل من عرقلة الحل [تريتون PB-0.5% X، 0.2% ألبومين المصل البقري (BSA)، أزيد الصوديوم 0.02% مصل حمار 5%، 1% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])].
      تنبيه: وأزيد الصوديوم و [دمس] مواد سامة. وينبغي استخدام معدات الوقاية الشخصية (قفازات ومعطف مختبر، ونظارات البداية) عند التعامل. أي حلول ينبغي التخلص منها كنفايات خطرة.
    2. استخدام ماصة نقل لنقل الأسماك إلى قنينة زجاجية 4 مل مع غطاء رأس المسمار. استخدام ماصة نقل إلى إزالة ببست وإضافة 3 مل عرقلة الحل. احتضانها ح 1 في الرايت مع هزاز.
    3. استخدام ماصة نقل الحل حظر واضافه جسم الابتدائي المخفف في عرقلة الحل. تبني بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات.
      ملاحظة: على سبيل المثال، إضافة 1: 250 إضعاف مكافحة--هوك/هود الماوس بروتين الخلايا العصبية [مونوكلونل] جسم (انظر الجدول للمواد للحصول على قائمة من الأجسام المضادة التي استخدمت بنجاح في مكسيكي (أ)). مجموعة من الأسماك مع لا جسم الأولية وأضاف ينبغي أن تدرج في هذه الخطوة. يجب أن يكون حجم لجسم ما يكفي لتغطية السمك والسماح للتحريض.
    4. أغسل السمك 3 مرات مع ببست كما هو موضح في الخطوة 6.3.4. استبدال ببست بجسم الثانوي المخفف في عرقلة الحل واحتضان بين عشية وضحاها في الرايت مع الانفعالات.
      ملاحظة: أن التركيزات المثلى جسم الابتدائي والثانوي ووقت الحضانة ودرجة حرارة الحضانة ينبغي أن تحدد لكل جسم. وكان بين عشية وضحاها في الرايت فعالة بالنسبة للأجسام المضادة المدرجة في الجدول للمواد.
    5. أغسل السمك 3 مرات مع ببست، مع كل غسل تدوم 15 دقيقة كما هو موضح في الخطوة 6.3.4.
    6. نقل الأسماك إلى برنامج تلفزيوني للتخزين القصير الأجل قبل الشروع في تشريح، تركيب، أو تقطيع الأسماك.

Representative Results

ويبين الجدول 1 النجاح خلال سنة واحدة لتربية الأسماك السطحية و cavefish تنجا، مولينو، و Pachón في خزانات تربية ثابتة. السطح ويولد Pachón مع أجنة مخصبة أنتجت دائماً دبرت اليرقات، بينما مولينو وتنجا باءت بالفشل بعض الوقت (2/6 و 2/18 تفريخ الأحداث لا تنتج اليرقات مظلل، على التوالي). وهناك تباين في حجم مخلب التي تظهر لا يجب أن ينسب إلى عمر الأسماك الأصل. ويبين الجدول 2 مجموع مظلل اليرقات الناتجة عن بعض الأحداث التفريخ، وعمر الأسماك الأصل. بشكل عام، وجدنا أن إنتاج الأسماك السطحية أكبر عدد من اليرقات كل تفرخ (المتوسط ± 1,550 894، ن = 5)، تليها Pachón (المتوسط ± 879 680، ن = 6)، تنجا (المتوسط ± 570 373، ن = 11)، ومولينو (المتوسط ± 386 276، n = 3). عدد اليرقات المنتجة عادة أكثر مما بحاجة لكل تجربة أو للنمو في البالغين. ونحن عادة إعداد 6-18 حضانة الحاويات (يرقات 120-360) و euthanize الأسماك المتبقية.

لقياس مدى نجاح البروتوكول الحضانة سجلنا عدد اليرقات مظلل والأسماك اليرقات بعد الباقين على قيد الحياة من أحداث التفريخ الناجح. الجدول 3 يوضح البيانات من شهر 1 للتربية في تعميم الدبابات ويشمل عدد اليرقات نقلها إلى حاويات الحضانة التي نجت إلى 14 إدارة الشرطة الاتحادية. خلال هذا الشهر، تراوح معدل البقاء على قيد الحياة 41-81 في المئة، أدى إلى 65-293 الأسماك المتاحة لكل السكان للتجارب أو النمو في البالغين.

لتحديد ما إذا كانت الجامعة-جبل إيمونوستينينج بنجاح، قارنا الأسفار عينات المحتضنة مع جسم الأولية لتلك المحتضنة مع الجسم المضاد الثانوي فقط. إشارة الفلورسنت مرئياً فقط في الأسماك المحتضنة مع جسم الأولية. وقد استخدمنا هذا البروتوكول بنجاح قم بتسمية الخلايا العصبية10 (الشكل 1) وخلايا البنكرياس6 مراحل تصل إلى 12.5 إدارة الشرطة الاتحادية في كل سطح، وكهف مورفوتيبيس.

Figure 1
رقم 1: العلامات العصبية. الجامعة-جبل إيمونوستاينينج من مكسيكي أ. صورة 12.5 إدارة الشرطة الاتحادية سطح الأسماك () و Pachón كافيفيش (ب). صورة لمنطقة منتصف الجسم [مخطط أصفر مظلل يظهر في (أ) و (ب)] من الأسماك السطحية (ج) و Pachón كافيفيش (د) ملطخة بجسم الخلايا العصبية القومية (هو جين تاو). () كونفوكال الصورة من منطقة الخلايا العصبية المعوية تظهر الأمعاء الأسماك السطحية (هو جين تاو) وإسقاطاتها (أسيتيلاتيد توبولين). لهذه الصورة، تم تشريح خارج الأمعاء وشنت في المتوسط تحتوي على DAPI وصمة عار الأنوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

السكان محاولات التفريخ الأحداث براثن
سطح 94 23 23
مولينو 110 6 4
Pachón 167 13 13
تنجا 242 18 16

الجدول 1: موجز للبيانات من سنة واحدة لتربية ألف-مكسيكي في خزانات ثابتة. عدد من تكاثر محاولات، نتيجة التفريخ الأحداث، وعدد الأحداث التي أنتجت التفريخ فقست اليرقات.

السكان سن الأم يرقات مظلل
سطح السنة 1 989
سطح السنة 1 1050
سطح 3 سنوات 2214
سطح 3 سنوات 432
سطح 3 سنوات 1768
سطح 4 سنوات 2852
Pachón السنة 1 1194
Pachón السنة 1 عام 1933
Pachón 1.5 سنة 371
Pachón 3 سنوات 480
Pachón 4 سنوات 1190
Pachón 4 سنوات 110
تنجا 9 أشهر 259
تيناجا 9 أشهر 253
تنجا 10 أشهر 1100
تنجا 11 شهرا 857
تنجا السنة 1 713
تنجا السنة 1 853
تنجا السنة 1 542
تنجا 1.5 سنة 360
تنجا 1.5 سنة 58
تنجا 1.5 سنة 1100
تنجا 4 سنوات 185
مولينو 2.5 سنة 460
مولينو 2.5 سنة 619
مولينو 3 سنوات 81

الجدول 2: تقريب سن الإناث وعدد اليرقات فقست من أحداث التناسل فردية من السكان المشار إليها في مكسيكي أ.

السكان محاولات التفريخ الأحداث براثن حجم مخلب نقل اليرقات إلى الكؤوس الحضانة الأسماك اليرقات بعد في 14dpf البقاء على قيد الحياة (%)
سطح 4 3 2 576 و 1728 360 174 48
مولينو 4 2 1 228 159 65 41
تنجا 4 1 1 1952 175 93 53
Pachón 4 1 1 1696 360 293 81

الجدول 3: موجز للبيانات من شهر واحد من تربية ألف مكسيكي في تعميم نظام وتربية اليرقات. عدد محاولات، نتيجة تربية تفريخ الأحداث، براثن التي أنتجت مظلل اليرقات، متوسط عدد اليرقات في مخلب، اليرقات نقلها إلى حاويات الحضانة، وما بعد اليرقات السمكية موجودة في حاويات الحضانة بعد 14 يوما.

Discussion

مقارنة نشاط الجينات بين المياه السطحية وكهف مكسيكي (أ) يتطلب البارامترات البيئية التي تسيطر عليها بعناية، والأساليب التي يمكن أن يتم نسخ عبر المختبرات. لدينا بروتوكول لرفع مكسيكي (أ) يوفر المحتوى التغذوي متسقة خلال التنمية ما بعد اليرقات. وعقب هذا نظام التغذية، يمكن مقارنة وظيفة الجينات ثقة بين السكان استخدام بروتوكول immunohistochemistry قوية نقدم. هنا نناقش أهمية هذا الأسلوب، فضلا عن القيود والتطبيقات المستقبلية.

لتحقيق نمو الكثافة المطابقة، وجدنا أن الأسماك اليرقات بعد يمكن أن ترفع دون تعميم الماء لمدة أسبوعين في الحاويات 1.5 لتر على اتباع نظام غذائي والروتيفرا. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لجمع الأسماك في نظام مغلق؛ ومع ذلك، يجب إضافة الروتيفر يوميا للتعويض عن تلك التي فقدت من خلال التدفق دبابة. فقست حديثا الارتيميا النوبليوس تستخدم عادة كمصدر لغذاء في تربية الأحياء المائية، ولكن وجدنا أن استخدام الروتيفر له مزايا كبيرة، بما في ذلك: تخفيض الأسعار وتحسين الأمن البيولوجي والتغذية تتفق وأفضل نوعية المياه (انظر أدناه).

أولاً، تكلفة أسبوعية في المواد الاستهلاكية 4 دولار الروتيفر، مقابل 14 دولاراً الارتيميا. فيما يتعلق بالسلامة البيولوجية، يتم رفع الروتيفر في المختبر تحت ظروف خاضعة للرقابة، بينما يتم جمع الارتيميا من البرية وتخضع للتغيير الطبيعي في العوامل الجرثومية أو الممرض محتويات23. بالإضافة إلى ذلك، يتم تكوين المغذيات الارتيميا النوبليوس مصممة بيئياً وغير متناسقة لذلك. النوبليوس تزدهر في مخازن الطاقة الخاصة بهم بعد الفقس؛ أنها تفقد بسرعة القيمة الغذائية وتطور ينبغي أن يتغذى على النحو الأمثل للأسماك ضمن عدة ساعات. تبدأ الارتيميا التغذية في البيت 12 بعد الفقس، ويمثل المرة الأولى التي يمكن أن يكون إثراء الناحية التغذوية؛ ومع ذلك، في هذه المرحلة فقد أصبحت كبيرة جداً بالنسبة 5 إدارة الشرطة الاتحادية الأسماك تستهلك. وبالمقارنة، والروتيفرا باستمرار تتغذى على الطحالب البحرية أدى إلى ارتفاع محتوى المغذيات بغض النظر عن عندما يتم حصادها والروتيفرا. الروتيفر أصغر بكثير من أرتمييا النوبليوس (160 مقابل 400 ميكرون)، يجعلها أسهل للأسماك التقاط وابتلاع. الأسماك السطحية ما بعد اليرقات و cavefish تستهلك الروتيفر في كميات مماثلة مما يوحي بأي فرق في تفضيل أو القدرة على التقاط الروتيفر10.

وأخيراً، تبدأ الارتيميا النوبليوس الموت عدة ساعات بعد أن أدخلت في المياه العذبة. وسوف تسوس النوبليوس المأكولة، يتناقص بسرعة نوعية المياه إذا لم تتم إزالتها يدوياً. إزالة الميت الارتيميا مضيعة للوقت وخطيرة بالنسبة للأسماك بعد اليرقات التي ليست أكبر بكثير من الارتيميا وقد تكون الصدفة إزالتها أو أصيب بجروح. الروتيفر يمكن العيش إلى أجل غير مسمى في حاويات الحضانة، وتوفير الغذاء للأسماك في جميع الأوقات دون التأثير إلى حد كبير على نوعية المياه.

وفي حين استخدام الروتيفر كمصدر لغذاء فوائد جمة، للحفاظ على الطحالب دولابية الأسهم، يجب إضافة إلى نظام الثقافة يوميا. وهذا يمكن أن يتحقق مع علبة تغذية تلقائية بأن يوزع الطحالب السائلة في وعاء الثقافة دولابية (انظر الجدول للمواد). الروتيفر ويجب أيضا أن تحصد من هذا التشكيل كل 24-48 ساعة للحفاظ على صحة الثقافة. قد تفضل الباحثين أن تربية الأسماك إلا نادراً جداً (مرة واحدة في سنة، على سبيل المثال)، وهي لا تهتم بإجراء مقارنات بين السكان في مراحل ما بعد اليرقات الارتيميا كمصدر لغذاء، إذ يمكن أن تكون دبرت الأجنة انسيستيد في أي وقت.

نحن نوصي بتعقب عدد اليرقات مظلل والباقين على قيد الحياة لرصد نجاح التفقيس والنمو. إذا كانت معظم الأجنة أو اليرقات يموت، قد يكون سبب التلوث البكتيرية أو الفطرية. من المستحسن لرصد نوعية المياه من المياه جاهزة للأسماك وتعقيم المعدات أي مع الإيثانول 70%. يمكن إعادة استخدام الحاويات الحضانة بعد تنظيفها وتعقيمها. للتقليل من خطر الإصابة بالمرض، كما أنها حاسمة لإزالة السمك الميت أي من حاويات الحضانة وعدم إضافة الروتيفر قبل 5 إدارة الشرطة الاتحادية، عندما تبدأ الأسماك لتناول الطعام.

ألف-مكسيكي ناضجة جنسياً في سنة واحدة تقريبا. هذا هو حد لتوليد المعدلة وراثيا مكسيكي (أ) مقارنة مع دانيو rerio (الزرد) التي تستطيع أن تولد في الأسابيع 10-1224. إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) أسلوب بديل للتحقيق في التعبير الجيني والتعريب البروتين. يمكن تكييفها في كل خطوة والمستخدمة للكشف عن المستضدات في أي أنسجة لمصلحة البروتوكول هو موضح هنا. من المهم أن نلاحظ، مع ذلك، أن بعض الأنسجة قد يكون أكثر صعوبة لتصور في الأسماك السطحية بسبب التصبغ (حاجز غير موجود في كافيفيش أونبيجمينتيد)، التي قد تؤثر على تفسير الدراسات المقارنة. ولمعالجة هذه المشكلة المحتملة، يمكن المبيضة الصباغ الأسماك السطحية بعد التثبيت باستخدام بيروكسيد الهيدروجين 3%.

المدينة يتطلب التثبيت الناجح الأنسجة، ومنع، واختراق الأجسام المضادة. طرق لكل تختلف باختلاف الأنسجة والبروتين من الفائدة. يجب أن نحافظ على الوقت مثبت والتثبيت العمارة خلية مع الحفاظ على حانمه مستضد. لهذا البروتوكول، استخدم مثبت كروسلينكينج (بارافورمالدهيد)، وحذف مثبت يشوه (مثل الميثانول أو الأسيتون). ووجدنا أن الحضانة في الأسيتون تضاءل إشارة الأجسام المضادة لعلامات العصبية والبنكرياس. خطوة حظر أمر ضروري لمنع الأجسام المضادة من الملزمة للبروتينات غير المستهدفة في الأنسجة. هذا الأسلوب يستخدم مزيجاً من المصل العادي (5 في المائة) وجيش صرب البوسنة (0.2 ٪) في عرقلة الحل. عرقلة الحل يحتوي على الأجسام المضادة، والبروتينات التي تربط مواقع رد الفعل على البروتينات في الأنسجة، تناقص غير محددة ملزمة للأجسام المضادة الأولية والثانوية.

لتحقيق اختراق الأجسام المضادة، ويجب أن تكون بيرميبيليزيد الأنسجة. وهذا يمكن أن يتحقق مع المنظفات أو المذيبات يشوه ولكن يجب أن يكون الأمثل للحفاظ على حانمه مستضد. لدينا بروتوكول يستخدم مزيجاً من تريتون وثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]). تريتون و [دمس] مدرجة خلال الخطوات الحضانة تسد وجسم في تركيزات 0.5% و 1%، على التوالي. باستخدام هذا التركيز، لاحظنا تلطيخ في المخ والبنكرياس، والأمعاء، والعضلات، مما يوحي بأنه من المحتمل فعالة للاختراق من جميع الأنسجة. حجم الأسماك قد تؤثر أيضا على الاختراق. لم يتم اختباره هذا البروتوكول على الأسماك التي يزيد عمرها على 14 يوما (حوالي 7 مم في الطول). لاستكشاف تلوين, من المستحسن تغيير الخطوات اختراق التثبيت، ومنع، والأجسام المضادة. من المهم أيضا لدراسة حفظ التسلسل إيمونوجين مع البروتين مكسيكي (أ) أهمية استخدام الجينوم المتاحة25.

ألف مكسيكي هو نموذج ممتاز للتحقيق في تطور بالمقارنة مع السكان من نفس الأنواع التي نشأت في بيئات مختلفة إلى حد كبير يمكن أن تكون مباشرة في المختبر. بروتوكولات تربية قياسية، على حد سواء داخل وفيما بين المختبرات، ضرورية لفهم الاختلافات البيولوجية بين الأسماك السطحية وكافيفيش. وتنص المادة لدينا أسلوب لدراسة النشاط الجيني في ما بعد اليرقات الأسماك المعرضة لمعلمات النمو المطرد والتنمية.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل منح من "معاهد الصحة الوطنية" [HD089934, DK108495].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methylene blue Kordon B016CBHZUS antifungal
heater Finnex 4711457836017 100W Digital Control Heater
airstone Lee's Aquarium & Pet Products 10838125202 disposable air stone
salt Instant Ocean 51378014021 Sea Salt
nursery container IPC 21545-002 40 oz or 1.5 L clear containers
transfer pipette VWR 414004-002 plastic bulb pipettes
compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers Reed Mariculture na fish food
RGcomplete APBreed 817656016572 32 oz bottle of rotifer food
Programmable Auto Dosing Pump DP-4 Jebao DP-4 automatic feeder for rotifers
Tricane-S Western Chemical MS 222 fish anesthetic
sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G for tricane solution
nylon mesh strainer HIC (Harold Import Co.) 735343476235 3-inch diameter
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L fixative
10X PBS Invitrogen AM9625 buffer, dilute to 1X using distilled water
Triton-x 100 Sigma-Aldrich T8787-250ML detergent
sodium azide Sigma-Aldrich S2002-25G anti-bacterial
bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-100G blocking reagent
glass vial with screw-top cap 4mL Wheaton 224742 staining vial
plastic mesh screen for breeding tank Pentair N1670 Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net.
vinyl-coated disk magnets Kjmagnets D84PC-AST
New Life Spectrum Thera-A pellet fish food New Life International na Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website
Antibodies
insulin antibody from guinea pig Dako A0564 1:200
glucagon antibody from sheep Abcam ab36215 1:200
acetylated tubulin antibody from mouse Sigma T6793 1:500
HuD/HuC antibody from mouse Life Technologies A-21271 1:500
nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit Abcam ab106417 5μg/mL
choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit Abcam ab178850 1:2000
seratonin (5HT) from rabbit Immunostar 20080 1:500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carlson, B. M., Klingler, I. B., Meyer, B. J., Gross, J. B. Genetic analysis reveals candidate genes for activity QTL in the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. PeerJ. 6, e5189 (2018).
  2. Chin, J. S. R., Gassant, C. E., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. 441, (2), 319-327 (2018).
  3. Lloyd, E., Olive, C., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. 441, (2), 328-337 (2018).
  4. Tabin, J. A., Aspiras, A., et al. Temperature preference of cave and surface populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441, (2), 338-344 (2018).
  5. Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441, (2), 297-304 (2018).
  6. Riddle, M. R., Aspiras, A. C., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, (7698), 647-651 (2018).
  7. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9, (9), e107877 (2014).
  8. Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, (31), 9668-9673 (2015).
  9. Tang, J. L. Y., Guo, Y., et al. The developmental origin of heart size and shape differences in Astyanax mexicanus populations. Developmental Biology. 441, (2), 272-284 (2018).
  10. Riddle, M. R., Boesmans, W., Caballero, O., Kazwiny, Y., Tabin, C. J. Morphogenesis and motility of the Astyanax mexicanus gastrointestinal tract. Developmental Biology. 441, (2), 285-296 (2018).
  11. Gore, A. V., Tomins, K. A., et al. An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration. Nature Ecology & Evolution. 2, (7), 1155-1160 (2018).
  12. McGaugh, S. E., Gross, J. B., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, (2014).
  13. Gross, J. B., Furterer, A., Carlson, B. M., Stahl, B. A. An Integrated Transcriptome-Wide Analysis of Cave and Surface Dwelling Astyanax mexicanus. PLoS One. 8, (2), e55659 (2013).
  14. Hinaux, H., Pottin, K., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pachón Cavefish. Zebrafish. 8, (4), 155-165 (2011).
  15. Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through natural spawning. Cold Spring Harbor Protocols. 3, (11), (2008).
  16. Borowsky, B. R. Handling Astyanax mexicanus Eggs and Fry. CSH Protocols. (2008).
  17. Stahl, B. A., Gross, J. B. A Comparative Transcriptomic Analysis of Development in Two Astyanax Cavefish Populations. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328, (6), 515-532 (2017).
  18. Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax Transgenesis and Husbandry. How Cavefish Enters the Laboratory. Zebrafish. 11, (4), 291-299 (2014).
  19. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PloS One. 10, (3), e0119370 (2015).
  20. JoVE. Current methods in Astyanax mexicanus research. Available from: https://www.jove.com/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch (2018).
  21. Heanue, T. A., et al. A Novel Zebrafish ret Heterozygous Model of Hirschsprung Disease Identifies a Functional Role for mapk10 as a Modifier of Enteric Nervous System Phenotype Severity. PLoS Genetics. 12, (11), (2016).
  22. Reed Mariculture Culturing Rotifers in Small Systems (Home or Lab). Available from: http://reedmariculture.com/support_rotifers_culturing.php (2018).
  23. Riddle, M. R., Baxter, B. K., Avery, B. J. Molecular identification of microorganisms associated with the brine shrimp Artemia franciscana. Aquatic Biosystems. 9, (1), (2013).
  24. Tsang, B., et al. Breeding Zebrafish: A Review of Different Methods and a Discussion on Standardization. Zebrafish. 14, (6), 561-573 (2017).
  25. Cave fish assembly and gene annotation. Available from: http://useast.ensembl.org/Astyanax_mexicanus/Info/Annotation (2018).
رفع "تترا المكسيكي" <em>مكسيكي أستياناكس</em> لتحليل تعمل بوستلارفال والجامعة-جبل إيمونوهيستوتشيميستري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Riddle, M., Martineau, B., Peavey, M., Tabin, C. Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (142), e58972, doi:10.3791/58972 (2018).More

Riddle, M., Martineau, B., Peavey, M., Tabin, C. Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (142), e58972, doi:10.3791/58972 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter