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Genetics

Alzando la Tetra messicano Astyanax mexicanus per analisi di Post-larval fenotipi e Immunohistochemistry intero-monta

doi: 10.3791/58972 Published: December 28, 2018

Summary

In questo protocollo, dimostriamo come allevare gli adulti Astyanax mexicanus , sollevare le larve ed eseguire immunohistochemistry intero-monta il pesce post-larvale per confrontare i fenotipi della superficie e Grotta morfotipi.

Abstract

Fiume e Grotta-adattato popolazioni di Astyanax mexicanus mostrano le differenze nella morfologia, fisiologia e comportamento. Ricerca incentrata sul confronto tra forme dell'adulto ha rivelato le basi genetiche di alcune di queste differenze. Meno è conosciuto circa come le popolazioni differiscono nelle fasi post-larvale (al momento della comparsa di alimentazione). Tali studi possono fornire la comprensione in come caverna sopravvivere fino all'età adulta nel loro ambiente naturale. Metodi per confrontare lo sviluppo post-larvale in laboratorio richiedono l'acquacoltura standardizzato e regimi di alimentazione. Qui descriviamo come allevare pesci su una dieta dei rotiferi di nutrienti in acqua di ricircolo per fino a fecondazione post due settimane. Dimostriamo come raccogliere pesci post-larvale da questo sistema di scuola materna ed eseguire intero-monta immunostaining. Immunostaining è un'interessante alternativa alle analisi di espressione del transgene per indagare lo sviluppo e la funzione del gene in a. mexicanus. Il metodo di vivaio utilizzabile anche come un protocollo standard per le popolazioni di densità-abbinati che stabilisce per la crescita in adulti.

Introduction

Il tetra messicano, Astyanax mexicanus, è una singola specie di pesce che esiste come fiume-abitazione popolazioni (superficie pesce) e un numero di caverne popolazioni (caverna) denominato per le grotte che abitano (cioè, Tinaja, Molino, Pachón). Un numero crescente di ricercatori sta utilizzando a. mexicanus di indagare le basi di genetiche ed evolutiva di comportamentale1,2,3,4, metabolica5,6 ,7,8ed evoluzione morfologica9,10,11. Risorse disponibili per gli studi di a. mexicanus includono un genoma sequenziato ed annotata12; transcriptome13; sviluppo gestione temporanea tabella14; e metodi per l'allevamento di15,16,17, transgenetica18di creazione e modifica dei geni19. Diffusione di ulteriori strumenti e protocolli standard aggiornati accelererà la crescita della comunità di ricerca di caverna (Vedi questa raccolta di metodi20).

Il nostro obiettivo è quello di aggiungere al repertorio degli strumenti esistente, fornendo un metodo affidabile per la valutazione gene attività in situ in post-larvale a. mexicanus, in modo paragonabile tra i laboratori. Ci sono due sfide per raggiungere questo obiettivo. In primo luogo, c'è una necessità di regimi standardizzati da cova e alzando il pesce tra i laboratori, come differenze nei parametri quali alimentazione e densità influenzano la crescita e maturazione, quindi influire sulle attività del gene. In secondo luogo, c'è la necessità di un metodo standardizzato ma adattabile per l'esame di modelli di attività del gene nel pesce post-larvale. Affrontiamo questi problemi qui, che istituisce procedure standard per l'allevamento dei pesci a stadi post-larvali e l'introduzione di un protocollo robusto intero-monta immunohistochemistry (IHC) per valutare l'espressione genica in a. mexicanus.

In primo luogo dimostriamo come allevare il pesce attraverso la deposizione delle uova naturali e identificare le uova fecondate. Avanti descritto sono come si schiudono le uova fecondate (larve) e trasferirli ai contenitori di vivaio, dove essi sono mantenuti ad una densità di 20 pesci per contenitore per due settimane senza ricircolo o cambiando l'acqua. Al momento della fecondazione post 5 giorni, i pesci hanno sviluppato a stadi post-larvali (non più avere una fornitura di tuorlo) e sono forniti di alghe-federazione Brachionus plicatilis (rotiferi) come fonte di cibo ricco di sostanze nutritive che non richiedono rifornimento giornaliero. Questo metodo fornisce i parametri di crescita coerente per lo sviluppo larvale e post-larvale.

Per valutare la funzione del gene, dimostriamo come rimuovere il pesce dai contenitori di vivaio ed eseguire intero-monta IHC. Il metodo IHC presentato è adattato da protocolli sviluppati per l'uso con Danio rerio21 ed è efficace per l'esame di antigeni in tutti i tessuti a. mexicanus provati, compreso il cervello, intestino e pancreas. IHC è un'alternativa più veloce alla generazione di animali transgenici per l'esame dell'espressione genica e la localizzazione della proteina. Questo protocollo sarà utile per studi volti a crescere a. mexicanus e confrontando i fenotipi dei pesci di superficie e caverna nelle fasi post-larvale.

Protocol

Le procedure descritte in questo protocollo sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso la Harvard Medical School.

1. allevamento

Nota: Ci sono parecchi metodi pubblicati per15,16,17,20 che potrebbe essere utilizzato anche in questa fase di allevamento. Prima dell'allevamento, pesci adulti sono mantenuti su un 10:14 chiaro: scuro ciclo a 23 ° C e ha alimentato una dieta di pellet (Vedi tabella materiali) una volta al giorno. Pesce può essere allevato in un sistema di ricircolo con filtrazione meccanica e sterilizzazione UV. Allevamento può essere eseguita anche in serbatoi statici (non di ricircolo), ma il pesce dovrebbe non essere lasciato in un serbatoio statico per più di 3 giorni, come la qualità dell'acqua si degrada rapidamente.

  1. Riempire un serbatoio di 5 gal con acqua pesce (declorurata acqua portata a: pH = 7.1 + /-2, conducibilità = 900 + /-150 µS, temperatura = 23 ° C).
  2. Collocare plastica mesh (Vedi materiali) nella parte inferiore del serbatoio. Se l'allevamento in serbatoi statici, apporre un riscaldatore di acqua al lato del serbatoio. Se nidificazione in un sistema di ricircolo, inserire un riscaldatore di acqua nel pozzetto del sistema.
    Nota: La maglia di plastica impedisce gli adulti che consumano uova.
  3. Posto uno femmina e due maschi a. mexicanus di pesce superiore a 1 anno di età nel serbatoio. Consentire il pesce raggiunga per 30 min.
  4. Impostare la temperatura del riscaldatore a 24 ° C (o 1 ° C più calda rispetto alla temperatura di partenza).
  5. Dopo 24 h, aumentare la temperatura di 1 ° C.
  6. Dopo 24 h, aumentare la temperatura di 1 ° C. Controllare i serbatoi tutti i giorni per le uova dal bagliore di una torcia sulla parte inferiore del serbatoio. Trattenere i pesci dal cibo durante questo periodo di 3 giorni.
  7. Se la riproduzione non è stata indotta dopo 3 giorni, spegnere il riscaldatore e permettere all'acqua di tornare a temperatura ambiente (TA) prima di spostare il pesce loro serbatoio originale.

2. schiusa delle uova fecondate le uova

  1. Una volta che le uova sono identificate in una vasca di allevamento, rimuovere gli adulti e la maglia di plastica e ridurre l'acqua ad una profondità di 10 cm utilizzando un bicchiere o una tazza.
    Nota: Per stimare il tempo di deposizione delle uova, utilizzare una pipetta di trasferimento per inserire alcune uova in una capsula di Petri e visualizzarli con un microscopio stereoscopico per determinare la fase14 e stimare il tempo di fecondazione.
  2. Spostare il serbatoio ad una superficie di lavoro conveniente e rimuovere eventuali uova opache o feci, lasciando solo le uova fertili, traslucide nel serbatoio.
    Nota: Il numero di uova fertili possa essere registrato in questo momento.
  3. Riempire il serbatoio con pesce-pronto acqua (Vedi punto 1.1) e aggiungere 6-7 gocce di blu di metilene al serbatoio, come l'acqua riempie.
    Nota: La concentrazione finale di blu di metilene è circa 1,5 ppm.
  4. Aggiungere un riscaldatore e la vasca di gorgogliamento dell'acquario (collegato a una pompa ad aria, con un regolatore) al serbatoio.
  5. Impostare il riscaldatore a 24 ° C e agire sul regolatore di flusso d'aria per produrre un delicato flusso di bolle.
  6. Mettere un coperchio sul serbatoio per aiutare a mantenere la temperatura dell'acqua.
    Nota: Le uova dovrebbero iniziare da cova entro 24 ore il tempo di deposizione delle uova.

3. trasferimento delle larve covate a vivaio contenitori

  1. Aggiungere 20 g di sale (Vedi materiali) a 8 L di pesce-pronto acqua (Vedi punto 1.1) e mescolare fino a scioglimento. Riempire ogni contenitore di vivaio di 1,5 L (Vedi materiali) con 1 L di acqua preparata.
  2. Utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare le larve covate in contenitori di vivaio preparati ad una densità di 20 pesci per contenitore.
    Nota: Una lampada frontale può essere utile per individuare e trasferire le larve covate.
  3. Dopo la rimozione di tutte le larve covate visibile, agiti l'acqua nel serbatoio di agitazione, e/o soffiando getti d'acqua i bordi e gli angoli del serbatoio con la pipetta.
    Nota: Questo vi aiuterà a rivelare le larve che sono state mancate al primo passaggio.
  4. Smaltire le larve non utilizzate in questa fase utilizzando le linee guida di Office di Welfare del laboratorio (OLAW). Aggiungere ipoclorito di sodio al serbatoio per ottenere una concentrazione finale di 6,15%. Attendere almeno 5 minuti prima di versare nel lavandino.
  5. Etichettare ogni contenitore di scuola materna con la data e l'ora di fecondazione. Visualizzare vivaio contenitori ogni giorno e continuare a rimuovere eventuali larve morte.

4. preparazione del cibo per pesci basati su Rotifera

  1. Per informazioni su come ottenere rotiferi, vedere Tabella materiali . Seguire il protocollo di riferimento per impostare, gestire e raccogliere rotiferi22.
  2. Preparare il pesce cibo aggiungere 3 mL di miscela di alghe (Vedi Tabella materiali) a 1 L di rotiferi raccolti. Questa miscela verrà aggiunto direttamente ai contenitori vivaio come un approvvigionamento di generi alimentari.

5. alimentazione dei pesci post-larvale

  1. Quando i pesci sono 5 giorni dopo la fecondazione (dpf), aggiungere 3 mL di cibo per pesci (preparato al punto 4.2) per ogni contenitore di vivaio. La densità ottima, rotiferi dovrebbero essere visibile in densi gruppi agli angoli dei contenitori della scuola materna e meno evidente al centro del contenitore. Aggiungere ulteriori Rotifero miscela fino a quando non viene raggiunta la densità appropriata.
  2. Controllare i contenitori al giorno per la presenza dei rotiferi e aggiungere di più se la concentrazione ottiene impoverita. Continuare a rimuovere eventuali larve morte.
  3. Quando il pesce raggiunge 14 dpf, spostarli in un serbatoio con un sistema di ricircolo ad una densità di 5 pesci/L di acqua.
    Nota: Il numero di sopravvivenza post-larvale pesce può essere registrato in questo momento.

6. intero-monta Immunohistochemistry di pesce post-larvale

  1. Rimuovi post-larvale pesce della fase desiderata dal cibo per 24 h versando il contenitore di vivaio contenente il pesce attraverso un nylon mesh filtro e mettere il filtro in un recipiente con acqua pulita pesce (Vedi punto 1.1).
    Nota: È essenziale per rimuovere tutto il cibo. Anche piccole quantità di cibo nell'intestino sono auto-fluorescente e influenzerà la formazione immagine.
  2. Raccogliere ed eutanasia il pesce.
    Nota: Il protocollo di eutanasia deve seguire le norme OLAW ed essere approvato dal tuo uso Comitato e istituzionali Animal Care. Abbiamo notato tricaina da solo non eutanasia pesce post-larvale, che i pesci cominciano a muoversi quando trasferiti da tricaina fissativo se i pesci non sono mantenuti anche sul ghiaccio.
    1. Preparare la soluzione di tricaina in un becher aggiungendo 0,4 g di tricaina-S e 0,8 g di bicarbonato di sodio in 1 L di acqua deionizzata e posizionarlo sul ghiaccio.
    2. Versare l'acqua contenente il pesce attraverso un colino di maglia di nylon per raccogliere i pesci. Delicatamente immergere la succhieruola in soluzione di tricaina ghiacciata e lasciarlo in ghiaccio per 10 min.
  3. Difficoltà il pesce euthanized.
    1. Utilizzare una pipetta con una punta di taglio per trasferire il pesce in una provetta conica.
    2. Rimuovere la soluzione di tricaina con una pipetta di trasferimento e sostituirli con fissativo. Incubare con dondolo.
      Nota: Tempo di fissativo e la fissazione deve essere determinato basato sull'anticorpo utilizzato. soluzione di formalina al 10% (4% formaldeide, vedi materiali) durante la notte a 4 ° C è sufficiente per gli anticorpi elencati nella Tabella materiali.
      Attenzione: La formalina è tossico ed infiammabile. Indossare indumenti protettivi (guanti, camice e occhiali splash) e gestire in una cappa chimica. Soluzioni contenenti formalina devono essere eliminati come rifiuti pericolosi.
    3. Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere con cautela il fissativo senza disturbare il pesce. Aggiungere 3 mL di fosfato salino-triton soluzione tamponata [PBS con 0,1% Triton (PBST), Vedi materiali] e incubare per 15 min a RT con dondolo.
    4. Rimuovere PBST e sostituire con PBST fresco e incubare per 15 minuti ripetere questo "lavaggio" un tempo supplementare.
      Nota: I pesci possono essere memorizzati in PBS contenente 0,02% di sodio azide a 4 ° C per diverse settimane.
  4. Eseguire intero-monta immunostaining.
    1. Preparare 50 mL di soluzione [PB-0.5% Triton X, 0,2% albumina di siero bovino (BSA), 1% di dimetilsolfossido (DMSO), 0,02% di sodio azide, 5% di siero di asino] di blocco.
      Attenzione: La sodio azide e DMSO sono tossici. Dispositivi di protezione individuale (guanti, camice e occhiali splash) devono essere utilizzato durante la manipolazione. Tutte le soluzioni devono essere eliminate come rifiuti pericolosi.
    2. Utilizzare una pipetta di trasferimento per trasferire il pesce a un flaconcino di vetro da 4 mL con tappo a vite tappo. Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere il PBST e aggiungere 3 mL di soluzione di blocco. Incubare per 1 h a RT con dondolo.
    3. Utilizzare una pipetta per rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere anticorpo primario diluito in soluzione di blocco. Incubare per una notte a temperatura ambiente con agitazione.
      Nota: ad esempio, aggiungere diluizione di 1: 250 di anti-HuC/HuD neuronale proteina anticorpo monoclonale murino ottenuto (Vedi Tabella materiali per un elenco degli anticorpi che sono stati utilizzati con successo in a. mexicanus). Un insieme di pesce con nessun anticorpo primario aggiunto dovrebbe essere incluso in questa fase. Volume di anticorpo dovrebbe essere sufficiente per coprire il pesce e consentire per agitazione.
    4. Lavare il pesce 3 volte con PBST come descritto al punto 6.3.4. Sostituire PBST con anticorpo secondario diluito in soluzione di blocco e incubare per una notte a temperatura ambiente con agitazione.
      Nota: Le concentrazioni ottimali dell'anticorpo primario e secondario, tempo di incubazione e temperatura di incubazione dovrebbe essere determinate per ogni anticorpo. Pernottamento al RT era efficace per gli anticorpi elencati nella Tabella materiali.
    5. Lavare il pesce 3 volte con PBST, con ogni lavaggio dura 15 minuti, come descritto al punto 6.3.4.
    6. Trasferire il pesce in PBS per deposito a breve termine prima di procedere con la dissezione, montaggio, o il pesce di sezionamento.

Representative Results

La tabella 1 Mostra il successo durante un anno di allevamento di pesci di superficie e Tinaja, Molino e Pachón caverna in vasche di allevamento statico. Superficie e depone le uova Pachón con embrioni fecondati sempre prodotti covato larve, mentre Molino e Tinaja erano infruttuosi qualche volta (2/6 e 2/18 eventi di riproduzione non ha prodotto le larve covate, rispettivamente). Non c'è variazione nella dimensione di frizione non è da attribuire all'età del pesce genitore. Tabella 2 indica il numero totale delle larve covate derivanti da alcuni degli eventi deposizione delle uova e l'età del pesce genitore. In generale, abbiamo trovato che la superficie pesci producono il maggior numero di larve per deporre le uova (media ± 1.550 894, n = 5), seguita da Pachón (media ± 879 680, n = 6), Tinaja (media 570 ± 373, n = 11) e Molino (media ± 386 276, n = 3). Il numero di larve prodotte è in genere più che sono necessari per esperimento o per crescita in adulti. In genere impostare 6-18 contenitori vivaio (120-360 larve) ed eutanasia il pesce rimanente.

Per misurare il successo del protocollo vivaio abbiamo registrato il numero di larve covate e pesci sopravvissuti post-larvale da eventi di successo riproduttivo. La tabella 3 Mostra dati da 1 mese di allevamento in serbatoi di ricircolo e include il numero di larve trasferiti in contenitori di vivaio che è sopravvissuto a 14 dpf. Durante questo mese, il tasso di sopravvivenza hanno variato da 41-81 per cento, con conseguente 65-293 pesce disponibile a popolazione per esperimenti o crescita in adulti.

Per determinare se intero-monta immunostaining è successo, abbiamo confrontato la fluorescenza dei campioni incubati con l'anticorpo primario a quelle incubate con l'anticorpo secondario solo. Il segnale fluorescente è solo visibile nei pesci incubati con l'anticorpo primario. Abbiamo usato questo protocollo per neuroni10 (Figura 1) e le cellule pancreatiche6 etichette alle fasi fino a 12,5 dpf in entrambi superficie e Grotta morfotipi con successo.

Figure 1
Figura 1: neurone etichettatura. Intero-monta immunostaining di a. mexicanus. Immagine di 12,5 dpf superficie pesci (un) e caverna Pachón (b). Immagine della regione metà del corpo [covato contorno giallo mostrato (a) e (b)] di superficie pesce (c) e Pachón caverna (d) macchiato con l'anticorpo pan-neuronale (Hu). (e), confocale immagine di una regione dei neuroni enterici visualizzando dell'intestino di pesci di superficie (Hu) e loro proiezioni (tubulina acetilata). Per questa immagine, l'intestino è stato dissecato fuori e montato in mezzo contenente DAPI per macchiare i nuclei. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

popolazione tentativi di eventi di riproduzione frizioni
superficie 94 23 23
Molino 110 6 4
Pachón 167 13 13
Tinaja 242 18 16

Tabella 1: riepilogo dei dati da un anno di allevamento A. mexicanus in serbatoi statici. Numero di allevamento tentativi, con conseguente generazione di eventi, e numero di eventi che prodotti di deposizione delle uova schiuse le larve.

popolazione età del padre larve covate
superficie 1 anno 989
superficie 1 anno 1050
superficie 3 anni 2214
superficie 3 anni 432
superficie 3 anni 1768
superficie 4 anni 2852
Pachón 1 anno 1194
Pachón 1 anno 1933
Pachón 1,5 anni 371
Pachón 3 anni 480
Pachón 4 anni 1190
Pachón 4 anni 110
Tinaja 9 mesi 259
Tinaja 9 mesi 253
Tinaja 10 mesi 1100
Tinaja 11 mesi 857
Tinaja 1 anno 713
Tinaja 1 anno 853
Tinaja 1 anno 542
Tinaja 1,5 anni 360
Tinaja 1,5 anni 58
Tinaja 1,5 anni 1100
Tinaja 4 anni 185
Molino 2,5 anni 460
Molino 2,5 anni 619
Molino 3 anni 81

Tabella 2: approssimativa età della donna e il numero delle larve covate da singoli eventi di deposizione delle uova dalle popolazioni indicate di A. mexicanus.

popolazione tentativi di eventi di riproduzione frizioni nidiata larve trasferite in tazze di vivaio post-larvale pesce presso 14dpf sopravvivenza (%)
superficie 4 3 2 576 & 1728 360 174 48
Molino 4 2 1 228 159 65 41
Tinaja 4 1 1 1952 175 93 53
Pachón 4 1 1 1696 360 293 81

Tabella 3: riepilogo dei dati da un mese di a. mexicanus di allevamento in un sistema di ricircolo e sollevando le larve. Numero di allevamento tentativi, con conseguente generazione di eventi, frizioni che ha prodotto le larve covate, il numero medio di larve per frizione, larve trasferite il vivaio contenitori e post-larvale pesci presenti nei contenitori del vivaio dopo 14 giorni.

Discussion

Confronto tra attività genica tra superficie e Grotta a. mexicanus richiede attentamente controllati parametri ambientali e metodi che possono essere replicati di laboratori. Il nostro protocollo per l'allevamento a. mexicanus fornisce contenuti nutrizionali coerenti durante lo sviluppo post-larvale. A seguito di questo regime alimentare, funzione del gene può essere paragonato con fiducia tra popolazioni utilizzando il protocollo robusto immunohistochemistry che presentiamo. Qui discutiamo l'importanza di questo metodo così come i suoi limiti e le applicazioni future.

Per realizzare una crescita pari densità, abbiamo trovato che pesce post-larvale può essere sollevata senza ricircolo dell'acqua per due settimane in contenitori di 1,5 L su una dieta dei rotiferi. Questo protocollo può anche essere usato per allevare pesci su un sistema di ricircolo; Tuttavia, rotiferi devono essere aggiunto ogni giorno per compensare quelli persi attraverso il deflusso di serbatoio. Naupli di Artemia appena schiusi sono comunemente usati come fonte di cibo in acquacoltura, ma abbiamo trovato che l'utilizzo di rotiferi ha notevoli vantaggi, tra cui: ridotto prezzo, biosicurezza migliorata, nutrizione coerente e migliore qualità dell'acqua (Vedi sotto).

In primo luogo, il costo settimanale dei consumabili è 4 dollari per rotiferi, rispetto a 14 dollari per artemie. Per quanto riguarda la biosicurezza, rotiferi sono allevati in laboratorio in condizioni controllate, mentre Artemia sono raccolti dal selvaggio e soggette a variazione naturale in microbica o agente patogeno Sommario23. Inoltre, la composizione nutrizionale dei naupli di Artemia sono ambientalmente determinati e pertanto incoerente. Naupli prosperano sulle proprie riserve di energia dopo la schiusa; perdono rapidamente valore nutritivo come sviluppano e dovrebbero essere alimentati in modo ottimale ai pesci all'interno di diverse ore. Artemia avviare l'alimentazione a 12 casa post-cova, che rappresenta la prima volta che potrebbe essere nutrizionalmente arricchiti; Tuttavia, in questa fase sono diventati troppo grandi per 5 dpf pesci a consumare. In confronto, rotiferi si nutrono continuamente di microalghe marine conseguente alto contenuto nutritivo indipendentemente da quando vengono raccolti i rotiferi. Rotiferi sono molto più piccoli di Artmeia naupli (160 vs 400 micron), che li rende più facile per il pesce catturare e inghiottire. Caverna e post-larvale superficie pesci consuma rotiferi in quantità simili non suggerendo alcuna differenza nella capacità di catturare i rotiferi10o preferenze.

Infine, Naupli di Artemia iniziano morendo in acqua dolce diverse ore dopo essere stato introdotto. Non vengono consumate naupli decadrà, rapidamente diminuendo la qualità dell'acqua, se non vengono rimossi manualmente. Rimozione di morto Artemia è che richiede tempo e pericoloso per i pesci post-larvale che non sono molto più grande di Artemia e potrebbero essere accidentalmente rimosso o feriti. Rotiferi possono vivere indefinitamente nei contenitori del vivaio e fornire cibo ai pesci in ogni momento senza influire significativamente sulla qualità dell'acqua.

Mentre utilizzando rotiferi come una fonte di cibo ha notevoli benefici, per mantenere le alghe stock, Rotifera deve essere aggiunto al sistema cultura ogni giorno. Questo può essere realizzato con un alimentatore automatico che eroga alghe liquide nel contenitore di cultura Rotifero (Vedi Tabella materiali). Rotiferi devono anche essere raccolto da questo set-up ogni 24-48 ore per mantenere la salute della cultura. I ricercatori che allevano i pesci molto raramente (una volta un anno, per esempio) e non si occupano di effettuare confronti tra le popolazioni nelle fasi post-larvale possono preferire Artemia come fonte di cibo, poiché gli embrioni incistati possono essere covati in qualsiasi momento.

Si consiglia di tenere traccia del numero di larve covate e superstite per monitorare il successo di schiusa e di crescita. Se la maggior parte del embrioni o larve muoiono, è possibile a causa di contaminazione batterica o fungina. Si raccomanda di monitorare la qualità dell'acqua dell'acqua pesce-pronto e sterilizzare qualsiasi apparecchiatura con etanolo al 70%. Contenitori di vivaio possono essere riutilizzati dopo averli puliti e sterilizzati. Per minimizzare il rischio di malattia, è anche fondamentale per rimuovere qualsiasi pesce morto dai contenitori di vivaio e non aggiungere rotiferi prima 5 dpf, quando i pesci cominciano a mangiare.

A. mexicanus sono sessualmente maturi a circa un anno di età. Si tratta di una limitazione per la generazione transgenica a. mexicanus rispetto a Danio rerio (pesce zebra) che sono in grado di riprodursi a 10-12 settimane24. Immunohistochemistry (IHC) è un metodo alternativo per studiare l'espressione genica e la localizzazione della proteina. Il protocollo descritto qui può essere adattato ad ogni passo e utilizzato per rilevare gli antigeni in qualsiasi tessuto di interesse. È importante notare, tuttavia, che alcuni tessuti possono essere più difficili da visualizzare in superficie pesci a causa della pigmentazione (una barriera che non esiste nella caverna unpigmented), che possono influenzare l'interpretazione degli studi comparativi. Per risolvere questo potenziale problema, superficie pesce pigmento può essere candeggiato dopo la fissazione utilizzando perossido di idrogeno 3%.

IHC richiede la fissazione di riuscita dei tessuti, il blocco e la penetrazione dell'anticorpo. Metodi per ciascuna variano a seconda del tessuto e la proteina di interesse. Il tempo di fissativo e la fissazione deve preservare architettura cellulare mantenendo l'epitopo dell'antigene. Per questo protocollo, utilizziamo un fissativo di cross-linking (paraformaldeide) e omettere un fissativo denaturante (come metanolo o acetone). Abbiamo trovato che incubazione in acetone diminuita segnale anticorpo per gli indicatori di un neurone e del pancreas. Il passo di blocco è essenziale per impedire gli anticorpi di associazione a proteine non bersaglio nel tessuto. Questo metodo utilizza una combinazione di siero normale (5%) e BSA (0,2%) nella soluzione di blocco. La soluzione bloccante contiene anticorpi e proteine che si legano a siti reattivi sulle proteine nel tessuto, diminuendo il legame non specifico degli anticorpi primari e secondari.

Per ottenere la penetrazione dell'anticorpo, il tessuto deve essere permeabilizzato. Questo può essere realizzato con detergenti o solventi denaturante, ma deve essere ottimizzato per preservare l'epitopo dell'antigene. Il nostro protocollo utilizza una combinazione di Triton e dimetil solfossido (DMSO). Triton e DMSO sono inclusi durante le fasi di incubazione dell'anticorpo e di blocco a concentrazioni di 0,5% e 1%, rispettivamente. Usando questa concentrazione, abbiamo osservato che macchia in cervello, pancreas, intestino e muscolare, suggerendo che è probabile efficace per la penetrazione di tutti i tessuti. Dimensione del pesce può anche influenzare la penetrazione. Questo protocollo non è stato testato sui pesci che sono superiori ai 14 giorni di età (circa 7 mm di lunghezza). Per risolvere i problemi di colorazione, si raccomanda di modificare la procedura di fissazione, blocco e anticorpo penetrazione. È anche importante esaminare la conservazione di sequenza dell'immunogeno con la proteina a. mexicanus di interesse utilizzando il genoma disponibili25.

A. mexicanus è un eccellente modello per studiare l'evoluzione come popolazioni della stessa specie che si sono evoluti in ambienti radicalmente diversi possono essere confrontate direttamente in laboratorio. Protocolli standard di allevamento, all'interno e tra laboratori, sono essenziali per comprendere le differenze biologiche tra superficie pesce e caverna. Nostro articolo fornisce un metodo per esaminare lo sviluppo e l'attività del gene in post-larvale pesci esposti ai parametri di crescita costante.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health [HD089934, DK108495].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methylene blue Kordon B016CBHZUS antifungal
heater Finnex 4711457836017 100W Digital Control Heater
airstone Lee's Aquarium & Pet Products 10838125202 disposable air stone
salt Instant Ocean 51378014021 Sea Salt
nursery container IPC 21545-002 40 oz or 1.5 L clear containers
transfer pipette VWR 414004-002 plastic bulb pipettes
compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers Reed Mariculture na fish food
RGcomplete APBreed 817656016572 32 oz bottle of rotifer food
Programmable Auto Dosing Pump DP-4 Jebao DP-4 automatic feeder for rotifers
Tricane-S Western Chemical MS 222 fish anesthetic
sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G for tricane solution
nylon mesh strainer HIC (Harold Import Co.) 735343476235 3-inch diameter
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L fixative
10X PBS Invitrogen AM9625 buffer, dilute to 1X using distilled water
Triton-x 100 Sigma-Aldrich T8787-250ML detergent
sodium azide Sigma-Aldrich S2002-25G anti-bacterial
bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-100G blocking reagent
glass vial with screw-top cap 4mL Wheaton 224742 staining vial
plastic mesh screen for breeding tank Pentair N1670 Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net.
vinyl-coated disk magnets Kjmagnets D84PC-AST
New Life Spectrum Thera-A pellet fish food New Life International na Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website
Antibodies
insulin antibody from guinea pig Dako A0564 1:200
glucagon antibody from sheep Abcam ab36215 1:200
acetylated tubulin antibody from mouse Sigma T6793 1:500
HuD/HuC antibody from mouse Life Technologies A-21271 1:500
nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit Abcam ab106417 5μg/mL
choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit Abcam ab178850 1:2000
seratonin (5HT) from rabbit Immunostar 20080 1:500

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References

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Alzando la Tetra messicano <em>Astyanax mexicanus</em> per analisi di Post-larval fenotipi e Immunohistochemistry intero-monta
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Riddle, M., Martineau, B., Peavey, M., Tabin, C. Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (142), e58972, doi:10.3791/58972 (2018).More

Riddle, M., Martineau, B., Peavey, M., Tabin, C. Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (142), e58972, doi:10.3791/58972 (2018).

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