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Genetics

Post-larval 고기 분석 및 전체 마운트 Immunohistochemistry 멕시코 Tetra Astyanax mexicanus 를 높이

doi: 10.3791/58972 Published: December 28, 2018

Summary

이 프로토콜에서 우리 Astyanax mexicanus 성인 사육, 애벌레, 인상 하는 방법을 보여 하 고 표면의 고기를 비교 하 여 morphotypes 동굴 후 애벌레 물고기에 전체 마운트 immunohistochemistry를 수행 합니다.

Abstract

강 및 Astyanax mexicanus 의 인구 동굴 적응 형태학, 생리학, 행동에 있는 차이 표시합니다. 성인 양식 비교에 초점을 맞춘 연구 이러한 차이점 중 일부의 유전 기초를 계시 했다. 적은 인구 (먹이의 발병)에서 포스트 애벌레 단계에서 어떻게 다른 지에 대 한 알려져 있다. 이러한 연구 결과 cavefish 그들의 자연 환경에서 성년을 통해 생존 하는 방법에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 실험실에서 후 애벌레의 개발을 비교 하기 위한 방법 표준화 된 양식 및 정권 먹이 필요 합니다. 여기는 물고기까지 2 주 게시물 수정에 대 한 재순환 비 물에 영양분이 풍부한 rotifers의 다이어트 하는 방법에 설명 합니다. 이 보육 시스템에서 후 애벌레 물고기를 수집 하 고 전체-마운트 immunostaining를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. Immunostaining은 transgene 식 분석 조사 개발 및 유전자 기능 A. mexicanus에 대 한 매력적인 대안 이다. 보육 방법 성인으로 성장에 대 한 설정 밀도 일치 하는 인구에 대 한 표준 프로토콜로 사용할 수 있습니다.

Introduction

멕시코 tetra Astyanax mexicanus 는 단일 종의 물고기 강-주거 인구 (표면 물고기)으로 존재 하 고 다양 한 동굴 주거 인구 (cavefish) 그들이 서식 하는 동굴에 대 한 명명 된 (즉, Tinaja, Molino, Pachón). 연구원의 성장 수를 사용 하 여 A. mexicanus 행동1,2,3,4, 신진 대사5,6의 유전과 개발 기초 조사 ,7,8및 형태학 진화9,,1011. A. mexicanus 의 연구에 대 한 사용 가능한 리소스 포함 게놈 시퀀스 및 주석12; transcriptome13; 개발 준비 테이블14; 그리고15,,1617번 식, 제 닉18, 만드는 방법과 유전자19편집. 추가 도구 및 업데이트 표준 프로토콜의 보급 cavefish 연구 커뮤니티의 성장을 가속화할 것 이다 (이 방법 컬렉션20참조).

우리의 목표는 유전자 활동에서 현장에서 포스트 애벌레 A. mexicanus, 실험실 사이 비교 방식에서에서 평가 하기 위한 강력한 방법을 제공 하 여 툴의 기존 레 퍼 토리에 추가 하는. 이 목표를 달성 하는 두 가지 도전이 있다. 첫째, 부 화에 대 한 표준화 된 정권에 대 한 필요가 있다 고 실험실 사이 물고기를 양육, 수 유 및 밀도 등의 차이점으로 영향을 성장과 성숙, 그로 인하여 유전자 활동에 영향을 미치는. 둘째, 포스트 애벌레 물고기의 유전자 활동의 패턴을 조사 하기 위한 표준화 된 아직 적응 방법에 대 한 필요가 있다. 우리는 물고기 포스트 애벌레 단계를 제기 하 고 소개 하는 A. mexicanus에서 유전자 발현을 평가 하기 위한 강력한 전체 마운트 immunohistochemistry (IHC) 프로토콜에 대 한 표준 관행을 수립 여기, 이러한 문제를 해결.

우리는 먼저 자연 산란을 통해 물고기를 번 식 하 고 수정 된 알을 식별 하는 방법을 보여 줍니다. 설명된 다음은 수정 된 달걀 (애벌레)를 해치 고 어디 그들이 유지 됩니다 컨테이너 당 20 물고기의 밀도에서 2 주에 대 한 재순환 또는 물 변경 없이 보육 컨테이너에 그들을 전송 하는 방법 이다. 5 일 게시물 수정에 물고기 포스트 애벌레 단계 (더 이상 데 노 른 자 공급)을 개발 하 고 매일 보충을 필요로 하지 않는 영양이 풍부한 음식 소스로 조류 먹이 Brachionus plicatilis (rotifers)를 제공 됩니다. 이 메서드는 애벌레와 애벌레 후 개발에 대 한 일관 된 성장을 매개 변수를 제공합니다.

유전자 기능을 평가 하기 위해 보육 컨테이너에서 물고기를 제거 하 고 전체-마운트 IHC 수행 하는 방법을 보여 줍니다. IHC 방법 제시 Danio rerio21 와 함께 사용 하기 위해 개발 된 프로토콜에서 적응 하 고 모든 A. mexicanus 조직에서 테스트, 뇌, 소장, 췌 장 등 항 원 검사에 대 한 효과적입니다. IHC 생성 하는 유전자 변형 동물 유전자 발현 및 단백질 지 방화의 검사에 대 한 빠른 대안입니다. 이 프로토콜은 A. mexicanus 성장과 포스트 애벌레 단계에서 표면 물고기와 cavefish의 고기를 비교 하기 위한 연구를 위해 유용할 것 이다.

Protocol

이 프로토콜에 걸쳐 설명 하는 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 하버드의과 대학에 의해 승인 되었습니다.

1입니다. 번 식

참고: 또한이 단계에서 사용 될 수 있는15,,1617,20 번 식에 대 한 여러 가지 게시 방법이 있다. 번 식, 이전 성인 물고기 10:14 빛: 다크 23 ° C에서 주기 및 먹이 펠 릿 다이어트에 유지 됩니다 (참조 테이블의 재료) 한 번 매일. 물고기는 기계적인 여과 및 UV 살 균 반복 시스템에서 자란 수 있습니다. 번 식 또한 정적 (비 재순환) 탱크, 수행 될 수 있습니다 하지만 물고기 하지 정적 탱크에 3 일 이상 그대로 두어야 수 질 신속 하 게 저하 됩니다.

  1. 물고기 준비 물 5 갤런 탱크를 채우기 (dechlorinated 물 조정: pH = 2, 전도도 + 7.1 150 µS, 온도 + 900 = = 23 ° C).
  2. 플라스틱 장소 메쉬 ( 자료참조)는 탱크의 바닥에. 정적 탱크에서 번 식 하는 경우 온수 탱크의 측면에 부착. 반복 시스템에서 사육 하는 경우 시스템 기름 통에 온수를 놓습니다.
    참고: 플라스틱 메쉬 계란 소비에서 성인을 방지할 수 있습니다.
  3. 장소 한 여자와 두 남자 A. mexicanus 는 탱크의 1 년 오래 된 보다 큰 물고기. 30 분에 대 한 적응을 물고기 허용.
  4. 24 ° C (또는 1 ° C 시작 온도 보다 따뜻한) 히터의 온도 설정 합니다.
  5. 24 시간 후 증가 온도 1 ° c.
  6. 24 시간 후 증가 온도 1 ° c. 탱크의 바닥에는 손전등 빛나는 여 매일 계란에 대 한 탱크를 확인 합니다. 두 일 동안 음식에서 물고기를 보류 합니다.
  7. 3 일 후 산란 하지 유도 하고있다, 히터를 해제 하 고 그들의 원래 탱크 물고기를 이동 하기 전에 실내 온도 (RT)로 돌아가려면 물 허용.

2. 해칭 수정 된 계란

  1. 계란 사육 탱크에 식별 되 면 성인과 플라스틱 메쉬를 제거 하 고 비 커 또는 컵을 사용 하 여 10 cm의 깊이에 물 감소.
    참고: 산란의 시간 추정, 페 트리 접시에 여러 계란을 배치 하 고14 단계 확인 하 고 수정 시간을 추정 하는 stereomicroscope에 그들을 볼을 전송 피 펫을 사용 합니다.
  2. 편리한 작업 표면에 탱크를 이동 하 고 불투명 한 계란 또는 탱크에만 반투명, 비옥한 계란을 떠나 배설물 제거.
    참고:이 시간에는 비옥한 계란 수를 기록할 수 있습니다.
  3. 물고기 준비와 탱크 (단계 1.1 참조) 물 및 물 채우고으로 탱크에 메 틸 렌 블루의 6-7 방울을 추가 작성.
    참고: 메 틸 렌 블루의 최종 농도 약 1.5 ppm 이다.
  4. 탱크 히터 및 수족관 bubbler (연결할 공기 펌프는 레 귤 레이 터)를 추가 합니다.
  5. 24 ° C에 히터를 설정 하 고 거품의 부드러운 흐름을 생산 하기 위해 airstream 레 귤 레이 터를 조정 합니다.
  6. 물 온도 유지 하기 위해 탱크에 커버를 놓습니다.
    참고: 계란의 산란 시간 24 시간 이내 부 화를 시작 한다.

3. 보육 컨테이너 부 화 애벌레의 전송

  1. 소금 20 g 추가 8 L의 물고기 준비 물 (단계 1.1 참조) 하 고 해산 때까지 휘저어 ( 자료참조). 각 1.5 L 보육 컨테이너 채우기 (참조 자료) 준비 물 1 리터와 함께.
  2. 전송 피 펫을 사용 하 여 컨테이너 당 20 물고기의 조밀도에 준비 보육 용기에 부 화 애벌레를 이동.
    참고: 헤드 램프 부 화 애벌레를 전송 하는데 유용할 수 있습니다.
  3. 모든 보이는 부 화 애벌레가 제거 된 후, 교 반, 또는에 가장자리와 모서리 피펫으로와 탱크의 물 제트기를 부 여 탱크에 물을 교 반 하십시오.
    참고:이 첫 번째 패스에 놓친 애벌레를 공개 도움이 됩니다.
  4. 지침의는 사무실의 실험실 복지 (OLAW)를 사용 하 여이 단계에서 사용 하지 않는 애벌레 폐기. 6.15%의 최종 농도 달성 하기 위해 탱크에 염소를 추가 합니다. 싱크대를 내리고 전에 적어도 5 분 기다립니다.
  5. 레이블 날짜 및 수정 시간 각 보육 컨테이너. 보육 컨테이너를 매일 볼 하 고 모든 죽은 애벌레를 제거 하려면 계속.

4.의 Rotifer 기반 물고기 음식 준비

  1. Rotifers에 정보 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 설정, 유지, 수확 rotifers22을 참조 된 프로토콜을 따릅니다.
  2. 생선을 준비 해 조류 혼합의 3 mL를 추가 하 여 음식 ( 재료의 표참조) 수확된 rotifers의 1 l. 이 혼합물은 식량 공급으로 보육 용기에 직접 추가 됩니다.

5. 포스트 애벌레 물고기의 먹이

  1. 물고기 때 5 일 게시물 수정 (dpf), 각 보육 컨테이너 (4.2 단계에서 준비) 물고기 음식의 3 mL를 추가 합니다. 최적의 밀도에서 rotifers는 컨테이너의 중심에 보육 컨테이너의 모서리에 조밀한 그룹에 표시 하 고 덜 명백한 이어야 한다. 적절 한 밀도 도달할 때까지 추가 rotifer 혼합물을 추가 합니다.
  2. 매일 rotifers의 존재에 대 한 컨테이너를 확인 하 고 농도 고갈 되 면 더 추가. 어떤 죽은 애벌레를 제거를 계속 합니다.
  3. 물고기 14 dpf에 도달, 물 5 물고기/L의 조밀도에 반복 시스템에 맞게 탱크를 이동 합니다.
    참고: 포스트 애벌레 물고기를 살아 나 기의 수는이 시간에 기록할 수 있습니다.

6. 전체-마운트 Immunohistochemistry 후 애벌레 물고기의

  1. 붓는 보육 컨테이너는 나일론을 통해 물고기를 포함 하 여 24 시간에 대 한 음식에서 원하는 단계의 제거 후 애벌레 물고기 메쉬 스 트레이너 및 깨끗 한 생선 준비 물 컨테이너에는 스 트레이너를 배치 (단계 1.1 참조).
    참고: 모든 음식의 제거 필수적 이다. 도 적은 양의 음식에에서 자동 형광 고 이미징에 영향을 미칠 것 이다.
  2. 수집 하 고 물고기를 안락사.
    참고: 안락사 프로토콜 OLAW 지침을 따라야 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인을 받아야. 우리 tricaine 혼자 후 애벌레 물고기, 안락사 하지 않습니다 및 물고기는 물고기는 얼음에 또한 유지 되지 정착 액을 tricaine에서 전송 될 때 이동 하기 시작 지적 했다.
    1. 이온을 제거 된 물 1 l tricaine-S의 0.4 g, 나트륨 중 탄산염의 0.8 g을 추가 하 여 비 커에서 tricaine 솔루션을 준비 하 고 얼음에 그것을 배치.
    2. 물고기를 수집 하는 나일론 메쉬 스 트레이너를 통해 물고기를 포함 하는 물을 부 어. 부드럽게 차가운 Tricaine 솔루션에 스 트레이너를 잠수함과 10 분 동안 얼음에 그것을 두고.
  3. 안락사 물고기 수정.
    1. 잘라 팁 전송 피 펫을 사용 하 여 원뿔 관에 물고기를 전송.
    2. 전송 피 펫과 Tricaine 솔루션을 제거 하 고 정착 액을 바꿉니다. 락으로 품 어.
      참고: 정착 액 및 고정 시간 결정 되어야 합니다 사용 하는 항 체에 따라. 4 ° C에서 하룻밤 10% 포 르 말린 용액 (4% 포름알데히드, 참조 자료) 자료의 테이블에에서 나열 된 항 체에 대 한 적절 한입니다.
      주의: 포 르 말린은 유독 하 고 가연성. 개인 보호 장비 (장갑, 랩 코트, 그리고 스플래시 고글)을 착용 하 고 화학 후드에서 처리. 포 르 말린을 포함 하는 솔루션으로 유해 폐기물 처분 한다.
    3. 전송 피 펫을 사용 하 여 물고기를 방해 하지 않고는 정착 액을 조심 스럽게 제거. 3 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수-트리톤 솔루션 추가 [PBS와 0.1% 트리톤 (PBST), 참조 자료] 고 락을 함께 RT에서 15 분 동안 품 어.
    4. PBST를 제거 하 고 신선한 PBST 바꿉니다 "세척" 하나의 추가 시간 이것을 반복 하는 15 분 동안 품 어.
      참고: 물고기 몇 주 동안 4 ℃에서 0.02% 나트륨 아 지 드를 포함 하는 PBS에 저장할 수 있습니다.
  4. 전체-마운트 immunostaining를 수행 합니다.
    1. 차단 솔루션 [PB-0.5% 트리톤 X, 0.2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 1% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), 0.02% 나트륨 아 지 드, 5% 당나귀 세럼] 50ml를 준비 합니다.
      주의: 나트륨 아 지 드와 DMSO 독성이 있다. 개인 보호 장비 (장갑, 랩 코트, 그리고 스플래시 고글) 처리할 때 사용 되어야 한다. 어떤 솔루션으로 유해 폐기물 처분 한다.
    2. 전송 피 펫을 사용 하 여 나사 가기 모자 4 mL 유리 유리병에 물고기를 전송. PBST를 제거 하 고 차단 솔루션 3 mL를 추가 전송 피 펫을 사용 합니다. 락으로 RT에 1 시간에 품 어.
    3. 전송 피 펫을 사용 하 여 차단 솔루션을 제거 하 고 기본 항 체 희석 솔루션을 차단에 추가. 동요와 함께 실 온에서 하룻밤를 품 어.
      참고: 예를 들어, 추가 안티-HuC/HuD 신경 단백질 마우스 단일 클론 항 체의 1: 250 희석 ( A. mexicanus에서 성공적으로 사용 된 항 체의 목록에 대 한 재료의 표 참조). 추가 없이 1 차 항 체로 물고기의 세트는이 단계에 포함 되어야 합니다. 항 체의 양을 충분히 커버 물고기 동요에 대 한 허용 해야 합니다.
    4. 6.3.4 단계에서 설명한 대로 3 번 PBST 물고기를 세척. 이차 항 체 솔루션을 차단에 희석 된 PBST를 대체 하 고 동요와 RT에서 밤새 품 어.
      참고: 최적의 차 및 2 차 항 체 농도, 보육 시간, 및 부 화 온도 각 항 체에 대 한 결정 되어야 합니다. RT에서 하룻밤 재료의 테이블에에서 나열 된 항 체에 대 한 효과적 이었습니다.
    5. 3 번과 PBST, 각 세척 단계 6.3.4에서에서 설명 된 대로 15 분을 지속 물고기를 세척.
    6. 해 부와 함께 진행 하기 전에 단기 저장용 PBS에 물고기를 전송 설치, 또는 물고기를 단면.

Representative Results

표 1 표면 물고기와 정적 사육 탱크에 Tinaja, Molino, 및 Pachón cavefish를 번 식의 1 년 동안 성공을 보여준다. 표면 및 생산 항상 수정 된 배아와 Pachón 알 부 화 애벌레, Molino 및 Tinaja 실패 했다 몇 시간 동안 (2/6 및 2/18 이벤트 산란 부 화 애벌레, 각각 생성 하지 않았다). 부모 물고기의 나이 나타나지 않는 클러치 크기에서 변이 있다. 표 2 는 산란 이벤트의 일부와 부모 물고기의 나이에서 발생 하는 부 화 애벌레의 총 수를 보여 줍니다. 일반적으로, 우리 표면 물고기 애벌레 산란 당 가장 많은 생산을 발견 (1550 ± 894, n 평균 = 5), Pachón 뒤 (평균 879 ± 680, n = 6), Tinaja (평균 570 ± 373, n = 11), 및 Molino (평균 386 ± 276, n = 3). 애벌레 생성 수는 일반적으로 보다는 실험 또는 성인으로 성장에 대 한 더 많은입니다. 우리는 일반적으로 6-18 보육 컨테이너 (120-360 애벌레)를 설정 하 고 나머지 물고기를 안락사.

보육 프로토콜의 성공을 측정 하는 우리 부 화 애벌레와 성공적인 산란 이벤트에서 살아남은 후 애벌레 물고기의 수를 기록 했다. 표 3 탱크 재순환에 번 식의 1 달에서 데이터를 표시 하 고 애벌레 14 dpf에 살아남은 보육 컨테이너에 전송의 수를 포함 한다. 이 달 동안 생존 율 65-293 물고기 실험 또는 성인으로 성장에 대 한 인구 당 사용할 수 있는 결과 41-81%에서 배열 했다.

확인 하려면 전체 마운트 immunostaining 성공 하면, 우리는 샘플만 이차 항 체와 알을 품을 그 1 차적인 항 체를 incubated의 형광을 비교. 형광 신호는 1 차적인 항 체와 알을 품 어 볼 수만 있습니다. 우리는 성공적으로 두 표면에서 12.5 dpf까지 단계에서 신경10 (그림 1) 및 췌 장 세포6 라벨 morphotypes 동굴을이 프로토콜을 이용 했다.

Figure 1
그림 1: 신경 라벨. 전체-마운트의 immunostaining A. mexicanus. 이미지의 12.5 dpf 표면 (a) Pachón cavefish (b). [해치 노란색 개요에 표시 된 (a) 및 (b)] 중순 신체 영역의 이미지의 표면 (c) Pachón cavefish (d) 물 팬 신경 항 체 (후). (e) Confocal 영상 표면 생선 내장 보여주는 장 뉴런 (후)와 그들의 예측 (acetylated tubulin)의 지역. 이 이미지에 대 한 소장을 해 부 되었고 DAPI는 핵 얼룩을 포함 하는 매체에 탑재. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

인구 시도 이벤트를 산란 클러치
표면 94 23 23
몰리 노 110 6 4
Pachón 167 13 13
Tinaja 242 18 16

표 1: 번 식의 1 년에서 데이터의 요약 A. mexicanus 정적 탱크에. 번 식의 수, 이벤트, 산란 결과 고 산란 생산 이벤트의 숫자 애벌레 부 화.

인구 부모 나이 부 화 유 충
표면 1 년 989
표면 1 년 1050
표면 3 년 2214
표면 3 년 432
표면 3 년 1768
표면 4 년 2852
Pachón 1 년 1194
Pachón 1 년 1933
Pachón 1.5 년 371
Pachón 3 년 480
Pachón 4 년 1190
Pachón 4 년 110
Tinaja 9 개월 259
Tinaja 9 개월 253
Tinaja 10 개월 1100
Tinaja 11 개월 857
Tinaja 1 년 713
Tinaja 1 년 853
Tinaja 1 년 542
Tinaja 1.5 년 360
Tinaja 1.5 년 58
Tinaja 1.5 년 1100
Tinaja 4 년 185
몰리 노 2.5 년 460
몰리 노 2.5 년 619
몰리 노 3 년 81

표 2: 여성 나이 및 부 화 애벌레의 수의 표시 된 인구에서 개별 산란 이벤트에서 대략 A. mexicanus.

인구 시도 이벤트를 산란 클러치 클러치 크기 애벌레로 보육 컵 14dpf에서 후 애벌레 물고기 생존 (%)
표면 4 3 2 576 및 1728 360 174 48
몰리 노 4 2 1 228 159 65 41
Tinaja 4 1 1 1952 175 93 53
Pachón 4 1 1 1696 360 293 81

표 3: 재순환 시스템와 애벌레를 모금에 A. mexicanus 를 번 식의 한 달에서 데이터의 요약. 수 시도, 그 결과 번 식의 부 화 애벌레, 애벌레 클러치, 당 전송 보육 컨테이너 및 포스트 애벌레 물고기 14 일 후 보육 컨테이너에 존재 하는 애벌레의 평균 수를 생성 하는 클러치 이벤트, 산란.

Discussion

표면과 동굴 사이 유전자 활동을 비교 A. mexicanus 는 신중 하 게 통제 환경 변수와 메서드 연구소 간에 복제 될 수 있습니다 필요 합니다. A. mexicanus 양육에 대 한 우리의 프로토콜 후 애벌레 개발 하는 동안 일관 된 영양 콘텐츠를 제공 합니다. 이 먹이 정권 따라 유전자 함수는 선물이 강력한 immunohistochemistry 프로토콜을 사용 하 여 인구 사이 자신 있게 비교할 수 있습니다. 여기 우리가이 방법으로 그것의 한계와 미래 응용. 프로그램의 중요성을 토론

달성 하기 위해 밀도 일치 하는 성장, 우리는 포스트 애벌레 물고기 rotifers의 다이어트에 1.5 리터 용기에 2 주 동안 물 재순환 없이 발생 될 수 있습니다 발견. 이 프로토콜 반복 시스템;에 물고기를 사용할 수 있습니다. 그러나, rotifers는 그 탱크 유출 통해 손실 보상을 매일 추가 되어야 합니다. 새로 부 화 Artemia nauplii 양식, 음식 근원으로 일반적으로 사용 됩니다 하지만 우리는 rotifers를 사용 하 여 포함 하는 상당한 장점을 발견: 감소 가격, 향상 된 생물, 일관 된 영양, 그리고 더 나은 수 질 (아래 참조).

첫째, 소모품에 주간 비용 rotifers, Artemia14 달러에 비해 4 달러 이다. 생물에 관한 rotifers에서에서 발생 하는 제어 조건 하에서 실험실 Artemia 미생물에 자연적인 변이 및 야생에서 수집 하는 동안 또는 병원 체23목차. 또한, Artemia nauplii의 영양소 구성 환경 결정 하 고 따라서 일관성이 있습니다. Nauplii 해칭; 후에 그들의 자신의 에너지 스토어에서 번성 그들은 신속 하 게 개발 하 고 최적으로 먹여야 한다 물고기를 몇 시간 이내 영양 가치를 풀어. 부 화 후, 그들은 영양 농축 될 수; 처음으로 나타내는 12 집에서 먹이 Artemia 시작 그러나,이 단계에서 그들은 너무 커서 5 dpf 물고기 소비 되고있다. 비교에서는, rotifers는 지속적으로 높은 영양 콘텐츠는 rotifers는 수확 하는 때에 발생 하는 해양 미세에 피드. Rotifers는 Artmeia nauplii (160 400 미크론), 그들을 쉽게 캡처하고 삼키기 물고기 보다 훨씬 작습니다. 포스트 애벌레 표면 물고기와 cavefish 기본 설정 또는 rotifers10캡처 하는 능력에 차이가 제안 하는 유사한 수량에 rotifers를 소모 한다.

마지막으로, Artemia nauplii 시작 신선한 물에 소개 되 고 후 몇 시간을 죽어. Uneaten nauplii, 급속 하 게 감소 하는 수 질 수동으로 제거 하지 않는 경우 붕괴 것입니다. 죽은 Artemia 를 제거 하는 것은 어렵고 Artemia 보다 훨씬 더 큰 고 실수로 제거 되거나 손상 될 수 있습니다 후 애벌레 물고기에 대 한 위험. Rotifers 보육 컨테이너에서 무기한 라이브 하 고 수 질에 크게 영향을 주지 않고 모든 시간에 물고기 음식을 제공할 수 있습니다.

반면 음식 소스는 상당한 혜택 rotifer 재고, 조류를 유지 하기 위해 rotifers를 사용 하 여 추가 되어야 합니다 문화 시스템에 매일. 이 액체 조류 rotifer 문화 컨테이너로 dispenses 자동 급지대 달성 될 수 있다 ( 재료의 표참조). Rotifers 해야 합니다 또한 수확 될이 설정에서 24-48 시간 마다 문화의 건강을 유지 하기 위해. 물고기 아주 가끔 (일년에 한 번, 예를 들면)를 번 식과 포스트 애벌레 단계에서 인구 사이 비교와 관심을 하지 않습니다 연구자 encysted 태아는 언제 든 지 부 화 될 수 있기 때문 음식 소스로 Artemia 를 선호 수 있습니다.

해치 고 살아남은 애벌레 부 화와 성장 성공을 모니터링할 수를 추적 하는 것이 좋습니다. 대부분의 태아 또는 애벌레 죽으면, 그것은 세균 이나 곰 팡이 오염이 원인일 수 있습니다. 물고기 준비 물의 수 질을 모니터링 하 고 모든 장비 70% 에탄올으로 소독 하는 것이 좋습니다. 그들은 청소 하 고 소독 후 보육 컨테이너를 다시 사용할 수 있습니다. 질병의 위험을 최소화 하는 보육 컨테이너에서 죽은 물고기를 제거 하 고 생선을 먹고 시작 하지 5 dpf, 전에 rotifers를 추가 중요 한 이기도 합니다.

A. mexicanus 는 약 1 년 오래 된 성적으로 성숙한입니다. 이것은 유전자 변형 A. mexicanus Danio rerio (zebrafish) 10-12 주24번 식 수에 비해 생성에 대 한 제한 이다. Immunohistochemistry (IHC)는 유전자 발현 및 단백질 지 방화 조사 하는 대체 방법입니다. 여기에 설명 된 프로토콜 각 단계에서 적응 고 관심의 어떤 조직에서 항 원을 검출 하는 데 사용 될 수 있습니다. 그러나 그것은 일부 조직 비교 연구의 해석에 영향을 미칠 수 있는 염색 (unpigmented cavefish에 존재 하지 않는 장벽), 때문에 표면 물고기에 시각화 하기 더 어려울 수 있습니다,, 주의 해야 합니다. 이 문제를 해결 하려면 표면 물고기 안료 3% 과산화 수소를 사용 하 여 고정 후 표백 될 수 있다.

IHC는 성공적인 조직 고정, 차단, 그리고 항 체 침투 필요 합니다. 각 메서드는 조직 관심사의 단백질에 따라 다릅니다. 정착 액 및 고정 시간 항 epitope를 유지 하면서 셀 구조를 보존 해야 합니다. 이 프로토콜에 대 한 우리 상호 정착 액 (paraformaldehyde)를 사용 하 고 (예: 메탄올, 아세톤) 변성 정착 액을 생략. 우리는 아세톤에 외피 신경 및 췌 장 표시자에 대 한 항 체 신호 감소를 발견. 블로킹 단계 조직에 비 대상 단백질 바인딩에서 항 체를 방지 하기 위해 필수적입니다. 이 방법은 차단 솔루션에서 정상적인 혈 청 (5%)와 BSA (0.2%)의 조합을 사용합니다. 차단 솔루션 항 체 및 떨어지면서 일반적인 바인딩 1 차 및 이차 항 체의 조직에서 단백질에 반응 사이트에 바인딩되는 단백질에 포함 되어 있습니다.

항 체 침투를 달성 하기 위해 조직 permeabilized 해야 합니다. 이 세제 또는 변성 용 매와 달성 될 수 있다 하지만 항 epitope를 보존 하기 위해 최적화 해야 합니다. 우리의 프로토콜 트리톤과 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 조합을 사용합니다. 트리톤 DMSO 포함 됩니다 0.5%와 1%의 농도에서 차단 하 고 항 체 외피 단계 동안 각각. 이 농도 사용 하 여, 우리는 관찰에 뇌, 췌 장, 소장, 근육, 얼룩 모든 조직의 침투에 대 한 가능성이 효과적인 다는 것을 제안. 물고기 크기를 침투에 또한 영향을 미칠 수 있습니다. 이 프로토콜은 14 일 (길이 약 7 m m) 보다 큰 물고기에 테스트 되지. 얼룩 문제 해결, 고정, 차단, 그리고 항 체 침투 단계를 변경 하는 것이 좋습니다. 그것은 또한 사용 가능한 게놈25를 사용 하 여 관심사의 A. mexicanus 단백질으로는 immunogen의 순서 보존을 검사 하는 것이 중요.

A. mexicanus 으로 극적으로 다른 환경에서 진화 같은 종족의 인구는 실험실에서 직접 비교 될 수 있다 진화를 조사 하는 우수한 모델입니다. 표준 축산 프로토콜, 내과 연구소, 중 표면 물고기와 cavefish의 생물 학적 차이 이해 하는 데 필수적입니다. 우리의 문서 개발 및 일관 된 성장 매개 변수에 노출 후 애벌레 물고기의 유전자 활동을 검사 하는 방법을 제공 합니다.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 건강의 국가 학회 [HD089934, DK108495]에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methylene blue Kordon B016CBHZUS antifungal
heater Finnex 4711457836017 100W Digital Control Heater
airstone Lee's Aquarium & Pet Products 10838125202 disposable air stone
salt Instant Ocean 51378014021 Sea Salt
nursery container IPC 21545-002 40 oz or 1.5 L clear containers
transfer pipette VWR 414004-002 plastic bulb pipettes
compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers Reed Mariculture na fish food
RGcomplete APBreed 817656016572 32 oz bottle of rotifer food
Programmable Auto Dosing Pump DP-4 Jebao DP-4 automatic feeder for rotifers
Tricane-S Western Chemical MS 222 fish anesthetic
sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G for tricane solution
nylon mesh strainer HIC (Harold Import Co.) 735343476235 3-inch diameter
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L fixative
10X PBS Invitrogen AM9625 buffer, dilute to 1X using distilled water
Triton-x 100 Sigma-Aldrich T8787-250ML detergent
sodium azide Sigma-Aldrich S2002-25G anti-bacterial
bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-100G blocking reagent
glass vial with screw-top cap 4mL Wheaton 224742 staining vial
plastic mesh screen for breeding tank Pentair N1670 Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net.
vinyl-coated disk magnets Kjmagnets D84PC-AST
New Life Spectrum Thera-A pellet fish food New Life International na Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website
Antibodies
insulin antibody from guinea pig Dako A0564 1:200
glucagon antibody from sheep Abcam ab36215 1:200
acetylated tubulin antibody from mouse Sigma T6793 1:500
HuD/HuC antibody from mouse Life Technologies A-21271 1:500
nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit Abcam ab106417 5μg/mL
choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit Abcam ab178850 1:2000
seratonin (5HT) from rabbit Immunostar 20080 1:500

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References

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Post-larval 고기 분석 및 전체 마운트 Immunohistochemistry 멕시코 Tetra <em>Astyanax mexicanus</em> 를 높이
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Riddle, M., Martineau, B., Peavey, M., Tabin, C. Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (142), e58972, doi:10.3791/58972 (2018).More

Riddle, M., Martineau, B., Peavey, M., Tabin, C. Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (142), e58972, doi:10.3791/58972 (2018).

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