Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Adfærdsmæssige Test batteri til gentagne vurdering af motoriske færdigheder, humør og kognition i mus

Published: March 2, 2019 doi: 10.3791/58973
Automatic Translation
1,2,3, 3, 3
1Nanjing Key Laboratory of Pediatrics, Children's Hospital of Nanjing Medical University, 2Nanjing Key Laboratory of Pediatrics, Nanjing Medical University, 3Laboratory of Neurodegenerative Disease, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, Pokfulam, Hong Kong Special Administrative Region (HK SAR)

Summary

En omfattende adfærdsmæssige test batteri af motorik, humør – herunder social interaktion, depression og angst- og kognition er beregnet til gentagen vurdering af neurodegeneration-relaterede adfærdsmæssige ændringer i mus.

Abstract

Farmakologiske og toksikologiske undersøgelser i neurodegeneration kræver omfattende adfærdsanalyse i mus, fordi motor dysfunktioner og dysfunktioner i humør og kognition er almindelige og ofte fælles symptomer i neurodegenerative sygdomme. Vist her er et adfærdsmæssige test batteri til motor, humør og kognition, som gentagne gange kan testes i en langsgående undersøgelse. Dette batteri vurderer den samlede adfærdsmæssige fænotype i mus ved at undersøge hvert domæne adfærd med mindst to uafhængige godt anerkendte tests (dvs. åben-field test og rotarod test for motorik, sociale interaktion test, forhøjede plus maze test, og tvungne svømme test for emotionel funktion, og Morris vand maze test og roman objekt anerkendelse test for kognitiv funktion). Derfor, denne følsomme og omfattende test batteri er et kraftfuldt værktøj til studiet af adfærdsmæssige vekslen i neurodegeneration.

Introduction

Neurodegenerative sygdomme featured ødelæggende adfærdsmæssige symptomer, herunder kognitiv svækkelse, humør dysfunktioner som angst og depression eller motor dysfunktion1. Patogenesen af forskellige former for neurodegenerative sygdomme er uklart2. Akkumulerende undersøgelser tyder på, at genetiske og miljømæssige faktorer kan både bidrage til patogenesen af neurodegenerative sygdomme. At identificere risikofaktoren for neurodegeneration kræver adfærdsanalyse. Selv om hver type neurodegenerativ sygdom har sin underskrift adfærdsmæssige symptom (fx Alzheimers sygdom [AD] er featured med kognitiv svækkelse og Parkinsons sygdom [PD] med motor dysfunktion). Med progression af sygdommen manifestere patienterne komorbiditet af forskellige adfærdsmæssige abnormiteter3. For eksempel, viser AD patienter symptomer på humør dysfunktion i fremskredent stadium4,5. PD patienter kan udvikle sig til PD-relaterede demens og udvikle kognitiv forringelse6. Baseret på disse funktioner, er adfærdsanalyse i neurodegeneration modeller sædvanligvis omfattende og gentagne.

For at nå dette mål, var et batteri, der indeholder klassisk og udbredte adfærdsmæssige test med fremragende gyldighed designet til adfærdsmæssige analyser i motor, humør og kognition. Funktionen motor kan testes ved open-field test7,8 , og den accelererende rotarod test. Humør dysfunktion, herunder social dysfunktion, depression og angst, er hyppigst ses i neurodegenerative sygdomme5. Derfor indeholder dette batteri en social interaktion test for selskabelighed9, forhøjet plus maze test for angst10, og den tvungne svømme test for depression11. Kognitiv svækkelse er en af de mest karakteristiske symptomer i neurodegenerative sygdomme som AD og frontotemporal lobar demens12. Kognitive domæner, herunder korttidshukommelsen og episodisk hukommelse, er modtagelige for neurodegeneration13,14,15. Derfor, Morris vand maze test for fysisk læring og hukommelse16 og roman objekt anerkendelse test for kortsigtede hukommelse17 er inkluderet i batteriet. Disse tests er forenelige med hinanden. Rækkefølgen af prøverne var designet til at maksimere tilvænning og at minimere interferens, for at øge kompatibiliteten i batteriet. Da hver funktion er testet af mindst to uafhængige tests, der er forskellige i princip og metode, kan resultaterne af hver prøvning valideres yderligere. Derudover er protokoller af nogle tests fremhævet ved gentagne afprøvning, at lette den langsgående undersøgelse af udviklingen af neurodegenerative sygdomme. Derfor, denne adfærd test batteri undersøgelser forskellige underdomæner af adfærdsmæssige ændringer ses i forskellige stadier af neurodegeneration mens koster et minimalt antal dyr. Dette batteri har været brugt i en langsgående undersøgelse, som evalueres adfærdsændringer i unge voksne (3-måned-forhenværende) mandlige C57BL/6N mus efter respiratorisk eksponering for silica nanopartikler, en arbejdsskade, der er en potentiel risikofaktor i neurodegeneration18. Men andre stammer eller modeller, såsom alderen mus og genetisk manipulerede mus, kan opfører sig anderledes end unge C57BL/6N mus. Derfor kan forsigtighed være påkrævet ved brug af dette batteri i disse mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af Udvalget om brug af levende dyr i undervisning og forskning (CULATR), University of Hong Kong.

1. generel protokol

Bemærk: Dette afsnit er baseret på Deacon19.

  1. Adfærdsmæssige værelse setup
    1. Slippe af uafhængige stimulation/distraktion, herunder direkte lys på den eksperimentelle apparater, lugt, støj og andre irrelevant dyr, i adfærdsmæssige rum (som bør være omkring 10 m2 med justerbar belysning og, helst, har en forværelset).
      Bemærk: Da musen er et natdyr, belysning under 15 lux i open-field test, kunne roman objekt anerkendelse test og social interaktion test minimere interferens/stress fra lyset og hjælpe musen til at fokusere på testen.
    2. Indstille kameraet til video-optagelse mindst 1,5 m over gulvet, at sikre, at det er ude af syne for test musen.
  2. Boliger og tilvænning
    1. Gruppe-hus mus i en dyreenhed under observation (f.eks. opstaldning i grupper ikke mere end fire voksne mus).
      Bemærk: Her, 3-måned-forhenværende mandlige C57BL/6N mus blev brugt og har til huse i et 1144B bur. Udelukke syge, tilskadekomne eller alvorligt stresset mus. Oplevelser af sult, tørst, eller at blive mobbet kan påvirke ydeevnen af musen.
    2. Arrangere for de samme dyr handleren til at gennemføre alle de adfærdsmæssige test, for at mindske variabiliteten. Udføre transport, håndtering, og eksperimentere i løbet af lys cyklus fra 7:00 til 7:00. Hvis det er muligt, arrangere alle de andre håndtering, såsom administration af stof/toksin (fx intranasal instillation af silica nanopartikler) eller bur-rengøring, efter testen.
    3. Paralleldistributører bure med tilfældige tal til blinde eksperimentatoren før hvert forsøg. Habituate mus til den eksperimenterende miljø i den adfærdsmæssige plads til 15-30 min i deres hjem bure. Holde hjem bure i adfærdsmæssige rummet under hele forsøget.
    4. Før du starter eksperimentet, skal du sætte en nonexperimental C57BL/6N mus i apparatet, så den eksperimentelle betingelse for den første mus er det samme som resten. Derefter rengøre apparatet som følger: Fjern urin og afføring med en ren papirserviet, rense den eksperimentelle enhed med vand fra hanen, og derefter, dække lugt efterladt af musen ved at tørre apparatet med et stykke køkkenrulle let sprøjtes med 70% ethanol.
    5. For at minimere distraktion forårsaget af eksperimentatoren, spørge eksperimentatoren at forlade adfærdsmæssige mødelokalet under video optagelse, eller bo bag tæppet under Morris vand maze test.
  3. Adfærdsmæssige prøvningsarrangement
    1. Arrangere den adfærdsmæssige test i rækkefølgen, som vist i figur 1A. Planlæg at udføre testene fordelt ud af 24 timer, bortset fra forhøjet plus maze test.
      Bemærk: Da hele proceduren kræver op til 2 uger, forenkle batteriet ved at vælge blandt lignende test før ansøgning i en akut eller kortsigtede undersøgelse.
      Forsigtighed: 2 dages open-field test sikrer ordentlig tilvænning til nye objekt anerkendelse test. Test den tvungne svømme test sidste da det kan forårsage stress i C57BL/6N mus.

2. BehavioralTest protokol

  1. Open-field test8,18,19,20
    1. Udføre prøvning open-felt i en 60 cm (længde [L]) x 60 cm (bredde [W]) x 40 cm (højde [H]) uigennemsigtige hvid plast arena.
      Bemærk: Ved hjælp af flere arenaer kan øge gennemløbet af testen.
    2. Start kamera optagelse og forsigtigt sætte musen ud for midten af en mur af arena, står over for den samme mur. Optage opførsel af musen for 10 min før den returneres til burene. Ren apparatet, som beskrevet i trin 1.2.4.
      Bemærk: Startpunktet i open-field test kan også være centrum for arenaen. Være konsekvent blandt mus.
    3. Gentag, indtil alle mus slut protokollen. Modvægt den teste rækkefølge mellem grupper.
    4. Udføre en dataanalyse som følger.
      1. Opdele arena i fire firkanter af fire kvadrater (imaginære gitter) på computerskærmen. For at vurdere bevægeapparatet funktion, tælle antallet af linjer, der krydses af musen i arena19.
        Bemærk: Definitionen af "krydser en streg" er, når begge bagben lemmer krydse den. Denne definition gælder også for forhøjet plus maze test.
      2. Måle tiden i det centrale område som en indikator for angst. Det centrale område er de fire pladser i midten af arenaen.
        Bemærk: Yderligere parametre, såsom opdræt (begge front poter fra jorden, med front poter mod en væg eller stående), latenstid første bagud, og grooming og frysning angive emotionalitet af musen.
      3. Alternativt kan du bruge en tracking software, som beskrevet i detaljer af Seibenhener og Wooten8, til at måle den tilbagelagte hastighed og tidsforbrug i området center.
  2. Accelererende rotarod test18
    1. Udføre de 3 dages uddannelse af den accelererende rotarod før enhver behandling af narkotika eller toksin/modellering/udbrud af sygdom og afprøve den motoriske funktion for 1 dag, som planlagt i figur 1A.
      Bemærk: Musen modtager tre forsøg pr. dag under træningen og test. Hvert forsøg starter med rotation af stangen og slutter med dråbe af musen.
    2. Placer apparatet rotarod på bænken i den adfærdsmæssige værelse. Undgå direkte belysning til udstyr. Programmere udstyr som udgangspunkt i 4 rpm og accelerere til 40 rpm i 5 min.
    3. I hvert forsøg, sætte musen på den statiske rod, står væggen i maskinen. Starte enheden, når musen er afgjort. Stoppe enheden når musen falder og optage musen tidsforbrug på stangen. Straks gentage for en anden to forsøg før returnere musen tilbage til hjem buret.
    4. Gentag fremgangsmåden på de andre mus.
    5. Mål den gennemsnitlige tid brugt på stang af tre forsøg under testen for at vurdere motorik.
      Bemærk: Den gennemsnitlige tid på stangen under den tredje dag i uddannelse er baseline af motorik.
  3. Social interaktion test18
    1. For den sociale interaktion test, bruge en open-felt arena med to identiske gennemsigtig kamre (8 cm [L] x 6 cm [W] x 12 cm [H]) med huller på overfladen – og en roman mus (hjælper), som er et homoseksuelt juvenile conspecific, der har haft nogen tidligere kontakt med den emnet mus. Figur 1B viser ordningen af proceduren. Ren arenaen og kamre som beskrevet i trin 1.2.4.
      Bemærk: Roman musen kan ikke være en littermate eller bur kammerat emne musen. Det er opstaldes og sund. Habituate roman musen til den adfærdsmæssige plads til 15-30 min, som beskrevet i trin 1.2.3.
    2. Separat placere de to kamre i to modsatte vægge af arenaen. Introducere emnet musen ind i arenaen som beskrevet i trin 2.1.2 og er vist i figur 1B, for en 3 min udforskning. Returnere emne musen til burene og fjerne enhver urin eller afføring i arenaen.
    3. Sætte hjælperen i en af afdelingerne. Genindføre emnet musen til arena og optage i 3 min. bagefter, retur både mus til hver af deres egne hjem bure. Gentag procedurer med andre emne mus som beskrevet ovenfor.
      Bemærk: Modvægt til siden af hjælperen eller tilfældigt tildele det inden for gruppen.
    4. Fra videoen, vurdere den parameter, der beskriver sociale interaktion aktivitet af mus som thelper/tTom, hvilket betyder, at forholdet mellem tid interagere med helper kammer (thelper) og tomme en (tTom), eller bruge anerkendelse indeksere thelper/ (thelper + tTom).
      Bemærk: En interaktion mellem emne mus og kammer er defineret som når musens næse er inden for 2 cm af kammeret og peger mod det.
  4. Forhøjet plus labyrint test 10
    1. Gennemføre forhøjet plus labyrint test samme dag efter alle mus er testet i open-felttest. Ren apparatet, som beskrevet i trin 1.2.4.
      Bemærk: Konfiguration af forhøjet plus labyrint er et "+"-form. Det har to åbne arme (30 cm x 5 cm x 0,5 cm) over for hinanden og vinkelret på to lukkede arme (30 x 5 x 16 cm) med en center platform (5 cm x 5 cm x 0,5 cm). Labyrinten er forhøjet 40 cm fra jorden.
    2. Placer musen på krydset af åbne og lukkede arme, vender ud mod den åbne arm, der er modsat eksperimentatoren (figur 1 c). Optage funktionsmåden for 5 min før returnere musen til burene. Gentag indtil alle mus er testet.
      Bemærk: Ind i labyrinten med dens ansigt til åben arm kunne øge musens udforskning af den åbne arm.
    3. Måle den tid musen i de åbne arme (tåbne) og i de lukkede arme (tlukke) baseret på video: tåbne/tlukke angiver niveauet af angst.
  5. Tvungne svømme test11
    1. Den tvungne svømme test apparater er en cylindrisk tank, der er 30 cm høj og 20 cm i diameter. Fyld tanken op til 15 cm høj med postevand ved stuetemperatur (23-25 ° C).
      Bemærk: Brug frisk vand for hver mus.
    2. Starter videooptagelsen og forsigtigt sætte musen i vand, i midten af apparatet. Optag video i 6 min. inden du sætter musen tilbage i sit hjem bur under infrarødt lys.
      Bemærk: Lave ikke forstyrre musen ved at drukne det eller vride sin hale.
    3. Måle immobilitet tid i de sidste 5 min af den optagede video. Mobilitet betyder enhver bevægelser end dem, der kræves til at afbalancere kroppen og holde hovedet over vandet.
  6. Roman objekt anerkendelse test17,18
    1. Oprette nye objekt anerkendelse test skal medtages 2 dage af tilvænning, 1 dag af fortrolighed, og 1 i test (figur 1 d); hver session er 10 min pr. mus, og intersession interval er 24 h.
      Bemærk: Tilvænning ved hjælp af open-field test udføres som beskrevet i punkt 2.1. Musen interagerer med to identiske objekter (gamle objekter) i fortrolighed. I overhøre, musen interagerer med en af de gamle objekter og et nyt objekt, begge placeret i det samme sted som objekter i fortrolighed. Roman objekt anerkendelse test apparat indeholder en åben-felt arena og to sæt af objekter. Hvert sæt indeholder to identiske objekter (A og A og objekter B og B). Objekter A og B er ens i størrelse, men forskellig tekstur (glas/plast/papir), form (runde/cubic) og farver (lyse/mørke). Objekterne skal være lugt-fri og stor nok til musen til at udforske inden for 10 min. Den passende størrelse for voksne C57BL/6N mus er 8 cm høj og 5 cm bred/i diameter.
    2. Markere positioner for de to objekter i fortrolighed og test, som er 5 cm fra siden og 7 cm fra toppen af arenaen.
      Bemærk: Mark positionen på aftenen før fortrolighed at undgå lugten af markøren.
    3. I fortrolighed interagerer musen med ét sæt af identiske objekter. Ren arena og objekter som beskrevet i trin 1.2.4 før du placerer musen i arenaen, står over for i midten af væggen, som vist i figur 1 d. Rekord for 10 min før returnere musen til burene. Gentag, indtil alle mus er færdig og vende tilbage alle bure til en dyreenhed.
      Bemærk: Opveje de objekter, der bruges i fortrolighed inden for gruppen for at mindske bias (fx mus nr. 1 og 2 udforske objekter A og A, og mus nr. 3 og 4 udforske objekter B og B, og på denne måde, objektet roman er-B for mus nr. 1 og 2 og objektet A for mus nr. 3 og 4).
    4. Udføre test 24 h efter fortrolighed. Bruge samme procedure som fortrolige, medmindre erstatte et af objekterne med en fra et andet sæt (fig. 1 d). Gentag, indtil alle mus har udført testen og bagefter, returnere alle bure til en dyreenhed.
      Bemærk: Modvægt til siden af det nye objekt i gruppen for at mindske bias (fxintroducere mus nr. 1 og 3 til objekter A og B, og mus nr. 2 og 4 til objekter B og A). På denne måde viser objektet roman på højre side for mus nr. 1 og 4, og på venstre side for mus nr. 2 og 3. Her er til venstre i venstre side af eksperimentatoren når de står arenaen.
    5. Mål den tid, hver musen interagerer med det nye objekt (tnye) og det gamle objekt (tgamle) separat, fra video-optagelser i testfasen. En interaktion mellem dyret og objektet er beskrevet i noten følgende trin 2.3.4. Beregne hukommelsen af musen som præference til det nye objekt = tnye/tgamle; eller tnye/ (tnye + tgamle).
      Bemærk: tnye/tgamle svarer til 1 eller tnye/ (tnye + tgamle) er lig med 0,5 betyder musen har ingen præference for det nye objekt (dvs., hukommelse værdiforringelse). Den tid, interagere med objekter i fortrolighed kan tjene som en kontrol af eksperimentet. Den samlede tid angiver udforskning aktivitet af musen, og tvenstre/thøjre antyder rumlige bias.
  7. Morris vand maze test16
    1. Konfigurere apparatet som følger.
      1. Sætte vand-labyrint, en cirkulær pool (af 120 cm i diameter og 60 cm dyb), i midten af en adfærdsmæssige værelse, og Markér positionen af labyrinten for at sikre stillingen forbliver den samme under hele forsøget.
      2. Opdele labyrinten i fire lige store imaginære kvadranter. Hænge de visuelle stikord (fx, cirkel, firkant, trekant og pentagon) i midten af hver kvadrant, 130 cm over gulvet og 53 cm fra væggen i labyrinten.
        Bemærk: Labyrinten og cue skal bo i den samme position under hele testen, så musen kan danne nøjagtige rumlig hukommelse.
      3. Placer en platform 25 cm fra væggen, i midten af den fjerde kvadrant, og Markér positionen. Platform for musen er 10 cm i diameter.
        Bemærk: Placeringen og diameter af platformen bestemme vanskeligheden ved opgaven. Den nærmere det er på væggen i labyrinten, eller jo større platform, den lettere opgave.
      4. Fyld vand labyrint med vand (med en temperatur på 23-25 ° C, farvet til hvid og gjort uigennemsigtig af mælkepulver/mad kridtning pulver) indtil vandstanden er 1 cm højere end platformen. Bringe mus i den adfærdsmæssige plads til 15-30 min for tilvænning, som vist i trin 1.2.3 og tænde det infrarøde lys over bure, som vil blive brugt til at tørre mus.
        Bemærk: Omfatte toppen af platform med hvid klud og net, så musen kan nemt klatre op på den. Sørg for der er ingen direkte belysning over vandet.
    2. Gennemføre uddannelse fase som følger.
      1. Uddannelse fase tager 5 dage, fire forsøg pr. dag. Semi-tilfældigt arrangere udgangspunkterne hver dag som demonstreret i litteratur16. Denne indsats forhindrer mus fastsætte associativ hukommelse, som er den mest almindelige måde at "snyde" i testen.
      2. I begyndelsen af hvert forsøg starter videooptagelsen og forsigtigt sætte musen ind i labyrinten.
        Bemærk: Ikke slip musen ind i tanken eller sno halen, som kan forårsage ekstra stress og desorientering.
      3. Spørg eksperimentatoren at bo ude af syne af musen og vende tilbage for at tage musen tilbage til sit hjem bur når nogen af følgende sker: (i) musen ikke kan finde platformen inden for 60 s; (ii) mus finder platform inden for 60 s og forbliver på det for 10 s. Omstændighederne, (i), spørge eksperimentatoren at placere musen på platformen og lad det blive der for 10 s.
        Bemærk: Punkt (ii): musen med held beliggende platform.
      4. Stoppe videoen og sætte musen tilbage i burene under infrarødt lys.
        Bemærk: Opretholde den mus kropstemperatur er afgørende for deres præstationer, fordi hypotermi understreger mus og kan påvirke følgende test.
      5. Gentag denne procedure med en anden mus.
      6. Baseret på videoen, lokaliserer post undslippe latenstid, som er varigheden af perioden musen tilbringer i labyrinten, trænge ind i labyrinten indtil øjeblikket det held platformen. Hvis musen ikke kan finde den platform eller forbliver der for mindre end 10 s i 60 s, undslippe latency tæller som 60 s. Plot indlæringskurve mod uddannelsesdage med gennemsnitlige undslippe ventetid pr. dag.
        Bemærk: Undslippe latency omfatter ikke 10 s tilbringe på platformen.
    3. Udføre sonde fase som følger.
      1. På den sjette dag i Morris vand maze test, oprette apparatet som beskrevet i trin 2.7.1., tage et billede af labyrinten for at registrere placeringen af platformen, og derefter fjerne platformen fra tank.
      2. Starte videooptagelsen, og forsigtigt sætte musen ind i labyrinten i kvadrant diagonalt modsatte mål kvadrant.
      3. Spørg eksperimentatoren at bo ude af syne for musen under 1 minut videooptagelse. Bagefter, har eksperimentator tage musen ud af labyrinten og sætte det tilbage i burene.
      4. Brug billede taget henne ved skridt 2.7.3.1. som reference til at måle varigheden af enhver platform passage. Tid varighed musen forbliver i target kvadrant (tmål), efter videoen. Den samlede tid er ttotal. Måle præferencen hen til den indskyde kvadrant som tmål /tsamlede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne adfærdsmæssige test batteri var designet til omfattende og gyldig adfærdsmæssige analyse af motor, humør og kognition, der er berørt i neurodegeneration5. Vi har anvendt dette batteri for at studere de adfærdsmæssige ændringer i unge voksne C57BL/6N mus efter respiratorisk eksponering for silica nanopartikler til 1 måned og 2 måneder18. Resultaterne viste, at C57BL/6N mus udsættes for silica nanopartikler viste forskellige adfærdsmæssige ændringer efter forskellig eksponering gange18. Kort, resultater i åben-field test (figur 2A) og den accelererende rotarod test (figur 2B) viste at silica nanopartikler eksponering ikke påvirkede funktionen bevægeapparatet eller motor i mus, der angiver en fuld evne til varetagelse af de øvrige prøver. Social interaktion aktivitet var påvirket efter en 1 måned eksponering for silica nanopartikler (figur 2 c). I betragtning af angst eller depression vil også mindske selskabelighed, vi analyseret data af open-felttest, forhøjet plus maze test (figur 2DE), og den tvungne svømme test (figur 2F), som ikke angav nogen komorbiditet af angst eller depression på tidspunkt 1 måned. En 2 måneders udsættelse for silica nanopartikler resulterede i angst efter den resultater i forhøjet plus maze test (figur 2E). En lignende trend var vist i det centrale område varighed i open-field test (figur 2D). Kognitiv svækkelse blev også fundet i Morris vand maze test og roman objekt anerkendelse test efter en 2 måneders eksponering (figur 3). Det skal bemærkes, at protokollen var lidt anderledes i de to forsøg med Morris vand maze test. En ekstra lampe blev tilføjet i den anden retssag, så alle mus altid opholdt sig under lampen til at holde varmen. Derfor blev ingen nonperformer vist i den anden retssag, mens to ud af otte mus blev nonperformers i sonden test i den første retssag.

Vi justeret protokollen, således at de fleste af test i batteriet kan afprøves flere gange. Centrale er at opretholde motivation af testene. Tests som social interaktion test, Roman objekt anerkendelse test og forhøjede plus maze test er motiveret af nyhed (dvs, en roman juvenile helper, Roman objekter og en roman miljø, henholdsvis). Ved at fastholde nyhed i protokollen, de unge voksne C57BL/6N mus viste en ensartet ydelse når testet igen efter 1 måned. Ifølge vores oplysninger, når introduceret til to forskellige hjælpere i de to forsøg, mus konsekvent viste en præference større end ti gange til helper end til det tomme kammer i den sociale interaktion test (figur 4A). I romanen objekt anerkendelse test foretrak de normale mus konsekvent roman objektet til det gamle objekt (figur 4B). Men i forhøjet plus maze test, når testet igen i det samme miljø efter 1 måned, udforskning faldt af halv (figur 4 c)10. Teoretisk, unge voksne C57BL/6 mus kan afprøves flere gange i disse tests så længe den eksperimentelle tilstand, herunder nyhed og status for mus, forbliver den samme. Vi har gentaget disse prøver hver måned for op til tre gange i vores laboratorium. Bemærkelsesværdigt, Morris vand maze test kan ikke testes gentagne gange i den samme gruppe af unge voksne C57BL/6N mus som oplevelsen betydeligt forstyrrer ydeevne når gentagne gange testet. Ifølge vores oplysninger huskede musene stadig platformen selv efter 1 måned, viser korrekt og langsigtede rumlig hukommelse. Når du ændrer placeringen af platformen, lærte de erfarne mus hurtigere end naiv mus, som de havde lært de regler og søgende strategi fra den forudgående uddannelse (figur 4D).

Figure 1
Figur 1: skemaer. (A) Arrangement af de adfærdsmæssige teste batteriet og skematiske observationsområderne (B) den sociale interaktion test, (C) forhøjet plus labyrint-test, og (D) roman objekt anerkendelse test. Forkortelser: R = accelererende rotarod test; AF = open-field test; EPM = forhøjet plus labyrint-test. Heller ikke = roman objekt anerkendelse test; SI = social interaktion test; MWM = Morris vand maze test; FST = tvungen svømning test. Udgangspunktet for mus i testen er vist med musen i ordningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: ændringer i motor og humør i mus udsættes for silica nanopartikler i 1 måned eller 2 måneder, opdaget af adfærdsmæssige test batteri. Mus blev testet i (A og D) open field testen, (B) rotarod test, (C) den sociale interaktion test, (E) forhøjet plus maze test, og (F) den tvungne svømme test består i batteriet. N = 8, 12 eller 20, hvilket betyder, at hver gruppe havde 8, 12 eller 20 mus, henholdsvis, som påvist i hver figur. N = 17-20 betyder hver gruppe havde 20 mus, bortset fra en kontrolgruppe på 1 måned, som bestod af 17 mus. I paneler A, Dog E, data blev først normaliseret til kontrol på hvert tidspunkt og derefter, blev analyseret med tosidede Student's t-test. Data i panelet B blev analyseret af gentagne foranstaltninger to-vejs ANOVA. Dataene i paneler C og F blev analyseret med tosidede Student's t-test. Alle data er vist som betyde ±S.E.M. * og *** betyder p < 0,05 og 0,0001, henholdsvis. Disse data er blevet udgivet tidligere af dem et al.18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: ændringer i kognition efter at være udsat for silica nanopartikler i 1 måned eller 2 måneder. Ændringer i de mus kognition efter at være udsat for silica nanopartikler for (A) 1 måned eller (E) 2 måneder, opdaget af roman objekt anerkendelse test. Ændringer i de mus kognition efter at være udsat for silica nanopartikler til (B - D) 1 måned eller (F - H) 2 måneder, opdaget af Morris vand maze test. Mus blev gentagne gange testet i romanen objekt anerkendelse test. En anden batch af mus blev testet i Morris vand maze test på forskellige tidspunkter. N = 6, 8, 12 eller 20, hvilket betyder, at hver gruppe havde 6, 8, 12 eller 20 mus, henholdsvis, som påvist i hver figur. I paneler A, C, D, E, Gog H, data blev analyseret med tosidede Student's t-test. Dataene i paneler B og F blev analyseret af gentagne foranstaltninger to-vejs ANOVA. Alle data er vist som betyde ±S.E.M. * betyder p < 0,05. Disse data er blevet udgivet tidligere af dem et al.18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: repræsentative data i tests. Repræsentative data i forsøg, herunder (A) den sociale interaktion test, (B) roman objekt anerkendelse test og (C) forhøjet plus maze test, testet i naive mus (prøve 1) og gentagne gange testet i det samme parti af mus (forsøg 2) . (D) repræsentative data af Morris vand maze test når gentagne gange testet. Dette tal er blevet ændret fra dig et al.18. Alle data er vist som betyde ±S.E.M. og analyseret med uparret Student's t-test. P < 0,001, i forhold til retssag 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Adfærdsmæssige analyse af mus er kritisk for neurodegeneration forskning. Mens kognitiv funktion er ofte den mest modtagelige adfærd påvirkes i neurodegenerative sygdomme, er humør dysfunktion, depression og angst, ofte komorbide. Derudover påvirker motorik ofte fortolkningen af resultaterne i nogle tests, såsom roman objekt anerkendelse test, forhøjet plus maze test og social interaktion test. Baseret på disse tanker, er en omfattende adfærdsmæssige test batteri påkrævet for en samlet og præcis vurdering af adfærd.

Det første skridt er at vælge de rigtige test. Vi indgår godt accepteret og klassisk tests, nemlig open-field test og rotarod test for motorik, forhøjet plus maze test for angst, den tvungne svømme test for depression, den sociale interaktion test for selskabelighed og Morris vand labyrint test og roman objekt anerkendelse test for kognition. Der er tre klassiske test for angst, nemlig open-field test, forhøjet plus test, og den mørke/lys boks test. Disse prøver alle udnytte konflikten mellem den medfødte nysgerrighed om romanen miljøet og aversion til feltet åben, forhøjet eller smukt illumineret. Derfor, mus er ikke betinget af skadelige stimuli, såsom elektrisk stød, predator lugt og så videre. Men rigelige undersøgelser har vist, at disse tests har dårlig intertest pålidelighed, selv inden for et enkelt laboratorium21. Vi brugte open-field test og forhøjet plus maze test til at analysere angst i mus i kortest mulig tid. Open-field test undersøger angst-lignende adfærd ud over bevægeapparatet funktion og er også tilvænning til nye objekt anerkendelse test og social interaktion test. Vi valgte den forhøjede plus labyrint test, fordi det er en veletableret paradigme. Det har fremragende ansigt gyldighed (fænomenologisk ligheden mellem adfærd i mus og symptomer hos patienter), konstruere gyldighed (graden som testen afspejler de underliggende teoretiske antagelser), og forudsigende gyldighed (nøjagtigheden af overhøre resultater når oversætte dem til mennesker)10. Hvis angst var prioriteten, overveje forskere herunder boksen mørk/lys test og grundigt analysere adfærd i disse test med flere parametre, såsom opdræt frekvens, stretch-deltage i opførsel, og afføring21. For det andet, resultaterne af disse test kan være let fortolkes fordi motiver af forsøgene er klar, som er enten den medfødte nysgerrighed til nyhed eller vand, til at udføre en simpel opgave i en kontrollerbar tilstand. I modsætning til sult og pretraining, hvilket kan medføre forskellige niveauer af motivation i mus, er disse typer af motivation stærk nok til de fleste af C57 musen til at udføre opgaven. For det tredje, disse tests har en god kompatibilitet med hinanden, fordi motivation ikke er alt for stressende at forårsage langsigtede eller endda permanent stress, såsom elektrisk stød eller mad/vand afsavn kan forårsage. Fortvivlelse test, herunder den tvungne svømme test og suspensionsprøvning hale udnytte det princip, at musen giver op kæmper når fanget i en desperat miljø. Ved at måle den "fortvivlelse tid", fortælle testene hvordan deprimeret musen er. C57BL/6N mus normalt vise 180 s af immobilitet ud af 300 s i disse tests11,22. Vi valgte den tvungne svømme test over halen suspension test, fordi det er forholdsvis mindre stressende når musen har erfaring i vand labyrint uddannelse. På denne måde, de er tilpasset til vand og kende hvor hen til forhindre hypotermi efter at blive våd. Derimod observeret vi ca. 2 g af kroppen vægttab natten efter suspensionsprøvning hale med angivelse af stor stress. Ikke desto mindre gentagne afprøvning af den tvungne svømme test bør gøres forsigtigt, og musene savn hen til genoprette længere end 24 timer før nogen yderligere eksperimenter/ofre. Alternativt, forskere kan overveje at medtage en saccharose præference test, et paradigme, flittigt brugt i stress-induceret depression-lignende irritabilitet, i batteriet. Denne test-protokollen kræver imidlertid dage af tilvænning til individuelle boliger23, hvilket kan være en stimulans, der påvirker resultatet af andre tests. Endelig gjort prøverne her have rimelig overførselshastighed. Alle prøver kan afslutte inden for 10 min/mus. Når øge mængden af udstyr, såsom open-felt arena, kanaler i rotarod testen, tanke i den tvungne svømme test, og banerne i suspensionsprøvning hale kan overførselshastigheden også øges. Selv om Morris vand maze test gør det vanskeligt at teste flere mus på samme tid, tager hver prøveversion kun ~ 60-75 s.

Den mest kritiske bekymring mens anvendelse adfærdsmæssige test batteri er indblanding blandt prøverne og stress fra hyppige håndtering. De negative virkninger af disse spørgsmål kan minimeres ved yderligere optimering af ordren og interval af test. Mens det er sund fornuft, at rækkefølgen af de adfærdsmæssige test bør være fra mindst til den mest stressende at musen, nogle tests i dette batteri kan bruges som akklimatisering til følgende test og forbedre stabiliteten i udførelsen. For eksempel udfører forhøjet plus maze test efter open-felttest øger udforskning af åbne arm10. Desuden, når musene er testet i størrelsesordenen open-field test, Roman objekt anerkendelse test og social interaktion test, de gradvist habituate til miljøet og opgave, herunder de adfærdsmæssige værelse, friland og objekter. Dermed er musene usandsynligt at manifestere neophobia7,24,25, som betyder viser en usædvanlig lav interaktion med det nye objekt/individuel, og er alle tilstrækkeligt fokuseret på opgaven. Denne ordning falder udsving i data af tests, der er motiveret af medfødte nysgerrighed. Morris vand maze test og den tvungne svømme test har en stærkere motivation. Derfor, musene er usandsynligt, at blive påvirket af oplevelsen af testene. Hyppige transport og håndtering under hele proceduren er en anden stress kilde, og det kræver ordentlig animalske håndtering og tilstrækkelig tilvænning. Det anbefales, at den test interval i batteriet skal være mindst 24 timer, så musene kan inddrive fra stress af disse stressfaktorer26,27,28. Men der er andre undersøgelser, der testede mus i flere prøver pr. dag29.

En anden bekymring over de gentagne afprøvning af opførsel er påvirkning af de tidligere erfaringer. Open-field test og accelererende rotarod testen kan bruges flere gange i motorik analyse. Nyhed-motiveret forsøg, herunder forhøjet plus maze test, Roman objekt anerkendelse test og test social interaktion kan udnyttes flere gange når motivationen er romanen i hvert forsøg, hvilket betyder en ny eksperimenterende miljø, par af objekter , eller hjælperen, henholdsvis. Som vist i den repræsentative data, kan ikke C57BL/6N mus trænes flere gange i den klassiske protokol af Morris vand maze test som de huskede den søgende strategi fra erfaring.

Dette batteri vurderer flere domæner af adfærd. På denne måde, kan resultaterne i nogle tests være en reference til data fortolkning af andre. I de repræsentative data i figur 1, når musene udsat for silica nanopartikler i 1 måned viste en reduktion i den sociale interaktion aktivitet, kunne det være Fænotypen af depression eller angst eller konsekvens af et underskud på motorik. Resultaterne af de motoriske funktion og angst test viste dog, at faldet i social interaktion var primær, ikke efterfølgende. Også, dette batteri indeholder forskellige tests for det samme domæne af adfærd, med forskellig følsomhed og skik. Ensartede tendens/resultater i disse test øge pålideligheden af batteriet. Men denne ordning tager ekstra tid for hele proceduren. Den kortsigtede eksperiment, der tager mindre end 1 måned skal bruge en forenklet version af dette batteri.

Denne adfærdsmæssige test batteri er designet til at screene adfærdsmæssige fænotype vist i forskellige faser efter eksponering for den genetiske eller miljømæssige risikofaktor for neurodegeneration. Denne protokol viser derfor kun de væsentlige udlæsninger hver test. Det er bemærkelsesværdigt, at hver adfærdsmæssige test kan give masser af oplysninger; Derfor kan brugeren udvide protokol til yderligere undersøgelse. For eksempel, afslører spontane aktivitet såsom grooming, opdræt, afføring og thigmotaxis i feltet åben emotionalitet8. Disse adfærd træk i forhøjet plus maze test kan også være indikatorer for angst10,21. Rotarod test undersøgelser motordrevne læring musene er uddannet efter modellering/sygdom udbrud/eksponering for miljømæssige risikofaktorer30. Den sociale interaktion test kan også studere sociale hukommelse ved at indføre en anden roman hjælper efter selskabelighed test9. Derfor, udvidelse af batteriet kan tilpasses til at passe forskellige prioriteter for undersøgelse. Men dette batteri er kun blevet testet i unge voksne C57BL/6N mus på grund af tidsbegrænsninger. Baseline udførelsen af andre stammer eller alderen C57BL/6 mus kan være forskellige. Derudover kan transgene neurodegenerative mus modeller udviser adfærdsmæssige underskud som hypo- eller hyperaktivitet. Derfor kan de ikke være egnet til forsøg med en lav motivation, som romanen objekt anerkendelse test. Yderligere bør optimering derfor kræves for adfærdsmæssige vurdering af disse mus.

Afslutningsvis, giver dette batteri en overbevisende og omfattende adfærdsmæssige analyse af neurodegeneration i C57 mus stamme. Det er mest velegnet til neurodegeneration-relaterede longitudinelle studier af toksiciteten af potentielle risikofaktorer/nervegift eller udvikling af lægemidler, som ofte har langsigtede administration og gentagne test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke Dr. Cora SW Lai fra skolen af biomedicinske videnskaber, universitetet i Hong Kong, for udlån forhøjet plus maze test og afdeling Anesthesiology fra Universitet i Hong Kong for udlån rotarod test apparater.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
chambers in social interaction test home made (8 cm (L) x 6 cm (W) x 12 cm (H)), transparant with holes, plastic
cylindrical tanks used in forced swimming test home made 30 cm height, 20 cm diameters, glass
elevated plus maze home made open arms (30 cm x 5 cm x 0.5 cm) ,closed arms (30 cm x 5 cm x 16 cm), center platform (5 cm x 5 cm x 0.5 cm), 40 cm tall. Plastic, nontransparant
IITC Roto-Rod Apparatus IITC life science Inc. 755, series 8
open field arena home made 60 cm (L) x 60 cm (W) x 40 cm (H), plastic, nontransparant
water maze home made 120 cm in diameter, 60 cm deep, steel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baquero, M., Martin, N. Depressive symptoms in neurodegenerative diseases. World Journal of Clinical Cases. 3 (8), 682-693 (2015).
  2. Brown, R. C., Lockwood, A. H., Sonawane, B. R. Neurodegenerative Diseases: An Overview of Environmental Risk Factors. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1250-1256 (2005).
  3. Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. Molecular pathways to neurodegeneration. Nature Medicine. 10, S2-S9 (2004).
  4. Cummings, J. L., Diaz, C., Levy, M., Binetti, G., Litvan, I. I. Neuropsychiatric Syndromes in Neurodegenerative Disease: Frequency and Signficance. Seminars in Clinical Neuropsychiatry. 1 (4), 241-247 (1996).
  5. Levenson, R. W., Sturm, V. E., Haase, C. M. Emotional and behavioral symptoms in neurodegenerative disease: a model for studying the neural bases of psychopathology. Annual Review of Clinical Psychology. 10, 581-606 (2014).
  6. Kehagia, A. A., Barker, R. A., Robbins, T. W. Neuropsychological and clinical heterogeneity of cognitive impairment and dementia in patients with Parkinson's disease. Lancet Neurology. 9 (12), 1200-1213 (2010).
  7. Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. The Open Field Test. Mood and Anxiety Related Phenotypes in Mice. Gould, T. D. , Humana Press. Totowa, NJ. 1-20 (2009).
  8. Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the Open Field Maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. Journal of Visualized Experiments. (96), e52434 (2015).
  9. Kaidanovich-Beilin, O., Lipina, T., Vukobradovic, I., Roder, J., Woodgett, J. R. Assessment of social interaction behaviors. Journal of Visualized Experiments. (48), e2473 (2011).
  10. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
  11. Can, A., et al. The mouse forced swim test. Journal of Visualized Experiments. (59), e3638 (2012).
  12. Veerappan, C. S., Sleiman, S., Coppola, G. Epigenetics of Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Neurotherapeutics. 10 (4), 709-721 (2013).
  13. Kirova, A. M., Bays, R. B., Lagalwar, S. Working memory and executive function decline across normal aging, mild cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Biomed Research International. 2015, 748212 (2015).
  14. Draganski, B., Lutti, A., Kherif, F. Impact of brain aging and neurodegeneration on cognition: evidence from MRI. Current Opinion in Neurology. 26 (6), 640-645 (2013).
  15. Schliebs, R., Arendt, T. The cholinergic system in aging and neuronal degeneration. Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).
  16. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
  17. Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8 (12), 2531-2537 (2013).
  18. You, R., et al. Silica nanoparticles induce neurodegeneration-like changes in behavior, neuropathology, and affect synapse through MAPK activation. Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 28 (2018).
  19. Housing Deacon, R. M. husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936-946 (2006).
  20. Poon, D. C., et al. PKR deficiency alters E. coli-induced sickness behaviors but does not exacerbate neuroimmune responses or bacterial load. Journal of Neuroinflammation. 12, 212 (2015).
  21. O'Leary, T. P., Gunn, R. K., Brown, R. E. What are we measuring when we test strain differences in anxiety in mice? Behavior Genetics. 43 (1), 34-50 (2013).
  22. Can, A., et al. The tail suspension test. Journal of Visualized Experiments. (59), e3769 (2012).
  23. Angoa-Perez, M., et al. Mice genetically depleted of brain serotonin do not display a depression-like behavioral phenotype. ACS Chemical Neuroscience. 5 (10), 908-919 (2014).
  24. Blazquez, G., Canete, T., Tobena, A., Gimenez-Llort, L., Fernandez-Teruel, A. Cognitive and emotional profiles of aged Alzheimer's disease (3xTgAD) mice: effects of environmental enrichment and sexual dimorphism. Behavioural Brain Research. 268, 185-201 (2014).
  25. Gimenez-Llort, L., et al. Modeling behavioral and neuronal symptoms of Alzheimer's disease in mice: a role for intraneuronal amyloid. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 31 (1), 125-147 (2007).
  26. Lad, H. V., et al. Behavioural battery testing: evaluation and behavioural outcomes in 8 inbred mouse strains. Physiology & Behavior. 99 (3), 301-316 (2010).
  27. Powell, T. R., Fernandes, C., Schalkwyk, L. C. Depression-Related Behavioral Tests. Current Protocols in Mouse Biology. 2 (2), 119-127 (2012).
  28. Paylor, R., Spencer, C. M., Yuva-Paylor, L. A., Pieke-Dahl, S. The use of behavioral test batteries, II: effect of test interval. Physiology & Behavior. 87 (1), 95-102 (2006).
  29. Lee, K. M., Coehlo, M., McGregor, H. A., Waltermire, R. S., Szumlinski, K. K. Binge alcohol drinking elicits persistent negative affect in mice. Behavioural Brain Research. 291, 385-398 (2015).
  30. Shiotsuki, H., et al. A rotarod test for evaluation of motor skill learning. Journal of Neuroscience Methods. 189 (2), 180-185 (2010).

Tags

Adfærd sag 145 Neurodegeneration motoriske sociale interaktion angst depression kognition
Adfærdsmæssige Test batteri til gentagne vurdering af motoriske færdigheder, humør og kognition i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

You, R., Liu, Y., Chang, R. C. C. A… More

You, R., Liu, Y., Chang, R. C. C. A Behavioral Test Battery for the Repeated Assessment of Motor Skills, Mood, and Cognition in Mice. J. Vis. Exp. (145), e58973, doi:10.3791/58973 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter