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Behavior

Uma bateria de testes comportamentais para a avaliação repetida das habilidades motoras, humor e cognição em ratos

Published: March 2, 2019 doi: 10.3791/58973
Automatic Translation
1,2,3, 3, 3
1Nanjing Key Laboratory of Pediatrics, Children's Hospital of Nanjing Medical University, 2Nanjing Key Laboratory of Pediatrics, Nanjing Medical University, 3Laboratory of Neurodegenerative Disease, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, Pokfulam, Hong Kong Special Administrative Region (HK SAR)

Summary

Uma bateria de testes comportamentais abrangente das habilidades motoras, humor — incluindo a interação social, depressão e ansiedade — e cognição destina-se a avaliação repetida das alterações comportamentais relacionadas à neurodegeneração em camundongos.

Abstract

Estudos farmacológicos e toxicológicos na neurodegeneração exigem abrangente análise comportamental em ratos porque disfunções motor e disfunções de humor e cognição são comuns e compartilhado muitas vezes sintomas em doenças neurodegenerativas. Mostrado aqui é uma bateria de testes comportamentais para motor, humor e cognição, que pode ser testada repetidamente em um estudo longitudinal. Esta bateria avalia o fenótipo comportamental em geral em ratos, examinando cada domínio de comportamento pelo menos dois testes bem aceitas independentes (ou seja, teste de campo aberto e rotarod teste para a função motora, teste de interação social, elevados além de teste de labirinto, e teste de natação forçada para função emocional e teste de labirinto de água de Morris e teste de reconhecimento de objeto romance para função cognitiva). Portanto, esta bateria de teste sensível e abrangente é uma poderosa ferramenta para o estudo da alternância comportamental na neurodegeneração.

Introduction

Doenças neurodegenerativas destaque devastadoras comportamentais sintomas, incluindo comprometimento cognitivo, disfunções de humor, como ansiedade e depressão ou disfunção motora1. A patogênese dos vários tipos de doenças neurodegenerativas é claro2. Acumulativos estudos indicam que fatores genéticos e ambientais podem tanto contribuir para a patogênese de doenças neurodegenerativas. Identificar o fator de risco de neurodegeneração requer análise comportamental. Embora cada tipo de doença neurodegenerativa tem seu sintoma comportamental de assinatura (por exemplo, a doença de Alzheimer [AD] é caracterizada com comprometimento cognitivo e a doença de Parkinson [PD] com disfunção motora). Com a progressão da doença, os pacientes manifestam comorbidade de anormalidades comportamentais diferentes3. Por exemplo, pacientes apresentam sintomas de disfunção do humor no estágio avançado4,5. Pacientes com DP podem progredir em demência PD-relacionados e desenvolver comprometimento cognitivo6. Baseado sobre esses recursos, a análise comportamental na neurodegeneração modelos geralmente é abrangente e repetidas.

Para atingir este objetivo, uma bateria que contém testes comportamentais clássicos e amplamente utilizados com excelente validade foi projetada para análises comportamentais no motor, humor e cognição. A função motora pode ser testada pelo teste de campo aberto7,8 e o teste de rotarod a aceleração. Disfunção do humor, incluindo disfunção social, depressão e ansiedade, são mais comumente vistos em de doenças neurodegenerativas5. Portanto, esta bateria inclui um teste de interação social para sociabilidade9, a elevada mais teste de labirinto para ansiedade10e o teste de natação forçada para depressão11. Comprometimento cognitivo é um dos sintomas mais característicos em doenças neurodegenerativas, como AD e de demência lobar frontotemporal12. Domínios cognitivos, incluindo a curto prazo e a memória episódica, são suscetíveis a neurodegeneração13,14,15. Portanto, o teste de labirinto de Morris água para aprendizagem espacial e memória de16 e o teste de reconhecimento de objeto romance para curto prazo memória17 estão incluídos na bateria. Estes testes são compatíveis uns com os outros. A ordem dos testes foi projetada para maximizar a habituação e a minimizar as interferências, para aumentar ainda mais a compatibilidade dentro da bateria. Desde que cada função é testada pelo menos dois testes independentes que são diferentes em princípio e método, os resultados de cada teste podem ser validados ainda mais. Além disso, os protocolos de alguns testes são destacados para testes repetidos, facilitando o estudo longitudinal do desenvolvimento de doenças neurodegenerativas. Portanto, esta bateria de testes de comportamento estuda diferentes subdomínios de mudanças de comportamento vistos em vários estágios de neurodegeneração enquanto custando um número mínimo de animais. Esta bateria tem sido utilizada em um estudo longitudinal que avaliou as alterações comportamentais em jovens adultos (3 meses) masculino C57BL/6N os ratos após exposição respiratória de nanopartículas de sílica, que é um factor de risco potencial de ofício Neurodegeneração18. No entanto, cepas ou outros modelos, tais como idade ratos e manipulado geneticamente ratos, podem se comportar de forma diferente de jovens camundongos C57BL/6N. Portanto, cuidado pode ser exigido ao usar esta bateria nestes ratos.

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Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comité sobre o uso de animais vivos no ensino e pesquisa (CULATR), Universidade de Hong Kong.

1. geral protocolo

Nota: Esta seção baseia-se diácono19.

  1. Instalação de sala comportamental
    1. Livrar-se da estimulação/distração independente, incluindo luz direta no aparato experimental, odor, barulho e outros animais irrelevantes, na sala comportamental (que deve ser cerca de 10 m2 com ajustável iluminação e, de preferência, ter uma antecâmara).
      Nota: Desde que o rato é um animal noturno, iluminação abaixo dos 15 lux no teste de campo aberto, romance objeto reconhecimento e teste de interação social poderiam minimizar o stress/interferência da luz e ajudar o mouse para focar o teste.
    2. Configurar a câmera para pelo menos 1,5 m acima do piso, garantindo que é fora do alcance do mouse teste de gravação de vídeo.
  2. Habitação e habituação
    1. Grupo-casa os ratos em uma unidade animal sob observação (por exemplo, Alojamento em grupo não mais que quatro ratos adultos).
      Nota: Aqui, utilizaram-se camundongos C57BL/6N machos de 3 meses de idade e alojados em uma gaiola de 1144B. Descarta os ratos doentes, feridos ou severamente estressados. Experiências de fome, sede ou bullying podem afetar o desempenho do mouse.
    2. Providencie o mesmo manipulador de animais realizar todos os testes comportamentais, para diminuir a variabilidade. Realizar o transporte, manuseio e experimentar durante o ciclo de luz de 07:00 a 19:00 Se possível, organize todas as outras manipulações, tais como a administração de qualquer droga/toxina (por exemplo, a instilação intranasal de nanopartículas de sílica) ou limpeza de gaiola, depois do teste.
    3. Reclassificar as gaiolas com números aleatórios para cegar o experimentador antes de cada experimento. Se habituar os ratos no ambiente experimental no quarto comportamental por 15 a 30 min em suas gaiolas para casa. Manter as gaiolas em casa no quarto comportamental durante todo o experimento.
    4. Antes de iniciar o experimento, coloca um rato C57BL/6N nonexperimental no aparelho, para que a condição experimental para o primeiro mouse é o mesmo que o resto. Em seguida, limpar o aparelho da seguinte forma: remover a urina e fezes com uma toalha de papel limpo, limpar o dispositivo experimental com água da torneira e em seguida, cobrir o odor deixado pelo mouse por limpar o aparelho com uma toalha de papel levemente pulverizada com etanol a 70%.
    5. Para minimizar a distração causada pelo experimentador, pedir o experimentador para sair da sala comportamental durante a gravação de vídeo, ou ficar atrás da cortina, durante o teste de labirinto de água de Morris.
  3. Arranjo do teste comportamental
    1. Providenciar o teste comportamental na ordem, como mostrado na figura 1A. Plano para a realização de testes espaçados por 24 h, com excepção da elevada além de teste de labirinto.
      Nota: Uma vez que todo o procedimento exige até 2 semanas, simplifica a bateria escolhendo entre os testes semelhantes antes da aplicação de um estudo de curto prazo ou aguda.
      Atenção: O teste de campo aberto dia 2 garante habituação apropriada para o teste de reconhecimento de objeto romance. Teste o teste de natação forçada última como pode causar estresse em camundongos C57BL/6N.

2. BehavioralTest protocolo

  1. Teste de campo aberto8,18,19,20
    1. Realize o teste de campo aberto em um 60 cm (comprimento [L]) x 60cm (largura [W]) x arena de plástico branco não transparente 40 cm (altura [H]).
      Nota: Usar várias arenas pode aumentar a taxa de transferência do teste.
    2. Iniciar a gravação de câmera e gentilmente colocou o mouse ao lado no meio de uma parede da arena, enfrentando essa mesma parede. Registre o comportamento do rato durante 10 minutos antes de retorná-lo para a gaiola em casa. Limpe o aparelho conforme descrito na etapa 1.2.4.
      Nota: O ponto de início do teste de campo aberto também pode ser o centro da arena. Ser consistentes entre os ratos.
    3. Repita até que todos os ratos terminar o protocolo. Contrabalançar a ordem teste entre grupos.
    4. Realizar a análise de dados da seguinte maneira.
      1. Divida a arena em quatro quadrados por quatro quadrados (grade imaginária) na tela do computador. Para avaliar a função motora, conte o número de linhas que cruzou com o mouse na arena19.
        Nota: A definição de "cruzar uma linha" é quando ambos os membros posteriores cruzá-la. Esta definição também se aplica para a elevada e mais teste de labirinto.
      2. Medir o tempo gasto na área central, como um indicador da ansiedade. A área central é as quatro praças no centro da arena.
        Nota: Parâmetros adicionais, tais como a criação (ambas as patas dianteiras do chão, com as patas da frente contra uma parede ou de pé), a latência para a retaguarda de primeira e aliciamento e congelamento indicam a emotividade do mouse.
      3. Como alternativa, use um software de rastreamento, conforme descrito em detalhe por Seibenhener e Wooten8, para medir a distância percorrida, a velocidade e o tempo gasto na área central.
  2. Acelerando rotarod teste18
    1. Realize no dia 3, formação da aceleração rotarod teste antes de qualquer tratamento de drogas ou toxinas/modelagem/início da doença e testar a função motora para 1 dia, como previsto na figura 1A.
      Nota: O rato recebe três ensaios por dia, durante o treinamento e teste. Cada julgamento começa com a rotação da haste e termina com a queda do mouse.
    2. Coloque o aparelho rotarod no banco no quarto comportamental. Evite a iluminação direta no equipamento. Programe o equipamento como a partir de 4 rpm e acelerando a 40 rpm dentro de 5 min.
    3. Em cada julgamento, coloque o mouse sobre a haste de estática, olhando para a parede da máquina. Inicie o dispositivo quando o mouse estiver resolvido. Parar o dispositivo, uma vez que o rato cai e registrar o tempo o rato gastou na haste. Repita imediatamente para outro dois ensaios antes de retornar o mouse volta para a jaula para casa.
    4. Repita o procedimento nos outros ratos.
    5. Medir o tempo médio gasto na haste de três ensaios durante o ensaio para estimar a função motora.
      Nota: O tempo médio na haste durante o terceiro dia de treinamento é a base da função motora.
  3. Interação social teste18
    1. Para o teste de interação social, use uma campo aberto arena com duas câmaras transparentes idênticas (8 cm [L] x 6 cm [W] x 12 cm [H]) com orifícios na superfície — e um rato romance (auxiliar), que é um conspecific juvenil do mesmo-sexo que tem não teve nenhum contato anterior com o rato do assunto. A figura 1B mostra o esquema do procedimento. Limpe a arena e as câmaras, conforme descrito na etapa 1.2.4.
      Nota: O romance mouse não pode ser um companheiro littermate ou gaiola do rato assunto. É saudável e alojados em grupo. Se habituar o mouse romance a sala comportamental por 15 a 30 min conforme descrito na etapa 1.2.3.
    2. Separadamente, coloque as duas câmaras no meio de duas paredes opostas da arena. Introduza o mouse do assunto na arena como descrito na etapa 2.1.2 e mostrada na figura 1B, para uma exploração de 3 min. Retorne o mouse do assunto da gaiola em casa e remover qualquer urina ou fezes na arena.
    3. Colocar o auxiliar em uma das câmaras. Reintroduzir o mouse do assunto para a arena e gravar por 3 min. depois, retorno ambos os ratos para cada uma das suas próprias gaiolas em casa. Repita os procedimentos com outros ratos de assunto como descrito acima.
      Nota: Contrabalançar o lado do programa auxiliar ou atribuí-lo aleatoriamente dentro do grupo.
    4. A partir do vídeo, estimar o parâmetro descrevendo a atividade de interação social dos ratos como tauxiliar/tvazio, que significa a proporção do tempo interagindo com a câmara de auxiliares (thelper) e o vazio (tvazio), um ou usar o reconhecimento do índice tauxiliar/ (tauxiliar + tvazio).
      Nota: Uma interação entre o mouse do assunto e a câmara é definida como quando o nariz do rato está a 2 cm da câmara e apontando em direção a ela.
  4. Elevados, além disso, teste de labirinto 10
    1. Conduta da elevada mais labirinto teste no mesmo dia depois que todos os ratos são testados no teste de campo aberto. Limpe o aparelho conforme descrito na etapa 1.2.4.
      Nota: A configuração da elevada plus labirinto é um "+"-forma. Tem dois braços abertos (30 cm x 5 cm x 0,5 cm) em frente um do outro e perpendicular aos dois braços fechados (30 x 5 x 16 cm) com uma plataforma de centro (5 x 5 cm x 0,5 cm). O labirinto é elevado a 40 cm do solo.
    2. Posicione o mouse na junção dos braços abertos e fechados, enfrentando o braço aberto que é o oposto do experimentador (Figura 1). Registre o comportamento por 5 min antes de retornar o rato da gaiola em casa. Repita até que todos os ratos são testados.
      Nota: Entrar no labirinto com seu rosto com o braço aberto poderia aumentar a exploração do rato do braço aberto.
    3. Medir o tempo que o rato passou nos braços abertos (tabrir) e nos braços fechados (tfechar) baseados no vídeo: tabrir/tfechar indica o nível de ansiedade.
  5. Teste de natação forçada11
    1. O aparato do teste de natação forçada é um tanque cilíndrico que é de 30 cm de altura e 20 cm de diâmetro. Encha o depósito até 15 cm de altura com água da torneira à temperatura ambiente (23-25 ° C).
      Nota: Use água fresca para cada rato.
    2. Iniciar a gravação de vídeo e Coloque suavemente o mouse na água, no centro do aparelho. Gravar o vídeo para 6 min antes de colocar o mouse de volta à sua jaula em casa sob luz infravermelha.
      Nota: Não perturbe o mouse por afogamento, ou torcer o rabo.
    3. Medir o tempo de imobilidade nos último 5 min do vídeo gravado. Mobilidade significa qualquer movimentos além dos necessários para equilibrar o corpo e para manter a cabeça acima da água.
  6. Reconhecimento de objeto romance teste17,18
    1. Configurar o teste de reconhecimento de objeto romance para incluir 2 dias de habituação, 1 dia de familiarização e 1 dia de teste (Figura 1); cada sessão é de 10 min por rato, e o intervalo de intercessão 24 h.
      Nota: A habituação usando o teste de campo aberto é executada conforme descrito na seção 2.1. O mouse interage com dois objetos idênticos (objetos velhos) em familiarização. No teste, o mouse interage com os objetos antigos e um novo objeto, ambos colocados no mesmo lugar que os objetos na familiarização. O aparato do teste de reconhecimento de objeto romance inclui uma campo aberto arena e dois conjuntos de objetos. Cada conjunto contém dois objetos idênticos (objetos A e A e B e B). Objetos A e B são semelhantes em tamanho, mas diferentes em textura (papel, plástico e vidro), forma (redonda/cúbico) e cor (claras/escuras). Os objetos devem ser livre de odor e grande o suficiente para o mouse explorar dentro de 10 min. O tamanho adequado para adultos camundongos C57BL/6N é 8 cm de altura e 5 cm de largura/em diâmetro.
    2. Marca as posições dos dois objetos na familiarização e teste, 5 cm de lado e 7 cm da parte superior da arena.
      Nota: Marca a posição na noite antes de familiarização para evitar o cheiro do marcador.
    3. Na familiarização, o mouse interage com um conjunto de objetos idênticos. Limpe a arena e objetos conforme descrito na etapa 1.2.4 antes de colocar o mouse na arena, enfrentando o meio da parede, como mostrado na Figura 1. Recorde de 10 min antes de retornar o rato da gaiola em casa. Repita até que todos os ratos são acabados e retornam todas as gaiolas à unidade animal.
      Nota: Contrabalançar os objetos usados na familiarização dentro do grupo para diminuir o preconceito (por exemplo, ratos n. º 1 e 2 explorar objetos A e A e ratos n º 3 e 4 explorar objetos B e B; desta forma, o romance objeto é objeto B para ratos no. 1 e 2 e objeto A para ratos não. 3 e 4).
    4. Realize o teste 24 h após a familiarização. Use o mesmo procedimento para a familiarização, exceto substituir um dos objetos com um de outro conjunto (Figura 1). Repita até que todos os ratos têm de executar o teste e, depois, retornam todas as gaiolas à unidade animal.
      Nota: Contrabalançar o lado do novo objeto dentro do grupo para diminuir o preconceito (por exemplo, apresentar os ratos n. º 1 e 3 objetos A e B e ratos n º 2 e 4 para objetos B e A). Desta forma, o objeto do romance mostra no lado direito para ratos n. º 1 e 4 e no lado esquerdo para ratos no. 2 e 3. Aqui, o lado esquerdo é o lado esquerdo do experimentador ao enfrentar a arena.
    5. Medir o tempo que cada mouse interage com o novo objeto (tnovo) e o objeto antigo (tvelho) separadamente, desde as imagens de vídeo em fase de testes. Uma interação entre o animal e o objeto é descrita na nota seguinte passo 2.3.4. Calcular a memória do mouse como a preferência para o novo objeto = tnovo/tantigo; ounovat / (nova t + tvelho).
      Nota: tnovo/tvelho é igual a 1 ou tnovo/ (nova t + tantigo) é igual a 0,5 significa que o mouse não tem nenhuma preferência para o novo objeto (ou seja, deficiência de memória). O tempo interagindo com objetos na familiarização pode servir como um controle do experimento. O tempo total indica a atividade de exploração do mouse, e sugere tesquerda/tcerto viés espacial.
  7. Labirinto de água Morris teste16
    1. Configure o aparelho como segue.
      1. Colocar o labirinto de água, uma piscina circular (de 120 cm de diâmetro e 60 cm de profundidade), no centro de uma sala de comportamental e marcar a posição do labirinto para assegurar que a posição permanece a mesma durante todo o experimento.
      2. Divida o labirinto em quatro quadrantes imaginário igual. Pendure as indicações visuais (por exemplo, círculo, quadrado, triângulo e Pentágono) no centro de cada quadrante, 130 centímetros acima do chão e 53 centímetros longe da parede do labirinto.
        Nota: O labirinto e o taco devem ficar na mesma posição durante o teste inteiro, para que o rato pode formar memória espacial exata.
      3. Coloque uma plataforma de 25 cm de distância da parede, no centro do quarto quadrante e marcar a posição. A plataforma para o mouse é 10 cm de diâmetro.
        Nota: A posição e o diâmetro da plataforma determinam a dificuldade da tarefa. O mais próximo é na parede do labirinto, ou quanto maior a plataforma, mais fácil a tarefa.
      4. Encha o labirinto de água com água (com temperatura de 23 a 25 ° C, coloridas em branco e feita opaco pelo branqueamento pó de leite em pó/alimentos) até o nível de água é maior do que a plataforma 1 cm. Trazer os ratos no quarto por 15 a 30 min de habituação comportamental, como mostrado na etapa 1.2.3 e acender a luz infravermelha acima as gaiolas, que será usado para secar os ratos.
        Nota: Cubra a parte superior da plataforma com pano branco e rede para que o rato pode facilmente subir nela. Certifique-se que não há nenhuma iluminação direta acima da água.
    2. Realizar a fase de formação como segue.
      1. A fase de treinamento leva 5 dias, quatro ensaios por dia. Organize semi aleatoriamente os pontos de partida em cada dia, conforme demonstrado na literatura16. Este esforço impede que o mouse que estabelece a memória associativa, que é a maneira mais comum para "enganar" o teste.
      2. No início de cada julgamento, iniciar a gravação de vídeo e Coloque suavemente o mouse o labirinto.
        Nota: Não solte o mouse no tanque ou torça seu rabo, o que pode causar desorientação e stress extra.
      3. Pedir o experimentador de permanecer fora de vista do rato e voltar a levar o mouse de volta para sua gaiola em casa quando qualquer um dos seguintes acontece: (i) o mouse não é possível localizar a plataforma dentro de 60 s; (ii) o mouse encontra a plataforma dentro de 60 s e permanece nela por 10 s. Circunstância (i), pedir o experimentador Coloque o mouse sobre a plataforma e deixá-lo ficar lá por 10 s.
        Nota: Ponto (ii), que o mouse localizado com sucesso a plataforma.
      4. Pare o vídeo e coloque o mouse de volta na gaiola casa sob luz infravermelha.
        Nota: Manter a temperatura corporal de ratos é crítico para seu desempenho porque hipotermia salienta ratos e pode afetar os seguintes testes.
      5. Repita o procedimento com outro rato.
      6. Baseado no vídeo, registro a latência de fuga, que é a duração do período que no labirinto, de entrar no labirinto até o momento em que o mouse gasta com êxito localiza a plataforma. Se o mouse não consegue encontrar a plataforma ou estadias lá por menos de 10 s em 60 s, a latência de fuga conta como enredo s. 60 a curva de aprendizado contra os dias de treinamento com a latência de fuga média por dia.
        Nota: A latência de fuga não inclui os 10 s passar na plataforma.
    3. Execute a fase de sonda como segue.
      1. No sexto dia do teste de labirinto de água Morris, configurar o aparelho conforme descrito na etapa 2.7.1., tirar uma foto do labirinto para gravar a posição da plataforma e em seguida, remover a plataforma do tanque.
      2. Iniciar o gravação de vídeo e Coloque suavemente o mouse no labirinto no quadrante diagonalmente oposto ao quadrante alvo.
      3. Pergunte o experimentador para ficar fora da vista do mouse durante a gravação de vídeo de 1 min. Depois, tem o experimentador pegar o mouse fora do labirinto e colocá-lo de volta na gaiola em casa.
      4. Use a imagem tirada pelo passo 2.7.3.1. como referência para medir a duração de qualquer cruzamento de plataforma. Tempo de duração que o mouse fica no quadrante alvo (talvo), de acordo com o vídeo. O tempo total é ttotal. Medir a preferência ao quadrante alvo como t alvo/ttotal.

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Representative Results

Esta bateria de testes comportamentais foi projetada para a análise comportamental abrangente e válida de motor, humor e cognição, que são comumente afetados na neurodegeneração5. Nós aplicamos esta bateria para estudar as mudanças comportamentais em jovens adultos C57BL/6N ratos após exposição respiratória de nanopartículas de sílica por 1 mês e 2 meses18. Os resultados revelaram que camundongos C57BL/6N expostos a nanopartículas de sílica mostraram várias mudanças comportamentais após exposição diferente vezes18. Brevemente, resultados no teste do campo aberto (Figura 2A) e o teste de aceleração rotarod (Figura 2B) demonstraram que a exposição de nanopartículas de sílica não afetou a função locomotora ou motor em camundongos, indicando uma capacidade total de realizar os outros testes. Atividade de interação social foi afetada após uma exposição de 1 mês de nanopartículas de sílica (Figura 2). Considerando a ansiedade ou depressão também diminuiria a sociabilidade, foram analisados dados do teste de campo aberto, elevado além de teste de labirinto (Figura 2DE) e o teste de natação forçada (Figura 2F), que não indicavam qualquer comorbidade de ansiedade ou depressão no ponto de tempo de 1 mês. Uma exposição de 2 mês de nanopartículas de sílica resultou na ansiedade de acordo com os resultados na elevada além de teste de labirinto (Figura 2E). Uma tendência semelhante foi mostrada na duração área central no teste de campo aberto (Figura 2D). Prejuízo cognitivo também foi detectado no teste de labirinto de água de Morris e teste de reconhecimento de objeto romance após uma exposição de 2 meses (Figura 3). Deve notar-se que o protocolo era ligeiramente diferente nos dois julgamentos do teste de labirinto de água Morris. Uma lâmpada adicional foi adicionada no segundo julgamento, então todos os ratos sempre ficaram sob a lâmpada para manter quente. Portanto, não nonperformer foi mostrado no segundo julgamento, enquanto dois de oito ratos tornou-se Jerry no teste da sonda no primeiro julgamento.

Nós ajustamos o protocolo para que a maioria dos testes na bateria pode ser testada várias vezes. A chave é manter a motivação dos testes. Testes, como teste de interação social, teste de reconhecimento de objeto romance e elevados além de teste de labirinto é motivado pela novidade (ou seja, um romance juvenil auxiliar, objetos novos e um ambiente de romance, respectivamente). Mantendo a novidade no protocolo, os jovem adulto C57BL/6N ratos mostraram um desempenho consistente quando testados novamente depois de 1 mês. De acordo com nossos dados, quando apresentou a dois auxiliares diferentes nos dois julgamentos, ratos consistentemente mostraram uma preferência maior do que dez vezes para o auxiliar do que para a câmara vazia na interação social de teste (Figura 4A). No teste de reconhecimento de objeto romance, os ratos normais consistentemente preferiam o romance objeto objeto antigo (Figura 4B). No entanto, na elevada e teste do labirinto, quando testado novamente no mesmo ambiente, depois de 1 mês, a exploração caiu pela metade (Figura 4)10. Teoricamente, adulto jovem C57BL/6 ratos podem ser testados repetidamente nestes testes contanto que a condição experimental, incluindo a novidade e o status dos ratos, permanece a mesma. Nós repetimos estes testes todos os meses para até três vezes em nosso laboratório. Notável, o teste de labirinto de Morris água não pode ser testado repetidamente no mesmo grupo de jovens adultos C57BL/6N ratos como a experiência interfere significativamente com o desempenho quando repetidamente testado. De acordo com nossos dados, os ratos ainda lembrado a plataforma mesmo depois de 1 mês, mostrando o correta e a longo prazo memória espacial. Quando muda a posição da plataforma, os ratos experientes aprenderam mais rápido do que os ratos ingênuos, como o que tinham aprendido as regras e estratégia de busca, desde o treinamento prévio (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: esquema. (A) arranjo do comportamental testar a bateria e as parcelas esquemáticas (B) o teste de interação social, (C) a elevada além de labirinto de teste e (D) o teste de reconhecimento de objeto romance. Abreviaturas: R = aceleração rotarod teste; DE = teste de campo aberto; EPM = elevados além de labirinto de teste; Nem = teste de reconhecimento de objeto romance; SI = teste de interação social; MWM = teste de labirinto de água Morris; FST = teste de natação forçada. O ponto de partida do mouse no ensaio é mostrado pelo mouse no esquema. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: mudanças no motor e humor em camundongos expostos a nanopartículas de sílica para 1 mês ou 2 meses, detectada pela bateria de testes comportamentais. Os ratos foram testados em (A e D) o campo aberto teste, (B) o rotarod, (C) o teste de interação social, (E) a elevada além de labirinto e teste de natação (F) a forçada composta na bateria. N = 8, 12 ou 20, o que significa que cada grupo tinha 8, 12 ou 20 ratos, respectivamente, como demonstrado em cada figura. N = 17-20, significa que cada grupo tinha 20 ratos, exceto por um grupo de controle em 1 mês, que consistia de 17 ratos. Em painéis, A, De E, dados primeiro foram normalizados para controle em cada ponto de tempo em, em seguida, foram analisados com do Student bicaudal t-teste. Os dados no painel B foram analisados por medidas repetidas ANOVA de duas vias. Os dados em painéis C e F foram analisados com do Student bicaudal t-teste. Todos os dados é mostrado como dizer ±S.E.M. * e * * * quer dizer p < 0,05 e 0,0001, respectivamente. Estes dados foram publicados anteriormente por você et al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: mudanças na cognição, após serem expostos a nanopartículas de sílica para 1 mês ou 2 meses. Mudanças na cognição dos ratos após serem expostos a nanopartículas de sílica para (A) 1 mês ou (E) 2 meses, detectado pelo reconhecimento romance objeto teste. Mudanças na cognição dos ratos após serem expostos a nanopartículas de sílica para (B - D) 1 mês ou (F - H) 2 meses, detectada pelo teste de labirinto de água Morris. Ratos foram repetidamente testados no teste de reconhecimento de objeto romance. Um novo lote de ratos foi testado no teste de labirinto de Morris água em pontos diferentes do tempo. N = 6, 8, 12 ou 20, o que significa que cada grupo tinha 6, 8, 12 ou 20 ratos, respectivamente, como demonstrado em cada figura. Em painéis, A, C, D, E, Ge H, os dados foram analisados com do Student bicaudal t-teste. Os dados em painéis B e F foram analisados por medidas repetidas ANOVA de duas vias. Todos os dados são mostrados como dizer ±S.E.M. * significa p < 0,05. Estes dados foram publicados anteriormente por você et al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: dados representativos em testes. Dados representativos, em testes, incluindo teste de (A), a interação social, (B) o reconhecimento de romance objeto teste e (C) a elevada e mais teste de labirinto, testaram em ratos ingênuos (1 avaliação) e testaram repetidamente no mesmo lote de ratos (teste 2) . (D) dados representativos do labirinto de água Morris teste quando repetidamente testado. Esta figura foi modificada de você et al.18. Todos os dados são mostrados como dizer ±S.E.M... e analisados com Student não pareado t-teste. P < 0,001, comparado com 1 experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Análise comportamental de ratos é crítico para a pesquisa de neurodegeneração. Enquanto a função cognitiva é, muitas vezes, o domínio mais suscetível de comportamento afetado em doenças neurodegenerativas, disfunção do humor, como depressão e ansiedade, muitas vezes é comórbidos. Além disso, a função motora muitas vezes afeta a interpretação dos resultados de alguns testes, tais como o teste de reconhecimento de objeto do romance, a elevada plus teste de labirinto e o teste de interação social. Baseado nestes pensamentos, uma bateria de testes comportamentais abrangente é necessária para uma avaliação global e precisa sobre os comportamentos.

O primeiro passo é escolher os testes adequados. Foram incluídos ensaios bem aceitados e clássicos, ou seja o teste de campo aberto e o rotarod teste de função motora, da elevada plus teste do labirinto para a ansiedade, o teste de natação forçada para a depressão, o teste de interação social para a sociabilidade e o labirinto de água Morris teste e o reconhecimento de romance objeto testam de cognição. Há três testes clássicos para a ansiedade, ou seja o teste de campo aberto, a elevada além de teste e o teste de caixa de claro/escuro. Estes testes todos exploram o conflito entre a curiosidade inata sobre o ambiente de romance e a aversão ao campo aberto, elevado ou brilhantemente iluminado. Portanto, os ratos não são condicionados por estímulos nocivos, tais como choque elétrico, o odor de predador e assim por diante. No entanto, abundantes estudos têm revelado que estes testes têm pouca confiabilidade intertest, mesmo dentro de um único laboratório21. Usamos o teste de campo aberto e elevado mais teste de labirinto para analisar a ansiedade em ratos no menor tempo possível. O teste de campo aberto examina o comportamento de ansiedade além da função locomotora e também é a habituação para o teste de reconhecimento de objeto romance e teste de interação social. Escolhemos o mais elevado de labirinto teste porque é um paradigma bem estabelecido. Tem validade de rosto excelente (fenomenológica similaridade entre o comportamento em ratos e os sintomas em pacientes), construir a validade (o grau ao qual o teste reflete os pressupostos teóricos subjacentes) e a validade preditiva (a precisão de os resultados dos testes quando traduzindo-os para os seres humanos)10. Se a ansiedade foi a prioridade, pesquisadores podem considerar incluindo caixa de claro/escuro testar e analisar exaustivamente o comportamento nesses testes com mais parâmetros, tais como frequência de criação, estiramento-participar de comportamento e defecação21. Em segundo lugar, os resultados destes testes podem ser facilmente interpretado porque as motivações dos testes são claras, que são a curiosidade inata à novidade, ou água, para executar uma tarefa simples em uma condição controlável. Ao contrário de fome e pretraining, que pode causar diferentes níveis de motivação em ratos, esses tipos de motivação são fortes o suficiente para a maioria do rato C57 para executar a tarefa. Em terceiro lugar, esses testes têm uma boa compatibilidade com os outros, porque a motivação não é muito estressante para causar estresse a longo prazo ou mesmo permanente, tais como choques elétricos ou privação de comida/água pode causar. Testes de desespero, incluindo o teste de natação forçada e o teste de suspensão da cauda, utilizam o princípio de que o mouse desiste lutando quando presos em um ambiente de desesperado. Medindo o tempo de"desespero", os testes diz deprimido como o mouse. Camundongos C57Bl/6N geralmente mostram 180 s de imobilidade de 300 s nestes testes11,22. Nós escolhemos o teste de natação forçada durante todo o ensaio de suspensão de cauda porque é comparativamente menos estressante quando o mouse tem experiência em água formação de labirinto. Desta forma, eles são adaptados à água em sabem como prevenir hipotermia após se molhar. Em contraste, observou-se cerca de 2 g de perda de peso corporal durante a noite, depois do teste de suspensão de cauda, indicando grande estresse. No entanto, testes repetidos do teste de natação forçada devem ser feito com cautela, e os ratos precisam recuperar por mais tempo do que 24 h antes de quaisquer outros experiências/sacrifícios. Alternativamente, os cientistas podem considerar incluindo um teste de preferência de sacarose, um paradigma usado extensivamente em induzida por estresse depressão-como anedonia, na bateria. No entanto, o protocolo do teste requer dias de habituação a habitação individual23, que pode ser um estímulo que afeta o resultado de outros testes. Por último, os testes aqui tem taxa de transferência razoável. Todos os testes podem terminar dentro de 10 min/rato. Ao aumentar a quantidade de equipamentos, tais como a arena de campo aberto, os canais no teste rotarod, os tanques no teste de natação forçada e as pistas no teste de suspensão da cauda, a taxa de transferência também pode ser aumentada. Embora o teste de labirinto de água Morris dificulta a testar vários mouses ao mesmo tempo, cada julgamento leva apenas s ~ 60-75.

A preocupação mais crítica ao aplicar a bateria de testes comportamentais é a interferência entre os testes e o estresse da manipulação frequente. Os efeitos adversos destas questões podem ser minimizados, otimizando ainda mais a ordem e o intervalo de teste. Enquanto é senso comum que a ordem dos testes comportamentais deve ser pelo menos para o mais estressante para o mouse, alguns testes nesta bateria pode ser usada como aclimatação para os seguintes testes e melhorar a estabilidade do desempenho. Por exemplo, realizando a elevada além de teste de labirinto após o teste de campo aberto aumenta a exploração do braço aberto10. Além disso, quando os ratos são testados na ordem de campo aberto, teste de reconhecimento de objeto romance e teste de interação social, eles gradualmente se habituar ao meio ambiente e da tarefa, incluindo o quarto comportamental, campo aberto e os objetos. Portanto, os ratos são susceptíveis de manifesto Cainofobia7,24,25, que significa mostrando uma anormalmente baixa interação com o objeto/indivíduo romance e são todos adequadamente concentrada na tarefa. Este arranjo diminui a flutuação em dados de testes que são motivados pela curiosidade inata. O teste de labirinto de água Morris e o teste de natação forçada têm uma motivação mais forte. Assim, os ratos são susceptíveis de ser afectadas pela experiência dos testes. Frequente transportes e manipulação durante todo o procedimento é outra fonte de estresse, exigindo manipulação animal adequada e suficiente habituação. Recomenda-se que o intervalo de teste na bateria deve ser pelo menos 24 h, para que os ratos podem recuperar do stress destes estressores26,,27,28. No entanto, existem outros estudos que testaram ratos em vários testes por dia29.

Outra preocupação sobre os testes repetidos dos comportamentos é a influência da experiência anterior. O teste de campo aberto e o teste de rotarod a aceleração podem ser usados várias vezes na análise da função motora. Novidade-motivado testes, incluindo a elevada plus teste do labirinto, o teste de reconhecimento de objeto romance e o teste de interação social, podem ser utilizados repetidamente quando a motivação é o romance em cada julgamento, o que significa um novo ambiente experimental, pares de objetos , ou auxiliar, respectivamente. Conforme os dados representativos, camundongos C57BL/6N não podem ser treinados repetidamente no protocolo clássico de teste de labirinto da água Morris como lembraram-se da estratégia de busca de experiência.

Esta bateria avalia vários domínios do comportamento. Desta forma, os resultados de alguns testes podem ser uma referência para a interpretação de dados de outros. Nos dados representativos na Figura 1, quando os ratos expostos a nanopartículas de sílica para 1 mês mostraram uma redução da atividade de interação social, pode ser o fenótipo de depressão ou ansiedade ou a consequência de um déficit de função motora. No entanto, os resultados dos testes de função e ansiedade motor indicaram que a diminuição da interação social era primário, não subsequentes. Além disso, esta bateria contém testes diferentes para o mesmo domínio de comportamentos, com uso e sensibilidade diferente. Tendência/resultados consistentes nestes testes aumentam a confiabilidade da bateria. No entanto, este arranjo leva tempo extra para todo o procedimento. O experimento de curto prazo que leva menos de 1 mês deve usar uma versão simplificada desta bateria.

Esta bateria de testes comportamentais é projetada para a tela o fenótipo comportamental mostrado em diferentes fases após a exposição ao factor de risco genético ou ambiental de neurodegeneração. Portanto, este protocolo lista apenas as leituras essenciais de cada teste. Vale ressaltar que cada teste comportamental pode fornecer muita informação; daí, o usuário pode expandir o protocolo para investigação futura. Por exemplo, a atividade espontânea como aliciamento, criação, defecação e thigmotaxis em campo aberto revela emotividade8. Estes traços de comportamento da elevada mais teste de labirinto também pode ser indicadores de ansiedade10,21. O motor de estudos de teste rotarod aprendendo os ratos são treinados após a modelagem/doença início/exposição a factores de risco ambientais30. O teste de interação social também pode estudar memória social, introduzindo uma segunda novela auxiliar após o teste de sociabilidade9. Portanto, a expansão da bateria pode ser personalizado para caber diferentes prioridades de estudo. No entanto, esta bateria só foi testada em ratos adultos jovens do C57BL/6N devido a limitações de tempo. O desempenho da linha de base de outras estirpes ou envelhecidos camundongos C57BL/6 pode ser diferente. Além disso, modelos de camundongos transgênicos neurodegenerativas podem apresentar défices comportamentais, tais como hipo ou hiperatividade. Daí, eles podem não ser adequados para os ensaios com uma baixa motivação, tais como o teste de reconhecimento de objeto romance. Portanto, ainda mais otimização deve ser necessária para a avaliação comportamental destes ratos.

Em conclusão, esta bateria permite uma convincente e abrangente análise comportamental de neurodegeneração na cepa de rato C57. É mais apropriado para estudos longitudinais neurodegeneração-relacionados da toxicidade de potencial fatores de risco/neurotoxina ou desenvolvimento de drogas, que muitas vezes apresenta a administração a longo prazo e testes repetidos.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecer Dr. Cora SW Lai da escola de ciências biomédicas, Universidade de Hong Kong, para empréstimos a elevada além de teste de labirinto e o departamento de Anestesiologia da Universidade de Hong Kong para a aparelhagem de ensaio rotarod os empréstimos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
chambers in social interaction test home made (8 cm (L) x 6 cm (W) x 12 cm (H)), transparant with holes, plastic
cylindrical tanks used in forced swimming test home made 30 cm height, 20 cm diameters, glass
elevated plus maze home made open arms (30 cm x 5 cm x 0.5 cm) ,closed arms (30 cm x 5 cm x 16 cm), center platform (5 cm x 5 cm x 0.5 cm), 40 cm tall. Plastic, nontransparant
IITC Roto-Rod Apparatus IITC life science Inc. 755, series 8
open field arena home made 60 cm (L) x 60 cm (W) x 40 cm (H), plastic, nontransparant
water maze home made 120 cm in diameter, 60 cm deep, steel

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You, R., Liu, Y., Chang, R. C. C. A Behavioral Test Battery for the Repeated Assessment of Motor Skills, Mood, and Cognition in Mice. J. Vis. Exp. (145), e58973, doi:10.3791/58973 (2019).

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