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Behavior

Una batería de pruebas de comportamiento para la evaluación repetida de la motricidad, humor y cognición en ratones

Published: March 2, 2019 doi: 10.3791/58973
Automatic Translation
1,2,3, 3, 3
1Nanjing Key Laboratory of Pediatrics, Children's Hospital of Nanjing Medical University, 2Nanjing Key Laboratory of Pediatrics, Nanjing Medical University, 3Laboratory of Neurodegenerative Disease, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, Pokfulam, Hong Kong Special Administrative Region (HK SAR)

Summary

Una batería de pruebas de comportamiento integral de las habilidades motoras, estado de ánimo, incluyendo la interacción social, depresión y ansiedad — y cognición está diseñada para la evaluación repetida de cambios de comportamiento relacionados con la neurodegeneración en ratones.

Abstract

Estudios farmacológicos y toxicológicos en neurodegeneración requieren análisis integral del comportamiento en los ratones debido a trastornos motores y trastornos de ánimo y la cognición son comunes y compartieron a menudo los síntomas en enfermedades neurodegenerativas. Se muestra aquí es una batería de pruebas de comportamiento para el motor, estado de ánimo y la cognición, que puede ser repetidamente probada en un estudio longitudinal. Esta batería evalúa el fenotipo general comportamiento en ratones mediante el examen de cada dominio de la conducta con al menos dos pruebas bien aceptados independiente (es decir, prueba de campo abierto y prueba del rotarod para motricidad, prueba de interacción social, elevado más prueba del laberinto, y prueba de nado forzado para función emocional y prueba de laberinto de agua de Morris y prueba de reconocimiento de objeto nuevo para la función cognitiva). Por lo tanto, esta batería de pruebas sensibles e integral es una poderosa herramienta para el estudio del comportamiento alternancia en neurodegeneración.

Introduction

Enfermedades neurodegenerativas presentó síntomas conductuales devastadoras, incluyendo deterioro cognitivo, disfunciones del estado de ánimo tales como ansiedad y depresión o de disfunción del motor1. La patogenia de diversos tipos de enfermedades neurodegenerativas es claro2. Estudios acumulativos indican que factores genéticos y ambientales pueden tanto contribuir a la patogenesia de las enfermedades neurodegenerativas. Identificar el factor de riesgo de la neurodegeneración requiere de análisis de conducta. Aunque cada tipo de enfermedad neurodegenerativa tiene su síntoma conductual de la firma (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer [AD] se presenta con deterioro cognitivo y la enfermedad de Parkinson [EP] con disfunción motora). Con la progresión de la enfermedad, los pacientes manifiestan comorbilidad de diferentes anormalidades del comportamiento3. Por ejemplo, pacientes con EA muestran síntomas de la disfunción del estado de ánimo en la etapa avanzada4,5. Pacientes con EP pueden progresar a demencia relacionada con el PD y desarrollar deterioro cognitivo6. Basado en estas características, el análisis del comportamiento en modelos de neurodegeneración suele ser amplia y repetida.

Para lograr este objetivo, una batería que contiene pruebas de comportamiento clásicas y ampliamente utilizadas con excelente validez fue diseñada para análisis de comportamiento en el motor, el estado de ánimo y la cognición. La función motora puede comprobarse por la prueba de campo abierto7,8 y la aceleración rotarod. Disfunción del estado de ánimo, incluyendo la disfunción social, depresión y ansiedad, se ven más comúnmente en neurodegenerativas enfermedades5. Por lo tanto, esta batería incluye una interacción social sociabilidad9, el elevado más prueba de laberinto para ansiedad10y la prueba de nado forzado para depresión11. Deterioro cognitivo es uno de los síntomas más característicos en enfermedades neurodegenerativas, como AD y demencia lobar de frontotemporal12. Dominios cognitivos, memoria a corto plazo como memoria episódica, son susceptibles a la neurodegeneración13,14,15. Por lo tanto, la prueba del laberinto de agua Morris para el aprendizaje espacial y memoria16 y la prueba de reconocimiento de objeto novedoso para la memoria a corto plazo17 están incluidos en la batería. Estas pruebas son compatibles entre sí. El orden de las pruebas fue diseñado para maximizar la habituación y a minimizar la interferencia, para aumentar la compatibilidad de la batería. Puesto que cada función es probado por los menos dos pruebas independientes que son diferentes en principio y de método, pueden validarse aún más los resultados de cada prueba. Por otra parte, se destacan los protocolos de pruebas para prueba repetida, facilita el estudio longitudinal del desarrollo de enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, esta batería de pruebas de comportamiento estudia diferentes subdominios de cambios en el comportamiento vistos en las distintas etapas de la neurodegeneración y costando un número mínimo de animales. Esta batería ha sido utilizada en un estudio longitudinal que evaluó los cambios del comportamiento en adultos (3 meses de edad) machos C57BL/6N ratones jóvenes después de la exposición respiratoria a nanopartículas de sílice, un peligro ocupacional que es un factor de riesgo potencial de neurodegeneración18. Sin embargo, otras cepas o modelos, como de ratones y manipulados genéticamente ratones, pueden comportarse de forma diferente que los jóvenes ratones C57BL/6N. Por lo tanto, cuidado puede ser necesario usar esta batería en estos ratones.

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Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la Comisión sobre la utilización de animales viven en la enseñanza y la investigación (CULATR), la Universidad de Hong Kong.

1. general protocolo

Nota: Esta sección se basa en diácono19.

  1. Configuración del comportamiento de la sala
    1. Deshacerse de estimulación/distracción sin relación, incluyendo la luz directa sobre el aparato experimental, olor, ruido y otros animales irrelevantes, en la sala de comportamiento (que debe ser unos 10 m2 con ajustable iluminación y, preferiblemente, tener un antesala).
      Nota: Puesto que el ratón es un animal nocturno, iluminación bajo 15 lux en la prueba de campo abierto, novela objeto reconocimiento test y test de interacción social podrían reducir al mínimo el interferencia de la luz, estrés y ayuda el ratón para centrarse en la prueba.
    2. Ajustar la cámara para al menos 1,5 m sobre el piso, asegurándose que esté fuera de la vista del ratón prueba de grabación de video.
  2. Vivienda y habituación
    1. Casa del grupo los ratones en una unidad de animales bajo observación (por ejemplo, alojamiento en grupo no más de cuatro ratones adultos).
      Nota: Aquí, se utilizaron ratones C57BL/6N machos 3 meses de edad y alojados en una jaula 1144B. Descartar los ratones enfermos, heridos o grandes esfuerzos. Experiencias de hambre, sed o maltratando pueden afectar el funcionamiento del ratón.
    2. Organizar para que el controlador del mismo animal para llevar a cabo todas las pruebas de comportamiento, para disminuir la variabilidad. Efectuar el transporte, manipulación y experimento durante el ciclo de luz de 7:00 a 19:00 Si es posible, coloque todos lo otros manejo, tales como la administración de cualquier droga, toxina (por ejemplo, la instilación intranasal de nanopartículas de sílice) o limpieza de la jaula, después de la prueba.
    3. Cambiarle las jaulas con números aleatorios a ciegas al experimentador antes de cada experimento. Habituar los ratones para el medio ambiente experimental en la sala de comportamiento durante 15 a 30 minutos en sus jaulas hogar. Mantener las jaulas de la casa en la sala de comportamiento durante todo el experimento.
    4. Antes de comenzar el experimento, puso un ratón C57BL/6N no experimental en el aparato para que la condición experimental para el primer ratón es el mismo que el resto. Luego, limpie el aparato como sigue: eliminar la orina y las heces con una toalla de papel limpia, limpiar el dispositivo experimental con agua del grifo y luego, el olor dejado por el ratón de limpiar el aparato con una toalla de papel ligeramente rociada con etanol al 70%.
    5. Para minimizar la distracción causada por el experimentador, pedir el experimentador para salir de la sala de comportamiento durante la grabación de vídeo, o permanecer detrás de la cortina durante el test de laberinto de agua de Morris.
  3. Arreglo de prueba de comportamiento
    1. Organizar la prueba de comportamiento en el orden como se muestra en la figura 1A. Plan para realizar las pruebas espaciadas por 24 horas, excepto el elevado más prueba del laberinto.
      Nota: Puesto que el proceso requiere hasta 2 semanas, simplificar la batería eligiendo entre pruebas similares antes de la aplicación en un estudio agudo o a corto plazo.
      PRECAUCIÓN: La prueba de campo abierto 2 días asegura correcta habituación para la prueba de reconocimiento de objeto nuevo. Prueba el test de natación forzada dura ya que puede causar estrés en ratones C57BL/6N.

2. BehavioralTest protocolo

  1. Prueba de campo abierto8,18,19,20
    1. Realizar la prueba de campo abierto en una (longitud [L]) de 60 cm x 60 cm (anchura [W]) x 40 cm (altura [H]) no transparentes blanco plástico de la arena.
      Nota: Utilizando múltiples arenas puede aumentar el rendimiento de la prueba.
    2. Iniciar la grabación de la cámara y poner suavemente el ratón cerca de la mitad de una pared de la arena, frente a esa misma pared. Registrar el comportamiento del ratón durante 10 minutos antes de regresar a la jaula del hogar. Limpie el aparato tal como se describe en el paso 1.2.4.
      Nota: El punto de partida en la prueba de campo abierto también puede ser el centro de la arena. Ser coherente entre los ratones.
    3. Repita hasta que todos los ratones fin del protocolo. Contrarrestar la prueba orden entre grupos.
    4. Realizar el análisis de datos como sigue.
      1. La arena se dividen en cuatro cuadrados por cuatro cuadrados (cuadrícula imaginaria) en la pantalla del ordenador. Para evaluar la función del aparato locomotor, contar el número de líneas por el ratón en la arena19.
        Nota: La definición de "cruzar una línea" es cuando se cruzan dos extremidades traseras. Esta definición también se aplica a la elevado más la prueba del laberinto.
      2. Medir el tiempo pasado en la zona central como un indicador de ansiedad. El área central es las cuatro plazas en el centro de la arena.
        Nota: Parámetros adicionales, como la crianza (ambas patas delanteras del suelo, con las patas delanteras contra una pared o de pie), la latencia a la primera parte posterior y la preparación y congelación indican la emocionalidad del ratón.
      3. Como alternativa, utiliza un software de seguimiento, como se describe en detalle por Seibenhener Wooten8para medir la distancia recorrida, la velocidad y el tiempo empleado en la zona centro.
  2. Aceleración rotarod prueba18
    1. Llevar a cabo el día 3 entrenamiento de la aceleración rotarod prueba antes de cualquier tratamiento de drogas o toxina, modelado, Inicio de la enfermedad y la función de motor de prueba para 1 día, según lo previsto en la figura 1A.
      Nota: El ratón recibe tres ensayos por día durante el entrenamiento y pruebas. Cada ensayo se inicia con la rotación de la barra y termina con la caída del ratón.
    2. Coloque el aparato de rotarod en el Banco en la sala de comportamiento. Evitar la iluminación directa al equipo. Programar el equipo a partir de 4 rpm y acelerar a 40 rpm en 5 minutos.
    3. En cada ensayo, ponga el ratón sobre la barra estática, mirando hacia la pared de la máquina. Iniciar el dispositivo cuando el ratón está colocado. Detener el dispositivo una vez que el ratón caiga y registre el tiempo el ratón en la barra. Inmediatamente repetir para otro dos ensayos antes de regresar el ratón a la jaula del hogar.
    4. Repita el procedimiento en los otros ratones.
    5. Medir el tiempo promedio en la barra de tres ensayos durante la prueba para estimar la función motora.
      Nota: El tiempo promedio en la barra durante el tercer día de entrenamiento es la base de la función motora.
  3. Test de interacción social18
    1. Para la prueba de interacción social, utilizar un espacio de campo abierto con dos compartimientos transparentes idénticos (8 cm [L] x 6 cm [W] x 12 cm [H]) con los agujeros en la superficie y un nuevo ratón (Ayudante) que es un coespecíficos juvenil del mismo sexo que no ha tenido ningún contacto anterior con el ratón de tema. Figura 1B muestra el esquema del procedimiento. Limpiar la arena y los compartimientos como se describe en el paso 1.2.4.
      Nota: El nuevo ratón no puede ser un compañero littermate o la jaula del ratón tema. Está ubicado en grupo y saludable. Habituar el ratón de nuevo a la sala de comportamiento durante 15 a 30 minutos como se describe en el paso 1.2.3.
    2. Colocar por separado las dos cámaras en medio de dos paredes opuestas de la arena. Introducir el ratón del tema en la arena como se describe en el paso 2.1.2 como se muestra en la figura 1B, para una exploración de 3 minutos. Volver el ratón sujeto a la estructura de inicio y eliminar orina o heces en la arena.
    3. Poner la ayuda en una de las cámaras. Reintroducir el ratón de tema a la arena y grabar durante 3 minutos después, vuelta ambos ratones a cada una de sus propias jaulas hogar. Repita el procedimiento con los otros ratones de tema como se describió anteriormente.
      Nota: El lado de la ayudante de contrapeso o asignarlo aleatoriamente dentro del grupo.
    4. En el video, estimar el parámetro que describe la actividad de interacción social de los ratones como thelper/tvacía, que significa la proporción de tiempo interactuando con la cámara auxiliar (thelper) y el vacío uno (tvacía), o utilizar el reconocimiento índice thelper/ (thelper + tvacío).
      Nota: Una interacción entre el ratón del sujeto y la cámara se define como cuando la nariz del ratón está dentro de 2 cm de la cámara y apuntando hacia él.
  4. Elevado más prueba de laberinto 10
    1. Realizar el elevado además de laberinto prueba el mismo día después de que todos los ratones son probados en la prueba de campo abierto. Limpie el aparato tal como se describe en el paso 1.2.4.
      Nota: La configuración de la elevación además de laberinto es un "+"-forma. Tiene dos brazos abiertos (30 cm x 5 cm x 0.5 cm) frente a la unos a otros y es perpendicular a dos brazos cerrados (30 x 5 x 16 cm) con una plataforma de centro (5 cm x 5 cm x 0.5 cm). El laberinto es elevado a 40 cm del suelo.
    2. Coloque el ratón en la intersección de los brazos abiertos y cerrados, hacia el brazo abierto que está enfrente del experimentador (figura 1). Registrar el comportamiento durante 5 minutos antes de regresar el ratón a la jaula del hogar. Repita hasta que todos los ratones son probados.
      Nota: Entrar en el laberinto con su cara en el brazo abierto podría aumentar la exploración del ratón del brazo abierto.
    3. Medir el tiempo el ratón en los brazos abiertos (tabierto) y en los brazos cerrados (tcierre) basados en el video: tabra/t decierre indica el nivel de ansiedad.
  5. Prueba de nado forzado11
    1. El aparato de la prueba de nado forzado es un tanque cilíndrico de 30 cm de altura y 20 cm de diámetro. Llene el tanque hasta 15 cm de alto con agua del grifo a temperatura ambiente (23-25 ° C).
      Nota: Utilice agua fresca para cada ratón.
    2. Iniciar la grabación de vídeo y suavemente ponga el ratón en el agua, en el centro del aparato. Registro el video de 6 min antes de colocar el ratón en su jaula casera bajo luz infrarroja.
      Nota: No toque el ratón lo sumergimos o torciendo su cola.
    3. Medir el tiempo de inmovilidad en lo últimos 5 min del video grabado. Movilidad significa cualquier movimiento distintos de los necesarios para equilibrar el cuerpo y mantener la cabeza sobre el agua.
  6. Reconocimiento de objeto novedoso test17,18
    1. Establecer la prueba de reconocimiento de objetos nuevos con 2 días de habituación, 1 día de familiarización y 1 día de la prueba (figura 1); cada sesión es de 10 min por ratón, y el intervalo de intercesión es 24 h.
      Nota: La habituación con la prueba de campo abierto se realiza como se describe en la sección 2.1. El ratón interactúa con dos objetos idénticos (objetos viejos) de familiarización. En la prueba, el ratón interactúa con uno de los objetos antiguos y un nuevo objeto, ambos colocan en el mismo lugar que los objetos de familiarización. El aparato de la prueba de reconocimiento de objeto novedoso incluye un espacio de campo abierto y dos conjuntos de objetos. Cada conjunto contiene dos objetos idénticos (objetos A y A y B y B). Objetos A y B son similares en tamaño pero diferente en textura (papel de plástico de vidrio), forma (redonda/litro) y color (brillantes/oscuros). Los objetos deben ser lo suficientemente grande como para que el ratón explorar dentro de 10 min y sin olor. El tamaño adecuado para adultos ratones C57BL/6N es 8 cm de altura y 5 cm ancho/in de diámetro.
    2. Marque las posiciones de los dos objetos en la familiarización y la prueba, que son 5 cm de lado y 7 cm de la parte superior de la arena.
      Nota: Marque la posición en la noche antes de la familiarización para evitar el olor de la pistola.
    3. En la familiarización, el ratón interactúa con un conjunto de objetos idénticos. Limpiar la arena y los objetos como se describe en el paso 1.2.4 antes de colocar el ratón en la arena, hacia el centro de la pared como se muestra en la figura 1. Récord de 10 minutos antes de regresar el ratón a la jaula del hogar. Repita hasta que todos los ratones son terminados y volver todas las jaulas a la unidad animal.
      Nota: Contrarrestar los objetos utilizados en la familiarización del grupo para disminuir el sesgo (por ejemplo, ratones Nº 1 y 2 explorar objetos A y A y ratones Nº 3 y 4 explorar objetos B & B; de esta manera, el nuevo objeto es objeto B para ratones no. 1 y 2 y objeto A para los ratones. 3 y 4).
    4. Realice la prueba de 24 h después de la familiarización. Utilice el mismo procedimiento en cuanto a la familiarización, excepto reemplazar uno de los objetos con uno de otro conjunto (figura 1). Repita hasta que todos los ratones han realizado la prueba y, después, volver a las jaulas a la unidad animal.
      Nota: Contrapeso del lado del nuevo objeto en el grupo para disminuir el sesgo (por ejemplo, introducir ratones Nº 1 y 3 objetos A y B y ratones no. 2 y 4 a B y A los objetos). De esta manera, el objeto de la novela muestra a la derecha para ratones no. 1 y 4 y en el lado izquierdo para ratones no. 2 y 3. Aquí, el lado izquierdo es el lado izquierdo del experimentador frente a la arena.
    5. Medir el tiempo que cada ratón interactúa con los nuevos objetos (tnuevo) y viejo (tviejo) por separado, de las imágenes en la fase de prueba. Una interacción entre el animal y el objeto se describe en la nota siguiente paso 2.3.4. Calcular la memoria del ratón como la preferencia por la novela objeto = tnuevo/tviejo; o tnuevo/ (nuevo t + tviejo).
      Nota: tnuevo/tviejo es igual a 1 o tnuevo/ (nuevo t + tviejo) es igual a 0.5 significa que el ratón no tiene ninguna preferencia para el objeto nuevo (es decir, deterioro de la memoria). El tiempo de interactuar con objetos en la familiarización puede servir como control del experimento. El tiempo total que indica la actividad de exploración del ratón, y sugiere tizquierda/tderecha diagonal espacial.
  7. 16 de la prueba del laberinto acuático de Morris
    1. Configurar el aparato como se indica a continuación.
      1. Poner el laberinto de agua, un estanque circular (de 120 cm de diámetro y 60 cm de profundidad), en el centro de una sala de comportamiento y marque la posición del laberinto para asegurar que la posición sigue siendo la misma durante todo el experimento.
      2. El laberinto se dividen en cuatro cuadrantes imaginarios iguales. Cuelgue las claves visuales (p. ej., círculo, cuadrado, triángulo y Pentágono) en el centro de cada cuadrante, 130 cm sobre el piso y la pared del laberinto 53 cm.
        Nota: El laberinto y la señal deben permanecer en la misma posición durante la prueba entera, así el ratón puede formar memoria espacial precisa.
      3. Colocar una plataforma de 25 cm de la pared, en el centro del cuarto cuadrante y marque la posición. La plataforma para el ratón es de 10 cm de diámetro.
        Nota: La posición y el diámetro de la plataforma de determinan la dificultad de la tarea. El más cercano es a la pared del laberinto, o cuanto mayor sea la plataforma, más fácil la tarea.
      4. El laberinto de agua se llenan de agua (con una temperatura de 23 a 25 ° C, de color en blanco y opaco por leche en polvo, alimento, polvo de blanquear) hasta el nivel del agua es superior a la plataforma 1 cm. Traer los ratones en la habitación comportamiento durante 15 a 30 min de la habituación como se muestra en el paso 1.2.3 y encienda la luz infrarroja por encima de las jaulas, que se utilizará para secar los ratones.
        Nota: Cubra la parte superior de la plataforma con tela blanca y la red para que el ratón puede subir fácilmente a él. Asegúrese de que no hay ninguna iluminación directa sobre el agua.
    2. Llevar a cabo la fase de entrenamiento como sigue.
      1. La fase de entrenamiento tarda 5 días, cuatro ensayos por día. Semi-aleatoriamente organizar los puntos de partida cada día según lo demostrado en la literatura16. Este esfuerzo evita que el ratón establecer la memoria asociativa, que es la forma más común de "hacer trampa" en la prueba.
      2. Al principio de cada ensayo, iniciar la grabación de vídeo y suavemente ponga el ratón en el laberinto.
        Nota: No soltar el ratón en el tanque o tuerza la cola, que puede causar desorientación y tensión extra.
      3. Pedir el experimentador a permanecer fuera de la vista del ratón y volver a llevar el ratón a su jaula casera cuando cualquiera de los siguientes ocurre: () el mouse no puedo localizar la plataforma dentro de 60 s; (ii) el ratón encuentra la plataforma dentro de 60 s y se mantiene en ella por 10 s. En circunstancia (i), pedir el experimentador al colocar el ratón en la plataforma y deje que se quedan para 10 s.
        Nota: Punto (ii) significa que el ratón correctamente situada la plataforma.
      4. Parar el vídeo y volver a poner el ratón en la jaula casera bajo luz infrarroja.
        Nota: Mantener la temperatura corporal de los ratones es fundamental para su desempeño porque hipotermia hace hincapié en ratones y puede afectar las siguientes pruebas.
      5. Repita el procedimiento con otro ratón.
      6. Registro la latencia de escape, que es la duración del período que pasa el ratón en el laberinto, de entrar en el laberinto hasta el momento con éxito basado en el video, localiza la plataforma. Si el ratón no puede encontrar la plataforma o se queda allí por menos de 10 s de 60 s, la latencia de escape cuenta como 60 s. diagrama la curva de aprendizaje contra los días de entrenamiento con la latencia de escape promedio por día.
        Nota: La latencia de escape no incluye los 10 s pasar en la plataforma.
    3. Realizar la fase de prueba como sigue.
      1. En el sexto día de la prueba del laberinto de agua de Morris, configurar el aparato como se describe en paso 2.7.1., tomar una foto del laberinto para registrar la posición de la plataforma y luego retire la plataforma del tanque.
      2. Iniciar el grabación de vídeo y suavemente ponga el ratón en el laberinto en el cuadrante diagonalmente opuesto al cuadrante blanco.
      3. Pedir el experimentador a permanecer fuera de la vista del ratón durante la grabación de vídeo de 1 minuto. Después, tienen el experimentador tome el ratón por el laberinto y poner de nuevo en la jaula del hogar.
      4. Usar la imagen tomada en el paso 2.7.3.1. como referencia para medir la duración de la travesía de cualquier plataforma. Tiempo de duración que el ratón se queda en el cuadrante de destino (destinode t), según el video. El tiempo total es ttotal. Medir la preferencia por el cuadrante blanco como /t dedestino de ttotal.

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Representative Results

Esta batería de pruebas conductuales fue diseñada para el análisis del comportamiento integral y válido de motor, el estado de ánimo y la cognición, que comúnmente son afectadas en la neurodegeneración5. Hemos aplicado esta batería para estudiar los cambios conductuales en ratones C57BL/6N adultos jóvenes después de la exposición respiratoria a nanopartículas de sílice para 1 mes y 2 meses18. Los resultados revelaron que ratones C57BL/6N expuestos a nanopartículas de sílice mostraron varios cambios conductuales después de exposición diferentes veces18. Brevemente, los resultados en el campo abierto (figura 2A) y la prueba aceleración rotarod (figura 2B) demostró que la exposición de nanopartículas de sílice no afectó la función locomotriz o motor en ratones, lo que indica una capacidad completa de implantación de las otras pruebas. Actividad de interacción social fue afectado después de una exposición de 1 mes a nanopartículas de sílice (figura 2). Considerando la ansiedad o la depresión disminuiría también sociabilidad, analizamos los datos de la prueba de campo abierto, elevado más prueba del laberinto (Figura 2DE) y el test de natación forzada (figura 2F), que no indicaron ninguna comorbilidad de ansiedad ni depresión en el punto de tiempo de 1 mes. Una exposición de 2 meses a nanopartículas de sílice dio lugar a la ansiedad según los resultados en la elevación más prueba del laberinto (Figura 2E). Una tendencia similar se muestra en la duración de la zona central en la prueba de campo abierto (Figura 2D). Deterioro cognitivo también fue detectado en el test de laberinto de agua de Morris y objeto de nuevo reconocimiento prueba después de una exposición de 2 meses (figura 3). Cabe señalar que el protocolo era ligeramente diferente en los dos ensayos de la prueba del laberinto de agua de Morris. Una lámpara adicional fue agregada en el segundo ensayo, por lo que todos los ratones me alojé siempre debajo de la lámpara para mantener el calor. Por lo tanto, no nonperformer fue demostrada en el segundo ensayo, mientras que dos de los ocho ratones se convirtieron nonperformers en la prueba de la sonda en el primer ensayo.

Nos ajusta el protocolo para que la mayoría de las pruebas de la batería puede probar varias veces. La clave está en mantener la motivación de las pruebas. Pruebas como el test de interacción social, prueba de reconocimiento de objeto novedoso y elevada plus prueba de laberinto está motivado por la novedad (es decir, un ayudante juvenil novela novela objetos y un ambiente de novela, respectivamente). Al mantener la novedad en el protocolo, los ratones C57BL/6N adultos jóvenes demostraron un desempeño consistente cuando se prueban otra vez después de 1 mes. Según nuestros datos, cuando introdujo a dos ayudantes diferentes en los dos ensayos, ratones consistentemente mostraron una preferencia mayor que diez veces al ayudante que a la cámara de vacíela en la interacción social de prueba (Figura 4A). En la prueba de reconocimiento de objetos nuevos, los ratones normales preferían constantemente el nuevo objeto el objeto antiguo (Figura 4B). Sin embargo, en el elevado más la prueba del laberinto, cuando otra vez en el mismo ambiente después de 1 mes, la exploración se redujo en medio (figura 4)10. Teóricamente, ratones C57BL/6 adultos jóvenes pueden probarse repetidamente en estas pruebas como la condición experimental, incluyendo la novedad y el estado de los ratones, sigue siendo el mismo. Hemos repetido estas pruebas cada mes para hasta tres veces en nuestro laboratorio. Notable, la prueba del laberinto de agua de Morris no se prueba repetidamente en el mismo grupo de ratones C57BL/6N de adultos jóvenes que la experiencia interfiere significativamente con el rendimiento cuando se prueban varias veces. Según nuestros datos, los ratones aún recuerdan la plataforma incluso después de 1 mes, mostrando la memoria espacial a largo plazo y correcta. Cuando se cambia la posición de la plataforma, los ratones experimentados aprendieron más rápido que los ratones de ingenuo, como habían aprendido las reglas y la estrategia de búsqueda de la formación previa (figura 4).

Figure 1
Figura 1: esquemas de. (A) arreglo de la conducta prueba de batería y los diagramas esquemáticos (B) la prueba de interacción social, (C) el elevado además de laberinto de prueba y (D) la prueba de reconocimiento de objeto nuevo. Abreviaciones: R = aceleración rotarod test; DE = prueba de campo abierto; EPM = elevado además de laberinto de prueba; NI = prueba de reconocimiento de objeto novedoso; SI = test de interacción social; MWM = test de laberinto de agua de Morris; FST = test de natación forzada. El punto de partida del ratón en la prueba se muestra en el ratón en el esquema. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: cambios en el motor y el estado de ánimo en ratones expuestos a las nanopartículas de sílice durante 1 mes o 2 meses, detectado por la batería de pruebas conductuales. Ratones fueron probados en (A y D) el campo abierto prueba, (B) el rotarod, (C) la prueba de interacción social, (E) el elevado más prueba del laberinto y la prueba de natación (F) el forzado en la batería. N = 8, 12 o 20, que significa que cada grupo tuvo 8, 12 o 20 ratones, respectivamente, como se demuestra en cada figura. N = 17-20 significa cada grupo tenía 20 ratones, excepto un grupo de control en 1 mes, que consistió en 17 ratones. En los paneles A, Dy E, datos primero se normalizaron al control en cada momento y, entonces, se analizaron con de Student de dos colas t-test. Los datos en el panel B se analizaron por medidas repetidas ANOVA de dos vías. Se analizaron los datos en los paneles C y F de Student dos colas t-test. Todos los datos se muestra como decir ±S.E.M. * y *** significan p < 0.05 y 0,0001, respectivamente. Estos datos han sido publicados previamente por usted et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: cambios en la cognición después de estar expuestos a nanopartículas de sílice durante 1 mes o 2 meses. Cambios en la cognición de los ratones después de ser expuestos a nanopartículas de sílice para (A) 1 mes o (E) 2 meses, detectado por el reconocimiento de la novela objeto de prueba. Cambios en la cognición de los ratones después de estar expuestos a nanopartículas de sílice para (B - D) 1 mes o (F - H) 2 meses, detectados por la prueba del laberinto de agua de Morris. Ratones fueron probados varias veces en la prueba de reconocimiento de objeto nuevo. Un lote diferente de ratones fue probado en el test de laberinto de agua de Morris en diferentes puntos temporales. N = 6, 8, 12 o 20, que significa que cada grupo tenía 6, 8, 12 o 20 ratones, respectivamente, como se demuestra en cada figura. En los paneles A, C, D, E, Gy H, los datos se analizaron con dos colas estudiante t-pruebas. Se analizaron los datos en los paneles B y F por medidas repetidas ANOVA de dos vías. Todos los datos se muestran como media ±S.E.M. * significa p < 0.05. Estos datos han sido publicados previamente por usted et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: datos representativos en pruebas. Datos representativos en pruebas, incluyendo la prueba de (A) la interacción social, prueba de (B) el reconocimiento de objetos nuevos y (C) el elevado más la prueba del laberinto, probaron en ratones ingenuos (ensayo 1) y probaron varias veces en el mismo lote de ratones (prueba 2) . (D) datos representativos del laberinto acuático de Morris prueba cuando repetidamente. Esta figura se ha modificado de lo et al18. Todos los datos se muestran como media ±S.E.M. y analizados con impar del estudiante t-pruebas. P < 0.001, en comparación con el ensayo 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Análisis del comportamiento de los ratones son fundamental para la investigación de la neurodegeneración. Mientras que la función cognitiva es a menudo más susceptibles de dominio del comportamiento afectado en enfermedades neurodegenerativas, disfunción del estado de ánimo, como depresión y ansiedad, es a menudo comorbid. Por otra parte, la función motora afecta a menudo la interpretación de los resultados en algunas pruebas, como la prueba de reconocimiento de objetos nuevos, la elevada plus prueba de laberinto y la prueba de interacción social. Partiendo de estas reflexiones, una batería de pruebas de comportamiento integral se requiere para una evaluación general y precisa de los comportamientos.

El primer paso es elegir las pruebas adecuadas. Se incluyeron pruebas clásicas y bien aceptadas, es decir, la prueba de campo abierto y la prueba del rotarod para la función motora, la elevada plus prueba de laberinto para la ansiedad, la prueba de nado forzado para la depresión, la prueba de interacción social para la sociabilidad y el laberinto acuático de Morris prueba y el reconocimiento de la novela objeto de prueba para la cognición. Hay tres pruebas clásicas para la ansiedad, es decir, la prueba de campo abierto, el elevado además de prueba y la prueba de caja de luz/oscuridad. Estas pruebas todos explotan el conflicto entre la curiosidad natural acerca del ambiente de la novela y la aversión al campo abierto, elevado o brillantemente iluminada. Por lo tanto, los ratones no están condicionados por estímulos nocivos, tales como descargas eléctricas, olores de depredadores y así sucesivamente. Sin embargo, abundantes estudios han revelado que estas pruebas tienen poca fiabilidad más intertest, incluso dentro de un solo laboratorio21. Utilizó la prueba de campo abierto y elevado más prueba de laberinto para analizar la ansiedad en ratones en el menor tiempo posible. La prueba de campo abierto examina ansiedad-como comportamiento, además de la función locomotriz y también es la habituación para la prueba de interacción social y prueba de reconocimiento de objeto nuevo. Elegimos el plus elevado laberinto de prueba ya que es un paradigma bien establecido. Tiene validez de cara excelente (similitud fenomenológica entre el comportamiento en los ratones y los síntomas de pacientes), validez de constructo (el grado en que la prueba refleja los supuestos teóricos subyacentes) y validez predictiva (la exactitud de resultados de la prueba al traducir a los seres humanos)10. Si la ansiedad era la prioridad, los investigadores podrían considerar incluyendo el cuadro oscuro/luz de prueba y analizar exhaustivamente el comportamiento en estas pruebas con más parámetros, como frecuencia de cría, tramo asistir a comportamiento y defecación21. En segundo lugar, los resultados de estas pruebas pueden ser fácilmente interpretado porque las motivaciones de las pruebas son claras, que son la innata curiosidad por la novedad o agua, para realizar una tarea sencilla en una condición controlable. A diferencia del hambre y de formación, que puede causar diferentes niveles de motivación en los ratones, este tipo de motivación es lo suficientemente fuerte para la mayoría del ratón C57 para realizar la tarea. En tercer lugar, estos test tienen una buena compatibilidad con los demás, porque la motivación no es demasiado estresante para causar estrés a largo plazo o incluso permanente, tal como puede causar choques eléctricos o privación de alimentos y agua. Pruebas de desesperación, incluyendo la prueba de nado forzado y la prueba de suspensión de la cola, utilizan el principio de que el ratón abandona luchando cuando atrapado en un ambiente de desesperación. Midiendo el "tiempo de desesperación", las pruebas Dile cómo deprimido es el ratón. Ratones C57BL/6N generalmente muestran 180 s de inmovilidad de 300 s en estas pruebas de11,22. Elegimos la natación forzada prueba sobre la prueba de suspensión de la cola porque es comparativamente menos estresante cuando el ratón tiene experiencia en agua laberinto de entrenamiento. De esta manera, ellos se adaptan al agua y saben cómo prevenir la hipotermia después de mojarse. En cambio, observamos alrededor de 2 g de pérdida de peso corporal durante la noche después de la prueba de suspensión de la cola, lo que indica gran estrés. Sin embargo, la prueba repetida de la prueba de nado forzado debe hacerse con cautela, y los ratones necesitan recuperar para un tiempo más largo que 24 horas antes de cualquier otros experimentos/sacrificios. Alternativamente, los científicos pueden considerar como una prueba de preferencia de sacarosa, un paradigma que se utiliza extensivamente en la anhedonia como depresión inducida por el estrés, en la batería. Sin embargo, el protocolo de esta prueba requiere días de habituación a vivienda individual23, que puede ser un estímulo que afecta el resultado de otras pruebas. Por último, las pruebas aquí tienen rendimiento razonable. Todas las pruebas pueden terminar dentro de 10 min y el ratón. Al aumentar la cantidad de equipos, tales como la arena del campo abierto, los canales en la prueba del rotarod, los tanques en el test de natación forzada y los carriles en la prueba de suspensión de la cola, también se puede aumentar el rendimiento. Aunque el test de laberinto de agua de Morris dificulta probar varios ratones al mismo tiempo, cada ensayo toma solamente s ~ 60-75.

La preocupación más importante al aplicar la batería de pruebas de comportamiento es la interferencia entre las pruebas y el estrés de manejo frecuente. Los efectos adversos de estas cuestiones pueden ser minimizados optimizando más el orden y el intervalo de la prueba. Si bien es sentido común que debe ser el orden de las pruebas de comportamiento de menos a los más estresantes para el ratón, algunas pruebas de esta batería puede utilizarse como aclimatación para los siguientes exámenes y mejorar la estabilidad de la actuación. Por ejemplo, realizar el elevado plus prueba de laberinto tras la prueba de campo abierto aumenta la exploración del brazo abierto10. Además, cuando los ratones son probados en la orden de prueba de campo abierto, prueba de reconocimiento de objetos nuevos y prueba de interacción social, poco a poco habituarse al entorno y la tarea, incluyendo la sala de comportamiento, campo abierto y los objetos. Por lo tanto los ratones están poco probable que manifiestan neofobia7,24,25, que significa que muestra una inusualmente baja interacción con el nueva objeto/persona y todo adecuadamente se centran en la tarea. Este arreglo reduce la fluctuación de datos de pruebas que están motivados por la curiosidad innata. La prueba del laberinto de agua de Morris y la prueba de nado forzado tienen una motivación más fuerte. Por lo tanto, los ratones están poco probable ser afectado por la experiencia de las pruebas. Transporte frecuente y la manipulación durante el procedimiento entero es otra fuente de estrés, por lo que requiere adecuado manejo animal y habituación suficiente. Se recomienda que el intervalo de prueba en la batería debe ser al menos de 24 h, por lo que los ratones pueden recuperarse de la tensión de estos estresores26,27,28. Sin embargo, hay otros estudios que probaron ratones en pruebas múltiples por día29.

Otra preocupación acerca de la prueba repetida de los comportamientos es la influencia de la experiencia previa. El campo abierto y la prueba aceleración rotarod pueden utilizarse repetidamente en el análisis de la función motora. Motivada por la novedad de pruebas, incluyendo el elevado plus prueba de laberinto, la prueba de reconocimiento de objetos nuevos y la prueba de interacción social, pueden ser utilizadas varias veces cuando la motivación es la novela en cada ensayo, lo que significa un nuevo ambiente experimental, pares de objetos , o ayudante, respectivamente. Como se muestra en los datos representativos, ratones C57BL/6N no pueden entrenar repetidamente en el protocolo clásico de la prueba de laberinto de agua de Morris como recordaban la estrategia de búsqueda de la experiencia.

Esta batería evalúa múltiples dominios del comportamiento. De esta manera, los resultados en algunas pruebas pueden ser una referencia para la interpretación de los datos de los demás. En los datos del representante en la figura 1, cuando los ratones expuestos a nanopartículas de sílice para 1 mes mostraron una reducción en la actividad de interacción social, podría ser el fenotipo de la depresión o la ansiedad o la consecuencia de un déficit de la función motora. Sin embargo, los resultados de las pruebas de función y ansiedad motor indican que la disminución en la interacción social es primario, no posterior. Además, esta batería contiene diferentes pruebas para el mismo dominio de comportamientos, con diferente sensibilidad y uso. Constante tendencia y resultados en estas pruebas aumentan la fiabilidad de la batería. Sin embargo, este arreglo toma tiempo extra durante todo el procedimiento. El experimento a corto plazo que lleva menos de 1 mes debe usar una versión simplificada de esta batería.

Esta batería de pruebas de comportamiento está diseñada para detectar el fenotipo conductual que se muestra en las diferentes etapas después de la exposición al factor de riesgo genético o ambiental de la neurodegeneración. Por lo tanto, este protocolo sólo enumera las lecturas esenciales de cada prueba. Cabe destacar que cada ensayo conductual puede proporcionar cargas de información; por lo tanto, el usuario puede ampliar el protocolo de investigación adicional. Por ejemplo, la actividad espontánea como el grooming, cría, defecación y thigmotaxis en campo abierto revela la emoción8. Estos rasgos de comportamiento en el elevado más prueba de laberinto también puede ser indicadores de ansiedad10,21. El motor de los estudios de prueba rotarod aprendiendo los ratones entrenan después de modelado, enfermedad Inicio exposición a factores de riesgo ambiental30. La prueba de interacción social también puede estudiar memoria social mediante la introducción de un segundo ayudante novela después de la prueba de sociabilidad9. Por lo tanto, expansión de la batería puede personalizarse para adaptarse a diferentes prioridades de estudio. Sin embargo, esta batería ha sido probada sólo en ratones C57BL/6N adultos jóvenes debido a limitaciones de tiempo. El rendimiento de la base de otras cepas o ratones C57BL/6 años de edad puede ser diferente. Por otra parte, modelos de ratones transgénicos neurodegenerativas pueden exhibir déficits conductuales tales como hipo - o hiperactividad. Por lo tanto, no pueden ser adecuados para las pruebas con una motivación baja, como el test de reconocimiento de objeto novedoso. Por lo tanto, más optimización debería ser necesaria para la evaluación del comportamiento de estos ratones.

En conclusión, esta batería permite un análisis convincente y completa del comportamiento de la neurodegeneración en la cepa de ratón C57. Es más adecuado para estudios longitudinales relacionadas con la neurodegeneración de la toxicidad de los factores de riesgo/neurotoxina potencial o desarrollo de fármacos, que a menudo cuenta con administración a largo plazo y repetidas pruebas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Dr. Cora SW Lai de la escuela de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Hong Kong, para prestar el elevado además de prueba de laberinto y el Departamento de Anestesiología de la Universidad de Hong Kong para el préstamo del aparato de prueba del rotarod.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
chambers in social interaction test home made (8 cm (L) x 6 cm (W) x 12 cm (H)), transparant with holes, plastic
cylindrical tanks used in forced swimming test home made 30 cm height, 20 cm diameters, glass
elevated plus maze home made open arms (30 cm x 5 cm x 0.5 cm) ,closed arms (30 cm x 5 cm x 16 cm), center platform (5 cm x 5 cm x 0.5 cm), 40 cm tall. Plastic, nontransparant
IITC Roto-Rod Apparatus IITC life science Inc. 755, series 8
open field arena home made 60 cm (L) x 60 cm (W) x 40 cm (H), plastic, nontransparant
water maze home made 120 cm in diameter, 60 cm deep, steel

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You, R., Liu, Y., Chang, R. C. C. A Behavioral Test Battery for the Repeated Assessment of Motor Skills, Mood, and Cognition in Mice. J. Vis. Exp. (145), e58973, doi:10.3791/58973 (2019).

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