Summary
一个全面的行为测试电池的运动技能, 情绪-包括社会交往, 抑郁, 焦虑-和认知是设计的重复评估神经退化相关的行为变化在小鼠。
Abstract
神经退行性变的药理和毒理研究需要对小鼠进行全面的行为分析, 因为运动功能障碍以及情绪和认知功能障碍是神经退行性疾病中常见且经常共有的症状。这里展示的是用于电机、情绪和认知的行为测试电池, 可以在纵向研究中反复测试。该电池通过至少两项独立的公认测试 (即运动功能的露场测试和 trogarod 测试、社会交往测试、升高加迷宫测试和情感功能的强制游泳测试, 莫里斯水迷宫测试和认知功能的新对象识别测试)。因此, 这种灵敏、全面的测试电池是研究神经退行性变行为变化的有力工具。
Introduction
神经退行性疾病具有破坏性的行为症状, 包括认知障碍、焦虑和抑郁等情绪障碍或运动功能障碍1。各种神经退行性疾病的发病机制尚不清楚2。累积的研究表明, 遗传和环境因素都可能导致神经退行性疾病的发病机制。确定神经退行性变的危险因素需要行为分析。虽然每种类型的神经退行性疾病都有其特征性行为症状 (例如, 阿尔茨海默氏病 [ad] 的特点是认知障碍和帕金森病 [pd] 与运动功能障碍)。随着病情的发展, 患者表现出不同行为异常的合并症 3.例如, ad 患者在晚期第4、5 阶段出现情绪功能障碍症状。pd 患者可能会发展为与 pd 相关的痴呆, 并出现认知障碍6。基于这些特征, 神经退行性变模型的行为分析通常是全面和重复的。
为了实现这一目标, 设计了一种具有良好有效性的经典且广泛使用的行为测试的电池, 用于电机、情绪和认知方面的行为分析。通过开场试验7、8 和加速旋转试验, 可以对电机功能进行测试。情绪功能障碍, 包括社会功能障碍、抑郁和焦虑, 在神经退行性疾病中最常见5。因此, 这种电池包括社交性 9的社会互动测试、焦虑10的提升加迷宫测试和抑郁症的强制游泳测试。认知障碍是 ad 和额叶痴呆等神经退行性疾病中最典型的症状之一.认知领域, 包括短期记忆和插曲记忆, 容易发生神经退行性变13,14,15。因此, 电池中包括了空间学习和记忆16 的莫里斯水迷宫测试和短期记忆17的新目标识别测试。这些测试是相互兼容的。测试的顺序旨在最大限度地提高习惯和最大限度地减少干扰, 以进一步提高电池内的兼容性。由于每个函数至少由两个原则和方法不同的独立测试进行测试, 因此每个测试的结果可以进一步验证。此外, 还重点介绍了一些试验的方案, 以便反复检测, 从而促进神经退行性疾病发展的纵向研究。因此, 这种行为测试电池研究不同的子域的行为变化看到在不同阶段的神经退行变, 而花费的动物最少数量。这种电池已被用于一项纵向研究, 评估年轻成人 (3个月大) 男性 c57bl/6n 小鼠在呼吸接触二氧化硅纳米颗粒后的行为变化, 这是一种职业危害, 是一种潜在的危险因素。神经退行性变18。然而, 其他菌株或模型, 如衰老的小鼠和基因操纵的小鼠, 可能会表现不同于年轻的 c57bl/6n 小鼠。因此, 在这些鼠标中使用此电池时可能需要小心。
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Protocol
这里所描述的所有方法都已获得香港大学教与研究中使用活体动物委员会 (culatr) 的批准。
1. 一般议定书
请注意:本节以执事19为基础。
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行为室设置
- 在行为室中, 消除不相关的刺激/干扰, 包括实验设备上的直射明亮的光线、气味、噪音和其他不相关的动物 (应在约10米2 , 可调节的照明, 最好是有一个前厅)。
请注意:由于老鼠是夜间动物, 在野外试验、新的物体识别试验和社会交往测试中, 15 勒克斯以下的照明可以最大限度地减少光的干扰应力, 帮助鼠标专注于测试。 - 将摄像机设置在地板上方至少1.5 米的视频录制中, 确保它不在测试鼠标的视线范围内。
- 在行为室中, 消除不相关的刺激/干扰, 包括实验设备上的直射明亮的光线、气味、噪音和其他不相关的动物 (应在约10米2 , 可调节的照明, 最好是有一个前厅)。
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住房和居住
- 将小鼠安置在动物单位中, 观察 (例如, 群库不超过4只成年小鼠)。
请注意:在这里, 3个月大的雄性 c57bl/6n 小鼠被使用并被安置在1144b 的笼子里。排除生病、受伤或压力严重的老鼠。饥饿、口渴或被欺负的经历可能会影响鼠标的性能。 - 安排同一个动物处理人员进行所有的行为测试, 以减少变异性。在上午7:00 至晚上7:00 的光循环期间进行运输、搬运和实验。如有可能, 在测试结束后安排所有其他处理, 如任何药物毒素 (例如鼻内注入二氧化硅纳米颗粒) 或清洗笼子。
- 在每次实验之前, 用随机数重新使用保持笼子, 使实验者失明。将小鼠放置在行为室的实验环境中, 在他们的家庭笼子里呆上15到30分钟。在整个实验过程中, 把家里的笼子放在行为室。
- 在开始实验之前, 在仪器中放置一个非实验 c57bl/6n 小鼠, 使第一只小鼠的实验条件与其他小鼠相同。然后, 将设备清洗如下: 用干净的纸巾取出尿液和粪便, 用自来水清洁实验装置, 然后用纸巾轻轻喷洒70% 乙醇擦拭设备, 将设备盖上鼠标留下的异味。
- 为了最大限度地减少实验者造成的干扰, 请实验者在录像过程中离开行为室, 或在莫里斯水迷宫测试期间呆在窗帘后面。
- 将小鼠安置在动物单位中, 观察 (例如, 群库不超过4只成年小鼠)。
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行为测试安排
- 按图1a 所示的顺序排列行为测试。计划在24小时前执行间隔的测试, 但提升加迷宫测试除外。
请注意:由于整个过程最多需要 2周, 在急性或短期研究中应用之前, 请在类似的测试中进行选择, 以简化电池。
注意事项:2天的开场试验保证了新的目标识别试验的适当适应。最后测试强制游泳试验, 因为它可能会导致 c57bl/6n 小鼠的压力。
- 按图1a 所示的顺序排列行为测试。计划在24小时前执行间隔的测试, 但提升加迷宫测试除外。
2. 行为测试协议
- 公开测试8、18、19、20
- 在60厘米 (长 [长]) x 60 厘米 (宽 [宽]) x 40 厘米 (高度 [h]) 不透明的白色塑料竞技场中进行开田测试。
请注意:使用多个竞技场可以提高测试的吞吐量。 - 开始相机录制, 轻轻地将鼠标放在竞技场墙的中间, 面对着同一堵墙。记录鼠标的行为 10分钟, 然后将其返回到主笼子。按照步骤1.2.4 中的说明清洁设备。
请注意:开放场测试的起点也可以是竞技场的中心。在老鼠中保持一致。 - 重复此操作, 直到所有的老鼠完成该协议。在组之间平衡测试顺序。
- 按如下方式执行数据分析。
- 将竞技场分成四个正方形, 在计算机屏幕上分成四个正方形 (虚构的网格)。要评估运动功能, 请计算鼠标在竞技场上的线数19。
请注意:"越线" 的定义是后肢交叉的时候。此定义也适用于提升加迷宫测试。 - 测量在中心区域花费的时间, 作为焦虑的指标。中心区域是竞技场中央的四个广场。
请注意:其他参数, 如饲养 (两个前爪离地, 前爪靠在墙上或站立), 延迟到第一个后方, 和梳理和冻结表明鼠标的情感。 - 或者, 使用跟踪软件 (如 seibenhener 和 wooten8详细介绍) 来测量行驶距离、速度和在中心区域花费的时间。
- 将竞技场分成四个正方形, 在计算机屏幕上分成四个正方形 (虚构的网格)。要评估运动功能, 请计算鼠标在竞技场上的线数19。
- 在60厘米 (长 [长]) x 60 厘米 (宽 [宽]) x 40 厘米 (高度 [h]) 不透明的白色塑料竞技场中进行开田测试。
- 加速转子测试18
- 按照图 1a的计划, 在治疗药物或毒/模型发病前进行3天加速罗塔罗德试验, 并对运动功能进行1天的测试。
请注意:在训练和测试过程中, 鼠标每天接受三次试验。每个试验从杆的旋转开始, 到鼠标的落差结束。 - 将旋转设备放置在行为室的长凳上。避免直接照明设备。将设备从下午4点开始编程, 并在5分钟内加速至40转/分。
- 在每次试验中, 将鼠标放在静态棒上, 面对机器的墙壁。在鼠标结算后启动设备。一旦鼠标掉落并记录鼠标在杆上花费的时间, 就停止设备。立即重复另外两次试验, 然后将鼠标返回家笼。
- 在其他老鼠上重复此过程。
- 在测试过程中测量三个试验的杆的平均花费时间, 以估计电机功能。
请注意:在训练的第三天, 杆子的平均时间是运动功能的基线。
- 按照图 1a的计划, 在治疗药物或毒/模型发病前进行3天加速罗塔罗德试验, 并对运动功能进行1天的测试。
- 社会交往测试18
- 对于社会交往测试, 使用具有两个相同透明腔 (8 厘米 [l] x 6 厘米 [宽] x 12 厘米 [h]) 的开放场地, 表面有孔--以及一种新型的小鼠 (助手), 这是一种与以前没有接触过的同性少年。主题鼠标。图 1 b显示了该过程的方案。按照步骤1.2.4 中所述, 清洁竞技场和房间。
请注意:新颖的老鼠不能是主体老鼠的垃圾或笼子伴侣。它是集体居住和健康的。按照步骤1.2.3 中的描述, 将新型鼠标到行为室15到30分钟。 - 分别将两个房间放置在竞技场对面的两个墙壁的中间。将主题鼠标引入竞技场, 如步骤2.1.2 中所述, 如图 1 b所示, 进行3分钟的探索。将主体老鼠送回家笼, 取出竞技场中的任何尿液或粪便。
- 把帮手放在其中一个房间里将主题鼠标重新引入竞技场并录制 3分钟. 之后, 将两只老鼠送回自己的每个家笼子。对上述其他主题小鼠重复上述步骤。
注: 平衡帮助器的一侧或在组中随机分配它。 - 从视频中, 估计描述小鼠社会交往活动的参数为 t助手/空, 这意味着与帮助室 (t 帮助室) 和空室 (t空)互动的时间比, 或使用识别索引 t帮助器/(t帮助器+ t空)。
请注意:主体鼠标与腔内之间的相互作用被定义为当鼠标的鼻子在室的2厘米范围内, 并指向它。
- 对于社会交往测试, 使用具有两个相同透明腔 (8 厘米 [l] x 6 厘米 [宽] x 12 厘米 [h]) 的开放场地, 表面有孔--以及一种新型的小鼠 (助手), 这是一种与以前没有接触过的同性少年。主题鼠标。图 1 b显示了该过程的方案。按照步骤1.2.4 中所述, 清洁竞技场和房间。
- 高架加迷宫测试 10
- 在所有小鼠在开田测试中进行测试后, 在同一天进行提升加迷宫测试。按照步骤1.2.4 中的说明清洁设备。
请注意:提升加迷宫的配置是一个 "+" 形状。它有两个张开的手臂 (30 厘米 x 5 厘米 x 0.5 厘米) 彼此交叉, 并垂直于两个封闭的手臂 (30 x 5 x 16 厘米) 与一个中心平台 (5 厘米 x 5 厘米 x 0.5 厘米)。迷宫距离地面40厘米。 - 将鼠标放在张开和闭合臂的交界处, 面对与实验者相对的张开臂 (图 1c)。记录行为 5分钟, 然后将鼠标返回到主笼子。重复, 直到所有的老鼠都被测试。
请注意:进入迷宫, 脸放在张开的手臂上, 可以增加老鼠对张开手臂的探索。 - 根据视频测量鼠标在张开的手臂 (t打开) 和封闭的手臂 (t关闭) 中花费的时间: t打开/关闭表示焦虑的程度。
- 在所有小鼠在开田测试中进行测试后, 在同一天进行提升加迷宫测试。按照步骤1.2.4 中的说明清洁设备。
- 强制游泳试验11
- 强制游泳试验的装置是一个圆柱形坦克, 高30厘米, 直径20厘米。在室温 (23-25°c) 下, 用自来水将罐高至15厘米。
请注意:每只老鼠使用淡水。 - 开始录像, 轻轻地将鼠标放入水中, 在设备的中心。录制视频 6分钟, 然后将鼠标放回红外光下的主笼子。
请注意:不要因为溺水或扭动老鼠的尾巴而打扰它。 - 在录制的视频的最后5分钟内测量静止时间。移动性是指除了平衡身体和保持头部在水面以上所需的运动之外的任何运动。
- 强制游泳试验的装置是一个圆柱形坦克, 高30厘米, 直径20厘米。在室温 (23-25°c) 下, 用自来水将罐高至15厘米。
- 新型目标识别测试17,18
- 建立新的对象识别测试, 包括2天的习惯、1天的熟悉和1天的测试 (图 1d);每个会话为每位鼠标 10分钟, 会话间隔为24小时。
请注意:使用露田试验的习惯如第2.1 节所述进行。鼠标与两个相同的对象 (旧对象) 交互以熟悉。在测试中, 鼠标与一个旧对象和一个新对象交互, 这两个对象都放置在与熟悉对象相同的位置。新的目标识别测试装置包括一个开放场竞技场和两套物体。每个集合包含两个相同的对象 (对象 a 和 a 以及对象 b 和 b)。物体 a 和 b 在大小上相似, 但在纹理 (玻璃/浆纸)、形状 (圆立方) 和颜色 (明亮/暗色) 上是不同的。对象应该是无气味和足够大的鼠标在10分钟内探索。成年 c57bl/6n 小鼠的适宜大小为8厘米高, 直径5厘米。 - 在熟悉和测试中标记两个物体的位置, 它们距离侧面5厘米, 距离竞技场顶部7厘米。
请注意:在熟悉的前一天晚上标记位置, 以避免标记的气味。 - 在熟悉中, 鼠标与一组相同的对象进行交互。按照步骤1.2.4 中所述, 清洁竞技场和对象, 然后将鼠标放置在竞技场中, 面对墙壁中央, 如图1d 所示。记录 10分钟, 然后将鼠标返回到家庭笼子。重复, 直到所有的老鼠都吃完了, 把所有的笼子都还给动物单位。
请注意:平衡小组内熟悉对象以减少偏见 (例如, 小鼠1号和2号探索物体 a 和 a, 3号和4号小鼠探索物体 b 和 b; 这样, 新物体是小鼠1号和2号物体的物体 b, 小鼠1号的物体 a。3和 4)。 - 在熟悉后24小时内进行测试。使用与熟悉时相同的过程, 但将其中一个对象替换为另一个集合中的对象 (图 1d)。重复, 直到所有的老鼠都进行了测试, 然后, 把所有的笼子都还给动物单位。
请注意:平衡组中新对象的一侧, 以减少偏差 (例如, 将第1和3号小鼠引入对象 a 和 b, 将第2和4号小鼠引入对象 b 和 a)。这样, 新的物体就会在右侧为1号和4号老鼠显示, 在左侧为2号和3号老鼠显示。在这里, 面对竞技场时, 左边是实验者的左侧。 - 从测试阶段的视频素材中分别测量每个鼠标与新对象 (tnew) 和旧对象 (t旧) 交互的时间。2.3.4 的后续步骤中介绍了动物和对象之间的交互。计算鼠标的内存作为对新对象的偏好 = t新的/旧的;例如:新的/新的).
注: t新/旧等于1或 t新/(t新+ t旧) 等于0.5 表示鼠标对新对象没有首选项 (即内存障碍)。熟悉对象与对象交互的时间可以作为实验的控制。总时间表示鼠标的勘探活动,右键表示空间偏差.
- 建立新的对象识别测试, 包括2天的习惯、1天的熟悉和1天的测试 (图 1d);每个会话为每位鼠标 10分钟, 会话间隔为24小时。
- 莫里斯水迷宫试验16
- 设置设备, 如下所示。
- 将水迷宫 (直径120厘米、深60厘米) 放入行为室的中心, 并标记迷宫的位置, 以确保整个实验期间的位置保持不变。
- 将迷宫分成四个相等的假想象限。将视觉提示 (例如, 圆形、正方形、三角形和五边形) 挂在每个象限的中心, 在地板上方130厘米, 远离迷宫墙53厘米。
请注意:在整个测试过程中, 迷宫和提示必须保持在相同的位置, 以便鼠标可以形成准确的空间记忆。 - 将一个平台放置在距离墙壁25厘米的地方, 位于第四象限的中心, 并标记位置。鼠标平台的直径为10厘米。
请注意:平台的位置和直径决定了任务的难度。离迷宫的墙壁越近, 或者平台越大, 任务就越容易。 - 用水灌满水迷宫 (温度为23至 25°c, 颜色为白色, 由奶粉/食品美白粉制成不透明), 直到水位比平台高1厘米。如步骤1.2.3 所示, 将小鼠带入行为室15到30分钟的习惯, 并打开笼子上方的红外光, 用于干燥小鼠。
请注意:用白布和网覆盖平台的顶部, 这样鼠标就可以很容易地爬上它。确保水面上方没有直接照明。
- 进行以下培训阶段。
- 培训阶段需要 5天, 每天4次试验。如文献16所示, 在每天的起点上进行半随机排列。这种努力阻止了鼠标建立联想记忆, 这是测试中最常见的 "欺骗" 方式。
- 在每次试用开始时, 开始录像, 轻轻地将鼠标放入迷宫中。
请注意:不要将鼠标放入油箱或扭动其尾部, 这可能会导致额外的压力和迷失方向。 - 当发生以下任何情况时, 请实验者远离鼠标视线, 并返回并将鼠标带回其主笼子: (i) 鼠标无法在60秒内找到平台;(ii) 鼠标在60秒内找到平台并在其上停留10秒。在 (i) 的情况下, 要求实验者将鼠标放在平台上, 让它在那里停留10秒。
请注意:点 (ii) 表示鼠标成功定位平台。 - 停止视频, 并将鼠标放回家庭笼子在红外光下。
请注意:保持老鼠的体温对它们的表现至关重要, 因为低温会对小鼠产生压力, 并可能影响以下测试。 - 使用另一个鼠标重复此过程。
- 在视频的基础上, 记录从进入迷宫到成功定位平台的时间, 逃逸延迟, 即鼠标在迷宫中花费的持续时间。如果鼠标在60秒内找不到平台或停留在那里不到 10秒, 则逃逸延迟计为 60秒. 根据训练日绘制学习曲线, 每天平均逃逸延迟。
请注意:转义延迟不包括在平台上花费的10秒。
- 执行探测阶段, 如下所示。
- 在莫里斯水迷宫试验的第六天, 按照步骤 2.7.1. 的步骤设置仪器, 拍摄迷宫的照片, 记录平台的位置, 然后从水箱中取出平台。
- 开始录像, 轻轻地将鼠标放入迷宫中的象限对角线与目标象限相对。
- 在1分钟的视频录制过程中, 请实验者远离鼠标的视线。然后, 让实验者把老鼠带出迷宫, 放回家里的笼子里。
- 使用在步骤2.7.3.1 拍摄的图像。作为测量任何平台交叉的持续时间的参考。视频显示, 鼠标停留在目标象限 (t目标) 中的持续时间。总时间不是总时间。测量目标象限的首选项为 t目标/t总计。
- 设置设备, 如下所示。
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Representative Results
该行为测试电池是为全面有效的运动、情绪和认知行为分析而设计的, 这些运动、情绪和认知是神经退行性变5中常见的。我们应用该电池研究了年轻成人 c57bl/6n 小鼠在呼吸接触二氧化硅纳米颗粒1个月零18后的行为变化.结果表明, c57bl/6n 小鼠接触二氧化硅纳米颗粒后, 在不同暴露时间18 后表现出不同的行为变化。简单地说, 开放场试验 (图 2a) 和加速旋转试验 (图 2A) 的结果表明, 二氧化硅纳米颗粒暴露并不影响小鼠的运动或运动功能, 这表明它们的完全能力是完成其他测试。接触二氧化硅纳米颗粒1个月后, 社会互动活动受到影响 (图 2c)。考虑到焦虑或抑郁也会降低社交能力, 我们分析了野外测试、高架加迷宫测试 (图 2F, e) 和强迫游泳测试 (图 2f) 的数据, 这些数据并不表明有任何合并症。焦虑也不是在1个月的时间点抑郁。暴露在二氧化硅纳米颗粒2个月导致焦虑根据结果在高加迷宫测试 (图 2e)。在开挖场试验中, 中心区域持续时间也显示了类似的趋势 (图 2d)。在暴露2个月后的莫里斯水迷宫测试和新的物体识别测试中也检测到认知障碍 (图 3)。需要注意的是, 在莫里斯水迷宫试验的两次试验中, 该协议略有不同。在第二次试验中又增加了一盏灯, 所以所有的老鼠总是呆在灯下保暖。因此, 在第二次试验中没有显示出任何非表演者, 而在第一次试验中, 八只老鼠中有两只成为了不执行者。
我们调整了协议, 以便电池中的大多数测试都能反复测试。关键是要保持考试的动机。像社会交往测试、新的物体识别测试和高架加迷宫测试这样的测试都是以新颖为动机的 (即, 分别是新的少年帮手、新颖的物体和新的环境)。通过保持协议中的新颖性, 年轻的成年 c57bl/6n 小鼠在1个月后再次测试时表现出了一致性。根据我们的数据, 在这两项试验中, 当被引入两个不同的助手时, 在社会交往测试中, 老鼠对帮助者的偏好一直是对空室的10倍以上 (图 4 a)。在新的物体识别测试中, 正常的小鼠一直倾向于新的物体而不是旧的物体 (图 4b)。然而, 在提升加迷宫试验中, 当1个月后在同一环境中再次测试时, 勘探减少了一半 (图 4c)10。从理论上讲, 只要实验条件, 包括小鼠的新颖性和状态保持不变, 年轻的成年 c57bl6 小鼠就可以在这些试验中反复测试。我们每个月都会在实验室里重复这些测试, 时间长达三次。值得注意的是, 莫里斯水迷宫试验不能在同一组年轻的 c57bl/6n 小鼠中反复测试, 因为这种经验在反复测试时会显著干扰性能。根据我们的数据, 这些老鼠即使在1个月后也会记住这个平台, 显示出正确和长期的空间记忆。当改变平台的位置时, 有经验的老鼠比天真的老鼠学到的东西更快, 因为他们从之前的训练中学到了规则和搜索策略 (图 4d)。
图 1: 原理图.(a) 行为测试电池的安排和原理图的 (b) 社会互动测试, (c) 提升加迷宫测试, (d) 新的对象识别测试。缩写: r = 加速转子测试;= 开放场测试;epm = 提升加迷宫测试;nor = 新的目标识别测试;si = 社会交往测试;mwm = 莫里斯水迷宫试验;fst = 强制游泳测试。鼠标在测试中的起点由鼠标在方案中显示。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 通过行为测试电池检测到暴露于二氧化硅纳米颗粒1个月或2个月的小鼠电机和情绪的变化.在 (a和d) 开放场测试、(b) rotarod 测试、(c) 社会交往测试、(e) 提升加迷宫测试和(f) 电池中包含的强制游泳测试中进行了测试。n = 8、12或 20, 这意味着每个组分别有8、12或20只小鼠, 如每个图所示。n = 17-20 表示每组有20只小鼠, 但1个月时的对照组除外, 该组由17只小鼠组成。在面板 a、 d和e 中, 数据首先被归一化以控制在每个时间点, 然后用双尾学生的t测试进行分析。采用双向方差分析的重复措施对b组的数据进行了分析。用双尾学生 t 检验对c和f面板中的数据进行了分析。所有数据分别显示为平均值±s. e. m. * 和 * * * 平均值 p < 0.05 和0.0001。这些数据以前已由你等人18 公布。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 暴露于二氧化硅纳米颗粒1个月或2个月后认知的变化.小鼠暴露于二氧化硅纳米颗粒后 (a) 1个月或 (e) 2个月后认知的变化, 通过新的物体识别试验检测。在莫里斯水迷宫试验中检测到的小鼠暴露于二氧化硅纳米颗粒 1个月或(f-h ) 2个月后认知的变化。在新的目标识别测试中, 对老鼠进行了反复测试。在莫里斯水迷宫试验中, 在不同的时间点测试了不同的鼠标。n = 6、8、12或 20, 这意味着每个组分别有6、8、12或20只小鼠, 如每个图所示。在a、 c、 d、 e、 g和h 面板中, 用双尾学生的t测试对数据进行了分析。通过双向方差分析的重复措施对b和f组的数据进行了分析。所有数据均显示为平均值±s. e. m. * 均值 p < 0.05。这些数据以前已由你等人18 公布。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 测试中的代表性数据.测试中的代表性数据, 包括 (a) 社会互动测试、(b) 新的物体识别测试和 (c) 在天真的小鼠中测试的升高加迷宫测试 (试验 1), 并在同一批小鼠中反复测试 (试验 2).(d) 莫里斯水迷宫试验反复测试时的代表性数据。这一数字已从你等人18 修改。所有数据均显示为平均值±s. e. m., 并通过未配对学生的t测试进行分析。p < 0.001, 与试验1相比。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
小鼠行为分析对神经退行性变的研究至关重要。虽然认知功能往往是神经退行性疾病最容易受到影响的行为领域, 但抑郁和焦虑等情绪障碍往往是合意的。此外, 在一些测试中, 如新的目标识别试验、高架加迷宫测试和社会互动测试, 运动函数往往会影响对结果的解释。基于这些想法, 需要一个全面的行为测试电池, 以便对行为进行全面和准确的评估。
第一步是选择正确的测试。我们包括了公认的经典测试, 即开放场测试和运动功能的罗加罗德测试、焦虑的提升加迷宫测试、抑郁的强制游泳测试、社交的社会互动测试和莫里斯水迷宫测试和新的认知对象识别测试。焦虑有三个经典的测试, 即开场测试、高升试验和暗光盒测试。这些测试都利用了对小说环境的固有好奇心与对开放、提升或明亮的领域的厌恶之间的冲突。因此, 老鼠不受有害刺激的影响, 如电击、捕食者气味等。然而, 大量的研究表明, 这些测试的内部测试可靠性很低, 即使在一个实验室内也是如此。我们使用开场试验和高架加迷宫试验, 在最短的时间内分析小鼠的焦虑。野外试验除了运动功能外, 还考察了焦虑样的行为, 也是新的对象识别测试和社会交往测试的习惯。我们选择了高架加迷宫测试, 因为它是一个成熟的范式。它具有出色的面部有效性 (小鼠行为与患者症状之间的现象学相似性)、构造有效性 (测试反映基本理论假设的程度) 和预测有效性 (将它们翻译给人类时的测试结果)10。如果焦虑是优先考虑的, 研究人员可能会考虑包括暗灯箱测试, 并综合分析这些测试中的行为与更多的参数, 如饲养频率, 拉伸参与行为, 和排便21。其次, 这些测试的结果可以很容易地解释, 因为测试的动机是明确的, 这要么是对新奇事物的固有好奇心, 要么是水, 在可控的条件下执行简单的任务。与饥饿和训练前不同的是, 饥饿和训练前可能会导致小鼠的动机水平不同, 这类动机足够强大, 大多数 c57 老鼠都能完成任务。第三, 这些测试之间有很好的兼容性, 因为动机不会太大的压力, 不会造成长期甚至永久的压力, 如触电或食物/水剥夺可能会造成。绝望的测试, 包括强制游泳测试和尾巴悬挂测试, 利用的原则, 鼠标放弃挣扎时, 被困在绝望的环境。通过测量 "绝望时间", 测试告诉老鼠有多沮丧。在这些测试中, c57bl/6n 小鼠通常在300秒中显示出180秒的不活动.我们选择了强制游泳测试而不是尾部悬架测试, 因为当老鼠有水迷宫训练经验时, 压力相对较小。这样, 它们就适应了水, 知道如何防止湿后体温过低。相比之下, 我们观察到, 在尾巴悬吊试验后, 夜间体重下降了约2克, 表明压力很大。然而, 反复测试的强迫游泳测试应谨慎, 老鼠需要恢复更长的时间超过24小时之前, 任何进一步的实验/牺牲。或者, 科学家可以考虑包括蔗糖偏好测试, 这是一种广泛用于电池中压力引起的抑郁样过敏症的范式。然而, 这项测试的程序要求对个人住房23 有几天的习惯, 这可能是影响其他测试结果的刺激因素。最后, 这里所做的测试具有合理的吞吐量。所有的测试都可以在10分钟内完成鼠标。在增加设备数量时, 如露天场地、旋翼试验中的通道、强制游泳试验中的坦克、尾悬架试验中的车道等, 吞吐量也可以增加。虽然莫里斯水迷宫测试使得很难同时测试多个小鼠, 但每次试验只需要大约60-75秒。
在应用行为测试电池时, 最关键的问题是测试之间的干扰和频繁操作带来的压力。通过进一步优化测试的顺序和间隔, 可以最大限度地减少这些问题的不利影响。虽然行为测试的顺序对鼠标的压力至少应该到最大, 这是常识, 但这种电池中的一些测试可以作为适应以下测试, 提高性能的稳定性。例如, 在开田试验后进行提升加迷宫试验, 会增加开放臂10的探索。此外, 当小鼠按野外试验、新的物体识别测试和社会交往测试的顺序进行测试时, 它们逐渐适应环境和任务, 包括行为室、开放场和物体。因此, 老鼠不可能表现出新恐惧症7,24,25, 这意味着显示出一个异常低的互动与新的对象个体, 并充分专注于任务。这种安排减少了出于天生好奇心的测试数据的波动。莫里斯水迷宫测试和强制游泳测试有更强的动机。因此, 老鼠不可能受到测试经验的影响。在整个过程中频繁的运输和处理是另一个压力源, 因此需要适当的动物处理和充分的习惯。建议电池的测试间隔应至少为 2 4小时, 这样老鼠就能从这些压力源 26、27、2 8的压力中恢复。然而, 还有其他研究在每天的多次测试中测试老鼠29。
另一个关于重复测试行为的问题是以前经历的影响。开场试验和加速转子试验可反复用于电机功能分析。新奇动机测试, 包括提升加迷宫测试、新的对象识别测试和社会交往测试, 在每次试验中, 当动机新颖时, 都可以反复使用, 这意味着一种新的实验环境, 对对象, 或助手。如代表性数据所示, c57bl/6n 小鼠无法在莫里斯水迷宫测试的经典协议中反复训练, 因为它们记住了从经验中获得的搜索策略。
此电池可评估多个行为域。这样, 一些测试的结果可以为其他测试的数据解释提供参考。在图 1中的代表性数据中, 当接触二氧化硅纳米颗粒1个月的小鼠的社会交往活动减少时, 可能是抑郁或焦虑的表型或运动功能缺陷的后果。然而, 运动功能和焦虑测试的结果表明, 社会交往的减少是主要的, 而不是随后的。此外, 此电池包含针对同一行为域的不同测试, 具有不同的灵敏度和使用。一致的趋势/导致这些测试提高了电池的可靠性。但是, 这种安排需要额外的时间来完成整个过程。需要不到1个月的短期实验应该使用这种电池的简化版本。
这种行为测试电池旨在筛选在暴露于神经退行性变的遗传或环境危险因素后的不同阶段所显示的行为表型。因此, 此协议仅列出每个测试的基本读数。值得注意的是, 每个行为测试都可以提供大量的信息;因此, 用户可以扩展协议进行进一步调查。例如, 自发的活动, 如仪容整洁, 饲养, 排便, 和在开放领域的轴有表现出情感.这些行为特征在高加迷宫测试也可以是焦虑的指标 10,21。腐烂测试研究小鼠运动学习在模型疾病/环境危险因素30后接受训练。社会交往测试还可以通过在社交测试9后引入第二部小说助手来研究社会记忆。因此, 可以定制电池的扩展, 以适应不同的研究重点。然而, 由于时间的限制, 这种电池只在年轻的 c57bl/6n 小鼠身上进行了测试。其他菌株或衰老的 c57bl6 小鼠的基线性能可能不同。此外, 转基因神经退行性小鼠模型可能表现出行为缺陷, 如低或多动症。因此, 它们可能不适合低动机的测试, 比如新的对象识别测试。因此, 这些小鼠的行为评估需要进一步优化。
总之, 这种电池允许一个令人信服的和全面的行为分析神经退行性变在 c57 小鼠株。它最适合于对潜在危险因子神经毒素或药物开发的毒性进行与神经退化相关的纵向研究, 其特点往往是长期给药和重复检测。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢香港大学生物医学学院的 cora sw lai 博士提供了高架加迷宫测试, 并感谢香港大学麻醉学系提供了 rotarod 测试仪器。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| chambers in social interaction test | home made | (8 cm (L) x 6 cm (W) x 12 cm (H)), transparant with holes, plastic | |
| cylindrical tanks used in forced swimming test | home made | 30 cm height, 20 cm diameters, glass | |
| elevated plus maze | home made | open arms (30 cm x 5 cm x 0.5 cm) ,closed arms (30 cm x 5 cm x 16 cm), center platform (5 cm x 5 cm x 0.5 cm), 40 cm tall. Plastic, nontransparant | |
| IITC Roto-Rod Apparatus | IITC life science Inc. | 755, series 8 | |
| open field arena | home made | 60 cm (L) x 60 cm (W) x 40 cm (H), plastic, nontransparant | |
| water maze | home made | 120 cm in diameter, 60 cm deep, steel |
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