Summary
Denne protokol beskriver en celle sortering baseret metode til rensning og kultur af fluorescerende GABAergic eller glutamatergic neuroner fra neocortex og hippocampus af postnatale mus eller rotter.
Abstract
Det overordnede mål med denne protokol er at generere renset neuronal kulturer afledt fra enten GABAergic eller glutamatergic neuroner. Rensede neuroner kan dyrkes i definerede medier i 16 dage in vitro og er underlagt analyser, der typisk udføres på dissocierede kulturer, herunder elektrofysiologiske, morfologiske og overlevelsesanalyser. Den største fordel ved disse kulturer er, at specifikke celletyper kan undervises selektivt i fravær af komplekse ydre påvirkninger, såsom dem, der opstår fra gliale celler eller andre neuron typer. Når man planlægger eksperimenter med rensede celler, er det dog vigtigt at bemærke, at neuroner i høj grad er afhængige af glibe-konditionerede medier for deres vækst og overlevelse. Desuden, glutamatergic neuroner yderligere afhænge af glia-udskiltede faktorer for etablering af Synaptic transmission. Vi beskriver derfor også en metode til at co-kulere neuroner og gliale celler i en ikke-kontakt arrangement. Ved hjælp af disse metoder, vi har identificeret store forskelle mellem udviklingen af GABAergic og glutamatergic neuronal netværk. Således, studere kulturer af renset neuroner har et stort potentiale for at fremme vores forståelse af, hvordan nervesystemet udvikler sig og funktioner. Desuden kan oprensede kulturer være nyttige til at undersøge den direkte virkning af farmakologiske agenser, vækstfaktorer eller til at udforske konsekvenserne af genetiske manipulationer på specifikke celletyper. Efterhånden som flere og flere transgene dyr bliver tilgængelige, mærkning yderligere specifikke celletyper af interesse, vi forventer, at de protokoller, der er beskrevet her vil vokse i deres anvendelighed og potentiale.
Introduction
Celle sortering er et effektivt værktøj til isolering af levende celler af interesse fra en heterogen blanding af celler. Celler kan sorteres baseret på størrelse og form kriterier, samt udtryk for fluorescerende markører1,2. Ofte anvendes fluorophore-konjugeret antistoffer til at mærke særskilte celletyper ved at målrette celle specifikke overfladeantigener3,4. Alternativt er transgene dyr eller virale leveringssystemer blevet konstrueret til at udtrykke fluorophores under celle specifikke promotorer5,6. Historisk set var udviklingen af transgene værktøjer og dyr kostbar og tidskrævende. For nylig har faldende omkostninger og færre tekniske vanskeligheder medført en dramatisk stigning i antallet af tilgængelige reporter linjer. Da tilgængeligheden af transgene værktøjer og reporter dyr fortsætter med at vokse, så også bør nytten og anvendeligheden af fluorescens-baserede celle sortering metoder.
Vi har for nylig demonstreret, at celle sortering fra transgene dyr kan rutinemæssigt anvendes til at rense primære neuroner som forberedelse til cellekultur7. Ved at sortere celler fra enten rotter eller mus, vi var i stand til at isolere og kultur fluorescerende neuroner, som udtrykker fluorescerende reporter proteiner specifikt i enten GABAergic eller glutamatergic neuroner6,8,9. Ved at studere disse renset neuronal kulturer, vi var i stand til at identificere en vigtig forskel i den måde GABAergic og glutamatergic neuroner afhænger af glia-udskillede faktorer for etablering af Synaptic transmission7. Desuden, ved co-culturing glia celler med renset neuroner, vi var i stand til at udvide på tidligere observationer demonstrerer den kritiske rolle, som glia celler spiller i vækst og overlevelse af neuroner10,11. Således, gennem en kombination af celle sortering og cellekultur, var vi i stand til at studere ikke kun udviklingen af specifikke neuron typer i isolation, men var i stand til at undersøge indflydelsen af gliale celler på deres funktion.
Vi præsenterer her en protokol til rensning og kultur af GABAergic og glutamatergic neuroner fra cortex og hippocampus af Transgene mus eller rotter. Vi præsenterer også en metode til non-Contact Co-kultur af rensede neuroner og gliale celler, der er tilpasset fra Geissler et al.12. For at generere renset GABAergic kulturer, har vi sorteret fluorescerende neuroner fra VGAT-Venus-A Wistar rotter8 eller vgat-Venus mus13, som selektivt udtrykker en forbedret gul fluorescerende protein variant (Venus) i > 95% af kortikale GABAergic neuroner. At generere renset glutamatergic kulturer, vi har sorteret fluorescerende neuroner fra NexCre; Ai9 mus6,9, som udtrykker tdtomato i kortikale glutamatergic neuroner. Hele sortering og kultur procedure kan udføres inden for 3-4 h og kan bruges til at generere hundredvis af replikate kulturer egnet til elektrofysiologiske, morfologiske og celle overlevelse analyse. Metoden er enkel, reproducerbar og kan producere renset neuronal kulturer, der er større end 97% ren for cellen type af interesse.
Protocol
Alle procedurer og vedligeholdelse af dyr blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer, den tyske dyreværns lov og det europæiske rådsdirektiv 86/609/EØF om beskyttelse af dyr under tilstedeværelse af tilladelser fra lokale myndigheder (LaGeSo Berlin, T-0215/11).
Bemærk: Denne protokol beskriver kulturen i rensede neuroner fra en enkelt Transgene mus eller rotte hvalp (postnatal dag 0 – 2). Alle teknikker skal udføres under sterile forhold. Alle opløsninger skal steriliseres med et 0,2 μm filter (Se tabel over materialer). Glas dæksedler og dissektions værktøjer skal være varme steriliseret i 3 timer ved 185 °C.
1. belægning glas Dæksedler med poly-L-lysin
- Der fremstilles glas dæksedler ved afrimning af en 5 mL alikvot 200 μg/mL poly-L-lysin (PLL) opløsning. Denne stamopløsning fortyndes til 20 μg/mL ved tilsætning af 45 mL ren vand af injektions kvalitet. Filter-Steriliser opløsningen i et nyt 50 mL konisk rør. Mærk dette rør som "PLL steril".
Bemærk: Brug vand opbevaret ved stuetemperatur for at fremskynde afrimningsprocessen. - Tilsæt 100 sterile, runde 12 mm glas dæksedler til den sterile PLL-opløsning. Agitere røret hver 5 – 10 min, for 2 – 3 min, for at sikre selv belægning. Frakke dæksedlerne på denne måde for 1 h.
Bemærk: Tysk fremstillede runde glas dæksedler (diameter = 12 mm) foretrækkes, da de giver en pålidelig dyrknings flade og passer let ind i brøndene på en 24-brønd cellekultur plade. - Efter 40 min PLL belægning, tage 2 stykker af silkepapir og lægge dem fladt i flow kabinet. Steriliser papiret ved hjælp af 70% ethanol, derefter flade for at fjerne folder og lad det tørre.
- Efter belægning af glas dæksedlerne i 1 time med PLL fjernes overskydende PLL-opløsning, og der tilsættes steril vand af injektions kvalitet. Omrystes forsigtigt dæksedlerne i 2 – 3 s for at muliggøre fjernelse af overskydende PLL. Gentag dette skylning trin 2 ekstra gange.
- Fjern overskydende vand, og overfør derefter dæksedlerne til det sterile silkepapir. Adskil forsigtigt hver dækglas med buede pincet og lad den tørre.
Bemærk: Dæksedler, der ikke er nemme at adskille, kan kasseres. Alternativt kan en lille mængde vand tilsættes for at hjælpe separation. - Når det er tørt, overføres dæksedlerne til en 24-brønd kultur plade.
Bemærk: Dæksedler skal gøres klar ca. 30 min – 1 time, før dissektions processen påbegyndes. Pladerne kan opbevares i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2 , indtil det er nødvendigt.
2. dissociation af Hippocampal og kortikale væv
- Fremstilling af cellekultur løsninger
- Til afkobling af neurale væv, først afrimning en 40 ml alikvot cellekultur buffer (sammensætning [i mm]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,3 Nah2po4, 1 mgso4· 7h2o, 1 CaCl2· 2H2o, 0,5 EDTA · 2Na · 2H2O og 25 D-glucose, pH = 7,4). 12 mL cellekultur buffer måles til et 15 mL konisk rør. etiketten som "BSA". 5 mL cellekultur buffer måles til et andet 15 mL rør. etiketten som "papain". Begge rør inkuberet i et vandbad i 15 min ved 37 °C.
- Filtrer-Steriliser den resterende cellekultur buffer, Mærk som "buffer-steril" og opbevar ved 4 °C, indtil det er nødvendigt.
- Der afvejes 120 mg kvæg serum albumin (BSA) og tilsættes til røret mærket "BSA". Der afvejes 7 mg papain og tilsættes til røret mærket "papain". Returner begge rør til vandbad i 15 minutter.
Bemærk: Det er nyttigt at tilføje en lille mængde buffer til veje båden for at lette overførsel af papain pulver. - Når alle pulvere er opløst, filter-sterilisere hver løsning til en frisk 15 mL konisk rør. Til tube papain skal du mærke den filtrerede opløsning som "papain-steril". For rørs BSA skal den sterile BSA-opløsning opdeles i 3 rør, der hver indeholder 4 mL BSA-opløsning. Mærk hvert rør som "BSA-steril" og enten "1", "2" eller "3". Vend alle rørene tilbage til vandbadet, og Fortsæt med at inkuberere ved 37 °C, indtil det er nødvendigt.
- Klargøring til vævs dissektion
- Tag et enkelt stykke 35 mm filterpapir (Se tabel over materialer) og Steriliser med 70% ethanol; Lad det tørre i låget på en 100 mm Petri skål i et flow kabinet.
- Læg saks, tang, skalpel og spatel (Se tabel over materialer), der kræves til dissektion af hippocampus og cortex.
- Anbring 2 35 mm petriskåle og en 100 mm petriskål indeholdende sterilt filtrerpapir på et tilgængeligt sted midt i flow kabinettet.
- Saml transgene NexCre; Ai9 og VGAT Venus muse unger, der skal dissekeret. Brug en fluorescerende lampe med passende excitation og emissions filtre (Se tabel over materialer) til at diskriminere fluorescerende unger fra vildtype littermates.
- Umiddelbart før dissekere dyr fyldes hver 35 mm Petri skål med kølet, steril cellekultur buffer.
Bemærk: En Petri skål er til rensning af værktøjerne mellem dissektionerne, og den anden er til opsamling af hippocampus og cortex.
- Vævs dissektion
- Så snart cellen kultur buffer hældes, hals brættes en postnatal dag 0 – 2 Transgene mus eller rotte hvalp ved hjælp af store, skarpe saks og bruge en steril 100 mm Petri skål til at overføre hovedet ind i flow kabinet. Brug pincet, saks og en spatel til omhyggeligt at overføre hjernen af en transgen hvalp til steril filtrerpapir.
- Brug en type 22 skalpel at dissekere væk cerebellum og at adskille de 2 halvkugler. Brug en lille spatel til at rulle halvkugler sideværts. Tryk forsigtigt ned på hver halvkugle, så cortex kommer i kontakt med filter papiret. Bevæg forsigtigt midt hjernen-regionerne for at afsløre hippocampus og cortex.
Bemærk: Vær omhyggelig med ikke at anvende for meget pres, når du trykker ned på halvkugler eller celler kan blive knust. - Brug en skalpel eller spatel til at adskille hippocampus og cortex fra hver halvkugle. Overføre dissekeret væv til en 35 mm Petri skål med kølet cellekultur buffer.
Bemærk: Hvis der dissekere flere dyr, opbevares steril cellekultur buffer i et 50 mL konisk rør på is. Efter hver dissektion, overføre dissekeret væv til den kølede cellekultur buffer. - Efter vellykket dissektion af cortico-hippocampal væv, overføre den sterile papain opløsning fra vandbadet til flow kabinet. Brug en 3 mL Pasteur-pipette til at overføre den dissekterede hippocampus og cortex til låget på en steril 35 mm Petri skål. Hak i en kryds-Kors bevægelse, ved hjælp af den flade del af en type 22 skalpel, indtil vævet er i små stykker.
- Brug en lille mængde papain-opløsning til at overføre det hakkede væv fra låget på Petri skålen til det sterile papain-rør. Papain-røret returneres til vandbad, og vævet inkuperes ved 37 °C i 25 min.
- Under papain inkubation, udgør fuldstændig fluorescens medie opløsning. Der afrimes en 1 mL alikvot B27, en 0,5 mL alikvot Glutamax og en 0,5 mL alikvot pen-STREP. Aliquot 48,5 mL af dvaletilstand et lavt fluorescens medie til et 50 mL konisk rør. Tilsæt B27, Glutamax og pen-STREP til opløsningen. Ryst opløsningen godt, Filtrer derefter-Steriliser og mærk som "dvale et komplet medie" (med dato og initialer). Der inkubeeres ved 37 °C i vandbad.
- Efter papain inkubation overføres papain-røret og sterile BSA-tubes til flow kabinettet. Brug en 1 mL Pasteur-pipette til kun at fjerne det cortico-hippocampale væv fra papain-røret til BSA-tube 1.
Bemærk: Vær omhyggelig med at minimere overførslen af overskydende papain opløsning.
- Dissociation af celler
- For at nedbryde store klumper af væv, udriv vævet flere gange ved hjælp af en 1 ml Pasteur pipette. Efter dette, udriv vævet 7 gange ved hjælp af en fin spids Pasteur pipette. Lad vævet stå i 30 s, så større stykker af væv til sediment.
- Efter 30 s, overføre de lavere 1 mL opløsning og væv fra BSA-tube 1 til BSA-tube 2. Triturate vævet i BSA-tube 2 flere gange ved hjælp af en fin spids Pasteur pipette.
- Efter trituration, overføre igen den nedre 1 mL af væv og opløsning fra BSA-tube 1, men nu til BSA-tube 3. Triturate vævet i BSA-tube 3 flere gange ved hjælp af en fin spids Pasteur pipette.
- Efter triturering overføres al opløsning og væv fra rør 2 og 3 til BSA-tube 1. Triturate yderligere 2-3 gange og centrifugeres ved 3.000 x g i 3 min.
- Under centrifugering, make up komplet Neural basal A medier (NBA medier). Aliquot 48,5 mL af NBA-mediet til et 50 mL konisk rør og inkule ved 37 °C i et vandbad. Mærk dette rør "kun NBA". Desuden afrimes en 1 mL alikvot B27, en 0,5 mL alikvot Glutamax og en 0,5 mL alikvot pen-STREP ved stuetemperatur.
- Efter centrifugering fjernes supernatanten forsigtigt fra pelleteret væv, og cellerne resuspenderes i 2 mL komplette medier. Brug en P1000-pipette til at triturere vævet op og ned 20 gange.
Bemærk: Vær omhyggelig med ikke at pipettere cellerne for kraftigt. Hvis der anvendes for meget tryk, kan cellerne blive beskadigede. - Brug en 1 mL Pasteur-pipette til at filtrere cellesuspensionen gennem en 30 μm celle si ind i et polystyren prøveglas.
Bemærk: Hvis cellesuspensionen ikke passerer umiddelbart gennem celle sien, kan det være nødvendigt at trykke på sien med en steril handske for at starte flowet. Dette vigtige trin forhindrer tilstopning af celle sortering. - Til opsamling af neuroner efter sortering forberedes opsamlings rørene ved at afpipette 300 μL af det komplette medie til det påkrævede antal polypropylen-rør.
- Cellesuspensionen er nu klar til at blive taget til celle sortering til sortering. Tag cellen suspension, ekstra samlinger rør og reservedele komplette medier i tilfælde fortynding af prøven er påkrævet.
3. celle sortering af renset GABAergic eller Glutamatergic neuroner
Bemærk: For at minimere risikoen for bakteriel kontaminering under sortering skylles prøverørene i sorterings Rens med 70% ethanol i mindst 5 minutter før sortering. Detaljerede sorteringsparametre varierer mellem instrumenterne, og grundlæggende overvejelser er som følger.
- Under den første celle sortering, fastsætte niveauer af baggrunds fluorescens fra ikke-mærkede celler ved at sortere og sammenligne celler fra en vildtype dyr.
- For hver fluorescerende celletype, der skal sorteres, skal du vælge de relevante excitation og emissions filtre. Excite Venus og TdTomato proteiner ved hjælp af 488 nm eller 531 nm excitation bølgelængder, hhv. Detektere udledt lys gennem 530/40 og 575/30 emission filtersæt, hhv.
- Tilsæt polypropylenrør, der indeholder 300 μL komplet medie, til celle sortering til celle indsamling.
- For høj renhed, sortere lysende mærkede fluorescerende celler (Se figur 1b for eksempel prik plots af sorterede celler).
- Efter sortering skal du for at opnå optimale resultater udføre en renheds test af de sorterede celler for at estimere renheds niveauerne. Bemærk, at den typiske restitutionssats for celler efter sortering er mellem 70 – 80%.
- Noter antallet af celler sorteret i hver samling rør. Denne værdi angives af celle sorterings instrumentet.
Bemærk: Celle sortering kan udføres ved hjælp af en 70 μm dyse (70 psi-kappe-væsketryk) eller en 100 μm-spids (20 psi-kappe-væsketryk).
4. dyrkning af sorterede neuroner
- Efter celle sortering skal de indsamlede celler overføres til 2 mL runde bund centrifugeglas ved hjælp af en 1 mL Pasteur-pipette. Centrifuger cellerne ved 3.000 x g i 3 minutter for at danne en celle pellet.
Bemærk: For at hjælpe med at identificere placeringen af celle pellet, orientere de runde bund centrifuge rør med hængslet af låget vender udad, som tillader celle pellet til at dannes på bagsiden af centrifugeglasset (dvs. på samme side af røret som hængslet). - Under centrifugering tilsættes 1 mL B27, 0,5 mL Glutamax og 0,5 mL pen-STREP til 48,5 mL af det præ-varmede NBA-medie. Ryst opløsningen grundigt, og Filtrer derefter sterilisering og mærkning som "NBA-komplette medier" (med dato og initialer). Vend tilbage til vandbadet, indtil det er nødvendigt.
- Efter centrifugering skal du bruge en 1 mL Pasteur-pipette til at overføre supernatanten til et andet centrifugeglas (Bevar supernatanten-incase-celle pillen forstyrret). Re-suspendere celle pellet i den nødvendige mængde præ-warmed komplette NBA-medier for at opnå en celletæthed på 1.000 celler/μL. Resuspender cellerne ved at pipettere op og ned med en P200-eller P1000-pipette.
- For at bekræfte tilstedeværelsen af dissocierede celler, kontrollere celle opløsningen under et mikroskop, ved hjælp af en 4X eller 10x objektiv linse. Alternativt kan du pipettere en lille mængde celle opløsning på en dækglas og kontrollere under mikroskopet. Hvis der er et stort antal celler til stede, kan supernatanten fra trin 4,3 kasseres.
- Før plating cellerne, vortex på en medium hastighed for 2 – 3 s for at sikre en jævn cellesuspension. Efter vortexing, pipette hurtigt 10 μL af cellesuspensionen til midten af hver coverslip. Efter Pipettering af cellerne, hurtigt returnere hver plade til inkubator (5% CO2/37 °c) og inkubere i 1 time.
Bemærk: Hvis du tilføjer celler til flere 24-brønd plader, sikre lige celle tætheder ved at vortexning celler mellem pladerne. - Efter 1 time, fodre cellerne med 500 μL af pre-warmed komplette NBA-medier og vende tilbage til inkubator.
Bemærk: Når du fodrer cellerne, er det vigtigt at pipettere mediet forsigtigt ned i siden af brønden for at undgå celle løsrivelse. Ved korte eksperimenter (< 16 dage) er fodring med ovennævnte tæthed ikke nødvendig. Ved plating en større tæthed af celler kan der være behov for hyppigere fodrings intervaller (Se diskussionen).
5. astrocyt beriget glial støtte kulturer
Bemærk: Produktionen af glia kulturer14 og brugen af cellekultur skær er blevet beskrevet tidligere12. Kort fortalt, er astrocyt beriget glia kulturer afledt af cortico-hippocampus væv (med meninges fjernet; P2 – P5), som er blevet dyrket i en uge på en 20 μg/mL PLL-belagte 6-brønd plader i serum suppleret med DMEM-medier.
- For at co-kultur renset neuroner og glia celler, passage konflydende gliale celler til det nødvendige antal cellekultur skær (0,4 μm porestørrelse-Se tabel over materialer). For at passere cellerne skal du fjerne en 6-brønd plade indeholdende konflydende glia celler fra inkubatoren og vaske 2 brønde, 2 gange, med 2 ml præ-varmet (37 °c) fosfatbuffer (PBS).
- Du Aspirér PBS-opløsningen og brug en P1000-pipette til at tilsætte 1 mL forvarmet (37 °C) trypsin (1:250)/EDTA (0,25%/0,02%) løsning til hver brønd.
- Returner 6-brønd pladen til inkubatoren, og kontroller hver 2 – 3 min. for celle adskillelse.
- Når signifikant celle udstationering har fundet sted, pipette cellerne og celle opløsningen forsigtigt op og ned ved hjælp af en fin spids Pasteur pipette, for at hjælpe yderligere frigørelse og adskillelse af individuelle celler.
- Celle opløsningen overføres til et 15 mL konisk rør, og der centrifugeres ved 3.000 x g i 3 min.
- Gensuspender cellerne ved hjælp af en P1000-pipette i 5 mL forvarmede (37 °C) NBA-komplette medier ved forsigtigt at pipettere op og ned, indtil celle pillen er i opløsning.
- Udfør en celletælling ved hjælp af et hæmoocytometer eller en automatiseret celle tæller.
Bemærk: Efter 7 dage i kulturen kan der høstes ca. 750000 – 1000000 celler fra hver brønd af en 6-brønd plade. - Plade 40.000 glia celler til hver cellekultur Indsæt i en 500 μl dråbe (80 celler/μl).
- Efter at lade cellerne overholde i 1 time, brug sterile pincet til at overføre glial-dækket cellekultur skær til 24-brønd plader indeholder renset neuroner. Fjern overskydende medie fra overfladen af cellekultur indsatserne (ca. 300 μL).
Bemærk: Da luftbobler ofte kan blive fanget under cellekultur skær, kan det være nødvendigt at forsigtigt vippe skær til at løsne disse bobler. Hvis der tilsættes flere glia celler til celle kulturens skær, kan der være behov for yderligere vask og centrifuge trin for at fjerne overskydende trypsin, hvilket kan være til skade for cellernes overlevelse.
Representative Results
Afkobling og celle sortering af fluorescerende neuroner fra Transgene mus eller rotte cortico-hippocampal væv kan udføres i ca. 3 – 4 h. Resultatet er en population af meget rene fluorescerende neuroner, som kan dyrkes i kultur i 16 dage.
For at generere rensede kulturer blev transgene dyr først identificeret ved hjælp af en fluorescerende lampe med passende filtersæt (eksempler på fluorescerende neonatal VGAT Venus og NexCre; Ai9-muse unger er vist i figur 1a). Efter identifikationen af transgene dyr, dissekeret væv var dissocierede, og de mest stærkt fluorescerende neuroner blev sorteret til at producere en renset cellepopulation. Eksempel på fluorescens intensitets punkts parceller for NexCre; Ai9 og VGAT Venus mus neuroner, fremstillet under FACS, er vist i figur 1b. Når det er optimeret, er det muligt at høste mellem 500.000 og 800.000 celler fra cortex og hippocampus af individuelle p0-2 NexCre; Ai9 eller VGAT Venus-mus. Cellerne kan sorteres med en hastighed på op til 600 hændelser/s. der blev foretaget estimater af cellens renhed ved hjælp af DAPI som en nuklear markør (figur 1c). Ved at sortere stærkt positive celler, en renhed på mere end 97% kan rutinemæssigt opnås7.
Efter vellykket sortering, skal belagte neuroner vises runde i form, har en glat membran og bør ses at spire neurites efter ca 1 h in vitro (figur 2a, B). Ved 7 dage in vitro, selv om nogle celledød kan være synlige, levedygtige celler bør være til stede i alle dyrkningsbetingelser (figur 2c, D). Ved 12 – 16 dage in vitro, ved hjælp af helcelle patch-klemme optagelser og biocytin-fyldning15, er det muligt at undersøge den morfologiske og elektrofysiologiske udvikling af rensede neuroner (figur 3). Analyse af rensede kulturer afslører, at både glutamatergic og GABAergic neuroner var i stand til at udvide axoner og dendritter fra deres celle kroppe (figur 3a, B) og bevare evnen til at generere aktionspotentialer som reaktion på suprathreshold depolariserende aktuelle injektioner (figur 3c, D). Især, men efter rensning, kun GABAergic neuroner modtaget betydelige mængder af spontan Synaptic transmission, og glutamatergic neuroner modtager meget lidt Synaptic transmission i fravær af gliale celler (figur 3E , F) 7. der er
Som vi tidligere har rapporteret, har celler i rensede kulturer tendens til at overleve mere dårligt end dem i usorterede kulturer og har betydeligt mindre dendritter og axoner7. For at overvinde disse underskud har vi tilpasset og anvendt metoder til støtte for udviklingen af rensede kulturer med glia celle12,14. Den cellulære sammensætning af vores gliale støttekulturer (DIV7) er vist i figur 4a. Disse kulturer indeholdt hovedsageligt glia fibrillær syreholdigt protein (GFAP) positive astrocytter, men også indeholdt nogle klynge af differentiering molekyle (CD11b) positive mikroglia og myelin grundlæggende protein (MBP) positive oligodendrocytter. Efter DIV 7 kan disse celler føres til cellekultur skær for at give ikke-kontakt støtte af rensede neuroner (figur 4b, C). Analyse af glia-neuron Co-kulturer afslører, at ca 40.000 glia celler var tilstrækkelige til at forbedre den langsigtede overlevelse og vækst af både renset glutamatergic og GABAergic neuroner (figur 4d, E)7. Endvidere, elektrofysiologisk analyse afslører, at glutamatergic neuroner, co-kultiveret med glia celler, var meget aktive og havde stærkt øget netværksaktivitet (procentdel af glia støttede glutamatergic neuroner fyring udbrud af action potentialer: 62%; n = 28; Figur 4F , G). Glial støtte er derfor vigtigt, ikke kun for at fremme neuron vækst og overlevelse, men også for at fremme Synaptic transmission og etablering af netværksaktivitet i glutamatergic kulturer.
Figur 1: rensning af glutamatergic og GABAergic neuroner. (A) billeder, der viser fluorescerende signal fra transgen-ekspressionen af tdtomato i nexcre; Ai9 mus (top) og Venus i VGAT Venus mus (nederst). Skala stænger = 5 mm.b) intensitets spredte observationsområder af tdtomato-og Venus-fluorescens af cortico-hippocampus dissocierede celler fra nexcre Ai9 mus (top) og VGAT Venus mus (bund). Stærkt fluorescerende TdTomato eller Venus neuroner blev udvalgt til sortering (angivet ved gating kasser). (C, venstre) Confocal billeder af sorteret TdTomato (top) og Venus (nederst) positive neuroner. (C, højre) Flettet billede viser celler Co-farvede med DAPI (i blå pseudo farve). TdTomato Fluorescens er endogene og forbliver stærk trods fiksering (i magenta pseudocolor). Venus udtryk er forbedret ved hjælp af en kombination af et primært antistof rettet mod GFP og Alexa fluor-488-konjugeret sekundært antistof (i grøn pseudocolor). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: cellekultur af renset glutamatergic eller GABAergic neuroner. (A) kombinerede infrarøde (lyse felt) billeder og overlejret fluorescerende signal fra tdtomato (venstre) og Venus (højre) positive neuroner, der dyrkes i 1 h in vitro. Hvide pile angiver placeringen af voksende neuriter. (B) konfokale billeder af tdtomato (venstre) og Venus (højre) positive neuroner, der dyrkes i 1 t in vitro. (C, D) Bright Field (top) og kombineret lyse felt og fluorescerende billeder (bunden) af TdTomato (C) og Venus positive neuroner (D) dyrket i 7 dage in vitro (DIV). Hvide pile viser placeringen af kondenserede kerner fra døde celler. Farvede pile identificerer optælling-mærkede neuroner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: morfologiske, elektrofysiologiske og synaptiske egenskaber af renset neuroner. (a, B) Confokale billeder af TdTomato (A) og Venus positive neuroner (B) ved DIV 13 og DIV 14, hhv. Celler præsenteres i sort ved hjælp af en inverteret look-up tabel for at støtte neurite visualisering. Insets viser det fluorescerende signal, der udtrykkes af de identificerede neuroner. (C, D) Spændings reaktionen fra en TdTomato (C) og Venus positive neuron (D) til hyperpolariserende (200 til-20 pA, i 20 pA trin) og depolariserende (200 pA) strøm impulser, opnået ved hel-celle patch-klemme optagelser. Insets viser de tilsvarende indspillede neuroner. Hver celles hvile membran potentiale er angivet til venstre for optagelses sporet. (E, F) Repræsentative spændings klemmer (10 s) opnået fra TdTomato (E) og Venus positive neuroner (F). Spontane excitatoriske postsynaptiske hændelser (EPSCs) blev registreret fra TdTomato-positive neuroner, holdt på et Holding potentiale på 50 mV. Spontant forekommende hæmmende postsynaptiske hændelser (IPSCs) blev registreret fra Venus positive neuroner opretholdt på et Holding potentiale på 0 mV. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: støtte til Neuron udvikling med glia Co-kultur. (A) konfokale billeder af glialkulturer, der er immun mærket for glia fibrillær syreholdigt protein (GFAP, venstre), klynge af differentierings molekyle (CD11b, midterste) og myelin basis protein (MBP, højre). Glial celler blev dyrket til DIV 7. (B) billeder af cellekultur skær, der anvendes til co-Culture gliale celler med renset neuroner i en ikke-kontakt arrangement. (C) en skematisk af den rumlige arrangement, der anvendes til co-kultur neuroner og glia. (D, E) Confokale billeder af tdtomato (D) og Venus positive neuroner (E), dyrket i 14 dage, i fravær (til venstre) eller tilstedeværelse (til højre) af glia støtte. (F, G) Strøm klemme optagelser (60 s) fra tdtomato (F) og Venus positive neuroner (G) dyrket i 14 dage i fravær (øverst) eller tilstedeværelse (nederst) af glia støtte. Neuroner blev registreret ved deres hvile membran potentiale (præsenteret til venstre for hver optagelse spor). Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi beskriver her en metode, der kombinerer sortering og dyrkning af primære neuroner til at generere renset neuronal cellekulturer. Denne metode tager omkring 1 time længere end en typisk primær dissocieret neuronal kultur protokol endnu giver mulighed for generering af hundredvis af replikate kulturer, der indeholder specifikke neuronal typer. Renset neuroner, som kan dyrkes isoleret i mindst 16 dage, udvide axoner og dendritter og kan affyre gentagne tog af aktionspotentialer (figur 2 og figur 3). Det er vigtigt, at disse celler er under de samme eksperimentelle analyser som regulære primære dissocierede neuronale kulturer, herunder elektrofysiologiske, morfologiske og overlevelsesanalyser. En stor fordel ved at arbejde med disse rensede kulturer er, at udviklingen af specifikke celletyper kan undersøgt isoleret. For at støtte udviklingen af rensede kulturer, præsenterer vi også en protokol til co-culturing af rensede neuroner med glia celler. Som tidligere vist forbedrer Co-kulering af rensede neuroner med gliale celler deres overlevelse, vækst og kan fremme dannelsen af netværk7 (figur 4). Således præsenterer vi her en kombination af metoder, der bør fremme studiet af glia-neuron interaktioner og kan vise sig nyttige for at studere udviklingen og samspillet mellem andre celletyper af interesse.
Undersøgelser på kulturer af renset glutamatergic neuroner har afsløret grundlæggende indsigt i den måde, glia celler udskilte faktorer, der fremmer udviklingen af neuronal netværk og synapse formation16,17,18 . Generelt, metoder til rensning af specifikke neuron typer har været mere succesfuldt anvendt til at studere udviklingen af glutamatergic neuroner snarere end GABAergic neuroner. Dette har ført til en skævhed i vores forståelse af, hvordan disse to celletyper udvikler sig. I betragtning af at GABAergic og glutamatergic neuroner afviger betydeligt med hensyn til deres anatomi, fysiologi og udviklingsmæssige oprindelse, er det afgørende, at vi studerer GABAergic neuroner i deres egen ret, for bedre at forstå deres funktion og fysiologi. Ved hjælp af protokollen præsenteret her, har vi tidligere identificeret vigtige forskelle i den måde GABAergic og glutamatergic neuroner afhænger af glia-udskillede faktorer for etablering af Synaptic transmission7. Ved at udgive denne protokol håber vi, at andre kan få yderligere indblik i de vigtige interaktioner mellem neuroner og gliale celler.
I denne protokol, beskriver vi en flow cytometri baseret celle sortering metode, som vi har brugt til at rense GABAergic eller glutamatergic neuroner fra forskellige transgene gnaver linjer. Venus positive GABAergic neuroner blev sorteret fra VGAT Venus mus13 eller rotter8 og tdtomat positive glutamatergic neuroner blev sorteret fra nexcre; Ai9 mus (opdrættet oprindeligt fra NexCre9 og Ai9 reporter Lines6, se Turko et al., 20187). I de seneste år, på grund af teknologiske fremskridt, er generationen af transgene dyr blevet betydeligt lettere. Som sådan, tilgængeligheden af dyr, der udtrykker fluorescerende molekyler, i mange forskellige celletyper, er vokset hurtigt. Dette har igen øget brugen og anvendeligheden af fluorescerende aktiverede celle sortering. Mens alternative metoder til isolering af celler af interesse i øjeblikket eksisterer16,19,20, de er noget hæmmet af deres afhængighed af tilgængeligheden af egnede antistoffer til naturligt forekommende overflade Antigener. Dette begrænser deres alsidighed sammenlignet med fluorescens-baserede celle sorteringsmetoder, som allerede kan bruges til at sortere celler fra de mange celle specifikke transgene reporter dyr, der allerede er tilgængelige. Ikke desto mindre, når optimeret, antistof-baserede sorteringsmetoder kan være hurtige og højtydende, og kan endda bedre bevare celle anatomi, ved at tillade rensning af celler med deres axoner og dendritter intakt21. Antistof sorteringsmetoder bør derfor stadig tages i betragtning, når der træffes beslutning om en sorterings strategi. I sidste ende vil celle typen af interesse, den alder, hvor cellerne skal sorteres, tilgængeligheden af transgene dyr eller overfladeantigener og antallet af nødvendige celler være de afgørende faktorer, når de vælger den mest velegnede sorterings strategi.
Selv om fluorescens-baseret celle sortering er en enkel og reproducerbar metode til rensning af celler, bør der udvises forsigtighed under visse trin i protokollen for at bevare celle kvaliteten. For eksempel er det efter hvert Centrifugerings trin vigtigt at sørge for, at celle pellet gensuspenderes så hurtigt som muligt, og at cellerne er blevet genvundet. Lejlighedsvis, celle pellet kan forstyrres, når du fjerner supernatanten. Det tilrådes derfor, mellem Centrifugerings trin, at kontrollere tilstedeværelsen af celler under mikroskopet for at udelukke et omfattende celletab. Efter celle plating skal cellerne have lov til at holde sig i mindst 1 time før fodring. Hvis cellerne fodres for tidligt, kan nogle celler blive opløst fra dæksedlen og derved reducere kultur tætheden. Efter 1 h i kultur, er det klogt at vurdere cellernes sundhed. Hvis cellerne ikke vises sundt (et eksempel på raske celler er vist i figur 2a), eller der er signifikant celledød, kan dette være en indikation af et problem under dissociations-eller sorterings proceduren. En anden vigtig overvejelse, når dyrkning af en celletype, er at tage sig, når forvaltningen af cellekultur medier. NBA-mediet indeholder phenolrødt, som fungerer som en pH-indikator22. Hvis mediet bliver for gult i farver, indikerer det, at pH-værdien er for sur; Hvis mediet bliver for pink, indikerer det, at opløsningen er for alkalisk. Stamopløsninger åbne i lange perioder, især medier aliciteres i koniske rør, tendens til at blive mere alkalisk over tid. Det tilrådes derfor at lave friske komplette NBA-medier hver uge og komplette medier hver anden uge (medium buffere under atmosfæriske forhold og bør derfor være mere stabile). Når disse punkter tages i betragtning, bør det være muligt at etablere rensede cellekulturer i ethvert laboratorium med adgang til celle sorterings-og cellekultur udstyr.
I de fleste af vores eksperimenter producerede vi rensede kulturer fra et enkelt dyr. Men når man renser celler for biokemiske analyser, kan det være nødvendigt at samle flere dyr til sortering. Vi har med succes sorteret op til 8 embryonale mus (embryonale dag 13 dyr) ved hjælp af ovenstående protokol (data ikke vist). Hvis der skal sorteres flere dyr, kan det dog være nødvendigt at øge mængden af både papain-og BSA-opløsninger (beskrevet i trin 2.1.1 – 2.1.4) for at tage højde for stigningen i vævs mængden. Desuden, hvis flere celler er belagt i kultur, så en hyppigere fodring tidsplan kan være påkrævet. Som udgangspunkt kan cellerne fodres hver 7 dage ved at fjerne 100 μL af konditionerede medier og tilføje 200 μL af friske komplette NBA-medier. Af hensyn til Neuron levedygtighed, hvis sortering flere dyr, tænkte bør gives til at minimere den slags tid så meget som muligt. Dette kræver ofte en omhyggelig optimering af downstream-analyser for effektiv anvendelse af rensede celler. Vi har rutinemæssigt sorteret muse neuroner med en frekvens på 600 hændelser/s, op til 500000 – 800000 celler pr. dyr (postnatal dag 0 – 2). Dette var dog uden udtømmende optimering af sorterings hastigheder og-forhold. Det bør derfor være muligt at forbedre Sorteringshastigheden og-udbyttet yderligere.
Oprensede neuroner kræver, at de har et glidet medie for deres overlevelse. Dette er blevet påvist tidligere ved at kulturere neuroner og gliale celler separat, før behandling af neuroner med glia konditioneret Media10. I vores eksperimenter valgte vi at støtte rensede neuroner ved at kulturere gliale celler på semi-permeable cellekultur skær, som er placeret inde i cellekultur pladen. Denne metode er blevet anvendt med succes for at studere glia-afledte ekstracellulære matrix proteiner og deres interaktion med neuroner12. Den ikke-kontakt, men kontinuerlig støtte fra denne metode har en række fordele i forhold til den separate kultur af celler. Mest bemærkelsesværdigt, den Co-kultur af gliale celler med neuroner giver mulighed for kontinuerlig regulering og konditionering af cellekultur medier, som mere ligner den in vivo situation. Desuden giver kontinuerlig Co-kultur af celler mulighed for potentiel feedback signalering mellem neuroner og glia, hvilket ikke er muligt i adskilte kulturer. I vores protokol, hvis det er nødvendigt, kan den kontinuerlige Co-kultur metode let udelades, og en klassisk behandling af neuroner med glia-condition medier kan udføres.
Sammenfattende, den protokol, der præsenteres her har til formål at give læseren et solidt fundament, hvorfra de kan etablere deres egen renset cellekultur eksperimenter. Vi forudser, at tilgængeligheden af transgene dyr og virale konstruktioner vil fortsætte med at stige i den nærmeste fremtid. Derfor vil celle sorterings teknikker baseret på fluorescens sandsynligvis blive endnu mere udbredte og værdifulde.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke den fremragende tekniske support, som Jenny Kirsch og Ana Teichmüller har ydet ved flow cytometry Core Facility, Deutsches Reuma-Forschungszentrum, Berlin. Vi vil gerne takke Jie Song for hans hjælp med overlevelse analyse. Vi vil også gerne takke Rita Loureiro for hendes hjælp med at indfange billederne af fluorescerende mus og Christian Ebner for kritisk læsning af protokollen. VGAT-Venus transgene rotter blev genereret af DRs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi og Y. Kawaguchi i National Institute for fysiologisk videnskab, Okazaki, Japan, ved hjælp af pCS2-Venus leveret af Dr. A. Miyawaki. Dette arbejde blev støttet af det tyske Forskningsråd (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG EXC 257-IV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neural Basal A media (NBA) | ThermoFisher Scientific | 10888022 | Cell Culture Buffer |
| B27 | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Culture supplement |
| Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050-038 | Culture supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic |
| Poly-L-Lysine | SIGMA | P1399 | Coverslip coating |
| Papain | SIGMA | P4762-1G | Enzyme |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A3294-100G | Serum |
| Hibernate A low fluorescence media | Brain Bits Ltd | HALF | Cell Transport media |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Biochrom | F0435 | Glial Culture Buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom | S0115 | Serum |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2163 | Enzyme |
| Fine Tip Pasteur Pipette | Neo Labs | - | Used for trituration of cells |
| 24-well plates | BD | 353047 | Culture plate |
| 50 mL Falcon tubes | BD | 352070 | - |
| 15 mL Falcon tubes | BD | 352096 | - |
| Glass coverslips: 12 mm round | Roth | P231.1 | - |
| 35 mm Petri dish | Corning | 353001 | - |
| 100 mm Petri dish | Corning | 353003 | - |
| 30 µm CellTrics Cell Sieve | sysmex | 04-004-2326 | To remove cell clumps before cell sorting |
| Round bottom polystyrene tubes | BD | 352054 | Transport tube for sorted cells |
| Round bottom polypropylyne tubes | BD | 352063 | Collection tube for sorted cells |
| Cell culture inserts – 0.4 µm transparent PET | Falcon | 353 095 | For the co-culture of neurons and glia |
| Extra fine Bonn Scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | To remove overlying skin and bone of mice |
| Extra narrow Scissors | Fine Scientific Tools | 14088-10 | To remove overlying skin and bone of rats |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11242-40 | To hold the head in place |
| Spatula (130 mm long/5 mm tip width) | Fine Scientific Tools | 3006.1 | To remove the brain to filter paper |
| Scalpel Blades | Swan-Morton | #0308 | To mechanically dissociate neural tissue |
| Haemocytometer (Neubauer Imroved) | Optik Labor | - | To cell count dissociated cells |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/LS-1G | To excite TdTomato |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/EF-4R2 | Td Tomato compatible emission filter |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/ULS-02B2 | To excite Venus |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/TEF-3GY1 | Venus compatible emission filter |
| Mouse-Anti-GFP primary antibodies | UC Davis | 75-132 | To enhance Venus signal following fixation |
| Mouse-Anti-GFAP primary antibodies | SIGMA | G-3893 | The identification of reactive astrocytes |
| Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies | Southern Biotech | 1561-15 | The identification of microglial cells |
| Rabbit-Anti-MBP primary antibodies | Millipore | AB980 | The identification of oligodendrocyes |
References
- Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 91, 1-24 (1998).
- Feher, K., Kirsch, J., Radbruch, A., Chang, H. D., Kaiser, T. Cell population identification using fluorescence-minus-one controls with a one-class classifying algorithm. Bioinformatics. 30 (23), 3372-3378 (2014).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Turko, P., Groberman, K., Browa, F., Cobb, S., Vida, I. Differential Dependence of GABAergic and Glutamatergic Neurons on Glia for the Establishment of Synaptic Transmission. Cerebral Cortex. , (2018).
- Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical gabaergic neurons revealed in transgenic venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
- Goebbels, S., Bormuth, I., Bode, U., Hermanson, O., Schwab, M. H., Nave, K. -A. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44, 611-621 (2006).
- Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209, 809-810 (1980).
- Lindsay, R. M. Adult rat brain astrocytes support survival of both NGF-dependent and NGF-insensitive neurones. Nature. 282 (5734), 80-82 (1979).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7742-7755 (2013).
- Wang, Y., et al. Fluorescent labeling of both gabaergicand glycinergic neurons in vesicular GABA transporter (VGAT)-venus transgenic mouse. Neuroscience. 164 (3), 1031-1043 (2009).
- Höltje, M., et al. Role of Rho gtpasein astrocyte morphology and migratory response during in vitro wound healing. Journal of Neurochemistry. 95 (5), 1237-1248 (2005).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. Journal of Visualized Experiments. , e51706 (2014).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277 (5332), 1684-1687 (1997).
- Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of synapse number by glia. Science. 291, 657-661 (2001).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Berghuis, P., et al. Brain-derived neurotrophic factor controls functional differentiation and microcircuit formation of selectively isolated fast-spiking gabaergic interneurons. European Journal of Neuroscience. 20 (5), 1290-1306 (2004).
- Liddelow, S. A., et al. Activated microglia induce neurotoxic reactive astrocytes via Il-1α, tnfα, and c1q. Nature. 541, 481-487 (2017).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
