Summary
Ce protocole décrit une méthode basée sur le tri cellulaire pour la purification et la culture des neurones GABAergiques fluorescents ou glutamatergiques du néocortex et de l’hippocampe de souris ou de rats postnatals.
Abstract
L’objectif général de ce protocole est de générer des cultures neuronales purifiées dérivées de neurones GABAergiques ou glutamatergiques. Les neurones purifiés peuvent être cultivés dans des milieux définis pendant 16 jours in vitro et se prêtent à toutes les analyses généralement effectuées sur des cultures dissociées, y compris les analyses électrophysiologiques, morphologiques et de survie. Le principal avantage de ces cultures est que les types de cellules spécifiques peuvent être étudiés sélectivement en l’absence d’influences externes complexes, telles que celles provenant de cellules gliales ou d’autres types de neurone. Cependant, lors de la planification d’expériences avec des cellules purifiées, il est important de noter que les neurones dépendent fortement des milieux conditionnés par la Glia pour leur croissance et leur survie. En outre, les neurones glutamatergiques dépendent davantage des facteurs sécrétés par la Glia pour l’établissement de la transmission synaptique. Nous décrivons donc également une méthode de co-culturing des neurones et des cellules gliales dans un arrangement sans contact. En utilisant ces méthodes, nous avons identifié des différences majeures entre le développement des réseaux neuronaux GABAergiques et glutamatergiques. Ainsi, l’étude des cultures des neurones purifiés a un grand potentiel pour approfondir notre compréhension de la façon dont le système nerveux se développe et fonctionne. En outre, les cultures purifiées peuvent être utiles pour enquêter sur l’action directe des agents pharmacologiques, des facteurs de croissance ou pour explorer les conséquences des manipulations génétiques sur des types de cellules spécifiques. Comme de plus en plus d’animaux transgéniques deviennent disponibles, l’étiquetage des types de cellules spécifiques supplémentaires d’intérêt, nous nous attendons à ce que les protocoles décrits ici vont croître dans leur applicabilité et le potentiel.
Introduction
Le tri cellulaire est un outil puissant pour l’isolement des cellules vivantes d’intérêt à partir d’un mélange hétérogène de cellules. Les cellules peuvent être triées en fonction des critères de taille et de forme, ainsi que l’expression des marqueurs fluorescents1,2. Souvent, les anticorps conjugués au fluorophore sont utilisés pour étiqueter des types de cellules distincts en ciblant les antigènes de surface spécifiques aux cellules3,4. Alternativement, les animaux transgéniques ou les systèmes d’administration virale ont été conçus pour exprimer des fluorophores sous des promoteurs spécifiques à la cellule5,6. Historiquement, le développement d’outils et d’animaux transgéniques était coûteux et chronophage. Plus récemment, la baisse des coûts et la diminution des difficultés techniques ont entraîné une augmentation spectaculaire du nombre de lignes de reporter disponibles. Comme la disponibilité des outils transgéniques et des animaux rapporteurs continue de croître, l’utilité et l’applicabilité des méthodes de tri des cellules basées sur la fluorescence devraient aussi être utiles.
Nous avons récemment démontré que le tri cellulaire des animaux transgéniques peut être systématiquement appliqué pour purifier les neurones primaires en préparation à la culture cellulaire7. En triant des cellules de rats ou de souris, nous avons pu isoler et culture des neurones fluorescents, qui expriment des protéines de reporter fluorescentes spécifiquement dans les neurones GABAergiques ou glutamatergiques6,8,9. En étudiant ces cultures neuronales purifiées, nous avons pu identifier une différence importante dans la façon dont les neurones GABAergiques et glutamatergiques dépendent des facteurs sécrétés par la Glia pour l’établissement de la transmission synaptique7. En outre, en co-culturant des cellules gliales avec des neurones purifiés, nous avons pu étendre sur les observations précédentes démontrant le rôle critique que les cellules gliales jouent dans la croissance et la survie des neurones10,11. Ainsi, grâce à une combinaison de tri cellulaire et de culture cellulaire, nous avons pu étudier non seulement le développement de types spécifiques de neurons isolés, mais nous avons pu étudier l’influence des cellules gliales sur leur fonction.
Nous présentons ici un protocole pour la purification et la culture des neurones GABAergiques et glutamatergiques du cortex et de l’hippocampe de souris transgéniques ou de rats. Nous présentons également une méthode pour la co-culture sans contact des neurones purifiés et des cellules gliales, adaptée de Geissler et coll.12. Afin de générer des cultures GABAergiques purifiées, nous avons trié les neurones fluorescents des rats VGAT-venus-A Wistar8 ou vgat-venus13, qui expriment sélectivement une variante de protéine fluorescente jaune améliorée (Vénus) dans > 95% des neurones GABAergiques corticaux. Pour générer des cultures glutamatergiques purifiées, nous avons trié les neurones fluorescents de NexCre; Ai9 souris6,9, qui expriment tdtomato dans les neurones corticaux glutamatergiques. L’ensemble de la procédure de tri et de culture peut être réalisée dans les 3-4 h et peut être utilisée pour générer des centaines de cultures répliquées adaptées à l’analyse électrophysiologique, morphologique et de survie cellulaire. La méthode est simple, reproductible et peut produire des cultures neuronales purifiées qui sont supérieures à 97% pur pour le type de cellule d’intérêt.
Protocol
Toutes les procédures et l’entretien des animaux ont été effectués conformément aux directives institutionnelles, à la loi allemande sur le bien-être animal et à la directive 86/609/CEE du Conseil européen concernant la protection des animaux, en présence des autorisations des autorités locales autorités compétentes (LaGeSo Berlin, T-0215/11).
Remarque: Ce protocole décrit la culture des neurones purifiés à partir d’une souris transgénique unique ou d’un chiot de rat (jour postnatal 0 – 2). Toutes les techniques doivent être exécutées dans des conditions stériles. Toutes les solutions doivent être stérilisées à l’aide d’un filtre de 0,2 μm (voir tableau des matériaux). Les lamelles en verre et les outils de dissection doivent être stérilisés à la chaleur pendant 3 h à 185 ° c.
1. revêtement verre COVERSLIPS avec poly-L-lysine
- Préparer des lamelles de verre en dégivrant une aliquote de 5 mL de 200 μg/mL de solution de poly-L-lysine (PLL). Diluer cette solution d’action à 20 μg/mL en ajoutant 45 mL d’eau pure de qualité injectable. Filtrer-stériliser la solution dans un nouveau tube conique 50 mL. Étiqueter ce tube comme "PLL stérile".
Remarque: Utiliser de l’eau stockée à température ambiante pour accélérer le processus de dégivrage. - Ajouter 100 lamelles de verre stériles, rondes, de 12 mm à la solution de PLL stérile. Agiter le tube toutes les 5 – 10 min, pendant 2 – 3 min, pour assurer un revêtement uniforme. Enduire les lamelles de cette façon pendant 1 h.
Remarque: Les lamelles de verre rondes fabriquées en Allemagne (diamètre = 12 mm) sont préférées, car elles fournissent une surface de culture fiable et s’intègrent facilement dans les puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits. - Après 40 min de revêtement PLL, prendre 2 morceaux de papier de soie et les poser à plat dans l’armoire à écoulement. Stériliser le papier à l’aide de 70% d’éthanol, puis aplatir pour enlever les plis et laisser sécher.
- Après avoir enduit les lamelles de verre pendant 1 h avec PLL, enlevez l’excès de solution PLL et ajoutez de l’eau de qualité injectable stérile. Agiter doucement les lamelles pendant 2 – 3 s pour permettre l’enlèvement de PLL en excès. Répétez cette étape de rinçage 2 fois supplémentaires.
- Enlevez l’excès d’eau, puis transférez les lamelles au papier de soie stérile. Séparer soigneusement chaque lamelle à l’aide de pinces incurvées et laisser sécher.
Remarque: Les lamelles qui ne se séparent pas facilement peuvent être jetées. Alternativement, une petite quantité d’eau peut être ajoutée pour aider à la séparation. - Une fois sec, transférez les lamelles vers une plaque de culture de 24 puits.
Remarque: Les COVERSLIPS doivent être préparés environ 30 min – 1 h avant de commencer le processus de dissection. Les plaques peuvent être entreposées dans un incubateur à 37 ° c et 5% CO2 jusqu’à ce que nécessaire.
2. dissociation du tissu hippocampal et cortical
- Préparation de solutions de culture cellulaire
- Pour la dissociation du tissu neural, commencez par décongeler une aliquote de 40 mL de tampon de culture cellulaire (composition [en mM]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,3 Nah2po4, 1 MgSO4· 7H2o, 1 CaCl2· 2H2o, 0,5 EDTA · 2Na · 2H2O et 25 D-glucose, pH = 7,4). Mesurez 12 mL de tampon de culture cellulaire dans un tube conique de 15 mL; étiquette «BSA». Mesurez 5 mL de tampon de culture cellulaire dans un autre tube de 15 mL; étiquette comme "papaïne". Incuber les deux tubes dans un bain d’eau pendant 15 min à 37 ° c.
- Filtrer-stériliser le tampon de culture cellulaire restant, étiqueter comme "tampon-stérile" et conserver à 4 ° c jusqu’à ce que nécessaire.
- Peser 120 mg d’albumine sérique bovine (BSA) et ajouter au tube étiqueté «BSA». Peser 7 mg de papaïne et ajouter au tube étiqueté "papaïne". Retourner les deux tubes au bain d’eau pendant 15 min.
Remarque: Il est utile d’ajouter une petite quantité de tampon au bateau de pesée pour faciliter le transfert de la poudre de papaïne. - Une fois que toutes les poudres se sont dissoutes, filtrer-stériliser chaque solution à un tube conique frais de 15 mL. Pour la papaïne de tube, étiqueter la solution filtrée comme "papaïne-stérile". Pour le tube BSA, diviser la solution de BSA stérile en 3 tubes, contenant chacun 4 mL de solution BSA. Étiqueter chaque tube comme "BSA-stérile" et soit "1", "2" ou "3". Retournez tous les tubes au bain-eau et continuez à incuber à 37 ° c jusqu’à ce que nécessaire.
- Préparation pour la dissection tissulaire
- Prendre un seul morceau de papier filtre de 35 mm (voir tableau des matériaux) et stériliser avec 70% d’éthanol; laisser sécher dans le couvercle d’une boîte de Petri de 100 mm, dans une armoire de débit.
- Disposer les ciseaux, forceps, scalpel et spatule (voir tableau des matériaux) requis pour la dissection de l’hippocampe et du cortex.
- Placer 2 35 boîtes de Petri de mm et une boîte de Petri de 100 mm contenant du papier filtre stérile dans un endroit accessible au centre de l’armoire de débit.
- Collecter des NexCre transgéniques; Les chiots de souris Ai9 et VGAT venus qui doivent être disséqué. Utilisez une lampe fluorescente avec des filtres d’excitation et d’émission appropriés (voir tableau des matériaux) pour discriminer les chiots fluorescents des littermates de type sauvage.
- Immédiatement avant de disséter les animaux, remplir chaque boîte de Petri de 35 mm avec un tampon de culture cellulaire réfrigéré et stérile.
Remarque: Une boîte de Petri est pour nettoyer les outils entre les dissections, et l’autre est pour collecter l’hippocampe et le cortex.
- Dissection tissulaire
- Dès que le tampon de culture cellulaire est versé, décapiter un jour postnatal 0 – 2 transgénique souris ou rat chiot à l’aide de grands ciseaux pointus et utiliser une boîte de Petri stérile 100 mm pour transférer la tête dans l’armoire de débit. Utilisez des pinces, des ciseaux et une spatule pour transférer soigneusement le cerveau d’un chiot transgénique sur du papier filtre stérile.
- Utiliser un scalpel de type 22 pour disséquer le cervelet et séparer les 2 hémisphères. Utilisez une petite spatule pour rouler les hémisphères latéralement. Sur chaque hémisphère, appuyez doucement pour que le cortex entre en contact avec le papier filtre. Déplacez doucement les régions du mésencéphale pour révéler l’hippocampe et le cortex.
Remarque: Veillez à ne pas appliquer trop de pression lorsque vous appuyez sur les hémisphères ou les cellules peuvent être écrasées. - Utilisez un scalpel ou une spatule pour séparer l’hippocampe et le cortex de chaque hémisphère. Transférer le tissu disséqué dans une boîte de Petri de 35 mm contenant un tampon de culture cellulaire réfrigérée.
Remarque: Si vous disséchez plusieurs animaux, stockez le tampon de culture cellulaire stérile dans un tube conique de 50 mL sur la glace. Après chaque dissection, transférer le tissu disséqué au tampon de culture cellulaire réfrigérée. - Après une dissection réussie du tissu cortico-hippocampal, transférer la solution de papaïne stérile du bain d’eau à l’armoire de débit. Utiliser une pipette Pasteur de 3 mL pour transférer l’hippocampe et le cortex disséqué au couvercle d’une boîte de Petri stérile de 35 mm. Hachez dans un mouvement croisé, en utilisant la partie plate d’un scalpel de type 22, jusqu’à ce que le tissu soit en petits morceaux.
- Utiliser une petite quantité de solution de papaïne pour transférer le tissu haché du couvercle de la boîte de Petri au tube de papaïne stérile. Retourner le tube de papaïne au bain d’eau et incuber le tissu à 37 ° c pendant 25 min.
- Pendant l’incubation de papaïne, composent une solution complète de fluorescence. Décongeler une aliquote de 1 mL de 2, 0,5 mL de Glutamax et une aliquote de 0,5 mL de PEN-STREP. Aliquot 48,5 mL d’Hibernate un support à faible fluorescence à un tube conique 50 mL. Ajouter b. b, Glutamax et PEN-STREP à la solution. Secouez bien la solution, puis filtrer-stériliser et étiqueter comme "Hibernate un média complet" (avec la date et les initiales). Incuber à 37 ° c dans un bain d’eau.
- Après incubation de papaïne, transférer le tube de papaïne et les tubes de BSA stériles dans l’armoire d’écoulement. Utiliser une pipette Pasteur de 1 mL pour enlever uniquement le tissu cortico-hippocampal du tube de papaïne dans le tube BSA 1.
Remarque: Prenez soin de minimiser le transfert de la solution de papaïne excédentaire.
- Dissociation des cellules
- Afin de briser les gros amas de tissu, triturer le tissu plusieurs fois en utilisant une pipette Pasteur de 1 mL. Après cela, Triturez le tissu 7 fois en utilisant une pipette Pasteur fine pointe. Laisser le tissu se tenir pendant 30 s, ce qui permet de plus grands morceaux de tissu aux sédiments.
- Après 30 s, transférer le 1 mL inférieur de solution et de tissu du BSA-tube 1 au BSA-tube 2. Triturer le tissu dans le BSA-tube 2 plusieurs fois à l’aide d’une pipette Pasteur fine pointe.
- Après la trituration, transférer à nouveau le plus bas 1 mL de tissu et de solution de BSA-tube 1, mais maintenant à BSA-tube 3. Triturer le tissu dans le BSA-tube 3 plusieurs fois à l’aide d’une pipette Pasteur fine pointe.
- Après la trituration, transférer toute la solution et le tissu des tubes 2 et 3 dans le BSA-tube 1. Triturer un autre 2-3 fois et centrifuger à 3 000 x g pendant 3 min.
- Pendant la centrifugation, composent le média neural basal A complet (médias NBA). Aliquot 48,5 mL de support NBA dans un tube conique 50 mL et incuber à 37 ° c dans un bain d’eau. Etiqueter ce tube "NBA seulement". De plus, décongeler une aliquote de 1 mL de 2, 0,5 mL de Glutamax et une aliquote de 0,5 mL de PEN-STREP à température ambiante.
- Après centrifugation, Enlevez délicatement le surnageant du tissu granulé et resuspendez les cellules dans 2 mL de support complet. Utiliser une pipette P1000 pour triturer le tissu de haut en bas 20 fois.
Remarque: Prenez soin de ne pas Pipetter les cellules trop vigoureusement. Si une pression trop forte est appliquée, les cellules peuvent être endommagées. - Utiliser une pipette Pasteur de 1 mL pour filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis à cellules de 30 μm dans un tube d’échantillon de polystyrène.
Remarque: Si la suspension de la cellule ne passe pas immédiatement par le tamis de la cellule, il peut être nécessaire d’appuyer sur le dessus du tamis avec un gant stérile pour commencer le flux. Cette étape importante empêche l’obstruction du trieur de cellules. - Pour la collecte des neurones après le tri, préparer les tubes de prélèvement en pipetant 300 μL de support complet au nombre requis de tubes en polypropylène.
- La suspension cellulaire est maintenant prête à être prise au trieur cellulaire pour le tri. Prenez la suspension cellulaire, les tubes de collecte supplémentaires et les pièces de rechange de support complet dans le cas où la dilution de l’échantillon est nécessaire.
3. tri cellulaire des neurones GABAergiques ou glutamatergiques purifiés
Remarque: Pour minimiser les risques de contamination bactérienne pendant le tri, rincer le tube d’échantillonnage de la trieuse avec 70% d’éthanol pendant au moins 5 min avant le tri. Les paramètres de tri détaillés varient selon les instruments, les considérations fondamentales sont les suivantes.
- Au cours du premier tri cellulaire, établissez des niveaux de fluorescence de fond à partir de cellules non marquées en triant et en comparant les cellules d’un animal de type sauvage.
- Pour chaque type de cellule fluorescente à trier, choisissez les filtres d’excitation et d’émission appropriés. Excitez les protéines Vénus et TdTomato en utilisant respectivement des longueurs d’onde d’excitation de 488 nm ou 531 nm. Détecter la lumière émise à travers 530/40 et 575/30 ensembles de filtres d’émission, respectivement.
- Ajouter des tubes de prélèvement de polypropylène contenant 300 μL de support complet, au trieur cellulaire pour la collecte de cellules.
- Pour une grande pureté, triez les cellules fluorescentes marquées par des couleurs vives (voir figure 1b , par exemple, les diagrammes de points des cellules triées).
- Après le tri, pour obtenir des résultats optimaux, effectuez un test de pureté des cellules triées pour estimer les niveaux de pureté. Notez que le taux de récupération typique des cellules après le tri se situe entre 70 – 80%.
- Notez le nombre de cellules triées dans chaque tube de collecte. Cette valeur est donnée par l’instrument de tri de cellule.
Remarque: Le tri des cellules peut être effectué à l’aide d’une buse de 70 μm (pression du fluide de gaine de 70 psi) ou d’une buse de 100 μm (pression du fluide de gaine de 20 psi).
4. culturing des neurones triés
- Après le tri cellulaire, transférer les cellules recueillies dans des tubes à centrifugation à fond rond de 2 mL, à l’aide d’une pipette Pasteur de 1 mL. Centrifugez les cellules à 3 000 x g pendant 3 min pour former un culot cellulaire.
Remarque: Pour aider à identifier l’emplacement du culot de la cellule, orienter les tubes de centrifugation à fond rond avec la charnière du couvercle orientée vers l’extérieur, ce qui permet au culot de cellule de se former à l’arrière du tube de centrifugation (c.-à-d., sur le même côté du tube que la charnière). - Au cours de la centrifugation, ajouter 1 mL de 0,5 mL de Glutamax et 0,5 mL de PEN-STREP à 48,5 mL de milieux NBA préchauffés. Secouez bien la solution, puis filtrer stériliser et étiqueter comme "NBA Complete Media" (avec date et initiales). Retourner au bain d’eau jusqu’à ce que nécessaire.
- Après centrifugation, utiliser une pipette Pasteur de 1 mL pour transférer le surnageant dans un autre tube de centrifugation (conserver l’Incase du surnageant le culot de la cellule a été perturbé). Résuspendez le culot cellulaire dans la quantité requise de milieux complets préchauffés de la NBA pour obtenir une densité cellulaire de 1 000 cellules/μL. Résuspendez les cellules en pipetant de haut en bas avec une pipette P200 ou P1000.
- Pour confirmer la présence de cellules dissociées, vérifiez la solution cellulaire sous un microscope, à l’aide d’un objectif 4x ou 10x. Alternativement, Pipetter une petite quantité de solution cellulaire sur une lèvre et vérifier sous le microscope. Si un grand nombre de cellules sont présentes, le surnageant de l’étape 4,3 peut être jeté.
- Avant de galvanisation des cellules, tourbillonner à une vitesse moyenne pendant 2 – 3 s pour assurer une suspension de cellule uniforme. Après vortexing, Pipetter rapidement 10 μL de la suspension cellulaire au centre de chaque Coverslip. Après avoir Pipetter les cellules, retournez rapidement chaque plaque à l’incubateur (5% CO2/37 ° c) et incubez pendant 1 h.
Remarque: Si vous ajoutez des cellules à plusieurs plaques de 24 puits, assurez-vous que même les densités cellulaires par les cellules Vortex entre les plaques. - Après 1 h, nourrir les cellules avec 500 μL de support complet préchauffé de la NBA et retourner à l’incubateur.
Remarque: Lors de l’alimentation des cellules, il est important de Pipetter le support doucement sur le côté du puits pour éviter le détachement de cellules. Pour les expériences courtes (< 16 jours), l’alimentation à la densité ci-dessus n’est pas nécessaire. Lors du placage d’une plus grande densité de cellules, des intervalles d’alimentation plus fréquents peuvent être exigés (voir discussion).
5. cultures de soutien glial enrichi astrocyte
Remarque: La production de cultures gliales14 et l’utilisation d’inserts de culture cellulaire a été décrite précédemment12. En bref, les cultures de Glia enrichies d’astrocytes sont dérivées du tissu cortico-hippocampal (avec des méninges enlevés; P2 – P5), qui ont été cultivés pendant une semaine sur des plaques de 6 puits revêtues de 20 μg/mL de PLL, dans des milieux sériques additionnés de DMEM.
- Pour co-culture des neurones purifiés et des cellules gliales, passage des cellules gliales confluentes au nombre requis d’inserts de culture cellulaire (taille de pores de 0,4 μm — voir tableau des matériaux). Pour passer les cellules, retirer une plaque de 6 puits contenant des cellules gliales confluentes de l’incubateur et laver 2 puits, 2 fois, avec 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préchauffée (37 ° c).
- Aspirer la solution de PBS et utiliser une pipette P1000 pour ajouter 1 mL de trypsine préchauffée (37 ° c) (1:250)/EDTA (0,25%/0,02%) solution à chaque puits.
- Retournez la plaque de 6 puits à l’incubateur et vérifiez toutes les 2 – 3 min pour le détachement de la cellule.
- Une fois le détachement significatif de cellules, Pipetter les cellules et la solution cellulaire doucement vers le haut et vers le bas en utilisant une pipette Pasteur fine pointe, pour aider à détacher et séparer les cellules individuelles.
- Transférer la solution cellulaire dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 3 000 x g pendant 3 min.
- Résuspendez les cellules à l’aide d’une pipette P1000 dans 5 mL de milieux complets NBA préchauffés (37 ° c) en pipetant doucement vers le haut et vers le bas jusqu’à ce que le culot de la cellule soit en solution.
- Effectuer un comptage de cellules à l’aide d’un hémolytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.
Remarque: Après 7 jours de culture, environ 750000-1.000.000 de cellules peuvent être récoltées de chaque puits d’une plaque de 6 puits. - Plaque 40 000 cellules gliales à chaque Insert de culture cellulaire dans une gouttelette de 500 μL (80 cellules/μL).
- Après avoir autorisé les cellules à adhérer pendant 1 h, utilisez des pinces stériles pour transférer des inserts de culture cellulaire recouverts de glial sur des plaques de 24 puits contenant des neurones purifiés. Enlevez les excès de support de la surface des inserts de culture cellulaire (environ 300 μL).
Remarque: Comme les bulles d’air peuvent souvent être piégées sous les inserts de culture cellulaire, il peut être nécessaire d’incliner doucement les inserts pour déloger ces bulles. Si plus de cellules gliales sont ajoutées à l’insert de culture cellulaire, d’autres étapes de lavage et de centrifugation peuvent être nécessaires pour éliminer l’excès de trypsine, ce qui peut nuire à la survie des cellules.
Representative Results
La dissociation et le tri cellulaire des neurones fluorescents de la souris transgénique ou du tissu cortico-hippocampal de rat peuvent être effectués en approximativement 3 – 4 h. Le résultat est une population de neurones fluorescents très purs, qui peuvent être cultivés en culture pendant 16 jours.
Pour générer des cultures purifiées, les animaux transgéniques ont été identifiés pour la première fois à l’aide d’une lampe fluorescente avec des filtres appropriés (exemples de VGAT néonatales fluorescentes Vénus et NexCre; Les chiots de souris Ai9 sont montrés dans la figure 1a). Après l’identification des animaux transgéniques, les tissus disséqués ont été dissociés et les neurones les plus fortement fluorescents ont été triés pour produire une population cellulaire purifiée. Exemple de diagrammes de points d’intensité de fluorescence pour NexCre; Les neurones souris Ai9 et VGAT venus, obtenus pendant le FACS, sont montrés dans la figure 1b. Lorsqu’il est optimisé, il est possible de récolter entre 500 000 et 800 000 cellules du cortex et de l’hippocampe de l’individu P0-2 NexCre; Souris Ai9 ou VGAT Vénus. Les cellules peuvent être triées à une vitesse vers le haut de 600 événements/s. les estimations de la pureté des cellules ont été effectuées en utilisant le DAPI comme marqueur nucléaire (figure 1c). En triant des cellules fortement positives, une pureté de plus de 97% peut être obtenue systématiquement7.
Après un tri réussi, les neurones plaqués doivent apparaître en forme ronde, avoir une membrane lisse et doivent être vus pour pousser les neurites après environ 1 h in vitro (figure 2a, B). Par 7 jours in vitro, bien que certains décès cellulaires puissent être apparents, des cellules viables devraient être présentes dans toutes les conditions de culture (Figure 2c, D). À 12 – 16 jours in vitro, à l’aide d’enregistrements de pinces à cellules entières et de remplissage de biocytine15, il est possible d’étudier le développement morphologique et électrophysiologique des neurones purifiés (figure 3). L’analyse des cultures purifiées révèle que les neurones glutamatergiques et GABAergiques ont pu étendre les axones et les dendrites de leurs corps cellulaires (figure 3A, B) et conserver la capacité de générer des potentiels d’action en réponse à d’injections de courant dépolarisant supraliminaires (figure 3C, D). Toutefois, à la suite de la purification, seuls les neurones GABAergiques ont reçu des quantités significatives de transmission synaptique spontanée, et les neurones glutamatergiques reçoivent très peu de transmission synaptique en l’absence de cellules gliales (figure 3e , F) le 7.
Comme nous l’avons signalé précédemment, les cellules des cultures purifiées tendent à survivre plus mal que celles des cultures non triées et ont des dendrites et des axones significativement plus petits7. Pour surmonter ces déficits, nous avons adapté et appliqué des méthodes pour soutenir le développement de cultures purifiées avec des cellules gliales12,14. La composition cellulaire de nos cultures de soutien gliales (DIV7) est illustrée à la figure 4a. Ces cultures contenaient principalement des astrocytes positifs de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), mais contenaient aussi une grappe de molécules de différenciation (CD11b) positives de microglies et de protéine de base de myéline (MBP), des oligodendrocytes positifs. Après div 7, ces cellules peuvent être repiquées à des inserts de culture de cellules pour fournir le soutien sans contact des neurones purifiés (figure 4b, C). L’analyse des co-cultures de la Glia-Neuron révèle qu’environ 40 000 cellules gliales étaient suffisantes pour améliorer la survie et la croissance à long terme des neurones glutamatergiques et GABAergiques purifiés (figure 4D, E)7. En outre, l’analyse électrophysiologique révèle que les neurones glutamatergiques, co-cultivés avec des cellules gliales, étaient très actifs et avaient fortement augmenté l’activité du réseau (pourcentage de neurones glutamatergiques soutenus par le gliales déclenchant des rafales d’action potentiels: 62%; n = 28; Figure 4F , G). Le soutien glial est donc important non seulement pour la promotion de la croissance et de la survie des neurones, mais aussi pour la promotion de la transmission synaptique et l’établissement d’une activité réseau dans les cultures glutamatergiques.
Figure 1: purification des neurones glutamatergiques et GABAergiques. (A) images montrant le signal fluorescent de l’expression transgénique de TdTomato dans NexCre; Souris Ai9 (en haut) et Vénus en souris VGAT Vénus (en bas). Barres d’échelle = 5 mm. (B) diagrammes de dispersion d’intensité de la fluorescence TdTomato et de Vénus des cellules dissociées cortico-hippocampes de NexCre; Souris Ai9 (en haut) et souris VGAT Vénus (en bas). Les neurones tdtomato ou venus fortement fluorescents ont été sélectionnés pour le tri (indiqué par les boîtes de blocage). (C, gauche) Images confocales des neurones positifs triés TdTomato (Top) et venus (Bottom). (C, à droite) Image fusionnée montrant les cellules co-colorées avec DAPI (en pseudocouleur bleue). La fluorescence TdTomato est endogène et reste forte malgré la fixation (en pseudo-couleur magenta). L’expression de Vénus est améliorée en utilisant une combinaison d’un anticorps primaire dirigé contre le GFP et l’anticorps secondaire conjugué d’Alexa Fluor-488 (en pseudocouleur verte). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: culture cellulaire des neurones glutamatergiques ou GABAergiques purifiés. (A) les images infrarouges combinées (champ lumineux) et les signaux fluorescents superposés de TdTomato (à gauche) et de Vénus (droite) des neurones positifs cultivés pendant 1 h in vitro. Les flèches blanches indiquent l’emplacement des neurites en croissance. (B) les images confocales des neurones positifs de TdTomato (à gauche) et de Vénus (à droite) cultivés pendant 1 h in vitro. (C, D) Champ lumineux (en haut) et champ lumineux combiné et images fluorescentes (en bas) de TdTomato (C) et de neurones positifs venus (D) cultivés pendant 7 jours in vitro (DIV). Les flèches blanches montrent l’emplacement des noyaux condensés des cellules mortes. Les flèches colorées identifient les neurones marqués fluorescemment. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: propriétés morphologiques, électrophysiologiques et synaptiques des neurones purifiés. (A, B) Images confocales de TdTomato (A) et de neurones positifs venus (B) à DIV 13 et DIV 14, respectivement. Les cellules sont présentées en noir à l’aide d’une table de recherche inversée pour faciliter la visualisation des neurites. Les insets montrent le signal fluorescent exprimé par les neurones identifiés. (C, D) La réponse de tension d’un TdTomato (C) et de Vénus positif neurone (D) à hyperpolarisant (200 à-20 pA, en 20 pA pas) et dépolarisant (200 pA) impulsions de courant, obtenues par des enregistrements de patch-clamp à cellules entières. Les insets montrent les neurones enregistrés correspondants. Le potentiel membranaire au repos de chaque cellule est indiqué à gauche de la trace d’enregistrement. (E, F) Enregistrements de tension-clamp représentatifs (10 s) obtenus à partir de TdTomato (E) et de neurones positifs venus (F). Des événements postsynaptiques excitateurs spontanés (EPSCs) ont été enregistrés à partir de neurones positifs de TdTomato, maintenus à un potentiel de rétention de 50 mV. Des événements post-synaptiques inhibiteurs spontanément survenus (IPSC) ont été enregistrés à partir de neurones positifs venus maintenus à un potentiel de rétention de 0 mV. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: soutenir le développement du neurone avec la co-culture gliale. Aimages confocales de cultures gliales immunomarqué pour la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP, à gauche), grappe de molécule de différenciation (CD11b, milieu) et protéine de base de la myéline (MBP, droite). Les cellules gliales ont été cultivées pour DIV 7. (B) images d’inserts de culture cellulaire utilisés pour co-culture des cellules gliales avec des neurones purifiés dans un arrangement sans contact. (C) un schéma de l’agencement spatial utilisé pour la co-culture des neurones et des gliales. (D, E) Les images confocales des neurones positifs de TdTomato (D) et de Vénus (E), cultivées pendant 14 jours, en absence (à gauche) ou en présence (à droite) du support gliales. (F, G) Enregistrements de la pince de courant (60 s) des neurones positifs de TdTomato (F) et de Vénus (G) cultivés pendant 14 jours en absence (en haut) ou en présence (en bas) du support gliales. Les neurones ont été enregistrés à leur potentiel membranaire au repos (présenté à gauche de chaque trace d’enregistrement). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Nous décrivons ici une méthode qui combine le tri et la culture des neurones primaires pour générer des cultures cellulaires neuronales purifiées. Cette méthode prend environ 1 h de plus qu’un protocole typique de culture neuronale dissociée primaire mais permet la génération de centaines de cultures répliquées contenant des types neuronaux spécifiques. Les neurones purifiés, qui peuvent être cultivés isolément pendant au moins 16 jours, étendent les axones et les dendrites et peuvent déclencher des trains répétitifs de potentiels d’action (figure 2 et figure 3). Il est important de noter que ces cellules se prêtent aux mêmes analyses expérimentales que les cultures neuronales dissociées primaires régulières, y compris les analyses électrophysiologiques, morphologiques et de survie. Un avantage majeur de travailler avec ces cultures purifiées est que le développement de types cellulaires spécifiques peut être étudié isolément. Pour soutenir le développement des cultures purifiées, nous présentons également un protocole pour la co-culturing des neurones purifiés avec des cellules gliales. Comme indiqué précédemment, la co-culture des neurones purifiés avec des cellules gliales améliore leur survie, leur croissance et peuvent favoriser la formation du réseau7 (figure 4). Ainsi, nous présentons ici une combinaison de méthodes qui devraient poursuivre l’étude des interactions de la Glia-Neuron et peuvent s’avérer utiles pour étudier le développement et l’interaction entre d’autres types de cellules d’intérêt.
Des études sur les cultures de neurones glutamatergiques purifiés ont révélé des informations fondamentales sur la façon dont les cellules gliales sécrètent des facteurs qui favorisent le développement de réseaux neuronaux et la formation de Synapse16,17,18 . En général, les méthodes de purification des types de neurones spécifiques ont été plus efficacement appliquées à l’étude du développement des neurones glutamatergiques plutôt que des neurones GABAergiques. Cela a entraîné une disparité dans notre compréhension de la façon dont ces deux types de cellules se développent. Étant donné que les neurones GABAergiques et glutamatergiques diffèrent significativement en termes d’anatomie, de physiologie et d’origine développementale, il est vital que nous étudions les neurones GABAergiques à part entière, pour mieux comprendre leur fonction et leur physiologie. En utilisant le protocole présenté ici, nous avons déjà identifié des différences importantes dans la façon dont les neurones GABAergiques et glutamatergiques dépendent des facteurs sécrétés par la Glia pour l’établissement de la transmission synaptique7. En publiant ce protocole, nous espérons que d’autres pourront approfondir les interactions importantes entre les neurones et les cellules gliales.
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de tri cellulaire basée sur la cytométrie en flux, que nous avons utilisée pour purifier les neurones GABAergiques ou glutamatergiques de différentes lignées de rongeurs transgéniques. Les neurones GABAergiques positifs venus ont été triés à partir des souris VGAT venus13 ou des rats8 et des neurones glutamatergiques positifs tdtomato ont été triés à partir de nexcre; Les souris Ai9 (produites à l’origine à partir des lignées de reporter NexCre9 et Ai96, voir Turko et coll., 20187). Ces dernières années, en raison des progrès technologiques, la génération d’animaux transgéniques est devenue beaucoup plus facile. En tant que tel, la disponibilité des animaux exprimant des molécules fluorescentes, dans de nombreux types de cellules différentes, a augmenté rapidement. Cela a, à son tour, accru l’utilisation et l’applicabilité du tri des cellules fluorescentes activées. Alors que d’autres méthodes d’isolement des cellules d’intérêt existent actuellement16,19,20, elles sont quelque peu entravées par leur dépendance à l’égard de la disponibilité d’anticorps appropriés pour les surfaces naturelles Antigènes. Cela limite leur polyvalence par rapport aux méthodes de tri cellulaire basées sur la fluorescence, qui peuvent déjà être utilisées pour trier les cellules des nombreux animaux de reporter transgéniques spécifiques à la cellule qui sont déjà disponibles. Néanmoins, lorsqu’il est optimisé, les méthodes de tri basées sur les anticorps peuvent être rapides et à rendement élevé, et peuvent même mieux préserver l’anatomie des cellules, en permettant la purification des cellules avec leurs axones et leurs dendrites intactes21. Les méthodes de tri des anticorps doivent donc encore être prises en compte lors de la décision d’une stratégie de tri. En fin de compte, le type de cellule d’intérêt, l’âge auquel les cellules doivent être triées, la disponibilité d’animaux transgéniques ou d’antigènes de surface et le nombre de cellules nécessaires seront les facteurs déterminants lors du choix de la stratégie de tri la plus appropriée.
Bien que le tri cellulaire à base de fluorescence soit une méthode simple et reproductible pour purifier les cellules, il faut prendre soin de certaines étapes du protocole pour préserver la qualité des cellules. Par exemple, après chaque étape de centrifugation, il est important de s’assurer que le culot de la cellule est re-suspendu aussi rapidement que possible et que les cellules ont été récupérées avec succès. Occasionnellement, le culot de la cellule peut être perturbé lors du retrait du surnageant. Il est donc conseillé, entre les étapes de centrifugation, de vérifier la présence de cellules sous le microscope pour exclure toute perte de cellules importante. Après le placage cellulaire, les cellules doivent être autorisées à adhérer pendant au moins 1 h avant l’alimentation. Si les cellules sont alimentées trop tôt, certaines cellules peuvent se déloger de la Coverslip, réduisant ainsi la densité de culture. Après 1 h en culture, il est prudent d’évaluer la santé des cellules. Si les cellules ne semblent pas saines (un exemple de cellules saines est montrée dans la figure 2a), ou il y a une mort significative de cellules, alors ceci peut être une indication d’un problème pendant la procédure de dissociation ou de tri. Une autre considération importante, lors de la culture de n’importe quel type de cellule, est de prendre soin lors de la gestion des milieux de cultures cellulaires. Le support NBA contient du rouge de phénol, qui agit comme un indicateur de pH22. Si le média devient trop jaune en couleur, cela indique que le pH est trop acide; Si le média devient trop rose, cela indique que la solution est trop alcaline. Les solutions de stock ouvertes pendant de longues périodes, en particulier les supports alicités dans les tubes coniques, tendent à devenir plus alcalines au fil du temps. Il est donc conseillé de faire des nouveaux médias complets de la NBA chaque semaine et des médias complets toutes les deux semaines (les tampons moyens dans des conditions atmosphériques et devraient donc être plus stables). En tenant compte de ces points, il devrait être possible d’établir des cultures cellulaires purifiées dans n’importe quel laboratoire ayant accès au tri cellulaire et à l’équipement de culture cellulaire.
Dans la majorité de nos expériences, nous avons produit des cultures purifiées à partir d’un seul animal. Cependant, lors de l’épuration des cellules pour les analyses biochimiques, il peut être nécessaire de regrouper plusieurs animaux pour le tri. Nous avons réussi à trier jusqu’à 8 souris embryonnaires (jour embryonnaire 13 animaux) en utilisant le protocole ci-dessus (données non affichées). Toutefois, si l’on veut Trier davantage d’animaux, il peut être nécessaire d’augmenter le volume des solutions de papaïne et de BSA (décrites aux étapes 2.1.1 – 2.1.4) pour tenir compte de l’augmentation de la quantité de tissu. En outre, si plus de cellules sont plaquées dans la culture, alors un calendrier d’alimentation plus fréquent peut être exigé. Comme point de départ, les cellules peuvent être alimentées tous les 7 jours en enlevant 100 μL de support conditionné et en ajoutant 200 μL de nouveaux médias complets de la NBA. Pour le bien de la viabilité du neurone, si l’on trie plus d’animaux, il faut penser à minimiser le temps de tri autant que possible. Cela nécessite souvent l’optimisation minutieuse des analyses en aval pour une utilisation efficace des cellules purifiées. Nous avons régulièrement trié les neurones de souris à des taux de 600 événements/s, jusqu’à 500000 – 800 000 cellules par animal (jour postnatal 0 – 2). Cependant, ce n’était pas une optimisation exhaustive des vitesses et des conditions de tri. Par conséquent, d’autres améliorations de la vitesse de tri et du rendement devraient être possibles.
Les neurones purifiés ont besoin de milieux conditionnés pour leur survie. Cela a été démontré précédemment en cultivant les neurones et les cellules gliales séparément, avant de traiter les neurones avec des médias conditionnés gliales10. Dans nos expériences, nous avons choisi de soutenir les neurones purifiés en cultivant des cellules gliales sur des inserts de culture cellulaire semi-perméables, qui sont placés à l’intérieur de la plaque de culture cellulaire. Cette méthode a été appliquée avec succès pour étudier les protéines de matrice extracellulaire dérivées de la Glia et leur interaction avec les neurones12. Le soutien sans contact, mais continu fourni par cette méthode a un certain nombre d’avantages par rapport à la culture distincte des cellules. Plus particulièrement, la co-culture des cellules gliales avec des neurones permet la régulation et le conditionnement continus des milieux de culture cellulaire, ce qui ressemble plus étroitement à la situation in vivo. En outre, la co-culture continue des cellules permet la signalisation potentielle de rétroaction entre les neurones et la Glia, ce qui n’est pas possible dans les cultures séparées. Dans notre protocole, si nécessaire, la méthode de co-culture continue peut être facilement omise et un traitement classique des neurones avec des médias conditionnés par la Glia peut être effectué.
En résumé, le protocole présenté ici vise à fournir au lecteur une base solide à partir de laquelle ils peuvent établir leurs propres expériences de culture cellulaire purifiée. Nous prévoyons que la disponibilité des animaux transgéniques et des constructions virales continuera d’augmenter dans un avenir prévisible. Par conséquent, les techniques de tri cellulaire basées sur la fluorescence sont susceptibles de devenir encore plus largement utilisées et précieuses.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs remercient l’excellent support technique fourni par Jenny Kirsch et Ana Teichmüller au centre de cytométrie en flux, Deutsches Rhumma-Forschungszentrum, Berlin. Nous aimerions remercier Jie Song pour son aide à l’analyse de la survie. Nous aimerions également remercier Rita Loureiro pour son aide à capturer les images de souris fluorescentes et Christian Ebner pour la lecture critique du protocole. Les rats transgéniques VGAT-venus ont été générés par les Drs Y. Yanagawa, M. Hirabak et Y. Kawaguchi dans l’Institut national des sciences physiologiques, Okazaki, Japon, en utilisant pCS2-venus fourni par le Dr A. Miyawaki. Ce travail a été appuyé par le Conseil allemand de la recherche (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG EXC 257 à IV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neural Basal A media (NBA) | ThermoFisher Scientific | 10888022 | Cell Culture Buffer |
| B27 | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Culture supplement |
| Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050-038 | Culture supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic |
| Poly-L-Lysine | SIGMA | P1399 | Coverslip coating |
| Papain | SIGMA | P4762-1G | Enzyme |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A3294-100G | Serum |
| Hibernate A low fluorescence media | Brain Bits Ltd | HALF | Cell Transport media |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Biochrom | F0435 | Glial Culture Buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom | S0115 | Serum |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2163 | Enzyme |
| Fine Tip Pasteur Pipette | Neo Labs | - | Used for trituration of cells |
| 24-well plates | BD | 353047 | Culture plate |
| 50 mL Falcon tubes | BD | 352070 | - |
| 15 mL Falcon tubes | BD | 352096 | - |
| Glass coverslips: 12 mm round | Roth | P231.1 | - |
| 35 mm Petri dish | Corning | 353001 | - |
| 100 mm Petri dish | Corning | 353003 | - |
| 30 µm CellTrics Cell Sieve | sysmex | 04-004-2326 | To remove cell clumps before cell sorting |
| Round bottom polystyrene tubes | BD | 352054 | Transport tube for sorted cells |
| Round bottom polypropylyne tubes | BD | 352063 | Collection tube for sorted cells |
| Cell culture inserts – 0.4 µm transparent PET | Falcon | 353 095 | For the co-culture of neurons and glia |
| Extra fine Bonn Scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | To remove overlying skin and bone of mice |
| Extra narrow Scissors | Fine Scientific Tools | 14088-10 | To remove overlying skin and bone of rats |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11242-40 | To hold the head in place |
| Spatula (130 mm long/5 mm tip width) | Fine Scientific Tools | 3006.1 | To remove the brain to filter paper |
| Scalpel Blades | Swan-Morton | #0308 | To mechanically dissociate neural tissue |
| Haemocytometer (Neubauer Imroved) | Optik Labor | - | To cell count dissociated cells |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/LS-1G | To excite TdTomato |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/EF-4R2 | Td Tomato compatible emission filter |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/ULS-02B2 | To excite Venus |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/TEF-3GY1 | Venus compatible emission filter |
| Mouse-Anti-GFP primary antibodies | UC Davis | 75-132 | To enhance Venus signal following fixation |
| Mouse-Anti-GFAP primary antibodies | SIGMA | G-3893 | The identification of reactive astrocytes |
| Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies | Southern Biotech | 1561-15 | The identification of microglial cells |
| Rabbit-Anti-MBP primary antibodies | Millipore | AB980 | The identification of oligodendrocyes |
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