Summary
Denne protokollen beskriver en celle sortering basert metode for rensing og kultur av fluorescerende GABAergic eller glutamatergic neurons fra mektig og hippocampus av postnatal mus eller rotter.
Abstract
Det overordnede målet med denne protokollen er å generere renset neuronal kulturer avledet fra enten GABAergic eller glutamatergic neurons. Renset neurons kan være kultivert i definerte medier for 16 dager in vitro og er mottagelig for noen analyser vanligvis utført på dissosiert kulturer, inkludert elektrofysiologisk, morfologiske og overlevelse analyser. Den store fordelen med disse kulturene er at spesifikke celletyper kan selektivt studert i fravær av komplekse ytre påvirkninger, slik som de som oppstår fra gliacellene celler eller andre Nevron typer. Når du planlegger eksperimenter med renset celler, er det imidlertid viktig å merke seg at nevroner sterkt avhenger av glia medier for deres vekst og overlevelse. I tillegg glutamatergic neurons videre avhenge glia-utskilles faktorer for etablering av Synaptic overføring. Vi beskriver derfor også en metode for dyrking neurons og gliacellene celler i en ikke-kontakt ordning. Ved hjelp av disse metodene, har vi identifisert store forskjeller mellom utviklingen av GABAergic og glutamatergic neuronal nettverk. Således, studere kulturer av renset neurons har stort potensial for å fremme vår forståelse av hvordan nervesystemet utvikler og funksjoner. Videre kan renset kulturer være nyttig for å undersøke direkte handling av farmakologiske midler, vekstfaktorer eller for å utforske konsekvensene av genetiske manipulasjoner på bestemte celletyper. Ettersom mer og mer transgene dyr blir tilgjengelig, merking ekstra spesifikke celletyper av interesse, forventer vi at protokollene som er beskrevet her vil vokse i deres anvendelse og potensial.
Introduction
Celle sortering er et kraftig verktøy for isolering av levende celler av interesse fra en heterogen blanding av celler. Celler kan sorteres basert på størrelse og form kriterier, samt uttrykk for fluorescerende markører1,2. Ofte brukes fluoroforen antistoffer til å merke forskjellige celletyper ved å målrette mot celle spesifikk overflate antigener3,4. Alternativt, transgene dyr eller viral levering systemer er konstruert for å uttrykke fluorophores under Cell-spesifikke arrangører5,6. Historisk sett var utviklingen av transgene-verktøy og dyr kostbare og tidkrevende. Flere nylig, reduserte kostnader og færre tekniske problemer har ført til en dramatisk økning i antall tilgjengelige reporter linjer. Som tilgjengeligheten av transgene verktøy og reporter dyr fortsetter å vokse, så også bør nytten og anvendelsen av fluorescens-baserte celle sortering metoder.
Vi har nylig demonstrert at celle sortering fra transgene dyr kan rutinemessig brukes til å rense primære neurons i forberedelsene til cellekultur7. Ved å sortere celler fra enten rotter eller mus, var vi i stand til å isolere og kultur fluorescerende neurons, som uttrykker fluorescerende reporter proteiner spesielt i enten GABAergic eller glutamatergic neurons6,8,9. Ved å studere disse renset neuronal kulturer, var vi i stand til å identifisere en viktig forskjell i måten GABAergic og glutamatergic neurons avhenge glia-utskilles faktorer for etablering av Synaptic overføring7. I tillegg, ved co-dyrking gliacellene celler med renset neurons, kunne vi utvide på tidligere observasjoner demonstrere den kritiske rollen som gliacellene celler spille i vekst og overlevelse av neurons10,11. Således, gjennom en kombinasjon av celle sortering og cellekultur, var vi i stand til å studere ikke bare utviklingen av spesifikke Nevron typer isolert sett, men var i stand til å undersøke påvirkning av gliacellene celler på deres funksjon.
Vi presenterer her en protokoll for rensing og kultur av GABAergic og glutamatergic neurons fra cortex og hippocampus av transgene mus eller rotter. Vi presenterer også en metode for ikke-kontakt co-kultur av renset neurons og gliacellene celler, tilpasset fra Geissler et al.12. For å generere renset GABAergic kulturer, har vi sortert fluorescerende neurons fra VGAT-Venus-A Wistar rotter8 eller VGAT-Venus mus13, som selektivt uttrykker en forbedret gul fluorescerende protein variant (Venus) i > 95% av kortikale GABAergic neurons. For å generere renset glutamatergic kulturer, har vi sortert fluorescerende neurons fra NexCre; Ai9 mus6,9, som uttrykker tdTomato i kortikale glutamatergic neurons. Hele sortering og kultur prosedyre kan utføres innen 3-4 h og kan brukes til å generere hundrevis av gjenskape kulturer egnet for elektrofysiologisk, morfologiske og celle overlevelse analyse. Metoden er enkel, reproduserbar og kan produsere renset neuronal kulturer som er større enn 97% ren for cellen type interesse.
Protocol
Alle prosedyrer og dyr vedlikehold ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer, den tyske Animal Welfare Act og det europeiske rådsdirektiv 86/609/EØF om beskyttelse av dyr, i nærvær av tillatelser fra lokale myndigheter (LaGeSo Berlin, T-0215/11).
Merk: Denne protokollen beskriver kulturen i renset neurons fra en enkelt transgene mus eller rotte valp (postnatal dag 0 – 2). Alle teknikker bør utføres under sterile forhold. Alle løsninger bør steriliseres ved hjelp av et filter på 0,2 μm (se tabell over materialer). Glass coverslips og disseksjon verktøy skal være varme sterilisert for 3 t ved 185 ° c.
1. coating glass Coverslips med Poly-L-lysin
- Forbered glass coverslips ved å avriming en 5 mL alikvot av 200 μg/mL Poly-L-lysin (PLL) løsning. Fortynne denne lager løsningen til 20 μg/mL ved å tilsette 45 mL ren vann av injeksjons kvalitet. Filter-sterilisere oppløsningen til en ny 50 mL konisk slange. Merk dette røret som "PLL steril".
Merk: Bruk vann som er lagret ved romtemperatur for å fremskynde avriming prosessen. - Tilsett 100 steril, rund, 12 mm glass coverslips til den sterile PLL-løsningen. Agitere røret hver 5 – 10 min, for 2 – 3 min, for å sikre jevnt belegg. Coat coverslips på denne måten for 1 t.
Merk: Tysk-produsert runde glass coverslips (diameter = 12 mm) foretrekkes, som de gir en pålitelig kultur overflate og passer lett inn i brønnene til en 24-brønn cellekultur plate. - Etter 40 min av PLL belegg, ta 2 stykker av silkepapir og legg dem flatt i strømnings kabinettet. Sterilisere papiret med 70% etanol, deretter flate for å fjerne bretter og la tørke.
- Etter å ha belagt glass coverslips for 1 time med PLL, Fjern overflødig PLL-løsning og tilsett vann med steril injeksjons kvalitet. Agitere forsiktig coverslips for 2 – 3 s for å tillate fjerning av overflødig PLL. Gjenta dette skylle trinn 2 ekstra ganger.
- Fjern overflødig vann, og Overfør deretter coverslips til det sterile vevs papiret. Forsiktig skille hver dekkglass ved hjelp av buet tang og la tørke.
Merk: Coverslips som ikke lett skille kan kastes. Alternativt kan en liten mengde vann tilsettes for å hjelpe separasjon. - Når tørr, overføre coverslips til en 24-brønn kultur plate.
Merk: Coverslips bør gjøres klar ca. 30 min – 1 time før disseksjon prosessen starter. Platene kan oppbevares i en inkubator ved 37 ° c og 5% CO2 til nødvendig.
2. dissosiasjon av hippocampus og kortikale tissue
- Utarbeidelse av cellekultur løsninger
- For dissosiasjon av nevrale vev, først tine en 40 mL alikvot av cellekultur buffer (komposisjon [in mM]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,3 NaH2PO4, 1 MgSO4· 7H2O, 1 CaCl2· 2h2O, 0,5 EDTA · 2Na · 2H2O og 25 D-glukose, pH = 7,4). Mål ut 12 mL cellekultur buffer til et 15 mL konisk rør; etiketten som "BSA". Mål ut 5 mL cellekultur buffer til en annen 15 mL tube; etiketten som "Papain". Ruge begge rørene i et vannbad i 15 minutter ved 37 ° c.
- Filter-sterilisere den gjenværende cellekultur buffer, etiketten som "buffer-sterile" og oppbevares ved 4 ° c til nødvendig.
- Veie ut 120 mg av storfe serum albumin (BSA) og legge til røret merket "BSA". Veie ut 7 mg Papain og legge til røret merket "Papain". Returner begge rørene til vannbadet i 15 minutter.
Merk: Det er nyttig å legge til en liten mengde buffer til veie båten for å lette overføringen av det Papain pulveret. - Når alle pulver har oppløst, filter-sterilisere hver løsning til en frisk 15 mL konisk rør. For rør Papain, Merk den filtrerte løsningen som "Papain-steril". For BSA-rør kan du dele den sterile BSA-løsningen i tre rør, som hver inneholder 4 mL BSA-oppløsning. Merk hvert rør som "BSA-sterile" og enten "1", "2" eller "3". Returner alle rør tilbake til vannbadet og Fortsett å ruge ved 37 ° c til det er nødvendig.
- Forberedelse til vevs disseksjon
- Ta et enkelt stykke 35 mm filter papir (se tabell over materialer) og sterilisere med 70% etanol; La det tørke i lokket på en 100 mm Petri parabolen, i en Flow kabinett.
- Legg ut saksen, pinsett, skalpell og slikkepott (se tabell over materialer) som kreves for Disseksjon av hippocampus og cortex.
- Plasser 2 35 mm Petri retter og en 100 mm Petri parabolen inneholder sterilt filter papir i et tilgjengelig sted i sentrum av strømnings kabinett.
- Samle transgene NexCre; Ai9 og VGAT Venus musen pups det er å bli dissekert. Bruk en fluorescerende lampe med egnede eksitasjon og utslipps filtre (se tabell over materialer) for å diskriminere fluorescerende valper fra vill type littermates.
- Umiddelbart før dissekere dyr, Fyll hver 35 mm Petri parabolen med kjølt, steril cellekultur buffer.
Merk: One Petri parabolen er for rengjøring av verktøy mellom dissections, og den andre er for innsamling av hippocampus og cortex.
- Vev disseksjon
- Så snart cellen kulturen buffer helles, halshugge en postnatal dag 0-2 transgene mus eller rotte valp ved hjelp av store, skarpe saks og bruke en steril 100 mm Petri parabolen å overføre hodet inn i Flow kabinett. Bruk pinsett, saks og en slikkepott til å nøye overføre hjernen til en transgene valp til sterilt filter papir.
- Bruk en type 22 skalpell å analysere bort lillehjernen og å skille de 2 halvkuler. Bruk en liten slikkepott til å rulle halvkuler sideveis. Trykk forsiktig ned på hver halvkule slik at cortex kommer i kontakt med filter papiret. Forsiktig flytte mellomhjernen regioner for å avdekke hippocampus og cortex.
Merk: Vær forsiktig så du ikke bruke for mye press når du trykker ned på halvkuler eller celler kan bli knust. - Bruk en skalpell eller slikkepott til å skille hippocampus og cortex fra hver halvkule. Overfør dissekert vev til en 35 mm Petri parabolen inneholder kjølt cellekultur buffer.
Merk: Hvis dissekere flere dyr, lagre steril cellekultur buffer i et 50 mL konisk rør på is. Etter hver disseksjon, overføre dissekert vev til kjølt cellekultur buffer. - Etter en vellykket Disseksjon av cortico-hippocampus vev, overfør den sterile Papain løsningen fra vannbadet til strømnings kabinettet. Bruk en 3 mL Pasteur-pipette for å overføre dissekert hippocampus og cortex til lokket på et sterilt 35 mm Petri-fat. Chop i en kryss bevegelse, ved hjelp av den flate delen av en type 22 skalpell, inntil vevet er i små biter.
- Bruk en liten mengde Papain løsning for å overføre hakket vev fra lokket på Petri rett til sterilt Papain røret. Returner Papain røret til vannbadet og ruge vevet ved 37 ° c i 25 min.
- Under Papain inkubasjons, utgjør komplett fluorescens Media løsning. Tine en 1 mL alikvot av B27, en 0,5 mL alikvot av Glutamax og en 0,5 mL alikvot av pen-strep. Alikvot 48,5 mL dvalemodus et lavt fluorescens medium til et 50 mL konisk rør. Legg B27, Glutamax og pen-strep til løsningen. Rist løsningen godt, deretter filter-sterilisere og etiketten som "Hibernate en komplett Media" (med dato og initialer). Ruge ved 37 ° c i et vannbad.
- Etter Papain inkubasjons, Overfør Papain og sterile BSA-rør til strømnings kabinettet. Bruk en 1 mL-pipette for å fjerne bare det cortico hippocampus vevet fra Papain røret inn i BSA-rør 1.
Merk: Pass på å minimere overføring av overflødig Papain løsning.
- Dissosiasjon av celler
- For å bryte opp noen store klumper av vev, triturate vevet flere ganger ved hjelp av en 1 mL Pasteur pipetter. Etter dette, triturate vevet 7 ganger ved hjelp av en fin spiss Pasteur pipette. La vevet stå i 30 s, slik at større biter av vev til sediment.
- Etter 30 s, overfør den nedre 1 mL oppløsning og vev fra BSA-tube 1 til BSA-tube 2. Triturate vevet i BSA-tube 2 flere ganger ved hjelp av en fin spiss Pasteur pipette.
- Etter trituration, overføre igjen den nedre 1 mL vev og oppløsning fra BSA-tube 1, men nå til BSA-tube 3. Triturate vevet i BSA-tube 3 flere ganger ved hjelp av en fin spiss Pasteur pipette.
- Etter trituration, Overfør all løsning og vev fra rør 2 og 3 inn i BSA-tube 1. Triturate ytterligere 2-3 ganger og sentrifuge ved 3 000 x g i 3 min.
- Under sentrifugering, utgjør komplett neural basal A Media (NBA Media). Alikvot 48,5 mL av NBA-mediet til et 50 mL konisk rør og ruge ved 37 ° c i et vannbad. Label dette røret "NBA bare". I tillegg, tine en 1 mL alikvot av B27, en 0,5 mL alikvot av Glutamax og en 0,5 mL alikvot av pen-strep ved romtemperatur.
- Etter sentrifugering, forsiktig fjerne supernatanten fra pelleted vev og re-suspendere cellene i 2 mL av komplette medier. Bruk en P1000 pipette for å triturate vevet opp og ned 20 ganger.
Merk: Pass på å ikke Pipetter cellene for kraftig. Hvis for mye trykk påføres, kan cellene bli skadet. - Bruk en 1 mL en pipette for å filtrere celle fjæringen gjennom en 30 μm celle sikt inn i et polystyren prøverør.
Merk: Hvis celle fjæringen ikke passerer umiddelbart gjennom celle sil, kan det være nødvendig å trykke på toppen av sil med en steril hanske for å starte flyten. Dette viktige trinnet forhindrer tilstopping av celle sorteringen. - For å samle neurons etter sortering, forberede samling rør ved pipettering 300 μL av komplette medier til det nødvendige antall polypropylen rør.
- Celle fjæringen er nå klar til å tas med til celle sorteringen for sortering. Ta cellen suspensjon, ekstra samling rør og reservedeler komplette medier i tilfelle fortynning av prøven er nødvendig.
3. celle sortering av renset GABAergic eller Glutamatergic neurons
Merk: For å minimere sjansen for bakteriell forurensning under sortering skyll prøve slangen av sorteringen med 70% etanol i minst 5 min før sortering. Detaljerte sorteringsparametre varierer mellom instrumenter, grunnleggende hensyn er som følger.
- Under den første cellen sortere, etablere nivåer av bakgrunnen fluorescens fra umerkede celler ved å sortere og sammenligne celler fra en vill type dyr.
- For hver fluorescerende celle type som skal sorteres, velger du de aktuelle eksitasjon-og utslipps filtrene. Opphisse Venus og TdTomato proteiner bruker 488 NM eller 531 NM eksitasjon bølgelengder, henholdsvis. Detektere lys gjennom 530/40 og 575/30 utslipps filter sett, henholdsvis.
- Legg polypropylen samling rør, som inneholder 300 μL av komplette medier, til celle sorteringen for celle samlingen.
- For høy renhet, Sorter sterkt merkede fluorescerende celler (se figur 1B for eksempel prikk plott av sorterte celler).
- Etter sortering, for optimale resultater, utføre en renhet test av de sorterte cellene å estimere renhet nivåer. Vær oppmerksom på at den typiske utvinningsgraden av celler etter sortering er mellom 70 – 80%.
- Noter antall celler som er sortert i hvert purre rør. Denne verdien gis av celle sorterings instrumentet.
Merk: Celle sortering kan utføres ved hjelp av et 70 μm munnstykke (70 PSI skjede væsketrykk) eller en 100 μm dyse (20 PSI skjede væsketrykk).
4. dyrking av sorterte neurons
- Etter celle sortering, overføre innsamlede celler til 2 mL runde bunnen sentrifuger rør, ved hjelp av en 1 mL Pasteur pipetter. Sentrifuger cellene ved 3 000 x g i 3 min for å danne en celle pellet.
Merk: For å bidra til å identifisere plasseringen av cellen pellet, orientere runde bunnen sentrifuger rør med hengslene av lokket vendt utover, som gjør at cellen pellet å danne på baksiden av sentrifuge røret (dvs. på samme side av røret som hengslene). - Tilsett 1 mL B27, 0,5 mL Glutamax og 0,5 mL av pen-strep til 48,5 mL pre-varmet NBA-sentrifugering. Rist løsningen godt, deretter filtrere sterilisere og etiketten som "NBA komplett Media" (med dato og initialer). Gå tilbake til vannbad inntil nødvendig.
- Etter sentrifugering, bruke en 1 mL Pasteur pipette å overføre supernatanten til en annen sentrifugerør (beholde supernatanten incase cellen pellet ble forstyrret). Re-suspendere cellen pellet i den nødvendige mengden av pre-varmet komplett NBA Media for å oppnå en celle tetthet på 1 000 celler/μL. re-suspendere cellene ved pipettering opp og ned med en P200 eller P1000 pipette.
- For å bekrefte tilstedeværelsen av dissosiert celler, sjekk celle løsningen under et mikroskop, ved hjelp av en 4X eller 10x objektiv objektiv. Alternativt kan du pipette en liten mengde celle løsning på en dekkglass og sjekke under mikroskopet. Hvis det finnes et stort antall celler, kan supernatanten fra trinn 4,3 forkastes.
- Før plating av cellene, Vortex på en middels hastighet for 2-3 s for å sikre en jevn celle suspensjon. Etter virvlingen kan du raskt Pipetter 10 μL av celle fjæringen til midten av hver dekkglass. Etter pipettering cellene, raskt tilbake hver plate til inkubator (5% CO2/37 ° c) og ruge for 1 t.
Merk: Hvis du legger til celler i flere 24-brønn plater, må du sikre jevn celle tetthet ved å virvlingen celler mellom platene. - Etter 1 time, mate cellene med 500 μL av pre-varmet komplett NBA Media og gå tilbake til inkubator.
Merk: Når fôring cellene, er det viktig å pipette mediene forsiktig ned på siden av brønnen for å unngå celle avløsning. For korte eksperimenter (< 16 dager), fôring på ovenstående tetthet er ikke nødvendig. Når plating en større tetthet av celler, hyppigere fôring intervaller kan være nødvendig (se diskusjon).
5. astrocytt beriket gliacellene støtte kulturer
Merk: Produksjonen av gliacellene kulturer14 og bruken av cellekultur innsatser har blitt beskrevet tidligere12. I korte trekk, astrocytt beriket glia kulturer er avledet fra cortico-hippocampus vev (med hjernehinnene fjernet; P2 – P5), som har vært kultivert i en uke på en 20 μg/mL PLL-belagt 6-brønn plater, i serum supplert DMEM medier.
- For å co-kultur renset neurons og gliacellene celler, passasje confluent gliacellene celler til det nødvendige antall cellekultur inserts (0,4 μm pore størrelse-se tabell over materialer). Å passasje cellene, fjerne en 6-brønn plate som inneholder confluent gliacellene celler fra inkubator og vask 2 brønner, 2 ganger, med 2 mL pre-varmet (37 ° c) fosfat bufret saltvann (PBS).
- Aspirer PBS-løsningen og bruk en P1000 pipette for å legge til 1 mL pre-varmet (37 ° c) Trypsin (1:250)/EDTA (0,25%/0.02%) løsning til hver brønn.
- Returner 6-brønn plate til inkubator og sjekk hver 2 – 3 min for celle avløsning.
- Når betydelig celle avløsning har skjedd, pipette cellene og celle løsning forsiktig opp og ned ved hjelp av en fin spiss Pasteur pipette, for å hjelpe videre avløsning og separasjon av individuelle celler.
- Overfør celle løsningen til et 15 mL konisk rør og sentrifuge ved 3 000 x g i 3 min.
- Re-suspendere cellene ved hjelp av en P1000 pipette i 5 mL av pre-varmet (37 ° c) NBA komplett Media ved forsiktig pipettering opp og ned til cellen pellet er i løsningen.
- Utfør en celle telling ved hjelp av en haemocytometer eller en automatisert celle teller.
Merk: Etter 7 dager i kulturen, kan ca 750000-1000000 celler høstes fra hver brønn av en 6-brønn plate. - Plate 40 000 gliacellene celler til hver cellekultur settes inn i en 500 μL dråpe (80 celler/μL).
- Etter at cellene til å overholde 1 h, bruk steril tang for å overføre gliacellene cellekultur setter inn til 24-brønn plater som inneholder renset neurons. Fjern overflødig Media fra overflaten av cellen kultur inserts (ca 300 μL).
Merk: Som luftbobler kan ofte bli fanget under celle kulturen inserts, kan det være nødvendig å forsiktig vippe inserts å løsne disse boblene. Hvis flere gliacellene celler legges til cellekultur innsatsen, kan ytterligere vasking og sentrifuge trinn være nødvendig for å fjerne overflødig Trypsin, noe som kan være skadelig for celle overlevelse.
Representative Results
Dissosiasjon og celle sortering av fluorescerende neurons fra transgene mus eller rotte cortico-hippocampus vev kan utføres i ca 3 – 4 timer. Resultatet er en populasjon av svært rene fluorescerende neurons, som kan dyrkes i kultur i 16 dager.
For å generere renset kulturer ble transgene dyr først identifisert ved hjelp av en fluorescerende lampe med egnede filter sett (eksempler på fluorescerende nyfødt VGAT Venus og NexCre; Ai9 mus pups er vist i figur 1a). Etter identifisering av transgene dyr var dissekert vev dissosiert, og de sterkeste fluorescerende neurons ble sortert for å produsere en renset celle befolkning. Eksempel fluorescens intensitet prikk tomter for NexCre; Ai9 og VGAT Venus mus neurons, innhentet under FACS, er vist i figur 1B. Når optimalisert, er det mulig å høste mellom 500 000 og 800 000 celler fra cortex og hippocampus av individuelle p0-2 NexCre; Ai9 eller VGAT Venus mus. Celler kan sorteres med en hastighet i overkant av 600 hendelser/s. estimater av celle renhet ble utført ved hjelp av DAPI som en kjernefysisk markør (figur 1C). Ved å sortere sterkt positive celler, en renhet på mer enn 97% kan rutinemessig oppnås7.
Etter vellykket sortering, belagt neurons skal vises rund i form, har en glatt membran og bør sees å spire neurites etter ca 1 h in vitro (figur 2a, B). Ved 7 dager in vitro, selv om noen celle død kan være åpenbare, bør levedyktige celler være tilstede i alle kultur forhold (figur 2C, D). Ved 12 – 16 dager in vitro, ved hjelp av hel celle patch-klemme innspillinger og biocytin15, er det mulig å undersøke morfologiske og elektrofysiologisk utvikling av renset neurons (Figur 3). Analyse av renset kulturer avslører at både glutamatergic og GABAergic neurons var i stand til å forlenge axons og dendrites fra deres celle organer (figur 3a, B) og beholde evnen til å generere tiltak som svar på suprathreshold depolariserende nåværende injeksjoner (figur 3c, D). Spesielt, men etter rensing, bare GABAergic neurons mottatt betydelige mengder spontan Synaptic overføring, og glutamatergic neurons får svært lite Synaptic overføring i fravær av gliacellene celler (figur 3e , F) 7i.
Som vi tidligere har rapportert, celler i renset kulturer har en tendens til å overleve mer dårlig enn de i usortert kulturer og har betydelig mindre dendrites og axons7. For å overkomme disse underskudd har vi tilpasset og anvendt metoder for å støtte utviklingen av renset kulturer med gliacellene celler12,14. Den cellulære sammensetningen av våre gliacellene støtte kulturer (DIV7) er vist i figur 4a. Disse kulturene inneholdt overveiende gliacellene fibrillary surt protein (GFAP) positive astrocytter, men også inneholdt noen klynge av differensiering molekyl (CD11b) positive mikroglia og myelin grunnleggende protein (MBP) positive oligodendrocytes. Etter DIV 7, kan disse cellene være passert til cellekultur innsatser for å gi ikke-kontakt støtte av renset neurons (figur 4b, C). Analyse av glia-Nevron co-kulturer avslører at ca 40 000 gliacellene celler var tilstrekkelig til å forbedre den langsiktige overlevelse og vekst av både renset glutamatergic og GABAergic neurons (figur 4d, E)7. Videre avslører elektrofysiologisk analyse at glutamatergic neurons, co-kultivert med gliacellene celler, var svært aktive og hadde sterkt økt nettverksaktivitet (prosentandel av gliacellene støttet glutamatergic neurons avfyring serieopptak av handlingen potensialer: 62%; n = 28; Figur 4f , G). Gliacellene støtte er derfor viktig ikke bare for å fremme Nevron vekst og overlevelse, men også for å fremme Synaptic overføring og etablering av nettverksaktivitet i glutamatergic kulturer.
Figur 1: rensing av glutamatergic og GABAergic neurons. (A) bilder som viser fluorescerende signaler fra transgene uttrykk for TdTomato i NexCre; Ai9 mus (øverst) og Venus i VGAT Venus mus (nederst). Skala bars = 5 mm. (B) intensitet scatter plott av TdTomato og Venus fluorescens av cortico-hippocampus dissosiert celler fra NexCre; Ai9 mus (øverst) og VGAT Venus mus (nederst). Sterkt fluorescerende TdTomato eller Venus neurons ble valgt for sortering (indikert av gating boksene). (C, venstre) Konfokalmikroskopi bilder av sorterte TdTomato (øverst) og Venus (nederst) positive neurons. (C, høyre) Flettet bilde som viser celler med DAPI (i blå pseudocolour). TdTomato fluorescens er endogene og er fortsatt sterk til tross for fiksering (i magenta pseudofarger). Venus uttrykk er forbedret ved hjelp av en kombinasjon av et primært antistoff rettet mot GFP og Alexa fluor-488-bøyd sekundært antistoff (i grønne pseudofarger). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: cellekultur av renset glutamatergic eller GABAergic neurons. (A) kombinert infrarød (lyse felt) bilder og lagt fluorescerende signal fra TdTomato (til venstre) og Venus (til høyre) positive neurons kultivert for 1 t in vitro. Hvite piler angir plasseringen av voksende neurites. (B) konfokalmikroskopi bilder av TdTomato (venstre) og Venus (høyre) positive neurons kultivert for 1 h in vitro. (C, D) Bright felt (øverst) og kombinert lyse felt og fluorescerende bilder (nederst) av TdTomato (C) og Venus positive neurons (D) kultivert for 7 dager in vitro (DIV). Hvite piler viser plasseringen av kondensert kjerner fra døde celler. Fargede piler identifisere fluorescensmerkete merket neurons. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: morfologiske, elektrofysiologisk og Synaptic egenskaper av renset neurons. (A, B) Konfokalmikroskopi bilder av TdTomato (A) og Venus positive neurons (B) på DIV 13 og DIV 14, henholdsvis. Celler er presentert i svart ved hjelp av en invertert blikk opp tabellen for å hjelpe neurite visualisering. Inn data viser det fluorescerende signalet uttrykt av de identifiserte neurons. (C, D) Spenningen respons fra en TdTomato (C) og Venus positiv Nevron (D) til hyperpolarizing (200 til-20 pA, i 20 pA trinn) og depolariserende (200 pA) nåværende pulser, fremstilt ved hele cellen patch-klemme innspillinger. Inn data viser de tilsvarende registrerte neurons. Potensialet for hvile membranen i hver celle er indikert til venstre for opptaks sporet. (E, F) Representative spennings-klemme innspillinger (10 s) innhentet fra TdTomato (E) og Venus positive neurons (F). Spontane eksitatoriske postsynaptic hendelser (EPSCs) ble tatt opp fra TdTomato positive neurons, opprettholdt på et Holding potensiale på 50 mV. Spontant forekommende hemmende postsynaptic hendelser (IPSCs) ble tatt opp fra Venus positive neurons opprettholdes på et Holding potensial på 0 mV. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: hjelpemiddel Nevron utvikling med gliacellene co-kultur. (A) konfokalmikroskopi bilder av gliacellene kulturer immunolabeled for gliacellene fibrillary surt PROTEIN (GFAP, venstre), klynge av differensiering molekyl (CD11b, midten) og myelin grunnleggende PROTEIN (MBP, høyre). Gliacellene celler ble kultivert for DIV 7. (B) bilder av cellekultur setter inn brukt til å co-kultur gliacellene celler med renset neurons i en ikke-kontakt ordning. (C) en skjematisk av den romlige ordningen brukes til co-kultur neurons og glia. (D, E) Konfokalmikroskopi bilder av TdTomato (D) og Venus positive neurons (E), vokst i 14 dager, i fravær (venstre) eller tilstedeværelse (til høyre) av gliacellene støtte. (F, G) Gjeldende-klemme innspillinger (60 s) fra TdTomato (F) og Venus positive neurons (G) kultivert for 14 dager i fravær (øverst) eller tilstedeværelse (nederst) av gliacellene støtte. Neurons ble registrert på deres hvile membran potensial (presentert til venstre for hver innspilling spor). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Vi beskriver her en metode som kombinerer sortering og dyrking av primære neurons å generere renset neuronal cellekulturer. Denne metoden tar rundt 1 h lenger enn en typisk primær dissosiert neuronal kultur protokoll, men gir mulighet for generering av hundrevis av replikere kulturer som inneholder spesifikke neuronal typer. Renset neurons, som kan dyrkes i isolasjon i minst 16 dager, forlenge axons og dendrites og kan brann repeterende tog av handlingen potensialer (figur 2 og Figur 3). Viktigere er disse cellene mottagelig for de samme eksperimentelle analysene som vanlig primære dissosiert neuronal kulturer, inkludert elektrofysiologisk, morfologiske og overlevelse analyser. En stor fordel med å arbeide med disse renset kulturer er at utviklingen av bestemte celletyper kan bli studert i isolasjon. For å støtte utviklingen av renset kulturer, presenterer vi også en protokoll for co-dyrking renset neurons med gliacellene celler. Som vist tidligere, forbedrer co-dyrking renset neurons med gliacellene celler deres overlevelse, vekst og kan fremme nettverk formasjon7 (Figur 4). Dermed presenterer vi her en kombinasjon av metoder som bør videre studiet av glia-Nevron interaksjoner og kan være nyttig for å studere utvikling og samhandling mellom andre celletyper av interesse.
Studier på kulturer av renset glutamatergic neurons har avdekket grunnleggende innsikt i måten gliacellene celler skiller ut faktorer som fremmer utviklingen av neuronal nettverk og synapse formasjon16,17,18 . Generelt, metoder for rensing spesifikke Nevron typer har blitt mer vellykket brukt til å studere utviklingen av glutamatergic neurons stedet GABAergic neurons. Dette har ført til en forskjell i vår forståelse av hvordan disse to celletyper utvikler seg. Gitt at GABAergic og glutamatergic neurons avvike betydelig i forhold til deres anatomi, fysiologi og utviklingsmessige opprinnelse, er det viktig at vi studerer GABAergic neurons i sin egen rett, for bedre å forstå deres funksjon og fysiologi. Ved hjelp av protokollen som presenteres her, har vi tidligere identifisert viktige forskjeller i måten GABAergic og glutamatergic neurons avhenge av glia-utskilles faktorer for etablering av Synaptic overføring7. Ved å publisere denne protokollen håper vi at andre kan gjøre ytterligere innsikt i de viktige interaksjoner mellom neurons og gliacellene celler.
I denne protokollen beskriver vi en Flow flowcytometri basert celle sorteringsmetode, som vi har brukt til å rense GABAergic eller glutamatergic neurons fra ulike transgene gnager linjer. Venus positive GABAergic neurons ble sortert fra VGAT Venus mus13 eller rotter8 og TdTomato positive glutamatergic neurons ble sortert fra NexCre; Ai9 mus (avlet opprinnelig fra NexCre9 og Ai9 reporter linjer6, se turko et al., 20187). I de senere årene, på grunn av teknologiske fremskritt, har generering av transgene dyr blitt betydelig enklere. Som sådan, tilgjengeligheten av dyr uttrykker fluorescerende molekyler, i mange forskjellige celletyper, har vokst raskt. Dette har i sin tur økt bruk og anvendelse av fluorescerende aktivert celle sortering. Mens alternative metoder for å isolere celler av interesse i dag finnes16,19,20, de er noe hindret av deres avhengighet av tilgjengeligheten av egnede antistoffer mot naturlig forekommende overflaten Antigener. Dette begrenser deres allsidighet sammenlignet med fluorescens-baserte celle Sorteringsmetoder, som allerede kan brukes til å sortere celler fra de mange celle spesifikke transgene reporter dyrene som allerede er tilgjengelige. Likevel, når optimalisert, antistoff-baserte Sorteringsmetoder kan være rask og høy gir, og kan enda bedre bevare celle anatomi, ved å tillate rensing av celler med sine axons og dendrites intakt21. Antistoff Sorteringsmetoder bør derfor likevel vurderes når de bestemmer seg for en sorterings strategi. Til syvende og sist, cellen type interesse, alder hvor cellene skal sorteres, tilgjengeligheten av transgene dyr eller overflate antigener og antall celler som trengs vil være de avgjørende faktorene når du velger den mest hensiktsmessige sortering strategi.
Selv om fluorescens celle sortering er en enkel og reproduserbar metode for rensing av celler, bør det utvises forsiktighet under visse trinn i protokollen for å bevare celle kvaliteten. For eksempel, etter hvert sentrifugering trinn, er det viktig å sørge for at cellen pellet er re-suspendert så raskt som mulig og at cellene er vellykket gjenopprettet. Noen ganger kan celle pellet bli forstyrret når du fjerner supernatanten. Det er derfor anbefalt, mellom sentrifugering trinn, for å sjekke tilstedeværelsen av celler under mikroskopet for å utelukke eventuelle omfattende celle tap. Etter celle plating, bør cellene få lov til å holde seg i minst 1 time før fôring. Hvis cellene mates for tidlig, kan noen celler bli forskyves fra dekkglass, og dermed redusere kultur tettheten. Etter 1 time i kulturen, er det klokt å vurdere celle helse. Hvis cellene ikke vises sunt (et eksempel på friske celler er vist i figur 2a), eller det er betydelig celle død, så dette kan være en indikasjon på et problem under dissosiasjon eller sortering prosedyre. En ytterligere viktig faktor, når dyrking en hvilken som helst celle type, er å ta forsiktighet når du håndterer cellen kultur Media. NBA Media inneholder fenol rød, som fungerer som en pH-indikator22. Hvis mediene blir for gult i fargen, så indikerer dette at pH er for surt; Hvis mediene blir for rosa, så indikerer dette at løsningen er for alkalisk. Stock løsninger åpne for lange perioder, spesielt Media aliquoted i koniske rør, har en tendens til å bli mer alkalisk over tid. Det anbefales derfor å lage ferske komplette NBA-medier hver uke og komplette medier annenhver uke (medium buffere under atmosfæriske forhold og bør derfor være mer stabile). Tar disse punktene i betraktning bør det være mulig å etablere renset cellekulturer i ethvert laboratorium med tilgang til celle sortering og cellekultur utstyr.
I de fleste av våre eksperimenter produserte vi renset kulturer fra et enkelt dyr. Men når rensende celler for biokjemiske analyser, kan det være nødvendig å samle sammen flere dyr for sortering. Vi har lykkes sortert opp til 8 embryonale mus (embryonale dag 13 dyr) ved hjelp av ovennevnte protokollen (data ikke vist). Imidlertid, hvis flere dyrene er å bli sorterte, den kanskje være på krevd å forhøye det kvantum av begge to Papain og BSA løsninger (beskrevet inne skritt 2.1.1 – 2.1.4) å huse økningen inne tissue beløpet. I tillegg, hvis flere celler er belagt i kultur, deretter en hyppigere fôring tidsplan kan være nødvendig. Som utgangspunkt kan celler mates hver 7. dag ved å fjerne 100 μL av conditioned Media og legge til 200 μL av ferske komplette NBA-medier. For å få til Nevron levedyktighet, hvis sortering flere dyr, tenkte bør gis for å minimere sorterings tiden så mye som mulig. Dette krever ofte forsiktig optimalisering av nedstrøms analyser for effektiv bruk av renset celler. Vi har rutinemessig sortert mus neurons på utbredelsen av 600 hendelser/s, opptil 500000-800000 celler per dyr (postnatal dag 0 – 2). Men dette var uten uttømmende optimalisering av sortering hastigheter og forhold. Derfor bør ytterligere forbedringer i sortering hastighet og yield være mulig.
Renset neurons forlange glia-betinget Media for deres overlevelse. Dette har blitt demonstrert tidligere av dyrking neurons og gliacellene celler separat, før behandling neurons med gliacellene conditioned Media10. I våre eksperimenter, valgte vi å støtte renset neurons av dyrking gliacellene celler på halvgjennomtrengelig cellekultur inserts, som er plassert inne i cellen kultur plate. Denne metoden har blitt brukt for å studere glia-avledet ekstracellulære matrise proteiner og deres interaksjon med neurons12. Den ikke-kontakt, men kontinuerlig støtte fra denne metoden har en rekke fordeler i forhold til den separate kulturen i cellene. Spesielt kan co-kulturen i gliacellene celler med neurons for kontinuerlig regulering og condition av cellen kultur Media, som tettere ligner in vivo situasjonen. I tillegg gir kontinuerlig co-kultur av celler for potensielle feedback signalnettverk mellom neurons og glia, som ikke er mulig i separerte kulturer. I vår protokoll, om nødvendig, den kontinuerlige co-kultur metoden kan enkelt utelates og en klassisk behandling av neurons med glia-conditioned Media kan utføres.
Oppsummert protokollen som presenteres her har som mål å gi leseren et solid fundament som de kan etablere sin egen renset cellekultur eksperimenter. Vi spår at tilgjengeligheten av transgene dyr og virale konstruksjoner vil fortsette å øke i overskuelig fremtid. Derfor, celle sortering teknikker basert på fluorescens er sannsynlig å bli enda mer utbredt og verdifullt.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke den utmerkede teknisk støtte fra Jenny Kirsch og Ana Teichmüller ved Flow flowcytometri Core Facility, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum, Berlin. Vi vil gjerne takke Jie Song for hans hjelp med overlevelse analyse. Vi vil også gjerne takke Rita Loureiro for hennes hjelp til å fange bilder av fluorescerende mus og Christian Ebner for kritisk lesning av protokollen. VGAT-Venus transgene rotter ble generert av DRS. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi og Y. Kawaguchi i National Institute for fysiologiske Sciences, Okazaki, Japan, ved hjelp av pCS2-Venus levert av Dr. A. Miyawaki. Dette arbeidet ble støttet av det tyske Forskningsrådet (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG eks 257 til IV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neural Basal A media (NBA) | ThermoFisher Scientific | 10888022 | Cell Culture Buffer |
| B27 | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Culture supplement |
| Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050-038 | Culture supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic |
| Poly-L-Lysine | SIGMA | P1399 | Coverslip coating |
| Papain | SIGMA | P4762-1G | Enzyme |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A3294-100G | Serum |
| Hibernate A low fluorescence media | Brain Bits Ltd | HALF | Cell Transport media |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Biochrom | F0435 | Glial Culture Buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom | S0115 | Serum |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2163 | Enzyme |
| Fine Tip Pasteur Pipette | Neo Labs | - | Used for trituration of cells |
| 24-well plates | BD | 353047 | Culture plate |
| 50 mL Falcon tubes | BD | 352070 | - |
| 15 mL Falcon tubes | BD | 352096 | - |
| Glass coverslips: 12 mm round | Roth | P231.1 | - |
| 35 mm Petri dish | Corning | 353001 | - |
| 100 mm Petri dish | Corning | 353003 | - |
| 30 µm CellTrics Cell Sieve | sysmex | 04-004-2326 | To remove cell clumps before cell sorting |
| Round bottom polystyrene tubes | BD | 352054 | Transport tube for sorted cells |
| Round bottom polypropylyne tubes | BD | 352063 | Collection tube for sorted cells |
| Cell culture inserts – 0.4 µm transparent PET | Falcon | 353 095 | For the co-culture of neurons and glia |
| Extra fine Bonn Scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | To remove overlying skin and bone of mice |
| Extra narrow Scissors | Fine Scientific Tools | 14088-10 | To remove overlying skin and bone of rats |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11242-40 | To hold the head in place |
| Spatula (130 mm long/5 mm tip width) | Fine Scientific Tools | 3006.1 | To remove the brain to filter paper |
| Scalpel Blades | Swan-Morton | #0308 | To mechanically dissociate neural tissue |
| Haemocytometer (Neubauer Imroved) | Optik Labor | - | To cell count dissociated cells |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/LS-1G | To excite TdTomato |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/EF-4R2 | Td Tomato compatible emission filter |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/ULS-02B2 | To excite Venus |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/TEF-3GY1 | Venus compatible emission filter |
| Mouse-Anti-GFP primary antibodies | UC Davis | 75-132 | To enhance Venus signal following fixation |
| Mouse-Anti-GFAP primary antibodies | SIGMA | G-3893 | The identification of reactive astrocytes |
| Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies | Southern Biotech | 1561-15 | The identification of microglial cells |
| Rabbit-Anti-MBP primary antibodies | Millipore | AB980 | The identification of oligodendrocyes |
References
- Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 91, 1-24 (1998).
- Feher, K., Kirsch, J., Radbruch, A., Chang, H. D., Kaiser, T. Cell population identification using fluorescence-minus-one controls with a one-class classifying algorithm. Bioinformatics. 30 (23), 3372-3378 (2014).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Turko, P., Groberman, K., Browa, F., Cobb, S., Vida, I. Differential Dependence of GABAergic and Glutamatergic Neurons on Glia for the Establishment of Synaptic Transmission. Cerebral Cortex. , (2018).
- Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical gabaergic neurons revealed in transgenic venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
- Goebbels, S., Bormuth, I., Bode, U., Hermanson, O., Schwab, M. H., Nave, K. -A. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44, 611-621 (2006).
- Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209, 809-810 (1980).
- Lindsay, R. M. Adult rat brain astrocytes support survival of both NGF-dependent and NGF-insensitive neurones. Nature. 282 (5734), 80-82 (1979).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7742-7755 (2013).
- Wang, Y., et al. Fluorescent labeling of both gabaergicand glycinergic neurons in vesicular GABA transporter (VGAT)-venus transgenic mouse. Neuroscience. 164 (3), 1031-1043 (2009).
- Höltje, M., et al. Role of Rho gtpasein astrocyte morphology and migratory response during in vitro wound healing. Journal of Neurochemistry. 95 (5), 1237-1248 (2005).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. Journal of Visualized Experiments. , e51706 (2014).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277 (5332), 1684-1687 (1997).
- Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of synapse number by glia. Science. 291, 657-661 (2001).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Berghuis, P., et al. Brain-derived neurotrophic factor controls functional differentiation and microcircuit formation of selectively isolated fast-spiking gabaergic interneurons. European Journal of Neuroscience. 20 (5), 1290-1306 (2004).
- Liddelow, S. A., et al. Activated microglia induce neurotoxic reactive astrocytes via Il-1α, tnfα, and c1q. Nature. 541, 481-487 (2017).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
