Summary
Este protocolo descreve um método baseado classificação da pilha para a purificação e a cultura de neurônios gabaergic ou glutamatérgico fluorescentes do neocórtex e do hipocampo de ratos ou de ratos pós-natal.
Abstract
O objetivo geral deste protocolo é gerar culturas neuronais purificadas derivadas de neurônios Gabaérgicos ou glutamatérgicos. Os neurônios purificados podem ser cultivados em meios definidos por 16 dias in vitro e são passíveis a todas as análises executadas tipicamente em culturas dissociada, incluindo análises electrophysiological, morfológicas e da sobrevivência. A vantagem principal destas culturas é que os tipos específicos da pilha podem seletivamente ser estudados na ausência de influências externas complexas, tais como aquelas que levantam-se das pilhas glial ou dos outros tipos do neurônio. No entanto, ao planejar experimentos com células purificadas, é importante notar que os neurônios dependem fortemente da mídia com glia para seu crescimento e sobrevivência. Além disso, os neurônios glutamatérgicos ainda dependem de fatores secretados por glia para o estabelecimento de transmissão sináptica. Nós, portanto, também descrevemos um método para coculturar neurônios e células gliais em um arranjo sem contato. Usando esses métodos, identificamos grandes diferenças entre o desenvolvimento de redes neuronais gabaérgicas e glutamatérgicas. Assim, estudar culturas de neurônios purificados tem grande potencial para aprofundar nossa compreensão de como o sistema nervoso se desenvolve e funciona. Além disso, culturas purificadas podem ser úteis para investigar a ação direta de agentes farmacológicos, fatores de crescimento ou para explorar as conseqüências das manipulações genéticas em tipos específicos de células. À medida que mais e mais animais transgênicos se tornam disponíveis, rotulando tipos adicionais de células específicas de interesse, esperamos que os protocolos descritos aqui cresçam em sua aplicabilidade e potencial.
Introduction
A triagem de células é uma ferramenta poderosa para o isolamento de células vivas de interesse de uma mistura heterogênea de células. As células podem ser classificadas com base em critérios de tamanho e forma, bem como a expressão de marcadores fluorescentes1,2. Muitas vezes, os anticorpos conjugados com fluoróforo são usados para rotular tipos de células distintas,direcionando antígenos de superfície específicos da célula3,4. Alternativamente, Animais transgênicos ou sistemas de entrega viral foram projetados para expressar fluoróforos em promotores específicos da célula5,6. Historicamente, o desenvolvimento de ferramentas e animais transgênicos foi dispendioso e demorado. Mais recentemente, diminuir os custos e menos dificuldades técnicas levaram a um aumento dramático no número de linhas de repórter disponíveis. Como a disponibilidade de ferramentas transgênicas e animais de repórter continua a crescer, também deve a utilidade e aplicabilidade dos métodos de triagem de células à base de fluorescência.
Recentemente, demonstramos que a triagem celular de animais transgênicos pode ser rotineiramente aplicada para purificar os neurônios primários em preparação para a cultura celular7. Classificando as células de ratos ou camundongos, conseguimos isolar e cultura os neurônios fluorescentes, que expressam proteínas de repórter fluorescente especificamente em neurônios gabaérgicos ou glutamatérgicos6,8,9. Estudando essas culturas neuronais purificadas, pudemos identificar uma diferença importante na forma como os neurônios Gabaérgicos e glutamatérgicos dependem de fatores secretados por glia para o estabelecimento da transmissão sináptica7. Adicionalmente, ao coculturar células gliais com neurônios purificados, pudemos estender-nos a observações prévias demonstrando o papel crítico que as células gliais desempenham no crescimento e sobrevivência dos neurônios10,11. Assim, através de uma combinação de triagem celular e cultura celular, pudemos estudar não apenas o desenvolvimento de tipos específicos de neurônio isoladamente, mas foram capazes de investigar a influência das células gliais em sua função.
Apresentamos aqui um protocolo para a purificação e cultura de neurônios Gabaérgicos e glutamatérgicos do córtex e hipocampo de camundongos ou ratos transgênicos. Também apresentamos um método para a cocultura não-contato de neurônios purificados e células gliais, adaptado de Geissler et al.12. A fim de gerar culturas gabaérgicas purificadas, temos classificado neurônios fluorescentes de VGAT-Venus-ratos Wistar8 ou camundongos vgat-Venus13, que expressam seletivamente uma variante de proteína amarela fluorescente reforçada (Vênus) em > 95% de neurônios Gabaérgicos corticais. Para gerar culturas glutamatérgicas purificadas, temos classificado neurônios fluorescentes de NexCre; Ai9 camundongos6,9, que expressam tdtomato em neurônios glutamatérgicos corticais. Todo o procedimento de triagem e cultura pode ser realizado dentro de 3-4 h e pode ser usado para gerar centenas de culturas replicantes adequadas para análise de sobrevivência eletrofisiológica, morfológica e celular. O método é simples, reprodutível e pode produzir culturas neuronais purificadas que são maiores do que 97% puro para o tipo de célula de interesse.
Protocol
Todos os procedimentos e manutenção animal foram realizados de acordo com as orientações institucionais, a lei alemã de bem-estar animal e a Directiva 86/609/CEE do Conselho Europeu relativa à protecção dos animais, na presença de autorizações de competentes (LaGeSo Berlin, T-0215/11).
Nota: Este protocolo descreve a cultura de neurônios purificados de um único rato transgênico ou filhote de rato (dia pós-natal 0 – 2). Todas as técnicas devem ser executadas condições estéreis. Todas as soluções devem ser esterilizadas utilizando um filtro de 0,2 μm (ver tabela de materiais). As lamelas de vidro e as ferramentas da dissecção devem ser calor sterilized para 3 h em 185 ° c.
1. revestimento de vidro COVERSLIP com poli-L-lisina
- Prepare as coberturas de vidro descongelando uma alíquota de 5 mL de solução de 200 μg/mL de poli-L-lisina (PLL). Diluir esta solução de stock para 20 μg/mL adicionando 45 mL de água de grau de injecção pura. Filtrar-esterilizar a solução para um novo tubo cônico de 50 mL. Rotule este tubo como "PLL estéril".
Nota: Use água armazenada à temperatura ambiente para acelerar o processo de descongelação. - Adicione 100 coberturas de vidro estéreis, redondas e de 12 mm à solução PLL estéril. Agitar o tubo a cada 5 – 10 min, por 2 – 3 min, para garantir até mesmo o revestimento. Cubra os lamínulas desta forma durante 1 h.
Nota: Os COVERSLIP de vidro redondos alemão-manufacturados (diâmetro = 12 milímetros) são preferidos, porque fornecem uma superfície de confiança da cultura e cabem facilmente nos poços de uma placa da cultura da pilha 24-well. - Após 40 min de revestimento de PLL, tome 2 partes de papel de tecido e coloque-os horizontalmente no armário do fluxo. Esterilizar o papel usando 70% etanol, em seguida, aplainar para remover vincos e deixar secar.
- Após o revestimento das coberturas de vidro para 1 h com PLL, remova a solução adicional de PLL e adicione a água estéril da classe da injeção. Agitar suavemente os lamínulas para 2 – 3 s para permitir a remoção do excesso de PLL. Repita esta etapa de enxaguadela 2 vezes adicionais.
- Retire o excesso de água e, em seguida, transfira os lamínulas para o papel de tecido estéril. Separe cuidadosamente cada lamínula usando fórceps curvo e deixe secar.
Nota: Os COVERSLIP que não separam facilmente podem ser descartados. Alternativamente, uma pequena quantidade de água pode ser adicionada para ajudar na separação. - Uma vez que seco, transfira os COVERSLIP a uma placa da cultura de 24 poços.
Nota: As coberturas devem ser feitas prontas aproximadamente 30 min – 1 h antes de iniciar o processo de dissecção. As placas podem ser armazenadas em uma incubadora a 37 ° c e 5% CO2 até necessário.
2. dissociação do hipocampal e do tecido cortical
- Preparação de soluções de cultura celular
- Para a dissociação do tecido neural, primeiro degelo uma alíquota de 40 mL de buffer de cultura celular (composição [em mM]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,3 NaH2po4, 1 MgSO4· 7h2o, 1 CAcl2· 2h2o, 0,5 EDTA · 2Na · 2H2O e 25 D-glicose, pH = 7,4). Medir 12 mL de tampão de cultura celular para um tubo cônico de 15 mL; rótulo como "BSA". Medir 5 mL de tampão de cultura celular para um tubo de 15 mL diferente; rótulo como "papaína". Incubar os dois tubos num banho de água durante 15 min a 37 ° c.
- Filtro-esterilize o amortecedor restante da cultura da pilha, etiqueta como "amortecedor-estéril" e armazene-o em 4 ° c até que exigido.
- Pesar 120 mg de albumina sérica bovina (BSA) e adicionar ao tubo rotulado "BSA". Pesar 7 mg de papaína e adicionar ao tubo rotulado "papaína". Retorne os dois tubos para o banho de água por 15 min.
Nota: É útil adicionar uma pequena quantidade de tampão para o barco de pesagem para facilitar a transferência do pó de papaína. - Uma vez que todos os pós dissolvidos, filtre-esterilize cada solução a um tubo cônico de 15 mL fresco. Para o papain do tubo, rotule a solução filtrada como o "Papain-estéril". Para o tubo BSA, divida a solução estéril de BSA em 3 tubos, cada um contendo 4 mL de solução de BSA. Rotule cada tubo como "BSA-estéril" e "1", "2" ou "3". Retorne todos os tubos de volta ao banho de água e continue a incubar em 37 ° c até que exigido.
- Preparação para dissecção tecidual
- Pegue um único pedaço de papel de filtro de 35 mm (ver tabela de materiais) e esterilize com 70% de etanol; Deixe secar na tampa de um prato de Petri de 100 mm, em um armário de fluxo.
- Colocar para fora a tesoura, fórceps, bisturi e espátula (ver tabela de materiais) necessários para a dissecção do hipocampo e córtex.
- Coloque 2 35 mm de placas de Petri e um prato de Petri de 100 mm contendo papel de filtro estéril em um local acessível no centro do gabinete de fluxo.
- Coletar NexCre transgênicos; Ai9 e VGAT Venus mouse filhotes que devem ser dissecados. Use uma lâmpada fluorescente com os filtros apropriados da excitação e da emissão (veja a tabela de materiais) para discriminar filhotes de cachorro fluorescentes do tipo selvagem littermates.
- Imediatamente antes de dissecação de animais, encha cada prato de Petri de 35 mm com tampão de cultura celular refrigerado e estéril.
Nota: Um prato de Petri é para limpar as ferramentas entre as dissecções, e o outro é para coletar o hipocampo e o córtice.
- Dissecção tecidual
- Assim que o buffer de cultura celular é derramado, decapitar um dia pós-natal 0 – 2 rato transgênico ou filhote de rato usando grande, tesoura afiada e usar um estéril 100 mm prato de Petri para transferir a cabeça para o gabinete de fluxo. Use fórceps, tesouras e uma espátula para transferir cuidadosamente o cérebro de um filhote transgênico para o papel de filtro estéril.
- Use um bisturi tipo 22 para dissecar o cerebelo e separar os 2 hemisférios. Use uma pequena espátula para rolar os hemisférios lateralmente. Em cada hemisfério, pressione suavemente para que o córtex entra em contato com o papel de filtro. Mova suavemente as regiões do meio-cérebro para revelar o hipocampo e o córtex.
Nota: Tenha cuidado para não aplicar demasiada pressão ao pressionar para baixo nos hemisférios ou células pode tornar-se esmagado. - Use um bisturi ou espátula para separar o hipocampo e o córtex de cada hemisfério. Transfira o tecido dissecado para um prato de Petri de 35 mm contendo tampão de cultura de células refrigeradas.
Nota: Se dissecando vários animais, armazene o tampão estéril da cultura de pilha em um tubo cônico de 50 mL no gelo. Após cada dissecção, transfira o tecido dissecado ao amortecedor da cultura de pilha refrigerada. - Após a dissecção bem sucedida do tecido cortico-hippocampal, transfira a solução estéril do papaína do banho de água ao armário do fluxo. Use uma pipeta Pasteur de 3 mL para transferir o hipocampo e o córtice dissecados à tampa de um prato de Petri estéril de 35 milímetros. Pique em um movimento cruzado, usando a parte plana de um bisturi tipo 22, até que o tecido esteja em pedaços pequenos.
- Use uma pequena quantidade de solução de papaína para transferir o tecido picado da tampa do prato de Petri para o tubo de papaína estéril. Devolver o tubo de papaína ao banho de água e incubar o tecido a 37 ° c durante 25 min.
- Durante a incubação do papaína, compo a solução completa dos meios da fluorescência. Descongelar uma alíquota de 1 mL de B27, uma alíquota de 0,5 mL de Glutamax e uma alíquota de 0,5 mL de Pen-Strep. Alíquota 48,5 mL de hibernação um meio de fluorescência baixo para um tubo cônico de 50 mL. Adicione B27, Glutamax e Pen-Strep à solução. Agitar a solução bem, em seguida, filtrar-esterilizar e rótulo como "Hibernate A mídia completa" (com data e iniciais). Incubar a 37 ° c num banho de água.
- Após a incubação do papaína, transfira o papaína-tubo e os BSA-tubos estéreis ao armário do fluxo. Use uma pipeta de 1 ml Pasteur para remover somente o tecido cortico-hippocampal do tubo do papaína no BSA-tubo 1.
Nota: Tome cuidado para minimizar a transferência de solução de papaína em excesso.
- Dissociação de células
- A fim de romper qualquer grande aglomerados de tecido, triturar o tecido várias vezes usando uma 1 mL pipeta Pasteur. Depois disso, triturar o tecido 7 vezes usando uma ponta fina pipeta Pasteur. Deixe o tecido para ficar por 30 s, permitindo que pedaços maiores de tecido para sedimento.
- Após 30 s, transfira o 1 mL mais baixo da solução e do tecido do BSA-tubo 1 ao BSA-tubo 2. Triturar o tecido em BSA-Tube 2 várias vezes usando uma ponta fina pipeta Pasteur.
- Após a trituração, transfira outra vez os 1 mL mais baixos do tecido e da solução de BSA-tubo 1, mas agora a BSA-tubo 3. Triturar o tecido em BSA-tubo 3 várias vezes usando uma ponta fina pipeta Pasteur.
- Após a trituração, transfira toda a solução e o tecido dos tubos 2 e 3 no BSA-tubo 1. Triturar mais 2-3 vezes e centrifugar a 3.000 x g durante 3 min.
- Durante A centrifugação, compõem A mídia neural basal A completa (mídia da NBA). Alíquota 48,5 mL de mídia da NBA para um tubo cônico de 50 mL e incubar a 37 ° c em um banho de água. Rotule este tubo "NBA apenas". Além disso, descongelar uma alíquota de 1 mL de B27, uma alíquota de 0,5 mL de Glutamax e uma alíquota de 0,5 mL de Pen-Strep à temperatura ambiente.
- Após a centrifugação, Retire cuidadosamente o sobrenadante do tecido peletizado e Resuspenda as células em 2 mL de suportes completos. Use uma pipeta P1000 para triturar o tecido para cima e para baixo 20 vezes.
Nota: Tome cuidado para não pipeta as células muito vigorosamente. Se for aplicada demasiada pressão, as células podem ficar danificadas. - Use uma pipeta Pasteur de 1 mL para filtrar a suspensão da célula através de uma peneira de célula de 30 μm em um tubo de amostra de poliestireno.
Nota: Se a suspensão celular não passar imediatamente através da peneira celular, pode ser necessário pressionar em cima da peneira com uma luva estéril para iniciar o fluxo. Este passo importante impede o entupimento do classificador de células. - Para a coleta de neurônios após a triagem, preparar tubos de coleta por pipetagem 300 μL de mídia completa para o número necessário de tubos de polipropileno.
- A suspensão celular está agora pronto para ser levado para o classificador de células para a triagem. Pegue a suspensão celular, tubos de coleta extra e peças de reposição de mídia completa em caso de diluição da amostra é necessária.
3. triagem celular de neurônios Gabaérgicos ou glutamatérgicos purificados
Nota: Para minimizar a possibilidade de contaminação bacteriana durante a triagem enxaguar o tubo da amostra do classificador com etanol 70% por pelo menos 5 min antes da triagem. Os parâmetros de ordenação detalhados variam entre os instrumentos, considerações fundamentais são as seguintes.
- Durante o primeiro tipo de célula, estabeleça níveis de fluorescência de fundo de células não rotuladas classificando e comparando células de um animal selvagem.
- Para cada tipo de célula fluorescente a ser classificada, escolha os filtros de excitação e emissão apropriados. Excite Venus e TdTomato proteínas usando 488 nm ou 531 nm comprimentos de onda de excitação, respectivamente. Detecte a luz emitida através dos conjuntos de filtros de emissão 530/40 e 575/30, respectivamente.
- Adicione tubos de coleta de polipropileno, contendo 300 μL de mídia completa, ao classificador de células para coleta de células.
- Para a pureza elevada, classifique pilhas fluorescentes brilhantemente etiquetadas (veja Figura 1b por exemplo parcelas do ponto de pilhas classificadas).
- Após a classificação, para obter resultados ideais, realize um teste de pureza das células classificadas para estimar os níveis de pureza. Observe que a taxa de recuperação típica de células após a classificação é entre 70 – 80%.
- Anote o número de células classificadas em cada tubo de coleta. Esse valor é dado pelo instrumento de classificação da célula.
Nota: A triagem de células pode ser realizada usando um bocal de 70 μm (pressão de fluido de bainha de 70 psi) ou um bocal de 100 μm (pressão de fluido de bainha de 20 psi).
4. cultivo de neurônios classificados
- Após a triagem celular, transfira as células coletadas para 2 mL de tubos de centrífuga de fundo redondo, usando uma pipeta Pasteur de 1 mL. Centrifugue as células em 3.000 x g por 3 min para formar um pellet celular.
Nota: Para ajudar a identificar a localização do pellet celular, orientar os tubos de centrífuga de fundo redondo com a dobradiça da tampa voltada para fora, o que permite que o pellet célula para formar na parte de trás do tubo de centrífuga (ou seja, no mesmo lado do tubo como a dobradiça). - Durante a centrifugação, adicione 1 mL de B27, 0,5 mL de Glutamax e 0,5 mL de Pen-Strep a 48,5 mL de mídia pré-aquecida da NBA. Agitar bem a solução, em seguida, filtrar esterilizar e rótulo como "NBA Complete Media" (com data e iniciais). Retorne ao banho de água até que exigido.
- Após a centrifugação, utilize uma pipeta Pasteur de 1 mL para transferir o sobrenadante para um tubo de centrifugação diferente (manter o sobrenadante Incase que a pelota da célula foi perturbada). Re-suspender a pelota da pilha na quantidade exigida de meios completos pre-warmed de NBA para conseguir uma densidade da pilha de 1.000 Cells/μL. re-suspender as células por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta P200 ou P1000.
- Para confirmar a presença de células dissociadas, verifique a solução celular um microscópio, usando uma lente objetiva de 4x ou 10x. Alternativamente, Pipetar uma pequena quantidade de solução celular para uma lamínula e verificar o microscópio. Se um grande número de células estiver presente, o sobrenadante da etapa 4,3 pode ser Descartado.
- Antes de galvanizar as células, vórtice em uma velocidade média de 2 – 3 s para garantir uma suspensão celular mesmo. Após o vortexing, pipeta rapidamente 10 μL da suspensão da pilha ao centro de cada lamínula. Após a pipetagem das células, retorne rapidamente cada placa para a incubadora (5% CO2/37 ° c) e incubar por 1 h.
Nota: Se a adição de células a várias placas de 24 poços, garantir até mesmo densidades de célula por células vortexing entre as placas. - Após 1 h, alimente as células com 500 μL de mídia NBA completa pré-aquecida e retorne à incubadora.
Nota: Ao alimentar as células, é importante para a pipeta a mídia suavemente para baixo do lado do poço para evitar o descolamento da célula. Para experimentos curtos (< 16 dias), a alimentação na densidade acima não é necessária. Ao galvanizar uma maior densidade de células, intervalos de alimentação mais freqüentes podem ser necessários (ver discussão).
5. astrocyte enriquecido glial culturas de apoio
Nota: A produção de culturas glial14 e o uso de inserções da cultura da pilha foram descritos previamente12. Em resumo, as culturas enriquecidas do glia do astrocyte são derivadas do tecido cortico-hippocampal (com os meninges removidos; P2 – P5), que foram cultivadas por uma semana em uma placa de 6 poços revestida com PLL de 20 μg/mL, em meio de DMEM suplementado com soro.
- Para cocultura de neurônios purificados e células gliais, a passagem de células gliais confluentes para o número necessário de inserções de cultura celular (0,4 μm tamanho dos poros — ver tabela de materiais). Para passar as células, retire uma placa de 6 poços contendo células gliais confluentes da incubadora e lave 2 cavidades, 2 vezes, com 2 mL de soro pré-aquecido (37 ° c) com tampão de fosfato (PBS).
- Aspirar a solução de PBS e usar uma pipeta P1000 para adicionar 1 mL de Trypsin pré-aquecido (37 ° c) (1:250)/EDTA (0,25%/0,02%) solução para cada poço.
- Retorne a placa 6-well à incubadora e verific cada 2 – 3 minutos para o destacamento da pilha.
- Uma vez que o destacamento significativo da pilha ocorreu, pipeta as pilhas e a solução da pilha delicadamente acima e para baixo usando uma pipeta fina da ponta Pasteur, para ajudar um destacamento e uma separação mais adicionais de pilhas individuais.
- Transfira a solução celular para um tubo cônico de 15 mL e centrifugue a 3.000 x g durante 3 min.
- Re-suspender as células usando uma pipeta P1000 em 5 mL de pré-aquecido (37 ° c) NBA completa de mídia através de pipetagem suavemente para cima e para baixo até que o pellet célula está em solução.
- Realize uma contagem de células usando um de ou um contador de células automatizado.
Nota: Após 7 dias na cultura, aproximadamente 750000-1000000 as pilhas podem ser colhidas de cada poço de uma placa de 6 poços. - Placa 40.000 células gliais para cada inserção de cultura celular em uma gota de 500 μL (80 células/μL).
- Depois de permitir que as células aderiram por 1 h, use fórceps estéril para transferir inserções de cultura de células cobertas de glial para 24 placas bem contendo neurônios purificados. Remova o excesso de mídia da superfície das inserções de cultura de célula (aproximadamente 300 μL).
Nota: Porque as bolhas de ar podem frequentemente começ prendidas abaixo das inserções da cultura da pilha, pode ser necessário inclinar delicadamente as inserções para desalojar estas bolhas. Se mais células gliais forem adicionadas à inserção da cultura celular, mais etapas de lavagem e centrifugação podem ser necessárias para remover o excesso de tripsina, o que pode ser prejudicial para a sobrevivência celular.
Representative Results
A dissociação e triagem celular de neurônios fluorescentes de rato transgênico ou tecido cortico-hipocampal de ratos pode ser realizada em aproximadamente 3 – 4 h. O resultado é uma população de neurônios fluorescentes altamente puros, que podem ser cultivados em cultura por 16 dias.
Para gerar culturas purificadas, os animais transgênicos foram identificados pela primeira vez usando uma lâmpada fluorescente com conjuntos de filtros apropriados (exemplos de VGAT neonatal fluorescente Venus e NexCre; Ai9 os filhotes do rato são mostrados na Figura 1a). Depois da identificação de animais transgênicas, o tecido dissecado foi Dissociated, e os neurônios os mais fortemente fluorescentes foram classificados para produzir uma população purified da pilha. Exemplo de intensidade de fluorescência dot parcelas para NexCre; Os neurônios do camundongo Ai9 e VGAT Venus, obtidos durante o FACS, são mostrados na Figura 1b. Quando otimizado, é possível colher entre 500.000 e 800.000 células do córtex e hipocampo do indivíduo P0-2 NexCre; Camundongos Ai9 ou VGAT Venus. As células podem ser classificadas a uma velocidade acima de 600 eventos/s. as estimativas de pureza celular foram realizadas utilizando-se DAPI como marcador nuclear (Figura 1C). Classificando pilhas fortemente positivas, uma pureza de mais de 97% pode rotineiramente ser conseguida7.
Após a triagem bem-sucedida, os neurônios chapeados devem aparecer em forma redonda, têm uma membrana Lisa e devem ser vistos para brotar neuritos após aproximadamente 1 h in vitro (Figura 2a, B). Por 7 dias in vitro, embora alguma morte de pilha possa ser aparente, as pilhas viáveis devem estar atuais em todas as condições da cultura (Figura 2C, D). Aos 12 – 16 dias in vitro, utilizando gravações de pinça de células inteiras e enchimento de biocitina15, é possível investigar o desenvolvimento morfológico e eletrofisiológico de neurônios purificados (Figura 3). A análise de culturas purificadas revela que os neurônios glutamatérgicos e Gabaérgicos foram capazes de estender os axônios e dendritos de seus corpos celulares (Figura 3a, B) e manter a capacidade de gerar potenciais de ação em resposta a estímulo despolarizando injeções atuais (Figura 3C, D). Notavelmente, no entanto, após a purificação, apenas os neurônios Gabaérgicos receberam quantidades significativas de transmissão sináptica espontânea, e os neurônios glutamatérgicos recebem transmissão sináptica muito pequena na ausência de células gliais (Figura 3E , F) o 7.
Como já relatado anteriormente, as células em culturas purificadas tendem a sobreviver mais mal do que aquelas em culturas não classificadas e têm dendritos e axônios significativamente menores7. Para superar esses déficits, adaptamos e aplicamos métodos para apoiar o desenvolvimento de culturas purificadas com células gliais12,13. A composição celular de nossas culturas de suporte glial (DIV7) é mostrada na figura 4a. Estas culturas continham astrocytes positivos da proteína ácida fibrilary predominantemente glial (GFAP), mas igualmente continham algum conjunto da molécula da diferenciação (CD11b) microglia positivo e oligodendrocytes positivos da proteína básica de mielina (MBP). Após a DIV 7, essas células podem ser passadas para inserções de cultura celular para fornecer suporte sem contato de neurônios purificados (Figura 4B, C). A análise das co-culturas de glia-neurônio revela que aproximadamente 40.000 células gliais foram suficientes para melhorar a sobrevida a longo prazo e o crescimento de neurônios glutamatérgicos e Gabaérgicos purificados (Figura 4D, e)7. Além disso, a análise eletrofisiológica revela que os neurônios glutamatérgicos, cocultivados com células gliais, eram altamente ativos e tinham aumentado fortemente a atividade da rede (percentual de neurônios glutamatérgicos com suporte glial disparando rajadas de ação potenciais: 62%; n = 28; Figura 4F , G). O apoio glial é, portanto, importante não só para promover o crescimento e sobrevivência do neurónios, mas também para promover a transmissão sináptica e o estabelecimento de atividade de rede em culturas glutamatérgicas.
Figura 1: purificação de neurônios glutamatérgicos e Gabaérgicos. (A) imagens que mostram o sinal fluorescente da expressão do transgene de TdTomato em NexCre; Ai9 camundongos (topo) e Vênus em camundongos VGAT Venus (bottom). Barras de escala = 5 mm. (B) parcelas de dispersão de intensidade da fluorescência TdTomato e Venus de células dissociadas cortico-hipocampais de NexCre; Camundongos Ai9 (topo) e VGAT Venus (fundo). Os neurônios fortemente fluorescentes de TdTomato ou de Venus foram selecionados para classificar (indicado pelas caixas gating). (C, esquerda) Imagens confocais de neurônios classificados TdTomato (Top) e Venus (bottom) positivos. (C, direita) Imagem mesclada mostrando células cocoradas com DAPI (em pseudocor azul). TdTomato fluorescência é endógena e permanece forte apesar da fixação (em magenta pseudocolor). Expressão de Vênus é reforçada usando uma combinação de um anticorpo primário dirigido contra GFP e Alexa fluor-488-anticorpo secundário conjugados (em pseudocolor verde). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: cultura celular de neurônios glutamatérgicos ou Gabaérgicos purificados. (A) imagens de infravermelho (campo brilhante) combinadas e sinal fluorescente sobreposto de neurônios positivos de TdTomato (esquerda) e Vênus (direita) cultivados por 1 h in vitro. As setas brancas indicam a localização dos neuritos crescentes. (B) imagens confocais de neurônios positivos de TdTomato (esquerda) e Vênus (direita) cultivados por 1 h in vitro. (C, D) Campo brilhante (parte superior) e campo brilhante combinado e imagens fluorescentes (parte inferior) de TdTomato (C) e de neurônios positivos de Venus (D) cultivados por 7 dias in vitro (DIV). As setas brancas mostram a localização de núcleos condensados de células mortas. As setas coloridas identificam neurônios cDNAs etiquetados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Propriedades morfológicas, eletrofisiológicas e sinápticas de neurônios purificados. (A, B) Imagens confocais de TdTomato (A) e de neurónios positivos de Venus (B) em DIV 13 e em DIV 14, respectivamente. As pilhas são apresentadas no preto usando uma tabela invertida do olhar-acima para ajudar ao visualização do neurite. Os Insets mostram o sinal fluorescente expressado pelos neurônios identificados. (C, D) A resposta da tensão de um tdtomato (C) e de um neurônio positivo de Venus (D) a hiperpolarizante (200 a-20 PA, em 20 etapas do PA) e a despolarizando (200 PA) pulsos atuais, obtidos por gravações da remendo-braçadeira da inteiro-pilha. Os Insets mostram os neurônios gravados correspondentes. O potencial de membrana de repouso de cada célula é indicado à esquerda do traço de gravação. (E, F) Gravações representativas da tensão-braçadeira (10 s) obtidas de TdTomato (E) e de neurônios positivos de Venus (F). Os eventos pós-sináptica excitatórios espontâneos (epscs) foram gravados dos neurônios positivos de tdtomato, mantidos em um potencial de exploração de 50 milivolt. Os eventos pós-sinápticos inibitórios de ocorrência espontânea (IPSCs) foram gravados dos neurônios positivos de Venus mantidos em um potencial de exploração de 0 milivolt. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: apoio ao desenvolvimento do neurônio com cocultura glial. (A) imagens confocais de culturas gliais imunomarcado para a proteína ácida fibrilary glial (GFAP, esquerda), o conjunto da molécula da diferenciação (CD11b, médio) e a proteína básica do mielina (MBP, direita). As células gliais foram cultivadas para a DIV 7. (B) imagens de pastilhas de cultura celular usadas para cocultura de células gliais com neurônios purificados em arranjo sem contato. (C) um esquema do arranjo espacial utilizado para cocultura de neurônios e glia. (D, E) Imagens confocais de TdTomato (D) e neurônios positivos de Vênus (E), cultivadas por 14 dias, na ausência (esquerda) ou presença (direita) de suporte glial. (F, G) Gravações da corrente-braçadeira (60 s) dos neurônios positivos de TdTomato (F) e de Venus (G) cultivados por 14 dias na ausência (parte superior) ou na presença (parte inferior) do apoio glial. Os neurônios foram gravados em seu potencial de membrana de repouso (apresentado à esquerda de cada traço de gravação). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Nós descrevemos aqui um método que combine a classificação e a cultura de neurônios preliminares para gerar culturas de pilha neuronal purificadas. Este método toma ao redor 1 h mais por muito tempo do que um protocolo neuronal dissociada preliminar típico da cultura contudo permite a geração de centenas de culturas replicadas que contêm tipos neuronal específicos. Os neurônios purificados, que podem ser cultivados isoladamente por pelo menos 16 dias, estendem axônios e dendritos e podem disparar trens repetitivos de potenciais de ação (Figura 2 e Figura 3). É importante ressaltar que essas células são possibilitados pelas mesmas análises experimentais que as culturas neuronais dissociadas primárias regulares, incluindo análises eletrofisiológicas, morfológicas e de sobrevivência. Um grande benefício de trabalhar com essas culturas purificadas é que o desenvolvimento de tipos de células específicas pode ser estudado isoladamente. Para apoiar o desenvolvimento de culturas purificadas, também apresentamos um protocolo para coculturar os neurônios purificados com células gliais. Como demonstrado anteriormente, a coculturação de neurônios purificados com células gliais melhora sua sobrevida, crescimento e pode promover a formação da rede7 (Figura 4). Assim, apresentamos aqui uma combinação de métodos que devem aprofundar o estudo das interações glia-Neuron e podem revelar-se úteis para estudar o desenvolvimento e a interação entre outros tipos de células de interesse.
Estudos sobre culturas de neurônios glutamatérgicos purificados revelaram insights fundamentais sobre a forma como as células gliais secretam fatores que promovem o desenvolvimento de redes neuronais e a formação de sinapse16,17,18 . Em geral, métodos para purificar tipos específicos de neurônio têm sido aplicados com mais sucesso ao estudo do desenvolvimento de neurônios glutamatérgicos em vez de neurônios Gabaérgicos. Isto conduziu a uma disparidade em nossa compreensão de como estes dois tipos da pilha se desenvolvem. Dado que os neurônios Gabaérgicos e glutamatérgicos diferem significativamente em termos de sua anatomia, fisiologia e origens do desenvolvimento, é vital que estudamos neurônios Gabaérgicos em seu próprio direito, para entender melhor sua função e fisiologia. Usando o protocolo apresentado aqui, nós identificamos previamente diferenças importantes na maneira que os neurônios gabaergic e glutamatérgico dependem dos fatores glia-secreted para o estabelecimento da transmissão sináptica7. Ao publicar este protocolo, esperamos que outros possam fazer mais insights sobre as importantes interações entre neurônios e células gliais.
Neste protocolo, nós descrevemos um método baseado da classificação da pilha da citometria do fluxo, que nós tenhamos usado para purificar os neurônios gabaergic ou glutamatérgico das linhas transgênicas diferentes do roedor. Os neurônios Gabaérgicos positivos de Vênus foram classificados de camundongos VGAT Venus13 ou ratos8 e os neurônios glutamatérgicos positivos de Tdtomato foram classificados de nexcre; Ai9 camundongos (criados originalmente a partir de NexCre9 e Ai9 repórter linhas6, ver Turko et al., 20187). Nos últimos anos, devido aos avanços tecnológicos, a geração de animais transgênicos tornou-se significativamente mais fácil. Como tal, a disponibilidade dos animais que expressam moléculas fluorescentes, em muitos tipos diferentes da pilha, cresceu ràpida. Isso tem, por sua vez, aumentado o uso e aplicabilidade da triagem celular ativada fluorescente. Enquanto métodos alternativos para isolar as células de interesse existem atualmente16,19,20, eles são um pouco prejudicado pela sua dependência da disponibilidade de anticorpos adequados para a superfície natural Antígenos. Isso limita sua versatilidade quando comparado com os métodos de triagem de células à base de fluorescência, que já podem ser usados para classificar células de muitos animais de repórter transgênicos específicos de células que já estão disponíveis. No entanto, quando otimizados, os métodos de triagem baseados em anticorpos podem ser rápidos e de alto rendimento, e podem ainda melhor preservar a anatomia celular, permitindo a purificação de células com seus axônios e dendritos intactos21. Métodos de triagem de anticorpos, portanto, ainda devem ser considerados ao decidir sobre uma estratégia de classificação. Em última análise, o tipo de célula de interesse, a idade em que as células devem ser classificadas, a disponibilidade de animais transgênicos ou antígenos de superfície e o número de células necessárias serão os fatores determinantes na escolha da estratégia de triagem mais adequada.
Embora a triagem celular baseada em fluorescência seja um método simples e reprodutível para purificar as células, o cuidado deve ser tomado durante certas etapas do protocolo para preservar a qualidade da célula. Por exemplo, seguindo cada etapa da centrifugação, é importante certificar-se de que a pelota da pilha está resuspendida o mais rapidamente possível e que as pilhas estiveram recuperadas com sucesso. Ocasionalmente, a pelota da pilha pode ser perturbada ao remover o sobrenadante. Portanto, é aconselhável, entre as etapas de centrifugação, verificar a presença de células o microscópio para descartar qualquer perda de células extensa. Depois do chapeamento de pilha, as pilhas devem ser permitidas aderir pelo menos a 1 h antes de alimentar. Se as células são alimentadas muito cedo, algumas células podem tornar-se desalojadas a partir da lamínula, reduzindo assim a densidade da cultura. Após 1 h na cultura, é prudente avaliar a saúde da pilha. Se as células não aparecem saudáveis (um exemplo de células saudáveis é mostrada na Figura 2a), ou há morte celular significativa, então isso pode ser uma indicação de um problema durante a dissociação ou procedimento de classificação. Uma consideração importante mais adicional, ao cultivar todo o tipo da pilha, é tomar o cuidado ao controlar os meios de cultura da pilha. A mídia da NBA contém fenol vermelho, que atua como um indicador de pH22. Se a mídia se torna muito amarela na cor, então isso indica que o pH é muito ácido; se a mídia se torna muito rosa, então isso indica que a solução é muito alcalina. As soluções do estoque abrem por longos períodos, particular os meios aliquotam em tubos cônicos, tendem a tornar-se mais alcalinos sobre o tempo. É, portanto, aconselhados a tornar-se fresco completa NBA mídia a cada semana e mídia completa a cada duas semanas (os buffers médios em condições atmosféricas e, portanto, deve ser mais estável). Levando em consideração estes pontos, deve ser possível estabelecer culturas de células purificadas em qualquer laboratório com acesso à triagem celular e equipamentos de cultura celular.
Na maioria das nossas experiências produzimos culturas purificadas de um único animal. No entanto, quando as células purificantes para análises bioquímicas, pode ser necessário reunir vários animais para a triagem. Nós ordenamos com sucesso até 8 ratos embrionários (dia embrionário 13 animais) usando o protocolo acima (dados não mostrados). No entanto, se mais animais devem ser classificados, pode ser necessário aumentar o volume de ambas as soluções de papaína e BSA (descritas nas etapas 2.1.1 – 2.1.4) para acomodar o aumento da quantidade de tecido. Adicionalmente, se mais pilhas são chapeadas na cultura, a seguir uma programação de alimentação mais freqüente pode ser exigida. Como ponto de partida, as células podem ser alimentadas a cada 7 dias, removendo 100 μL de mídia condicionada e adicionando 200 μL de mídia NBA completa fresca. Para o bem da viabilidade do neurônio, se classificando mais animais, o pensamento deve ser dado a minimizar o tempo da sorte tanto quanto possível. Isto exige frequentemente a optimização cuidadosa de análises a jusante para o uso eficiente de pilhas purificadas. Temos rotineiramente classificado neurônios do mouse em taxas de 600 eventos/s, até 500000 – 800.000 células por animal (dia pós-natal 0 – 2). No entanto, isso foi sem otimização exaustiva de classificação de velocidades e condições. Portanto, novas melhorias na classificação de velocidade e rendimento devem ser possíveis.
Os neurônios purificados necessitam de mídia com glia para sua sobrevivência. Isto foi demonstrado previamente cultivando neurônios e pilhas glial separada, antes de tratar os neurônios com os meios glial-condicionados10. Em nossos experimentos, optou-se por apoiar os neurônios purificados, cultivando células gliais em inserções de cultura de células semipermeáveis, que são colocadas dentro da placa de cultura celular. Este método foi aplicado com sucesso para estudar proteínas de matriz extracelular derivadas de glia e sua interação com os neurônios12. O não-contato, mas suporte contínuo fornecido por este método tem um número de vantagens quando comparado com a cultura separada das células. Mais notavelmente, a cocultura de células gliais com neurônios permite a regulação contínua e condicionamento dos meios de cultura celular, que mais se assemelha à situação in vivo. Além, a cocultura contínua das pilhas permite a sinalização potencial do gabarito entre neurônios e glia, que não é possível em culturas separadas. Em nosso protocolo, se necessário, o método contínuo da cocultura pode facilmente ser omitido e um tratamento clássico dos neurônios com meios glia-condicionados pode ser executado.
Em resumo, o protocolo aqui apresentado tem como objetivo fornecer ao leitor uma base sólida a partir da qual eles podem estabelecer suas próprias experiências de cultura de células purificadas. Prevemos que a disponibilidade de animais transgênicos e construções virais continuará a aumentar para o futuro previsível. Conseqüentemente, as técnicas de classificação da pilha baseadas na fluorescência são prováveis tornar-se ainda mais amplamente utilizadas e valiosas.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o excelente suporte técnico prestado por Jenny Kirsch e Ana Teichmüller na unidade de núcleo de citometria de fluxo, Deutsches rheuma-Forschungszentrum, Berlim. Gostaríamos de agradecer a Jie Song por sua ajuda com a análise de sobrevivência. Gostaríamos também de agradecer a Rita Loureiro por sua ajuda capturando as imagens de camundongos fluorescentes e Christian Ebner para leitura crítica do protocolo. Os ratos transgênicos VGAT-Venus foram gerados pelos Drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi e Y. Kawaguchi no Instituto Nacional de Ciências fisiológicas, Okazaki, Japão, usando pCS2-Venus fornecido pelo Dr. A. Miyawaki. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho alemão de investigação (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG EXC 257 a IV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neural Basal A media (NBA) | ThermoFisher Scientific | 10888022 | Cell Culture Buffer |
| B27 | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Culture supplement |
| Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050-038 | Culture supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic |
| Poly-L-Lysine | SIGMA | P1399 | Coverslip coating |
| Papain | SIGMA | P4762-1G | Enzyme |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A3294-100G | Serum |
| Hibernate A low fluorescence media | Brain Bits Ltd | HALF | Cell Transport media |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Biochrom | F0435 | Glial Culture Buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom | S0115 | Serum |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2163 | Enzyme |
| Fine Tip Pasteur Pipette | Neo Labs | - | Used for trituration of cells |
| 24-well plates | BD | 353047 | Culture plate |
| 50 mL Falcon tubes | BD | 352070 | - |
| 15 mL Falcon tubes | BD | 352096 | - |
| Glass coverslips: 12 mm round | Roth | P231.1 | - |
| 35 mm Petri dish | Corning | 353001 | - |
| 100 mm Petri dish | Corning | 353003 | - |
| 30 µm CellTrics Cell Sieve | sysmex | 04-004-2326 | To remove cell clumps before cell sorting |
| Round bottom polystyrene tubes | BD | 352054 | Transport tube for sorted cells |
| Round bottom polypropylyne tubes | BD | 352063 | Collection tube for sorted cells |
| Cell culture inserts – 0.4 µm transparent PET | Falcon | 353 095 | For the co-culture of neurons and glia |
| Extra fine Bonn Scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | To remove overlying skin and bone of mice |
| Extra narrow Scissors | Fine Scientific Tools | 14088-10 | To remove overlying skin and bone of rats |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11242-40 | To hold the head in place |
| Spatula (130 mm long/5 mm tip width) | Fine Scientific Tools | 3006.1 | To remove the brain to filter paper |
| Scalpel Blades | Swan-Morton | #0308 | To mechanically dissociate neural tissue |
| Haemocytometer (Neubauer Imroved) | Optik Labor | - | To cell count dissociated cells |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/LS-1G | To excite TdTomato |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/EF-4R2 | Td Tomato compatible emission filter |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/ULS-02B2 | To excite Venus |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/TEF-3GY1 | Venus compatible emission filter |
| Mouse-Anti-GFP primary antibodies | UC Davis | 75-132 | To enhance Venus signal following fixation |
| Mouse-Anti-GFAP primary antibodies | SIGMA | G-3893 | The identification of reactive astrocytes |
| Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies | Southern Biotech | 1561-15 | The identification of microglial cells |
| Rabbit-Anti-MBP primary antibodies | Millipore | AB980 | The identification of oligodendrocyes |
References
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