Summary
Dit protocol Details een monolayer, serum-vrije methode voor het efficiënt genereren van hepatocyte-achtige cellen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in 18 dagen. Dit omvat zes stappen als hpscs sequentieel differentiëren in tussenliggende celtypen zoals de primitieve streak, definitieve endoderm, posterieure foregut en lever Bud voor ouders voor het vormen van hepatocyte-achtige cellen.
Abstract
De lever ontgift schadelijke stoffen, scheidt vitale eiwitten, en voert belangrijke metabole activiteiten, dus behoud van leven. Dientengevolge, leverfalen-die kan worden veroorzaakt door chronische alcohol inname, hepatitis, acute vergiftiging, of andere beledigingen-is een ernstige aandoening die kan uitmonden in bloeden, geelzucht, Coma, en uiteindelijk de dood. Echter, benaderingen voor de behandeling van leverfalen, evenals studies van de leverfunctie en ziekte, zijn gedeeltelijk gestoneerd door het ontbreken van een overvloedig aanbod van menselijke levercellen. Hiertoe beschrijft dit protocol de efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in hepatocyten achtige cellen, geleid door een ontwikkelings roadmap waarin wordt beschreven hoe lever lotgevallen worden gespecificeerd in zes opeenvolgende differentiatie stappen. Door het manipuleren van ontwikkelings signalerings trajecten ter bevordering van de lever differentiatie en expliciet onderdrukken van de vorming van ongewenste cel Fates, deze methode genereert efficiënt populaties van menselijke lever Bud voor ouders en hepatocyte-achtige cellen door dagen 6 respectievelijk 18 van de PSC-differentiatie. Dit wordt bereikt door de tijdelijk nauwkeurige controle van ontwikkelings signalerings trajecten, uitgeoefend door kleine moleculen en groeifactoren in een serumvrij kweekmedium. Differentiatie in dit systeem vindt plaats in monolagen en levert hepatocyten achtige cellen die karakteristieke hepatocyte enzymen uitdrukken en de mogelijkheid hebben om een muismodel van chronisch leverfalen te graveren. De mogelijkheid om efficiënt te genereren grote aantallen menselijke levercellen in vitro heeft vertakkingen voor de behandeling van leverfalen, voor drug screening, en voor mechanistische studies van leverziekte.
Introduction
Het doel van dit protocol is om de menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) efficiënt te differentiëren in verrijkte populaties van lever Bud-voorlopercellen en hepatocyten-achtige cel2. Toegang tot een klaar aanbod van menselijke lever voorlopercellen en hepatocyte-achtige cel zal versnellen inspanningen om te onderzoeken van de leverfunctie en ziekte en kan nieuwe cellulaire transplantatie therapieën voor leverfalen3,4, 5. Dit is in het verleden een uitdaging gebleken sinds hPSCs (waaronder embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen) in alle celtypen van het menselijk lichaam kunnen worden onderscheiden; Bijgevolg was het moeilijk om ze uitsluitend te differentiëren tot een zuivere populatie van een enkel celtype, zoals levercellen6.
Om hPSCs nauwkeurig te differentiëren in levercellen, is het eerst essentieel om niet alleen te begrijpen hoe levercellen worden gespecificeerd, maar ook hoe niet-lever celtypen zich ontwikkelen. Kennis van hoe niet-levercellen zich ontwikkelen is belangrijk om de vorming van niet-lever lijnen tijdens differentiatie logischerwijs te onderdrukken, waardoor hPSCs uitsluitend naar een leverlot2wordt geleidbaar. Ten tweede is het essentieel om de meervoudige ontwikkelingsstappen te afbakenen waarmee hPSCs zich onderscheiden in de richting van een lever lot. Het is bekend dat hpscs opeenvolgend differentiëren in meerdere celtypen die bekend staan als de primitieve streak (APS), definitieve endoderm (de), posterieure foregut (PFG) en lever Bud voorlopercellen (lb) voor het vormen van hepatocyte-achtige cel(HEP). Eerder werk bleek de signalen die lever lot en de signalen die de vorming van alternatieve niet-levercel-typen onderdrukt (met inbegrip van de maag, pancreas, en intestinale voorlopercellen) bij elke ontwikkeling Lineage keuze2, 7 , 8.
Collectief, deze inzichten hebben geleid tot een serum-vrije, monolaag methode om te onderscheiden hpscs naar primitieve streak, definitieve endoderm, posterieure foregut, lever Bud voor ouders en ten slotte, hepatocyte-achtige cellen2. Over het algemeen omvat de methode het zaaien van hpscs in een monolaag op een geschikte dichtheid, het voorbereiden van zes cocktails van differentiatie media (met groeifactoren en kleine moleculen die verschillende ontwikkelings signalerings trajecten reguleren), en opeenvolgend toevoegen van deze media om differentiatie te induceren in de loop van 18 dagen. Tijdens het proces is geen passage van cellen nodig. Van noot, omdat deze methode expliciet signalen bevat die de vorming van niet-leverceltypen onderdrukken, genereert deze differentiatie benadering1 efficiënter lever voorlopercellen en hepatocyten achtige cel door vergelijking met bestaande differentiatie methoden2,9,10,11,12. Bovendien kan het in deze tekst beschreven protocol de snellere aanmaak van hepatocyten die uiteindelijk hogere niveaus van hepatische transcriptiefactoren en enzymen uitdrukken dan die geproduceerd door andere protocollen9,10 , 11 , 12.
Het hier beschreven protocol heeft bepaalde voordelen ten opzichte van de huidige differentiatie protocollen. Ten eerste omvat het monolaag-differentiatie van hpscs, wat technisch eenvoudiger is in vergelijking met driedimensionale differentiatie methoden, zoals die welke gebaseerd zijn op embryoïde lichamen13. Ten tweede exploiteert deze methode een recente voorschot waarbij definitieve endoderm cellen (een vroege voorloper van levercellen) efficiënt en snel kunnen worden gegenereerd binnen 2 dagen na de hpsc-differentiatie2,7, waardoor de daaropvolgende productie van hepatocyten met verhoogde zuiverheid. Ten derde produceren de hepatocyte-achtige cellen die met deze methode worden geproduceerd, in vergelijkingen naast elkaar , meer albumine en drukken hogere niveaus van hepatische transcriptiefactoren en enzymen uit in vergelijking met hepatocyten geproduceerd in andere methoden10, 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van differentiatie media
Opmerking: Raadpleeg de tabel met materialen voor de fabrikant informatie over de gebruikte materialen en reagentia.
-
Bereiding van basis chemisch gedefinieerde media (CDM)
Opmerking: CDM2, CDM3, CDM4 en CDM5 zijn chemisch gedefinieerde media die worden gebruikt als basismedia koppelen voor het differentiëren van hpscs op levercellen in verschillende stadia. De samenstelling van deze media kan worden gevonden in tabel 1.- Maak een stockoplossing met polyvinylalcohol (PVA) om CDM2 of CDM3 te maken. Los 0,5 g PVA-poeder op in 50 mL van het gemodificeerde Dulbecco's medium (IMDM) van Iscove om een PVA-kolf van 10 mg/mL te genereren.
Opmerking: Omdat PVA niet gemakkelijk oplost, bereidt u het PVA/IMDM-mengsel in een conische kolf met continu roeren bij ~ 50 °C op een verwarmingskussen; roeren kan gemakkelijk worden bereikt met behulp van een magneetroerder. - Nadat PVA homogeen is opgelost in IMDM, verwijder de PVA-oplossing van het verwarmingskussen en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur.
- Gebruik een steriel filter van 0,2 μm om de PVA-oplossing te filteren.
- Bereid de CDM2 en CDM3 voor door de gefilterde PVA te combineren uit stap 1.1.1 en diverse commercieel gekochte componenten zoals beschreven in tabel 1 en de tabel met materialen. Gebruik steriele, 0,2 μm filter units om alle media te filteren.
Opmerking: Basismedium kan worden bewaard bij 4 °C, maar niet langer dan 2 maanden. - Bereid de resterende basismedia CDM4 en CDM5 volgende tabel 1voor.
- Maak een stockoplossing met polyvinylalcohol (PVA) om CDM2 of CDM3 te maken. Los 0,5 g PVA-poeder op in 50 mL van het gemodificeerde Dulbecco's medium (IMDM) van Iscove om een PVA-kolf van 10 mg/mL te genereren.
-
Voorbereiding van differentiatie media
- Om voorraadoplossingen voor de kleine moleculen en groeifactoren voor te bereiden, reconstitueren ze volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Voor opslag, ALIQUOT in steriele buisjes om vries-dooi cycli te verminderen en bij-20 °C of zoals aanbevolen te houden.
Opmerking: De samenstelling van het in verschillende differentiatie fasen te gebruiken differentiatie medium wordt beschreven in tabel 2 en in de volgende stappen. - Om het differentiatie medium voor te bereiden, ontdooit eerst de bevroren kleine moleculen en/of groeifactoren bij kamertemperatuur. Vervolgens aliquot de benodigde hoeveelheid basismedium. Maak ten slotte de uiteindelijke differentiatie media door de gespecificeerde kleine moleculen en groeifactoren toe te voegen aan het basismedium bij de juiste concentraties (tabel 2).
Opmerking: Vers bereide differentiatie medium moet idealiter op dezelfde dag worden gebruikt; anders kan het worden bewaard bij 4 °C en binnen drie dagen worden gebruikt. - Meng met behulp van een pipetpunt het differentiatie medium meerdere malen om ervoor te zorgen dat supplementen homogeen worden gedistribueerd voordat het medium aan cellen wordt toegevoegd (Voeg bijvoorbeeld 1 mL differentiatie medium toe aan elke put van een 12-well plaat.)
- Om voorraadoplossingen voor de kleine moleculen en groeifactoren voor te bereiden, reconstitueren ze volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Voor opslag, ALIQUOT in steriele buisjes om vries-dooi cycli te verminderen en bij-20 °C of zoals aanbevolen te houden.
2. zaad hPSCs op platen met gedefinieerde dichtheden voor differentiatie
- Coat celkweek kunststoffen die zullen worden gebruikt voor het zaaien met hPSCs.
- De matrix (bv. Geltrex) bij 4 °C 's nachts voor de dag van gebruik ontdooien.
- Verdun de volgende dag de matrix 1:100 door 500 μL van de matrix toe te voegen aan 50 mL van het gemodificeerde Adelaarsmedium (DMEM)/F12. Aangezien de matrix een hydrogel is die onherroepelijk polymeriseert bij blootstelling aan kamertemperatuur, bij het werken met de matrix, moet u de matrix buizen en-dragers altijd op ijs houden.
- Opmerking: De matrix opgeloste 1:100 in DMEM/F12 kan worden bewaard bij 4 °C, maar moet binnen 2 maanden worden gebruikt.
- Om een kweek plaat met de matrix te bedekken, Pipetteer de verdunde matrix in het vereiste aantal putjes met net genoeg volume van de matrix oplossing om het oppervlak van de put af te dekken (bijv. Voeg 0,5 mL matrix toe aan een putje van een 12-Wells plaat of 1 mL tot een put van een 6- goed bord). Schud de plaat indien nodig zachtjes om ervoor te zorgen dat de matrix oplossing de bodem van de put volledig bedekt.
- Laat de met matrix beklede plaat in een incubator van 37 °C gedurende ten minste 60 min. Bij deze temperatuur, de matrix polymeriseert tot een dunne film te vormen op de bodem van de put.
- Opmerking: Matrix gecoate platen kunnen in de incubator van 37 °C worden bewaard en binnen 3 dagen worden gebruikt, zolang de matrix niet is opgedroogd.
- Aspirate de overgebleven matrix oplossing van de gecoate putten onmiddellijk voorafgaand aan de zaaien van de putten met hpscs.
- Het doorgeven en zaaien van de gecoate platen met hPSCsNOTE: het dissociatie middel bevat enzymen die cellen ontkoppelen en het is belangrijk om hPSCs in het dissociatie middel te laten voor een zo kort mogelijke periode.
- Om met de hpscs voorafgaand aan de differentiatie de kweek platen met een matrix coating te laten groeien, worden ongedifferentieerde hpscs tot > 70% confluentie in commercieel verkrijgbare mTeSR1 medium (tabel van materialen) volgens het Protocol van de fabrikant. Het is van cruciaal belang om te passeren hPSCs voordat ze volledig worden Confluent, als hPSCs spontaan kunnen differentiëren bij hoge samenvloeiing.
Opmerking: hpscs moeten karyogetypt zijn om er zeker van te zijn dat er geen chromosomale afwijkingen zijn voordat ze voor experimenten worden gebruikt. De hPSCs die voor dit differentiatie protocol werden gebruikt, bleven in mTeSR1 media gehandhaafd en werden als klontjes met EDTA aangevoerd om karyotypische afwijkingen te minimaliseren. Karyotypisch-abnormale hPSCs mogen niet worden gebruikt voor differentiatie, omdat ze abnormaal snel kunnen prolifereren; de hier aanbevolen celdichtheden zijn daarom niet geschikt voor karyotypisch-abnormale cellen. - Voor de zaad hpscs voor differentiatie, aspiraat mTeSR1 van grotendeels-confluente hpsc culturen plaat en voeg commercieel gekochte dissociatie agent (tabel van de materialen) om de hpscs te ontkoppelen, met behulp van net genoeg dissociatie middel om het oppervlak van de goed of gerecht waarop de cellen groeien (Voeg bijvoorbeeld 0,5 mL dissociatie middel per goed toe van een 12-put plaat, 1 mL per put van een 6-put plaat of 3 mL per 10 cm schaal).
- Inbroed hPSCs in het dissociatie middel bij 37 °C gedurende 5 minuten of totdat sommige kolonies beginnen te ontkoppelen. Tik zachtjes de bodem van de put/plaat meerdere malen; Na enkele minuten dissociatie moeten de meeste hPSC-kolonies vrij in suspensie komen.
- Om gezien hpscs los te maken van de plaat, voegt u 2 ml/put van DMEM/F12 toe als u werkt met een 6-put plaat (of 1 ml/goed bij het werken met een 12-well plaat) om het dissociatie middel te verdunnen. Gebruik een serologische Pipet van 5 mL om meerdere malen voorzichtig omhoog en omlaag te pipet kelen om alle cellen van het oppervlak van de put af te spoelen; Verzamel resuspendeerde enkelvoudige cellen in een conische buis van 50 mL. Was de plaat een tweede keer met hetzelfde volume DMEM/F12 om te zorgen voor herstel van alle hPSCs.
- Aan de conische buis van 50 mL die de cellen bevat, voeg DMEM/F12 toe om het oorspronkelijke volume van de dissociatie agent te verdunnen met 1:5-1:10 (bijv. als het oorspronkelijke volume van het dissociatie middel 1 mL was, stel dan het totale volume van de celsuspensie in op 10 mL met DMEM/F12 om de de dissociatie agent op 1:10)
- Centrifugeer de verzamelde hPSCs in een conische buis van 50 mL bij 350 x g gedurende 3 minuten bij 4 °c tot pellet cellen.
- In afwachting van de cellen tot pellet, aspiraat matrix van de plaat waarin de hpscs zullen worden geseeid. Voeg vervolgens voldoende hoeveelheden mTesR1 aangevuld met 1 μM commercieel verkregen thiazovivine (een farmacologische ROTSREMMER) aan de ontvangende putjes om ze te bedekken (bijv. Voeg 0,5 mL mTeSR1 per putje toe van een 12-Wells plaat of 1 mL mTeSR1 per putje van een 6-putplaat).
Opmerking: Thiazovivine met een lage concentratie is opgenomen in deze stap om de overleving van de enkelvoudige cel te verbeteren en vandaar de daaropvolgende zaaien dichtheid van hpscs. - Na het centrifugeren van hPSCs, zuig voorzichtig het supernatant op, waardoor de peen hPSCs op de bodem van de conische buis staan. Het supernatant bevat dissociatie middel dat de daaropvolgende hechting van hPSCs remt en dus is het belangrijk om de grote meerderheid van het supernatant te aspireren voordat u doorgaat.
- Respendeer de celpellet in mTeSR1 aangevuld met 1 μM thiazovivine. Met een P1000 pipet u 2-3 keer zachtjes trillen om de celpellet gelijkmatig te respenderen in één celsuspensie. Niet te tritureren de celpellet als overmatige mechanische kracht zal hPSCs beschadigen en leiden tot een slechte overleving van de cel.
- Pipetteer na het resuspensie van de hPSCs onmiddellijk 10 μL van de suspensie in een hemocytometer en Tel het aantal cellen. Het is belangrijk om cellen zo snel mogelijk te laten tellen, omdat de zwaartekracht zal leiden tot hPSCs die zich op natuurlijke wijze in de bodem van de 50 mL-buis bevinden, wat een nauwkeurige celtelling zal opleveren.
- Pas het volume van de geresuspendeerde hPSCs aan met thiazovivin-aangevuld mTeSR1 om de gewenste celconcentratie voor beplating te bereiken. Voeg bijvoorbeeld, na het aanpassen van het volume van de geresuspendeerde hPSCs, 0,5 mL van de celsuspensie per put toe aan zaad 160000-250000 cellen in elke put van een 12-well plaat, waardoor een totaal volume van 1 mL in elke put wordt bereikt (0,5 mL media is toegevoegd aan de put in stap 2.2.7). Als grotere of kleinere putten worden gebruikt, schaal celaantallen/media volumes dienovereenkomstig omhoog of omlaag.
Opmerking: Het is belangrijk om hPSCs te zaad bij de aangegeven celdichtheid. Te-confluente hPSCs zullen niet efficiënt differentiëren en onder-confluente hPSCs zullen niet goed overleven tijdens differentiatie. - Schud de plaat in een kruis patroon (links, dan rechts; vooruit, daarna achteruit) om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig over de plaat/put worden verdeeld. Draai de plaat niet in een cirkelvormige beweging, want de cellen zullen zich in het midden van de plaat/put vestigen. Normaalgesproken zal hPSCs beginnen te hechten aan het oppervlak van de put binnen ~ 3-30 min. toestaan dat cellen groeien voor ten minste 24 h voordat de differentiatie wordt gestart.
- Om met de hpscs voorafgaand aan de differentiatie de kweek platen met een matrix coating te laten groeien, worden ongedifferentieerde hpscs tot > 70% confluentie in commercieel verkrijgbare mTeSR1 medium (tabel van materialen) volgens het Protocol van de fabrikant. Het is van cruciaal belang om te passeren hPSCs voordat ze volledig worden Confluent, als hPSCs spontaan kunnen differentiëren bij hoge samenvloeiing.
3. differentiatie van hPSCs in Endodermale cellen en lever progenitoren
- Nadat de hPSCs ten minste 24 uur zijn geplateerd (zoals beschreven in stap 2.2.12), controleert u, voordat u doorgaat met differentiatie, de morfologie van cellen onder een fase-contrast Microscoop, met specifieke nadruk op de diameter en dichtheid van geplateerde hPSC-kolonies.
Opmerking: Idealiter moeten klontjes gemakkelijk worden gespreid en van de juiste grootte en dichtheid gedurende de put voor stap 3,2. Grote (ongeveer > 400 μm) of kleine kolonies (ongeveer < 200 μm) van hPSCs zijn niet bruikbaar voor differentiatie (Figuur 4). Differentiatie signalen zullen niet gelijkmatig werken in grote hPSC-kolonies, wat leidt tot inefficiënte differentiatie. Kolonies die te klein zijn, overleven niet goed tijdens de eerste 3 dagen van de hPSC-differentiatie in dit differentiatie protocol. Als de dichtheid van de geseede hPSCs correct is, zullen de hPSC-kolonies vaak "bruggen" van cellen tussen hen vormen en de totale samenvloeiing zal ~ 30-50% zijn voordat de dag 1-differentiatie medium wordt toegevoegd (Figuur 4). - Als de kolonie groottes ideaal zijn in stap 3,1, ga dan naar dag 1 van differentiatie, wat een differentiatie van hPSCs inhoudt in anterieure primitieve streak (APS).
- Maak dag 1 APS-differentiatie medium door alle in tabel 2 beschreven reagentia te mengen met behulp van CDM 2 (tabel 1 en punt 1,2) als basismedium. Pipet om meerdere malen te mengen om een gelijkmatige verdeling van de componenten in de media te garanderen.
- Aspirate om de thiazovivin aangevuld mTeSR1 uit de vergulde hPSCs te verwijderen en kort hPSCs met IMDM media te wassen. Niet wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in plaats van IMDM, omdat PBS calciumionen mist (ca.2 +) en dus giftig is voor hpscs; het zal celmorfologie verstoren.
- Na de korte IMDM Wash, voeg dag 1 medium toe aan de hPSCs. Noteer de tijd en plaats de cellen weer in de incubator van 37 °C
- Ga verder met de volgende differentiatie stappen door de voorbereiding (tabel 2) en het toevoegen van het respectieve differentiatie medium aan de cellen op de respectievelijke dagen (met intervallen van 24 uur) van differentiatie rond hetzelfde tijdstip van de dag (Figuur 1). Vervang dagelijks met verse media, zelfs als opeenvolgende dagen van differentiatie dezelfde differentiatie media gebruiken. Tussen de media verandert, spoel cellen één keer met IMDM media om dode cellen en restant van vorige medium componenten te verwijderen.
- Naarmate de differentiatie verder reikt dan het stadium van de lever knop, neemt de celaantallen toe en voegt daarom meer media aan elk goed van de plaat om ervoor te zorgen dat de hoeveelheid differentiatie factoren en voedingsstoffen niet beperkend is. Voeg bijvoorbeeld 1 mL-differentiatie medium toe aan elke put van 12-well in eerste instantie op dag 1 tot 6 van differentiatie, maar Voeg 1,5-2 mL van latere differentiatie media toe op latere dagen van differentiatie (dagen 7 tot 18 van differentiatie).
4. karakterisering van Endodermale cellen en lever progenitoren door immunokleuring
- Bereid blokkerende buffer: 10% Donkey serum + 0,1% Triton X100 in gedeïoniseerde fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS).
- Bereid de kleurings buffer voor: 1% Donkey serum + 0,1% Triton X100 in DPBS.
- Aspirate medium uit cellen in 12-goed plaat.
- Voeg 4% Paraformaldehyde (in DPBS) gedurende 15 min bij kamertemperatuur toe om cellen te fixeren en vervolgens de cellen tweemaal te wassen met DPBS.
- Voeg een blokkerende buffer voor 1 uur bij kamertemperatuur toe om de vaste cellen te blokkeren en te permeiseren.
- Aspireren van de blokkerende oplossing en voeg primair antilichaam verdund in kleur buffer. (Zie tabel met materialen voor verdunnings verhoudingen van antilichamen.)
- De cellen 's nachts op 4 °C vlekken.
- Was cellen met 0,1% Triton X100 in DPBS.
- Voeg een secundaire antilichaam vlek toe in de kleurings buffer voor 1 uur bij kamertemperatuur. (Zie tabel met materialen voor verdunningen van secundaire antilichamen.)
- Verwijder het secundaire antilichaam en voeg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur DAPI toe om nucleaire tegen vlekken uit te voeren.
- Was tweemaal met 0,1% Triton X100 in DPBS om overtollig antilichaam en DAPI te verwijderen.
- Voer fluorescentiemicroscopie met een Zeiss Observer D1. U ook de plaat in 4 °C opslaan totdat er beeldvorming wordt uitgevoerd. Voor de verwachte resultaten, Zie Figuur 3.
5. karakterisering van lever voorlopercellen door fluorescentie geactiveerde cel-sortering (FACS) analyse
Opmerking: Gebruik FACS om het percentage van AFP + gedifferentieerde LB-cellen die op dag 6 van differentiatie uitkomen, nauwkeurig te kwantificeren. Volg dezelfde stappen om het percentage van ALB + gedifferentieerde hepatocyten te kwantificeren op dag 18 van differentiatie.
- ANTIAFP-antilichamen geconjugeerde.
- R-phycoerythrin toevoegen aan anti-AFP-antilichamen met een concentratie van (0,55 μg/μL) met behulp van R-phycoerythrin conjugatie Kit (Zie tabel met materialen).
Opmerking: Zorg ervoor dat de antilichamen worden gezuiverd en worden gereconstitueerd in buffers die geen amines bevatten. Zorg ervoor dat de hoeveelheid antilichamen die in een etiketterings reactie wordt gebruikt, lager moet zijn dan de hoeveelheid PE (d.w.z. 60 μg antilichaam met 100 μg PE). Slechte conjugatie van antilichamen kan leiden tot onbetrouwbare uitkomsten. - Voeg 1 μL modificatie reagens toe voor 10 μL van het te labelen antilichaam. Meng zachtjes.
- Verwijder de R-PE-mix (100 μL) en Pipetteer het bovenstaande mengsel rechtstreeks in het gelyofiliseerde R-PE-materiaal.
- Plaats de dop terug en laat de injectieflacon 3 uur in het donker staan bij kamertemperatuur.
- Voeg na 3 h of meer 1 μl dorstlesser-reagens toe voor 10 μL van het gebruikte antilichaam. Het geconjugeerde kan na 30 minuten gebruikt worden.
- Bewaar geconjugeerd antilichaam bij 4 °C.
- Was gedifferentieerde of ongedifferentieerde hPSCs in 6-well formaat met DMEM/F12.
- Kort behandelen met dissociatie middel (1 mL/goed in een 6-put-plaat) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur totdat de cellen worden losgekoppeld. Oogst en vlek zowel ongedifferentieerde hPSC-en gedifferentieerde leverprogenitorcellen identiek en analyseer parallel in hetzelfde experiment om de specificiteit van antilichaam kleuring te waarborgen.
- Tik zachtjes op Petri schaaltje om cellen los te maken. Gebruik een P1000 pipet om cellen van de plaat los te maken en cellen in een conische buis van 50 mL te verzamelen. Zorg ervoor dat cellen meestal zijn losgekoppeld voordat u doorgaat met de volgende stap. Daarna was Wells twee keer meer met 1xDPBS buffer om rest cellen te verzamelen.
- In de 50mL conische buis, verdund dissociatie middel in ~ 5 volumes van 1x DPBS buffer. Triturate rigoureus 3-4 keer met een P1000 pipet om ervoor te zorgen dat alle cellen in afzonderlijke cellen worden losgekoppeld.
Opmerking: Het is noodzakelijk om enkelvoudige cellen te genereren voorafgaand aan centrifugeren of klonters die vervolgens niet gemakkelijk kunnen worden losgekoppeld. Echter, niet te trituraat als dit kan de integriteit van de cel beschadigen. Tel het aantal cellen en gebruik de aanbevolen verhouding van cellen tot antilichaam verhouding, die eerder is geoptimaliseerd voor minimale achtergrond en maximale signaaldetectie. - Centrifuge conische buis met de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
- Aspireren de supernatant met zorg niet te verstoren de celpellet.
- Respendeer de celpellet grondig in fixatie/Perm buffer om een eencellige suspensie te genereren en vast te stellen op ijs bij 4 °C gedurende 20 min. Opmerking om over te brengen naar een micro centrifugebuis van 2 mL. Bovendien maakt het gebruik van een 2 mL micro centrifugebuis bij deze stap het mogelijk om de celpellet te storten op de V-vormige hoek van de buis, waardoor het celverlies tijdens het wassen wordt geminimaliseerd.
- Was elke pellet met 1,8 mL Perm/Wash buffer tweemaal. Respendeer de celpellet grondig in Perm/Wash buffer door de pipet 6 keer te mengen met een P1000 pipet. Vervolgens Centrifugeer, verwijder supernatant en herhaal het reinigingsproces met 1,8 mL Perm/Wash buffer.
- Resubreng celpellet in Perm/Wash buffer, zodat er 100 μL/individuele vlek is en breng vervolgens de celsuspensie over in een micro centrifugebuis van 2 mL.
Opmerking: Het is noodzakelijk om een eencellige suspensie te genereren bij deze stap voorafgaand aan antilichaam kleuring. Aggregaten van cellen zal niet worden gekleurd en dus zal de FACS analyse te Verdoe- Bovendien maakt het gebruik van een 2 mL micro centrifugebuis bij deze stap het mogelijk om de celpellet te storten op de V-vormige hoek van de buis, waardoor het celverlies tijdens het wassen wordt geminimaliseerd. - Na het opnieuw onderbreken van cellen in FACS buffer, aliquot ze in individuele 2 mL tubes (voor zowel Onbevlekte controle en antilichaam-gekleurd monsters).
- Vlek met anti-AFP-PE 0,33 μL per 150.000 cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Bijvoorbeeld voor een afzonderlijke vlek van 100 μL, vlek als volgt: 0,33 μL a-AFP PE en 100 μL Perm/Wash buffer. Respendeer cellen met P200 Pipetteer goed om zelfs vlekken te garanderen.
Opmerking: Alleen pipet-mix en niet Vortex omdat dit de eiwit stabiliteit kan verminderen. - Spoel de cellen tweemaal in 1-2 mL Perm/Wash buffer (1,9 mL/individuele vlek) en centrifugeer bij 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Was cellen met maar liefst 1-2 mL Perm/Wash buffer om voldoende wassen te garanderen.
Opmerking: Alleen pipet-mix en niet Vortex, omdat dit de eiwit stabiliteit kan verminderen. Na centrifugeren, zuig supernatant zorgvuldig op om te voorkomen dat cellen verdwijnen en zo veel mogelijk supernatant verwijderen om de Carry-over van antilichamen te minimaliseren en een completere wassing te garanderen. - Respendeer elke gewassen pellet in 300 μL Perm/Wash buffer en rek deze door een 100 μm filter in een FACS Tube om grote klonten cellen te belasten voorafgaand aan de FACS analyse.
- Analyseer cellen op een FACS Aria flow-cytometrie op het PE-kanaal. Analyseer minimaal 10.000 gebeurtenissen voor elke afzonderlijke vlek en Parseer gebeurtenissen op grond van de FSC-a/SSC-a-analyse, Selecteer cel onderhemden door gating op FSC-w/FSC-h gevolgd door SSC-h/SSC-w.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na 24 h van APS-differentiatie, zullen kolonies over het algemeen een verschillende morfologie aannemen dan ongedifferentieerde kolonies die gelijktijdig met een verlies van de heldere grens zijn, die meestal hPSC-kolonies beschrijven. Morfologisch, primitieve streak cellen hebben over het algemeen een onregelmatige grenzen en zijn meer verspreid en minder compact dan hPSCs-dit is suggestief van een epitheliale-naar-mesenchymale overgang als pluripotente epiblast cellen differentiëren en binnendringen in de primitieve streak in vivo. Als de kolonie grootte van de hPSCs voorafgaand aan differentiatie te groot was, zal er een duidelijk verhoogd centrum zijn dat niet-gedifferentieerde cellen omvat. Culturen die dergelijke grote klontjes bevatten, moeten worden weggegooid, omdat deze ongedifferentieerde kolonie centra de daaropvolgende differentiatie zullen vergaan. Als klontjes van de juiste grootte en dichtheid zijn verguld, is APS-differentiatie zeer reproduceerbaar en uniform, waardoor een 99.3 ± 0.1% MIXL1-GFP+ primitieve streak-populatie wordt gegenereerd (MIXL1 is een primitieve streak-marker)7. Merk op dat sommige celdood wordt waargenomen na 24 h van APS-differentiatie.
Op dag 2 van differentiatie, primitieve streak cellen hebben gedifferentieerd in dag 2 definitieve endoderm cellen, de overgrote meerderheid van die Express SOX17 (Figuur 2) en FOXA2. In tientallen onafhankelijke experimenten met 14 hESC-en hiPSC-lijnen (waaronder H1, H7, H9, HES2, HES3, BJC1, BJC3, HUF1C4 en HUF58C4), heeft deze aanpak op een efficiënte, consistente en efficiënt wijze zuivere, definitieve endoderm populaties gegenereerd (94,0% ± 3,1%)7. Deze methode voor het genereren van definitieve endoderm van hpscs levert hogere percentages van CXCR4+PDGFRA- endodermale populaties in vergelijking met andere endoderm-vormende benaderingen2,14.
Op dag 3 van differentiatie, endoderm heeft gedifferentieerd in foregut voor ouders die veelhoekige in vorm verschijnen (Figuur 1). Later, met 6 dagen van differentiatie, differentiëren de voor darm voorlopercellen in lever Bud-voor ouders die AFP, TBX3 en HNF4A uitdrukken (Figuur 3). Over drie hesc-lijnen (H1, H7, H9 hescs) genereert deze methode dag 6 AFP+ lever voor ouders op een efficiëntie van 89.0 ± 3,1% (Figuur 2). Eindelijk, na 18 dagen van de lever differentiatie van hPSCs, ALBUMINE+ hepatocyte-achtige cellen verschijnen. Morfologisch, ze lijken epitheel, vormen van heldere grenzen die doet denken aan gal canaliculi (Figuur 1). In dit stadium, het cytoplasma van de dag 18 hPSC-afgeleide hepatocyten lijkt donkerder dan de Nucleus (Figuur 1).
Figuur 1: schematische voorstelling van de differentiatie strategie en morfologie van ongedifferentieerde hPSCs, differentiërende endoderm en hepatocyte-achtige cellen. Differentiatieproces en tijdlijn werden getoond. Afkortingen: d = dag, hPSC = menselijke pluripotente stamcellen, APS = anterieure primitieve streak, DE = definitieve endoderm, PFG = posterieure foregut, LB = lever Bud-voorlopercellen, HP = hepatocyten progenitors, HEP = hepatocyte zoals Cells. Schaalbalk = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: percentage van dag 1 MIXL1 + primitieve streak, dag 2 SOX17 + Definitive (def) endoderm, dag 6 AFP + lever Bud voor ouders en Alb + hepatocyten populaties zoals getoond door FACS. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Immunokleurings analyse van dag 6 lever progenitors. hPSC werden voor het eerst gedifferentieerd in lever Bud voor ouders, die waren immunogekleurd voor lever Bud transcriptiefactoren HNF4A (rood), TBX3 (groen) evenals cytoplasmatische lever Bud marker AFP (rood). Nuclei werden met de DAPI (blauw) tegen het totale celnummer beoordeeld. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: celseeding dichtheid van hPSCs. Laag (links) en gepaste (midden en rechts) dichtheid van cellen die zijn geseeid. Schaalbalk = 1.000 μm. Pijl wijst naar "bruggen" tussen kolonies cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Basismedium | Samenstelling van basismedium |
| CDM2 | 1:1 IMDM/F12, 0,1% m/v PVA, 1% geconcentreerde lipiden, 0,7 μg/mL humane recombinant insuline, 15 μg/mL transferrine, 18 nM 1-thioglycerol |
| CDM3 | 1:1 IMDM/F12, 0,1% m/v PVA, 1% geconcentreerde lipiden, 10% KOSR |
| CDM4 | 1:1 IMDM/F12, 1% geconcentreerde lipiden, 15 μg/mL Transferrin |
| CDM5 | CMRL, 10% KOSR, 1% Glutamax |
Tabel 1: samenstelling van chemisch gedefinieerde media CDM2, CDM3, CDM4 en CDM5.
| Differentiatie stadia | Duur | Factoren | Doses | Basismedium |
| Dag 1 primitieve streak | 1 dag | Activine | 100 ng/mL | |
| CHIR99201 | 3 μM | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nM | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| Dag 2 definitieve endoderm | 1 dag | Activine | 100 ng/mL | |
| DM3189 | 250 nM | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nM | |||
| Dag 3 posterior Foregut | 1 dag | A83-01 | 1 μM | |
| TTNPB | 75 nM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| Dag 6 lever Bud voor ouders | 2 dagen | Activine | 10 ng/mL | |
| C59 | 1 μM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| Forskolin | 1 μM | |||
| 1 dag | Activine | 10 ng/mL | ||
| CHIR99201 | 1 μM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| Forskolin | 1 μM | |||
| Dag 12 hepatische voor ouders | 6 dagen | BMP4 | 10 μg/mL | |
| OSM | 10 ng/mL | |||
| Dexamethason | 10 μM | |||
| Forskolin | 10 μM | CDM4 | ||
| Ro4929097 | 2 μM | |||
| AA2P | 200 μg/mL | |||
| Insuline | 10 μg/mL | |||
| dag 18 hepatocyten | 6 dagen | Dexamethason | 10 μM | |
| Forskolin | 10 μM | CDM4 of | ||
| Ro4929097 | 2 μM | CDM5 | ||
| AA2P | 200 μg/mL | |||
| Insuline | 10 μg/mL |
Tabel 2: samenstelling van differentiatie media.
| Probleem | Mogelijke reden | Gestuurde oplossing |
| Cellen in het centrum van de kolonie niet differentiëren | i) grootte van de kolonie was buitensporig groot, cellen in het midden van grote kolonies waren niet toegankelijk voor differentiatie signalen | i) Controleer de cel telling technqiue. |
| II) ongelijke verdeling van klonten die samen zijn samengevoegd in het midden van de put (of de periferie), die zeer grote kolonies vormen | II) schud de plaat op een kruis manier om klonters gelijkmatig te verdelen tijdens het beplating, en controleer onder een Microscoop voordat u deze in de incubator plaatst. | |
| III) cellen onvoldoende differentiatie signalen ontvangen | III) Voeg voldoende volume differentiatie media toe: Voeg 1 mL medium per put toe in een 12-put plaat en 3 mL per put in een 6-well plaat | |
| Slechte efficiëntie van differentiatie | i) het starten van celcultuur gedeeltelijk gedifferentieerd | i) gebruik een nieuwe, kwalitatief hoogstaande partij ongedifferentieerde hPSCs |
| II) kolonies waren te dicht geseeid en vormden een confluente bladcellen | II) zaadcellen en Tel cellen nauwkeurig voor differentiatie, en schud gelijkmatig om ze te verdelen | |
| III) rest media en ongewenste signalen werden niet weggespoeld door onvoldoende wassen | III) residuele mTeSR1 of inductie media uit de vorige fase van differentiatie zullen de differentiatie blokkeren; was cellen met IMDM voorafgaand aan het toevoegen van differentiatie medium | |
| IV) wassen te hard; ongepaste wascondities zullen de celmorfologie ernstig verstoren | IV) alvorens een differentiatie medium toe te voegen, kort wassen met imdm. Het gebruik van DPBS (of media met verschillende osmolariteit of koude media) of verlengde wassing zal de celmorfologie en levensvatbaarheid in gevaar brengen | |
| v) verlengde of verkorte periode van differentiatie stadia, langer of korter dan aanbevolen. | v) Houd u aan de aanbevolen tijden voor elke fase van differentiatie. |
Tabel 3: mogelijke problemen en hun mogelijke oorzaken en oplossingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode maakt het genereren van verrijkte populaties van lever Bud-voorlopercellen, en vervolgens hepatocyte-achtige cel, van hPSCs. Het vermogen om verrijkte populaties van menselijke levercellen te genereren is belangrijk voor het praktische gebruik van dergelijke cellen. Eerdere methoden voor het genereren van hepatocyten van hPSCs leverde onzuivere celpopulaties die zowel lever-als niet-levercellen bevatten die, bij transplantatie in knaagdieren, bot en kraakbeen opleverden naast leverweefsel15. Vandaar dat de expliciete onderdrukking van niet-lever differentiatie essentieel is voor het genereren van verrijkte lever populaties die geschikt kunnen zijn voor een verscheidenheid aan toepassingen.
Met name de gecontroleerde beplating van hPSCs bij de allereerste stap is essentieel voor een efficiënte downstream-differentiatie. Het is belangrijk om hPSCs nauwkeurig te vullen met een bepaalde dichtheid voor differentiatie, en deze hPSCs gelijkmatig te verdelen over de put of plaat tijdens het proces van plating. Bijvoorbeeld voor elke put van een 12-well plaat, Seed 160.000 tot 250.000 hPSCs per put; over het algemeen is het noodzakelijk om de celdichtheid te titreren en uiteindelijk de celdichtheid te testen die geschikt is voor elke cellijn (Figuur 4). Als er te veel hPSCs per put worden geseeerd, zullen ze grote kolonies vormen, wat de efficiëntie van differentiatie negatief beïnvloedt, omdat cellen in het midden van grote kolonies minder toegankelijk zijn voor differentiatie signalen in vergelijking met cellen in de buurt van de periferie; kolonies van heterogene groottes zullen ook vergelijkbare problemen presenteren. Als de celdichtheden te laag zijn (bijv. onder 200.000 cellen/goed van een 12-goed plaat), is er mogelijk niet voldoende materiaal voor differentiatie en kan uitgebreide celdood worden waargenomen. De hierboven beschreven passage-en zaaien methode genereert consequent hpsc-klonters met een geschikte grootte voor downstreamdifferentiatie.
Een beperking van deze methode is dat de hepatocyte-achtige cellen die zijn gegenereerd niet identiek zijn aan volwassen hepatocyten, omdat de hPSC-afgeleide cellen nog steeds onvolgroeide lever marker AFP uitdrukken. Bovendien is de enzymatische activiteit van CYP3A4 ongeveer 55 keer lager in deze door hPSC afgeleide hepatocyte-achtige cellen in vergelijking met primaire humane hepatocyten. Een komende uitdaging zal zijn om deze hPSC-afgeleide Hepatocyt-achtige cellen te rijpen tot volwaardige, volwassen-achtige cellen. Een tweede beperking is dat efficiënte differentiatie zeer afhankelijk is van de begin dichtheid van cellen en daarom is het erg belangrijk om zaad bij de aanbevolen dichtheid te maken en ze gelijkmatig over de plaat te verspreiden (tabel 3).
Over het algemeen produceert dit protocol leverbud-voorlopercellen en hepatocyte-achtige cellijnen met een zuiverheid van 89.0 ± 3,1% in ten minste 3 hPSC-lijnen. Ten tweede, Hepatocyt-achtige cellen uitgedrukt leverenzymen, uitgescheiden humaan albumine en uitgedrukt hogere niveaus van lever genen dan cellen die worden gegenereerd met behulp van bestaande differentiatie benaderingen. Ten slotte vertonen de resulterende Hepatocyt-achtige cellen niet alleen bepaalde hepatocyte-functies in vitro, maar bovenal kunnen ze tot op zekere hoogte in vivo functioneren, omdat ze een muismodel van chronische leverbeschadiging kunnen graveren en de overleving op korte termijn kan verbeteren2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Bing Lim voor discussies en het Stanford Institute for Stem Cell Biology & regeneratieve geneeskunde voor infrastructuur ondersteuning. Dit werk werd gesteund door het California Institute for Regenerative Medicine (DISC2-10679) en het Stanford-UC Berkeley Siebel stam Cell Institute (to L.T.A. and K.M.L.) en het Stanford Beckman Center voor moleculaire en genetische geneeskunde, evenals de anonieme, Baxter en DiGenova families (naar K.M.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| Human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| Human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| Human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
References
- Bernal, W., Wendon, J. Acute Liver Failure. New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Fisher, R. A., Strom, S. C. Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results. Transplantation. 82, 441-449 (2006).
- Dhawan, A. Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges. Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).
- Salama, H., et al. Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases. Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).
- Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice. Differentiation. 98, 25-34 (2017).
- Loh, K. M., et al. Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
- Zhao, D., et al. Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects. Cell Research. 23, 157-161 (2012).
- Si Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 297-305 (2010).
- Carpentier, A., et al. Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen. Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).
- Avior, Y., et al. Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes. Hepatology. 62, 265-278 (2015).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).
- Haridass, D., et al. Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice. The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).
