Summary
このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)から肝細胞様細胞を18日間で効率的に生成する単層、血清フリー法を詳細に述べている。これは、hPSCが肝細胞様細胞を形成する前に、原始的な筋、決定的な内因性内因性、後部前腸および肝芽前駆体のような中間細胞型に順次分化するように6つのステップを伴う。
Abstract
肝臓は有害物質を破壊し、重要なタンパク質を分泌し、重要な代謝活動を実行し、生命を維持します。その結果、慢性アルコール摂取、肝炎、急性中毒、またはその他の侮辱によって引き起こされる肝不全は、出血、黄疸、昏睡、そして最終的に死亡する可能性のある重篤な状態である。しかし、肝不全を治療するアプローチは、肝機能や疾患の研究と同様に、ヒト肝細胞の豊富な供給の欠如によって部分的にスタイミクされています。この目的のために、このプロトコルは、肝細胞様細胞へのヒト多能性幹細胞(hPSC)の効率的な分化を詳細に説明し、6つの連続した分化ステップにわたって肝臓の運命がどのように指定されるかを説明する発達ロードマップによって導かれる。発達シグナル伝達経路を操作して肝臓分化を促進し、望ましくない細胞の形成を明示的に抑制することにより、この方法は6日目までにヒト肝芽前駆体および肝細胞様細胞の集団を効率的に生成する。PSC分化の18とそれぞれ。これは、血清フリー培養培地における低分子および成長因子によって発揮される発達シグナル伝達経路の時間的に正確な制御を通じて達成される。このシステムの分化は単層で起こり、特徴的な肝細胞酵素を発現し、慢性肝不全のマウスモデルを生着させる能力を有する肝細胞様細胞を生み出す。インビトロで多数のヒト肝細胞を効率的に生成する能力は、肝不全の治療、薬物スクリーニング、肝疾患の機械的研究に影響を及ぼす。
Introduction
このプロトコルの目的は、ヒト多能性幹細胞(hPSC)を肝臓芽前駆体および肝細胞様細胞2の濃縮集団に効率的に分化することである。ヒト肝前駆体および肝細胞様細胞の準備が整った供給へのアクセスは、肝機能および疾患を調査する努力を加速し、肝不全のための新しい細胞移植療法を可能にする3、4、 5.hPSC(胚性および誘導多能性幹細胞を含む)は、人体のすべての細胞型に分化することができるので、これは過去に困難であることが証明されています。その結果、肝細胞6のような単一細胞型の純粋な集団に排他的に区別することは困難であった。
hPSCを肝細胞に正確に区別するには、まず肝細胞がどのように指定されているのかだけでなく、非肝細胞型がどのように発達するかを理解することが重要です。非肝細胞がどのように発達するかについての知識は、分化中の非肝系統の形成を論理的に抑制するために重要であり、それによって排他的に肝運命2に向かってhPSCを導く。第二に、hPSCが肝臓の運命に向かって区別する複数の発達ステップを記述することが不可欠です。hPSCは、肝細胞様細胞(HEP)を形成する前に、原始的な筋(APS)、決定的内皮(DE)、後前駆体(PFG)および肝芽前駆体(LB)として知られている複数の細胞型に順次分化することが知られている。以前の研究では、肝臓の運命を指定するシグナルと、各発達系統選択2における代替非肝細胞型(胃、膵臓、腸前駆体を含む)の形成を抑制するシグナルを明らかにした。7,8.
これらの洞察は、これらの洞察は、原始的な筋、決定的な内因性、後頭蓋、肝臓芽前駆体、および最後に、肝細胞様細胞2に向かってhPSCを区別する血清フリー、単層法を生み出した。全体的に、この方法は、適切な密度で単層におけるhPSCの播種を含み、6つの分化媒体(様々な発達シグナル伝達経路を調節する成長因子および低分子を含む)を調製し、およびこれらのメディアを順次追加して、18日間にわたって差別化を誘導します。プロセス中に、細胞の通過は必要ありません。なお、この方法は非肝細胞型の形成を抑制するシグナルを明示的に含んでいるため、この分化アプローチ1は、現存する細胞と比較して肝前駆細胞および肝細胞様細胞をより効率的に生成する。分化方法2,9,10,11,12.さらに、このテキストに記載されているプロトコルは、最終的に他のプロトコル9、10によって生成されるものよりも高いレベルの肝転写因子および酵素を発現する肝細胞のより速い生成を可能にする,11歳,12.
ここで説明するプロトコルは、現在の差別化プロトコルに対して一定の利点があります。第1に、hPSCの単層分化を伴い、これは、胚体13に依存するもののような3次元分化方法と比較して技術的に単純である。第二に、この方法は、決定的な内皮細胞(肝細胞の早期前駆体)がhPSC分化2、7の2日以内に効率的かつ迅速に生成することができるという最近の進歩を利用し、その後のことが可能になる。増加した純度を有する肝細胞の産生。第三に、並べて比較すると、この方法2によって産生される肝細胞様細胞は、より多くのALBUMINを産生し、他の方法で産生される肝細胞と比較して肝転写因子および酵素のより高いレベルを発現する10、 11、12.
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Protocol
1. 差別化メディアの作成
注:使用する材料および試薬に関するメーカー情報については、材料の表を参照してください。
-
塩基化学的に定義された媒体(CDM)の調製
注:CDM2、CDM3、CDM4およびCDM5は、様々な段階で肝細胞にhPSCを分化するためのベースメディアとして使用される化学的に定義された媒体です。これらのメディアの構成は表1で見つけることができます。- CDM2またはCDM3を作るために、ポリビニルアルコール(PVA)を含むストック溶液を調製する。イスコベの改変ダルベッコ培地(IMDM)の50mLに0.5gのPVA粉末を溶解し、10mg/mLのPVAストックを生成します。
注:PVAは容易に溶解しないため、加熱パッド上で約50°Cで連続撹拌しながら円錐フラスコにPVA/IMDM混合物を調剤する。撹拌は、磁気攪拌機を使用して容易に達成することができる。 - PVAをIMDMに均質に溶解した後、加熱パッドからPVA溶液を取り出し、室温まで冷却します。
- 無菌の0.2 μmフィルターを使用して、PVA溶液をろ過します。
- ステップ 1.1.1 からフィルタリングされた PVAと、表 1および材料の表に示すように、さまざまな市販のコンポーネントを組み合わせて CDM2 と CDM3 を準備します。無菌の0.2 μmフィルターユニットを使用して、すべてのメディアをフィルタリングします。
注:ベース媒体は4°Cで保存できますが、2ヶ月以内に保存できます。 - 表 1の後に、残りの基本メディア CDM4 および CDM5 を準備します。
- CDM2またはCDM3を作るために、ポリビニルアルコール(PVA)を含むストック溶液を調製する。イスコベの改変ダルベッコ培地(IMDM)の50mLに0.5gのPVA粉末を溶解し、10mg/mLのPVAストックを生成します。
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分化媒体の作成
- 低分子および成長因子に対するストックソリューションを準備するには、メーカーの推奨事項に通してそれらを再構成します。貯蔵のために、凍結融解周期を減らし、-20°Cまたは推奨される状態に保つために無菌管にアリコート。
注:種々の分化段階で使用される分化媒体の組成は、表2および以下のステップで説明する。 - 分化培地を調製するには、まず、凍結した小分子および/または成長因子を室温で解凍する。次に、塩基媒体の必要量をアリコートします。最後に、指定された小分子および成長因子を適切な濃度で塩基媒体に添加して最終分化培地を調製する(表2)。
注:作りたての分化媒体は、理想的には同じ日に使用する必要があります。それ以外の場合は4°Cで保存し、3日以内に使用することができます。 - ピペットチップを使用して、分化培地を数回混ぜて、細胞に培地を添加する前にサプリメントが均質に分布していることを確認します(例えば、12ウェルプレートの各ウェルに分化培地の1mLを追加します)。
- 低分子および成長因子に対するストックソリューションを準備するには、メーカーの推奨事項に通してそれらを再構成します。貯蔵のために、凍結融解周期を減らし、-20°Cまたは推奨される状態に保つために無菌管にアリコート。
2. 分化のための定義された密度でプレートにhPSCをシード
- hPSCで播種に使用されるコート細胞培養プラスチック。
- 使用日の前に一晩4°Cでマトリックス(例えば、ゲルトレックス)を解凍します。
- 翌日、500 μLのマトリックスを50mLのコールド・ダルベッコの変性イーグル・ミディアム(DMEM)/F12に加えて、マトリックス1:100を希釈します。マトリックスは室温への曝露時に不可逆的に重合するヒドロゲルであるため、マトリックスを使用する場合は、常にマトリックスチューブとメディアを氷の上に保管してください。
- 注:DMEM/F12に1:100を溶解したマトリックスは4°Cで保存できますが、2ヶ月以内に使用する必要があります。
- 培養プレートをマトリックスでコーティングするには、希釈されたマトリックスを、井戸の表面を覆うのに十分な量のマトリックス溶液を使用して必要な数のウェルにピペットを入れます(例えば、12ウェルプレートの1つの井戸または1mLを6のウェルに1つのウェルに0.5 mLを追加します)ウェルプレート)。必要に応じて、プレートをそっと振って、マトリックス溶液が井戸の底を完全に覆っていることを確認します。
- マトリックスコーティングプレートを37°Cインキュベーターに少なくとも60分間放置します。この温度では、マトリックスが重合し、ウェルの底部に薄膜を形成する。
- 注:マトリックスコーティングプレートは37°Cインキュベーターに保管し、マトリックスが乾燥していない限り3日以内に使用できます。
- hPSCで井戸を播種する直前に、コーティングされた井戸から残りのマトリックス溶液を吸引する。
- hPSCsNOTEでコーティングされたプレートを受け渡し、播種:解離剤には細胞を解離する酵素が含まれており、可能な限り短時間で解離剤にhPSCを残しておくことが重要です。
- 分化前にhPSCを用いたマトリックスコーティング培養プレートをシードするには、メーカーのプロトコルに従って、市販のmTeSR1培地(材料の表)で未分化のhPSCを>70%の合流性に成長させます。hPSCは高い合流点で自発的に区別する可能性があるため、hPSCが完全にコンフルエントになる前にhPSCを通過することが重要です。
注:hPSCは、実験に使用する前に染色体異常がないことを確認するために、核入力する必要があります。この分化プロトコルに使用されるhPSCはmTeSR1メディアで維持され、角球体の異常を最小限に抑えるためにEDTAと共に束として通過した。カリオ典型的に異常なhPSCは、異常に急速に増殖する可能性があるため、分化に使用すべきではありません。したがって、ここで推奨される細胞播種密度は、角界典型的異常細胞には適していません。 - 分化用のhPSCをシードするには、mTeSR1を大部分のコンフルエントhPSC培養プレートから吸引し、市販の解離剤(材料表)を追加してhPSCを解離し、表面を覆うのに十分な解離剤を使用します。細胞が成長している井戸または皿(例えば、12ウェルプレートのウェルあたり0.5mL、6ウェルプレートのウェルあたり1mL、または10cm皿あたり3mL)を加える。
- 解離剤のhPSCを37°Cで5分間、または一部のコロニーが切り離し始めるまでインキュベートします。ウェル/プレートの底を数回ゆっくりとタップします。解離の数分後、ほとんどのhPSCコロニーは自由に懸濁液に入るべきです。
- 解離されたhPSCをプレートから取り除くには、解離剤を希釈するために、6ウェルプレート(または12ウェルプレートで作業する場合は1mL/ウェル)で作業する場合は、DMEM/F12の2 mL/ウェルを追加します。5 mLの血清ピペットを使用して、ウェルの表面からすべての細胞を洗い流すために、上下に何度もゆっくりとピペットを使用します。50 mL円錐形チューブで再懸濁した単一細胞を収集します。すべてのhPSCの回復を確実にするために、同じ量のDMEM/F12でもう一度プレートを洗います。
- 細胞を含む50mL円錐管に、DMEM/F12を添加して解離剤の元の体積を1:5-1:10で希釈する(例えば、解離剤の元の体積が1mLであった場合、DMEM/F12でセル懸濁液の総体積を10mLに調整して希釈する)1:10の解離剤)
- ペレット細胞に4°Cで3分間350 x gで50 mL円錐管で採取したhPSCを遠心分離する。
- 細胞がペレットを待っている間に、hPSCSが播種されるプレートからマトリックスを吸引する。次に、市販のチアゾビビン(薬理学的ROCK阻害剤)の1μMを補充したmTesR1を十分な量を加えてそれらをカバーするウェルをレシピエントウェルに加える(例えば、12ウェルプレートのウェルあたり0.5 mL mTeSR1または6ウェルプレート当たりmTeSR1の1mLを加える)。
注:低濃度のチアゾビビンは、単一細胞生存を高めるためにこのステップに含まれ、したがって、hPSCのその後の播種密度。 - hPSCを遠心分離した後、上清を注意深く吸引し、円錐管の底部にペレットhPSCを残す。上清には、hPSCのその後の接着を阻害する解離剤が含まれており、従って、進行する前に上清の大部分を吸引することが重要である。
- mTeSR1の細胞ペレットを1μMのチアゾビビンで補充する。p1000ピペットを使用して、2~3回穏やかにトリビュートし、細胞ペレットを単一の細胞懸濁液に均等に再懸濁させる。過度の機械的力がhPSCに損傷を与え、細胞生存の低下につながるので、細胞ペレットを過剰にトリチュレートしないでください。
- hPSCを再懸濁した後、直ちに懸濁液の10μLを血球計にピペットし、細胞数を数える。重力は50 mLチューブの底部に自然に沈降し、正確な細胞計数を混同するので、できるだけ早く数えるために細胞をピペットすることが重要です。
- チアゾビビン補充mTeSR1で再懸濁したhPSCの体積を調整し、めっきのための所望の細胞濃度を達成する。例えば、再懸濁されたhPSCの体積を調整した後、12ウェルプレートの各ウェルに160,000-250,000セルを種子に1ウェルあたり0.5mLのセル懸濁液を加え、各ウェルで1mLの総体積を達成する(ステップ2.2.7でウェルに0.5mLの培地を添加した)。 大きいまたは小さい井戸を使用している場合は、それに応じてセル番号/メディアボリュームを拡大または縮小します。
注:示された細胞密度でhPSCを播種することが重要です。過度にコンフルエントな hPSC は効率的に区別せず、コンフルエントでない hPSC は分化中にうまく生き残れるでしょう。 - クロスパターン(左、右、前方、後方)でプレートを数回振り、細胞がプレート/ウェル全体に均等に分布していることを確認します。セルがプレート/ウェルの中心に落ち着くように、円形の動きでプレートを旋回しないでください。通常、hPSCは約3〜30分以内にウェルの表面に付着し始め、分化を開始する前に少なくとも24時間細胞が成長することを許可する。
- 分化前にhPSCを用いたマトリックスコーティング培養プレートをシードするには、メーカーのプロトコルに従って、市販のmTeSR1培地(材料の表)で未分化のhPSCを>70%の合流性に成長させます。hPSCは高い合流点で自発的に区別する可能性があるため、hPSCが完全にコンフルエントになる前にhPSCを通過することが重要です。
3. 内皮細胞と肝臓前駆体へのhPSCの分化
- hPSCを少なくとも24時間(ステップ2.2.12に記載)めっきした後、分化を進める前に、メッキされたhPSCコロニーの直径と密度に特に重点を置いて、位相コントラスト顕微鏡下の細胞の形態を確認してください。
注:理想的には、束は容易に間隔をあけ、ステップ 3.2 の前にウェル全体で適切なサイズと密度を持つ必要があります。hPSC の大きな (約 >400 μm) または小さなコロニー (約 <200 μm) は、分化には使用できません (図4)。分化信号は、大規模なhPSCコロニー全体で均等に作用せず、非効率的な分化につながります。小さすぎるコロニーは、この分化プロトコルにおけるhPSC分化の最初の3日間はうまく生き残れない。シードhPSCの密度が正しい場合、hPSCコロニーはしばしばそれらの間の細胞の「ブリッジ」を形成し、全体的な合流点は1日目の分化媒体を加える前に〜30〜50%になります(図4)。 - コロニーサイズがステップ3.1で理想的な場合は、hPSCを前原始ストリーク(APS)に分化させる分化の1日目に進みます。
- CDM 2(表1およびセクション1.2)をベース媒体として使用して、表2に概説されているすべての試薬を混合して1日目のAPS分化媒体を調記します。ピペットは、メディア内のコンポーネントの均等な分布を確保するために、数回混合します。
- チアゾビビンをメッキされたhPSCからmTeSR1を補充し、IMDMメディアでhPSCを短時間洗浄する吸引を行う。PBSはカルシウムイオン(Ca2+)を欠いているため、IMDMの代わりにリン酸緩衝生理食塩分(PBS)で洗浄しないでください。それは細胞の形態を破壊します。
- 短いIMDM洗浄の後、hPSCに1日目の培地を追加します。時間を記録し、細胞を37°Cインキュベーターに戻す
- その後の分化工程を続けて(表2)、それぞれの分化媒体を各日(24時間間隔)の細胞に加えて、その日の同じ時刻に分化する(図1)。差別化の連続した日が同じ分化メディアを使用している場合でも、毎日新鮮なメディアに置き換えます。メディアの変更の間に、IMDMメディアで細胞を一度洗って、死んだ細胞と以前の培地成分の残骸を除去する。
- 分化が肝臓芽の段階を超えて進行するにつれて、細胞数が増加し、したがって、分化因子と栄養素の量が制限されていないことを確認するために、プレートの各ウェルにより多くの培地を追加します。例えば、分化の1日目から6日目に12ウェルの各ウェルに1mL分化媒体を加えるが、その後の分化媒体の1.5〜2mLを後日分化(分化の7日目〜18日目)に加える。
4. 免疫染色による内皮細胞と肝前駆体の特徴付け
- ブロッキングバッファーを調圧する: 10% ロバ血清 + 0.1% トリトン X100 脱イオンリン酸緩衝生理食生 (DPBS) で.
- 染色バッファーを調剤する: 1% ロバ血清 + 0.1% トリトン X100 DPBS.
- 12ウェルプレートの細胞から培地を吸引する。
- 室温で15分間4%のパラホルムアルデヒド(DPBS)を加え、細胞を固定し、DPBSで細胞を2回洗浄します。
- 室温で1時間のブロッキングバッファを追加し、固定細胞をブロックして透過させます。
- ブロッキング溶液を吸引し、染色バッファーで希釈した一次抗体を添加する。(抗体の希釈比については、材料の表を参照してください。
- 細胞を4°Cで一晩染色する。
- DPBSで0.1%のトリトンX100で細胞を3回洗います。
- 室温で1時間の染色バッファーに二次抗体染色を加える。(二次抗体の希釈については、材料の表を参照してください。
- 二次抗体を取り出し、室温で5分間DAPIを加えて核カウンターステインを行う。
- DPBSで0.1%のトリトンX100で2回洗浄し、過剰な抗体とDAPIを除去します。
- ツァイスオブザーバーD1で蛍光顕微鏡を行う。あるいは、画像化が行われるまで4°Cでプレートを貯蔵する。期待される結果については、図 3を参照してください。
5. 蛍光活性化細胞選別(FACS)分析による肝前駆体の特性解析
注:FACS を使用して、分化の 6 日目までに出現する AFP+ 分化 LB 細胞の割合を正確に定量化します。同じ手順に従って、分化の 18 日目までに ALB+ 分化肝細胞の割合を定量化します。
- 抗AFP抗体を結合する。
- R-フィコエリスリンコンジュゲーションキットを使用して(0.55 μg/μL)の濃度で抗AFP抗体にR-フィコエリスリンを添加する(材料の表を参照)。
注:抗体が精製され、アミンを含まないバッファーで再構成されていることを確認します。標識反応に使用される抗体の量がPEの量より少なくなければならないことを確認してください(すなわち、PEの100 μgを持つ抗体の60 μg)。抗体の結合が不十分な場合、信頼できない結果を招く可能性があります。 - 標識する抗体の10 μLに対して修飾剤の1 μLを添加する。穏やかに混ぜます。
- R-PEミックス(100μL)を取り出し、上記の混合物を凍結乾燥R-PE材料に直接ピペットします。
- キャップを後ろに置き、室温で暗闇の中で3時間立ったバイアルを残します。
- 3時間以上インキュベートした後、使用する抗体の10μLに対して1μLのクエンチャー試薬を添加する。コンジュゲートは30分後に使用できます。
- 共役抗体を4°Cに保存します。
- DMEM/F12で6ウェル形式で差別化または未分化のhPSCを洗浄します。
- 細胞が剥離するまで室温で5分間解離剤(6ウェルプレートで1mL/ウェル)で簡単に治療します。未分化hPSCと分化した肝前駆細胞の両方を同一に収穫・染色し、同じ実験で並行して分析し、抗体染色の特異性を確保します。
- ペトリ皿を軽くタップして、細胞を取り外します。p1000ピペットを使用して、プレートから細胞を取り外し、50 mL円錐形チューブで細胞を集集えます。次の手順に進む前に、セルが主にデタッチされていることを確認します。その後、残留細胞を収集するために1xDPBSバッファでウェルを2回洗浄します。
- 50mL円錐管では、1x DPBSバッファーの約5体で解離剤を希釈する。p1000ピペットで厳密に3〜4回トリビュートし、すべての細胞が単一の細胞に解離されることを確認します。
注:遠心分離または束の前に単一の細胞を生成することが不可欠であり、その後容易に解離することはできません。ただし、これは細胞の完全性を損なう可能性があるため、過度にトリチュレートしないでください。細胞数を数え、抗体比に対する細胞の推奨比率を使用します。 - 4°Cで5分間300 x gの細胞懸濁液を含有する遠心分離管。
- 細胞ペレットを邪魔しないように注意して上清を吸引する。
- 固定/パーマバッファーでセルペレットを徹底的に再懸濁し、単一細胞懸濁液を生成し、20分間4°Cで氷上に固定し、2mLマイクロセントリフュージチューブに転送します。さらに、このステップで2mLのマイクロ遠心管を使用すると、細胞ペレットがチューブのV字型コーナーに堆積し、洗時時の細胞損失を最小限に抑えます。
- 各ペレットを1.8mLのパーマ/ウォッシュバッファーで2回洗浄します。p1000ピペットで6回混合してパーマ/ウォッシュバッファーで細胞ペレットを完全に再中断します。次に、遠心分離機を上清を取り出し、パーマ/ウォッシュバッファーの1.8 mLで洗浄プロセスを繰り返します。
- パーマ/ウォッシュバッファーにセルペレットを再懸濁させ、100 μL/個状汚れがあり、その後、細胞懸濁液を2mLマイクロセントリフュージチューブに移します。
注:抗体染色の前に、この工程で単細胞懸濁液を生成することが不可欠です。細胞の凝集体は染色されず、FACS分析を混乱させる。さらに、このステップで2mLのマイクロ遠心管を使用すると、細胞ペレットがチューブのV字型コーナーに堆積し、洗時時の細胞損失を最小限に抑えます。 - FACSバッファー内の細胞を再中断した後、それらを個々の2 mLチューブ(無染色対照および抗体染色サンプルの両方)にアリコートします。
- 暗闇の中で室温で30分間、150,000細胞あたり0.33 μLの抗AFP-PEで染色します。例えば、100μLの個別染色の場合、次のように染色:a-AFP PEの0.33 μLおよびパーマ/ウォッシュバッファーの100 μL。p200ピペットでよく細胞を再中断し、染色も確実にします。
注:これは、タンパク質の安定性を低下させる可能性があるため、ピペットミックスと渦をしないでください。 - パーマ/ウォッシュバッファー(1.9 mL/個汚れ)の1-2 mLで細胞を2回洗い直し、遠心分離機を800 x gで4°Cで5分間洗い直します。十分な洗浄を確保するために、パーマ/洗浄バッファーの1-2 mL以上で細胞を洗浄します。
注:これは、タンパク質の安定性を低下させる可能性があるため、ピペットミックスと渦をしないでください。遠心分離後、細胞が脱落するのを防ぎ、抗体の持ち越しを最小限に抑え、より完全な洗浄を確実にするために、細胞が脱落するのを防ぐために、上清を注意深く吸引します。 - 各洗浄ペレットをパーマ/ウォッシュバッファーの 300 μL で再ステースし、100 μm フィルターを通して FACS チューブにひずみ、FACS 分析の前に大きな細胞の塊をひずみます。
- PEチャネル上のFACSアリアフローサイトメトリー上の細胞を分析します。個々の染色ごとに最低 10,000 個のイベントを分析し、FSC-A/SSC-A 分析によってイベントを解析し、FSC-W/FSC-H にゲーティングしてセルシングルを選択し、続いて SSC-H/SSC-W を解析します。
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Representative Results
APS分化の24時間後、コロニーは一般的にhPSCコロニーを囲む明るい境界線の喪失と伴う未分化コロニーとは異なる形態を採用する。形態学的に、原始的な筋細胞は一般的に不規則な境界線を有し、hPSCよりも広がり、よりコンパクトで低い-これは多能性エピブラスト細胞が分化し、原始に入るように上皮間葉転移の刺激である生体内のストリーク。分化前のhPSCのコロニーサイズが大きすぎると、未分化細胞を含むあからに発生した中心が存在します。このような大きな塊を含む培養物は、これらの未分化コロニーセンターが後続の分化を混乱させるので、廃棄する必要があります。正しいサイズと密度の塊がめっきされた場合、APS分化は非常に再現性が高く均一であり、99.3±0.1%MIXL1-Gfp+原始ストリーク集団を生成する(MIXL1は原始的な筋マーカーである)7。APS分化の24時間後に一部の細胞死が観察される。
分化の2日目までに、原始的な筋細胞は2日目の決定的な内皮細胞に分化し、その大部分はSOX17(図2)およびFOXA2を発現する。14 hESCおよびhiPSCライン(H1、H7、H9、HES2、HES3、BJC1、BJC3、HUF1C4およびHUF58C4を含む)を用いた数十の独立した実験において、このアプローチは、一貫して効率的に生成された純粋な決定的子宮内視集団(94.0%±3.1%)である。hPSCから決定的な内皮を生成するこの方法は、CXCR4+PDGFRA-内皮形成アプローチ2、14と比較して、より高い割合を生み出す。
分化の3日目までに、内皮は多角形の形状に見える前腸前駆体に分化している(図1)。その後、6日間の分化により、前駆子はAFP、TBX3、およびHNF4A(図3)を発現する肝芽前駆子に分化する。3つのhESCライン(H1、H7、H9 HESC)にわたって、この方法は89.0±3.1%の効率で6日目のAFP+肝前駆体形成を生成する(図2)。最後に、hPSCからの肝臓分化の18日後に、ALBUMIN+肝細胞様細胞が現れる。形態学的には、それらは上皮的に見え、胆汁カナリキュリを連想させる明るい境界線を形成する(図1)。この段階では、18 hPSC由来肝細胞の細胞質が核よりも暗く見える(図1)。
図1:未分化hPSCの分化戦略と形態の概略図、内皮および肝細胞様細胞の分化。分化プロセスとタイムラインを示した。略語:d=日、hPSC=ヒト多能性幹細胞、APS=前原始筋、DE=確定子宮内膜、PFG=後前駆体、LB=肝芽前駆体、HP=肝細胞前駆体、HEP=肝細胞様細胞。スケールバー = 400 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:1日目MIXL1+原始ストリーク、2日目SOX17+決定的(def)内皮、6日目AFP+肝芽前駆体およびALB+肝細胞集団の割合はFACSによって示される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:6日目の肝前駆者の免疫染色分析hPSCは、最初に肝芽転写因子HNF4A(赤)、TBX3(緑色)ならびに細胞質肝芽マーカーAFP(赤)のために免疫染色された肝芽前駆者に分化した。核は、総細胞数を評価するためにDAPI(青)で逆染色した。スケールバー = 50 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:hPSCの細胞播種密度。シードされた細胞の低(左)と適切な(中央と右)密度。スケールバー = 1,000 μm。矢印は、セルのコロニー間の「橋」を指します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ベースメディア | ベース培地の組成 |
| CDM2 | 1:1 IMDM/F12, 0.1% m/v PVA, 1% 濃縮脂質, 0.7 μg/mL ヒト組換えインスリン, 15 μg/mL トランスフェリン, 18 nM 1-チオグリセロール |
| CDM3 | 1:1 IMDM/F12, 0.1% m/v PVA, 1% 濃縮脂質, 10% KOSR |
| CDM4 | 1:1 IMDM/F12,1%濃縮脂質,15 μg/mL トランスフェリン |
| CDM5 | CMRL, 10% KOSR, 1% グルタマックス |
表1:化学的に定義された媒体CDM2、CDM3、CDM4、およびCDM5の組成。
| 差別化段階 | 期間 | 要因 | 用量 | ベースメディア |
| 1日目 プリミティブストリーク | 1 日 | アクチビン | 100 ng/mL | |
| チル99201 | 3 μM | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nM | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| 2日目 決定的な内因性 | 1 日 | アクチビン | 100 ng/mL | |
| DM3189 | 250 nM | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nM | |||
| 3日目 後のフォレガット | 1 日 | A83-01 | 1 μM | |
| TTNPB | 75 nM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| 6日目 肝芽前駆者 | 2 日間 | アクチビン | 10 ng/mL | |
| C59 | 1 μM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| フォルスコリン | 1 μM | |||
| 1 日 | アクチビン | 10 ng/mL | ||
| チル99201 | 1 μM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| フォルスコリン | 1 μM | |||
| 12日目肝前駆者 | 6 日間 | BMP4 | 10 μg/mL | |
| Osm | 10 ng/mL | |||
| デキサメタゾン | 10 μM | |||
| フォルスコリン | 10 μM | CDM4 | ||
| ロ4929097 | 2 μM | |||
| AA2P | 200 μg/mL | |||
| インスリン | 10 μg/mL | |||
| 18日目 肝細胞 | 6 日間 | デキサメタゾン | 10 μM | |
| フォルスコリン | 10 μM | CDM4 または | ||
| ロ4929097 | 2 μM | CDM5 | ||
| AA2P | 200 μg/mL | |||
| インスリン | 10 μg/mL |
表2:分化媒体の構成
| 問題 | 考えられる理由 | 提供されるソリューション |
| コロニーの中心にある細胞は分化しない | i) コロニーサイズが過度に大きかった場合、大きなコロニーの中央の細胞は分化信号にアクセスできなかった | i) セルカウント技術を確認します。 |
| ii) 井戸の中心(またはその周辺)で一緒に合併した塊の不均一な分布、非常に大きなコロニーを形成する | ii) プレートをクロス方で振り、めっき中に塊を均等に分配し、インキュベーターに入れる前に顕微鏡で確認する | |
| iii) 細胞が不十分な分化信号を受け取った | iii) 分化媒体の十分な量を追加する:12ウェルプレートに1mLの培地を追加し、6ウェルプレートにウェルあたり3mLを追加します。 | |
| 差別化の効率が悪い | i) 細胞培養を部分的に分化開始 | i) 未分化のhPSCの新しい高品質バッチを使用する |
| ii)コロニーはあまりにも密に播種され、細胞のコンフルエントシートを形成した | ii)種子細胞と分化のために細胞を正確にカウントし、それらを分配するために均等に振る | |
| iii) 残留媒体および不要な信号は、不十分な洗浄のために洗い流されなかった | iii) 分化の前の段階からの残留mTeSR1または誘導媒体は、差別化をブロックします。分化媒体を追加する前にIMDMで細胞を洗浄する | |
| iv)洗濯が過酷すぎる。不適切な洗浄条件は細胞形態を著しく破壊する | iv) どちらかの分化媒体を追加する前に、IMDMで簡単に洗浄してください。DPBS(または異なる浸透性または冷媒を有する媒体)または拡張洗浄の使用は、細胞形態と生存率を損なう | |
| v) 分化段階の期間が長くなったり短くなったりする場合は、推奨値よりも長く、または短い。 | v) 差別化の各段階の推奨タイミングに従います。 |
表 3: 潜在的な問題とその考えられる原因と解決策。
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Discussion
この方法は、hPSCから肝臓芽前駆体、および続いて肝細胞様細胞の濃縮集団の生成を可能にする。ヒト肝細胞の濃縮集団を生成する能力は、このような細胞の実用的な利用のために重要である。hPSCから肝細胞を生成する以前の方法は、げっ歯類への移植時に、肝臓組織15に加えて骨および軟骨を得た肝臓および非肝細胞の両方を含む不純な細胞集団を得た。したがって、非肝臓分化の明示的な抑制は、様々なアプリケーションに適している可能性のある豊かな肝臓集団を生成するために重要です。
特に、最初のステップでhPSCの制御されためっきは、効率的な下流の差別化のために不可欠です。分化のために一定の密度でhPSCを正確にプレートし、めっきの過程でこれらのhPSCをウェルまたはプレートに均等に分配することが重要です。たとえば、12ウェルプレートの各ウェルについて、1ウェル当たり160,000~250,000 hPSCをシードします。全体的に、細胞種分密度をツチレートし、最終的に各細胞株に適した細胞密度をテストすることが不可欠です(図4)。ウェルごとにシードされる hPSC が多すぎると、大きなコロニーが形成され、大きなコロニーの中央の細胞が周辺の細胞と比較して分化信号にアクセスしにくいため、分化効率に悪影響を及ぼします。異種サイズのコロニーも同様の問題を提示します。細胞密度が低すぎる場合(例えば、12ウェルプレートの200,000細胞/ウェル以下)、分化のための十分な材料が存在しない可能性があり、広範な細胞死が観察される可能性があります。上述のパッセージングおよびシード方法は、下流の分化に適したサイズのhPSC塊を一貫して生成する。
この方法の1つの制限は、hPSC由来細胞が未成熟な肝臓マーカーAFPを発現するように、生成された肝細胞様細胞が成人肝細胞と同一ではないというものである。また、CYP3A4酵素活性は、これらのhPSC由来肝細胞様細胞において、原発性成人ヒト肝細胞と比較して約55倍低い。今後の課題は、これらのhPSC由来肝細胞様細胞を本格的な成体様細胞に成熟させることです。第2の制限は、効率的な分化は細胞の開始密度に非常に依存するため、推奨密度で播種し、プレート全体に均等に分散させることが非常に重要である(表3)。
全体的に、このプロトコルは、少なくとも3つのhPSCラインで89.0±3.1%の純度で肝芽前駆体および肝細胞様細胞を産生する。第二に、肝細胞様細胞は肝酵素を発現し、ヒトALBUMINを分泌し、現存する分化アプローチを用いて生成された細胞よりも高いレベルの肝遺伝子を発現した。最後に、結果として得られ得る肝細胞様細胞は、インビトロで特定の肝細胞機能を示すだけでなく、最も重要なことは、慢性肝損傷のマウスモデルを生着させ、短期的な生存率を改善することができるので、生体内にある程度機能することができる2.
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
我々は、Bingリムに対する議論と、インフラ支援のための幹細胞生物学&再生医療スタンフォード研究所に感謝します。この研究は、カリフォルニア再生医療研究所(DISC2-10679)とスタンフォードUCバークレーシーベル幹細胞研究所(L.T.A.およびK.M.L.)とスタンフォードベックマン分子遺伝医学センターと匿名によって支援されました。バクスターとディジェノバの家族(K.M.L.へ)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| Human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| Human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| Human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
References
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