Summary
Denne protokollen detaljer en monolag, serum-fri metode for å effektivt generere hepatocytter celler fra humant Pluripotent stamceller (hPSCs) i 18 dager. Dette medfører seks trinn som hPSCs sekvensielt differensiere til mellomliggende celle-typer som primitive strek, definitive endoderm, bakre foregut og lever knopp forfedre før forming hepatocytter celler.
Abstract
Leveren detoxifies skadelige stoffer, utskiller vitale proteiner, og utfører viktige metabolske aktiviteter, og dermed opprettholde livet. Følgelig leversvikt-som kan være forårsaket av kronisk alkoholinntak, hepatitt, akutt forgiftning, eller andre fornærmelser-er en alvorlig tilstand som kan kulminere i blødning, gulsott, koma, og til slutt død. Men tilnærminger til behandling leversvikt, samt studier av leverfunksjon og sykdom, har vært stymied delvis av mangelen på en rikelig tilførsel av menneskelig leverceller. For dette formål, denne protokollen detaljer effektiv differensiering av menneskelige Pluripotent stamceller (hPSCs) i hepatocytter celler, guidet av en utviklingsmessige veikart som beskriver hvordan leveren skjebne er angitt over seks påfølgende differensiering trinn. Ved å manipulere utviklingsmessige signalering veier for å fremme leveren differensiering og eksplisitt undertrykke dannelsen av uønsket celle skjebne, denne metoden genererer effektivt bestander av menneskelig lever knopp forfedre og hepatocytter-lignende celler ved dager 6 og 18 av PSC differensiering, henholdsvis. Dette oppnås gjennom den timelig-presise kontrollen av de utviklingsmessige signal banene, som utøves av små molekyler og vekstfaktorer i et serum fritt kultur medium. Differensiering i dette systemet oppstår i monolagere og gir hepatocytter-lignende celler som uttrykker karakteristiske hepatocytter enzymer og har evnen til å engraft en mus modell av kronisk leversvikt. Evnen til å effektivt generere et stort antall menneskelige leverceller in vitro har forgreninger for behandling av leversvikt, for narkotika screening, og for mekanistisk studier av leversykdom.
Introduction
Formålet med denne protokollen er å effektivt differensiere menneskelige Pluripotent stamceller (hPSCs) i beriket bestander av lever knopp forfedre og hepatocytter celler2. Tilgang til en klar tilførsel av menneskelig leveren forfedre og hepatocytter-lignende celler vil akselerere arbeidet med å undersøke leveren funksjon og sykdom og kan aktivere nye cellulære transplantasjon terapi for leversvikt3,4, fempå. Dette har vist seg utfordrende i det siste siden hPSCs (som inkluderer embryonale og indusert Pluripotent stamceller) kan differensiere til alle celle-typer av menneskekroppen; Følgelig har det vært vanskelig å bare differensiere dem til en ren befolkning av en enkelt celle-type, for eksempel leverceller6.
For å nøyaktig differensiere hPSCs til leverceller, først er det avgjørende å forstå ikke bare hvordan leverceller er spesifisert, men også hvordan ikke-leveren celle-typer utvikle. Kunnskap om hvordan ikke-leverceller utvikler er viktig å logisk undertrykke dannelsen av ikke-leveren linjene under differensiering, og dermed utelukkende guiding hPSCs mot en lever skjebne2. For det andre er det viktig å avgrense flere utviklingsmessige trinn der hPSCs skille mot en lever skjebne. Det er kjent at hPSCs sekvensielt differensiere til flere celle-typer kjent som primitive strek (APS), definitive endoderm (DE), bakre foregut (PFG) og lever knopp forfedre (LB) før forming hepatocytter celler (HEP). Tidligere arbeid avslørte signalene spesifiserer leveren skjebne og signalene som undertrykte dannelsen av alternative ikke-leveren celle-typer (inkludert mage, bukspyttkjertel, og intestinal forfedre) på hver utviklingsmessige avstamning valg2, 7 andre er , 8i den.
Kollektivt, har disse innsikt gitt opphav til en serum-fri, monolag metode for å differensiere hPSCs mot primitive strek, definitive endoderm, bakre foregut, lever knopp forfedre og til slutt, hepatocytter-lignende celler2. Samlet metoden innebærer seeding i hPSCs i en monolag på en passende tetthet, forbereder seks cocktails differensiering Media (som inneholder vekstfaktorer og små molekyler som regulerer ulike utviklingsmessige signalering trasé), og legge til disse mediene sekvensielt for å indusere differensiering i løpet av 18 dager. Under prosessen er det ikke nødvendig med passaging av celler. Av notatet, fordi denne metoden eksplisitt inkluderer signaler som undertrykker dannelsen av ikke-leveren celle-typer, denne differensiering tilnærming1 mer effektivt genererer leveren forfedre og hepatocytter-lignende celler ved sammenligning til bevarte differensiering metoder2,9, 10,11,12. Videre gjør protokollen som er beskrevet i denne teksten, raskere generering av hepatocytter som til slutt uttrykker høyere nivåer av hepatic transkripsjon faktorer og enzymer enn de som er produsert av andre protokoller9,10 , 11 flere , Det er 12.
Protokollen er beskrevet her har visse fordeler fremfor dagens differensiering protokoller. Først innebærer det monolag differensiering av hPSCs, som er teknisk enklere i forhold til tredimensjonale differensiering metoder, slik som de som er avhengige av embryoid organer13. For det andre utnytter denne metoden en fersk forhånd der definitive endoderm celler (en tidlig forløper til leverceller) kan være effektivt og raskt generert innen 2 dager hPSC differensiering2,7, og dermed aktivere den påfølgende produksjon av hepatocytter med økt renhet. Tredje, i sidestilte sammenligninger, den hepatocytter-lignende celler produsert av denne metoden2 produsere mer ALBUMIN og uttrykke høyere nivåer av hepatic transkripsjon faktorer og enzymer i forhold til hepatocytter produsert i andre metoder10, 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av differensiering Media
Merk: Se tabellen over materialer for produsent informasjon om materialer og reagenser som brukes.
-
Tilberedning av basis kjemisk definerte medier (CDM)
Merk: CDM2, CDM3, CDM4 og CDM5 er kjemisk definerte medier som brukes som base medier for å skille hPSCs til leverceller på ulike stadier. Sammensetningen av disse mediene finnes i tabell 1.- For å gjøre CDM2 eller CDM3, utarbeide en lagerløsning som inneholder polyvinylklorid (PVA). Oppløse 0,5 g av PVA pulver i 50 mL av Iscove ' s modifisert Dulbecco ' s medium (IMDM) for å generere en 10 mg/mL PVA lager.
Merk: Siden PVA ikke oppløses lett, forberede PVA/IMDM blandingen i en konisk kolbe med kontinuerlig omrøring ved ~ 50 ° c på en oppvarming pad; kan enkelt oppnås ved hjelp av en magnetisk rører. - Etter PVA er homogent oppløst i IMDM, fjerne PVA løsningen fra varmeputen og la den avkjøles til romtemperatur.
- Bruk et sterilt filter på 0,2 μm til å filtrere PVA-løsningen.
- Forbered CDM2 og CDM3 ved å kombinere den filtrerte PVA fra trinn 1.1.1 og ulike kommersielt kjøpte komponenter som beskrevet i tabell 1 og materialfortegnelsen. Bruk sterile filter enheter av 0,2 μm til å filtrere alle medier.
Merk: Base medium kan oppbevares ved 4 ° c, men ikke lenger enn 2 måneder. - Klargjør de resterende base mediene CDM4 og CDM5 følgende tabell 1.
- For å gjøre CDM2 eller CDM3, utarbeide en lagerløsning som inneholder polyvinylklorid (PVA). Oppløse 0,5 g av PVA pulver i 50 mL av Iscove ' s modifisert Dulbecco ' s medium (IMDM) for å generere en 10 mg/mL PVA lager.
-
Utarbeidelse av differensiering Media
- For å forberede lager løsninger for de små molekylene og vekst faktorene, Rekonstituer dem i henhold til produsentens anbefalinger. For lagring, alikvot i sterile rør for å redusere fryse-tine sykluser og holde på-20 ° c eller som anbefalt.
Merk: Sammensetningen av differensiering medium som skal brukes på ulike differensiering stadier er beskrevet i tabell 2 og i følgende trinn. - For å forberede differensiering medium, først tine de frosne små molekyler og/eller vekstfaktorer ved romtemperatur. Deretter alikvot ut den nødvendige mengden av base medium. Til slutt klargjør du det endelige differensiering ved å legge til de spesifiserte små molekylene og vekst faktorene i basis mediet i de aktuelle konsentrasjonene (tabell 2).
Merk: Ferskt forberedt differensiering medium bør ideelt sett brukes på samme dag; ellers kan den oppbevares ved 4 ° c og brukes innen tre dager. - Bruk en pipette spissen, bland differensiering medium flere ganger for å sikre kosttilskudd er homogent distribueres før du legger til medium til cellene (f. eks, tilsett 1 mL differensiering medium til hver brønn av en 12-brønn plate.)
- For å forberede lager løsninger for de små molekylene og vekst faktorene, Rekonstituer dem i henhold til produsentens anbefalinger. For lagring, alikvot i sterile rør for å redusere fryse-tine sykluser og holde på-20 ° c eller som anbefalt.
2. Seed hPSCs på plater på definerte tettheten for differensiering
- Coat cellekultur plast som skal brukes for seeding med hPSCs.
- Tin matrisen (f.eks. Geltrex) ved 4 ° c over natten før bruks dagen.
- Neste dag, fortynne matrisen 1:100 ved å legge til 500 μL av matrisen i 50 mL kaldt Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium (DMEM)/F12. Siden matrisen er en hydrogel som irreversibelt polymeriseres ved eksponering for romtemperatur, når du arbeider med matrisen, alltid holde matrise rør og Media på isen.
- Merk: Matrisen oppløst 1:100 i DMEM/F12 kan oppbevares ved 4 ° c, men bør brukes innen 2 måneder.
- Å belegge en kultur tallerken med matrisen, pipette den fortynnede matrisen i det nødvendige antall brønner med akkurat nok volum av matrise løsning for å dekke overflaten av brønnen (for eksempel legge 0,5 mL matrise til en brønn av en 12-brønn plate eller 1 mL til en brønn av en 6- brønn plate). Hvis nødvendig, riste platen forsiktig for å sørge for at matrisen løsningen har fullt dekket bunnen av brønnen.
- La Matrix-belagt plate i en 37 ° c inkubator i minst 60 min. Ved denne temperaturen, matrisen polymeriseres å danne en tynn film på bunnen av brønnen.
- Merk: Matrix-belagt plater kan oppbevares i 37 ° c inkubator og brukes innen 3 dager så lenge matrisen ikke har tørket opp.
- Aspirer den resterende matrise løsning fra belagte brønner umiddelbart før seeding brønnene med hPSCs.
- Passaging og seeding belagt platene med hPSCsNOTE: den dissosiasjon agenten inneholder enzymer som distansere celler og det er viktig å forlate hPSCs i dissosiasjon agent for så kort av et tidsrom som mulig.
- Å seedet matrise-belagt kultur plater med hPSCs før differensiering, vokse udifferensierte hPSCs til > 70% confluency i kommersielt tilgjengelig mTeSR1 medium (tabell over materialer) i henhold til produsentens protokoll. Det er avgjørende å passasje hPSCs før de blir fullt confluent, som hPSCs kan spontant skille ved høye samløpet.
Merk: hPSCs må være karyotyped for å sikre at det ikke er noen kromosom unormalt før du bruker dem for eksperimenter. Den hPSCs brukes til denne differensiering protokollen ble opprettholdt i mTeSR1 Media og passert som klumper med EDTA for å minimere karyotypic unormalt. Karotypisk-unormal hPSCs bør ikke brukes til differensiering, da de kan spre unormalt raskt; Dermed er celle-seeding tettheten anbefalt her ikke egnet for karotypisk-unormale celler. - Å seedet hPSCs for differensiering, aspirer mTeSR1 fra stor grad-confluent hPSC kulturer plate og legge kommersielt kjøpt dissosiasjon agent (tabell av materialer) for å distansere den hPSCs, bruker akkurat nok dissosiasjon agent til å dekke overflaten av brønn eller rett som cellene vokser (f. eks, tilsett 0,5 mL av dissosiasjon middel per brønn av en 12-brønn plate, 1 mL per brønn av en 6-brønn plate eller 3 mL per 10 cm parabol).
- Ruge hPSCs i dissosiasjon-agenten ved 37 ° c i 5 min eller til noen kolonier begynner å løsne. Trykk forsiktig på bunnen av brønnen/platen flere ganger; etter flere minutter med dissosiasjon, de fleste hPSC kolonier bør fritt komme i suspensjon.
- For å løsne dissosiert hPSCs fra platen, tilsett 2 mL/brønn av DMEM/F12 hvis du arbeider med en 6-brønn plate (eller 1 mL/brønn hvis du arbeider med en 12-brønn plate) for å fortynne dissosiasjon middel. Bruk en 5 mL serologisk pipette for å forsiktig pipette opp og ned flere ganger for å vaske av alle cellene fra overflaten av brønnen; samle resuspendert enkeltceller i et 50 mL konisk rør. Vask platen en gang til med samme volum på DMEM/F12 for å sikre gjenvinning av alle hPSCs.
- Til 50 mL konisk rør som inneholder cellene, tilsett DMEM/F12 for å fortynne det opprinnelige volumet av dissosiasjon agent ved 1:5-1:10 (f. eks, hvis det opprinnelige volumet av dissosiasjon agent var 1 mL, justere det totale volumet av celle suspensjon til 10 mL med DMEM/F12 å fortynne den dissosiasjon agent på 1:10)
- Sentrifuger de innsamlede hPSCs i et 50 mL konisk rør ved 350 x g i 3 min ved 4 ° c til pellet celler.
- Mens du venter på at cellene til pellets, aspirer matrise fra platen der hPSCS vil bli sådd. Deretter legger du tilstrekkelige mengder mTesR1 supplert med 1 μM av kommersielt oppnådde thiazovivin (en farmakologisk ROCK inhibitor) til mottaker brønner for å dekke dem (for eksempel legge til 0,5 mL mTeSR1 per brønn av en 12-brønn plate eller 1 mL mTeSR1 per brønn av en 6-brønn plate).
Merk: Thiazovivin på en lav konsentrasjon er inkludert på dette trinnet for å forbedre enkelt celle overlevelse og dermed den påfølgende seeding tettheten av hPSCs. - Etter sentrifugering hPSCs, nøye aspirer supernatanten, forlater pelleted hPSCs på bunnen av den koniske røret. Den supernatanten inneholder dissosiasjon agent som vil hemme påfølgende vedheft av hPSCs og dermed er det viktig å aspirer det store flertallet av supernatanten før du fortsetter.
- Resuspend celle pellet i mTeSR1 supplert med 1 μM thiazovivin. Med en P1000 pipette, forsiktig triturate 2-3 ganger for å jevnt resuspend cellen pellet i en enkelt celle suspensjon. Ikke over-triturate cellen pellet som overdreven mekanisk kraft vil skade hPSCs og føre til dårlig celle overlevelse.
- Etter blanding av hPSCs umiddelbart pipette 10 μL av suspensjonen til en hemocytometer og telle antall celler. Det er viktig å Pipetter celler for telling så raskt som mulig, som tyngdekraften vil føre til hPSCs naturlig settling i bunnen av 50 mL røret, som vil forvirre nøyaktig celle telling.
- Juster volumet på resuspendert hPSCs med thiazovivin-supplert mTeSR1 for å oppnå ønsket celle konsentrasjon for plating. For eksempel, etter å ha justert volumet av resuspendert hPSCs, tilsett 0,5 mL av celle suspensjonen per brønn til frø 160000-250000 celler i hver brønn av en 12-brønn plate, og dermed oppnå et samlet volum på 1 mL i hver brønn (0,5 mL Media ble lagt til brønnen i trinn 2.2.7). Hvis det brukes større eller mindre brønner, skalerer du celle tall/medie volumer opp eller ned tilsvarende.
Merk: Det er viktig å frø hPSCs ved indikert celle tetthet. Overdrevent-confluent hPSCs vil ikke skille effektivt og under-confluent hPSCs vil ikke overleve godt under differensiering. - Rist platen i et kryssmønster (venstre, deretter til høyre; fremover, og deretter bakover) flere ganger for å sikre at cellene er jevnt fordelt over platen/brønnen. Ikke virvel platen i en sirkulær bevegelse, som cellene vil bosette seg i midten av tallerkenen/brønnen. Vanligvis vil hPSCs begynne å følge overflaten av brønnen innen ~ 3-30 min. Tillat at cellene vokser i minst 24 timer før du starter differensiering.
- Å seedet matrise-belagt kultur plater med hPSCs før differensiering, vokse udifferensierte hPSCs til > 70% confluency i kommersielt tilgjengelig mTeSR1 medium (tabell over materialer) i henhold til produsentens protokoll. Det er avgjørende å passasje hPSCs før de blir fullt confluent, som hPSCs kan spontant skille ved høye samløpet.
3. differensiering av hPSCs i Endodermal celler og Liver forfedre
- Etter hPSCs har vært belagt i minst 24 timer (som beskrevet i trinn 2.2.12), før du fortsetter med differensiering, sjekk morfologi av celler under en fase-kontrast mikroskop, med spesiell vekt på diameter og tetthet av belagt hPSC kolonier.
Merk: Ideelt sett bør klumper være lett linjeavstand og av passende størrelse og tetthet gjennom brønnen før trinn 3,2. Store (ca. > 400 μm) eller små kolonier (ca. < 200 μm) av hPSCs kan ikke brukes til differensiering (Figur 4). Differensiering signaler vil ikke handle jevnt gjennom store hPSC kolonier, noe som fører til ineffektiv differensiering. Kolonier som er for små overlever ikke godt i løpet av de første 3 dagene av hPSC differensiering i denne differensiering protokollen. Hvis tettheten av seeded hPSCs er riktig, vil hPSC koloniene ofte danne "broer" av celler mellom dem og den samlede samløpet vil være ~ 30-50% før du legger dag 1 differensiering medium (Figur 4). - Hvis koloni størrelser er ideelle i trinn 3,1, gå videre til dag 1 av differensiering, som innebærer differensiering av hPSCs i fremre primitive strek (APS).
- Forbered dag 1 APS differensiering medium ved å blande alle reagenser som er skissert i tabell 2 ved hjelp av CDM 2 (tabell 1 og del 1,2) som basis medium. Pipet å blande flere ganger for å sikre jevn fordeling av komponentene i Media.
- Aspirer å fjerne thiazovivin supplert mTeSR1 fra belagt hPSCs og kort vask hPSCs med IMDM Media. Ikke vask med fosfat bufret saltvann (PBS) i stedet for IMDM, som PBS mangler kalsium ioner (ca2 +) og er således giftig for hPSCs; det vil forstyrre celle morfologi.
- Etter den korte IMDM vask, legger dag 1 medium til hPSCs. Ta opp tid og plasser cellene tilbake i 37 ° c inkubator
- Fortsett med påfølgende differensiering trinnene ved å forberede (tabell 2) og legge den respektive differensiering medium til cellene på de respektive dager (ved 24 h intervaller) av differensiering rundt samme tid på dagen (figur 1). Erstatt med ferske medier daglig, selv om påfølgende dager med differensiering bruke samme differensiering Media. Mellom Media endringer, vaske celler en gang med IMDM Media for å fjerne døde celler og rester av tidligere medium komponenter.
- Som differensiering utvikler seg utover leveren knopp scenen, celle tall øker og dermed legge til flere medier til hver brønn av platen for å sikre at mengden av differensiering faktorer og næringsstoffer er ikke begrensende. For eksempel legge til 1 mL differensiering medium til hver brønn av 12-vel i utgangspunktet på dag 1 til 6 av differensiering, men legger 1.5-2 mL av påfølgende differensiering medier på senere dager med differensiering (dager 7 til 18 av differensiering).
4. karakterisering av Endodermal celler og Liver forfedre av Immunostaining
- Klargjør blokkerings buffer: 10% esel serum + 0,1% Triton X100 i deionisert fosfat bufret saltvann (DPBS).
- Klargjør farge buffer: 1% esel serum + 0,1% Triton X100 i DPBS.
- Aspirer medium fra celler i 12-brønn plate.
- Tilsett 4% paraformaldehyde (i DPBS) i 15 min ved romtemperatur for å fikse celler og vask deretter cellene to ganger med DPBS.
- Legg til blokkerings buffer for 1 time ved romtemperatur for å blokkere og permeabilize de faste cellene.
- Aspirer blokkerings løsningen og Legg til primært antistoff fortynnet i farge buffer. (Se tabell over materialer for fortynning prosenter av antistoffer.)
- Beis cellene over natten ved 4 ° c.
- Vask cellene tre ganger med 0,1% Triton X100 i DPBS.
- Legg til sekundær antistoff beis i farge bufferen for 1 time ved romtemperatur. (Se tabell over materialer for fortynninger av sekundære antistoffer.)
- Fjern sekundær antistoff og tilsett DAPI i 5 minutter ved romtemperatur for å utføre kjernefysiske counterstain.
- Vask to ganger med 0,1% Triton X100 i DPBS for å fjerne overflødig antistoff og DAPI.
- Gjennomfør fluorescens mikroskopi med en Zeiss Observer D1. Alternativt kan du lagre plate i 4 ° c til bildebehandling er utført. For forventede resultater, se Figur 3.
5. karakterisering av Liver forfedre av fluorescens aktivert Cell-sortering (FACS) analyse
Merk: Bruk FACS å presist kvantifisere prosentandelen av AFP + differensiert LB celler som dukker opp etter dag 6 av differensiering. Følg de samme trinnene for å kvantifisere prosentandelen av ALB + differensiert hepatocytter etter dag 18 av differensiering.
- Bøy et anti-AFP-antistoff.
- Legg til R-fykoerytrin i anti-AFP-antistoff ved en konsentrasjon av (0,55 μg/μL) ved bruk av R-fykoerytrin Bøyning Kit (se tabell over materialer).
Merk: Sørg for at Antistoffene er renset og rekonstituert i buffere som ikke inneholder aminer. Sørg for at mengden av antistoff som brukes i en merkings reaksjon, må være mindre enn mengden PE (dvs. 60 μg av antistoff med 100 μg av PE). Dårlig Bøyning av antistoffer kan føre til upålitelige utfall. - Tilsett 1 μL av spesial reagens for 10 μL av antistoff som skal merkes. Bland forsiktig.
- Fjern R-PE-miksen (100 μL) og Pipetter over blandingen direkte i det lyofilisert R-PE-materialet.
- Sett hetten tilbake og la hetteglasset stå i 3 timer i mørket ved romtemperatur.
- Etter incubating i 3 timer eller mer, tilsett 1 μL tørste reagens for 10 μL av antistoff. Bøy kan brukes etter 30 min.
- Oppbevares bøyd antistoff ved 4 ° c.
- Vask differensiert eller udifferensierte hPSCs i 6-brønn format med DMEM/F12.
- Behandle kort med dissosiasjon middel (1 mL/brønn i en 6-brønn plate) i 5 min ved romtemperatur til cellene løsner. Harvest og beis både udifferensierte hPSC og differensiert lever stamceller identisk og analysere parallelt i samme eksperiment for å sikre spesifisitet av antistoff farging.
- Tapp forsiktig Petri rett for å løsne celler. Bruk en P1000 pipette å løsne celler av platen og samle celler i en 50 mL konisk rør. Sørg for at cellene for det meste er koblet fra før du fortsetter med neste trinn. Deretter vaskes brønner to ganger mer med 1xDPBS buffer for å samle resterende celler.
- I 50 ml konisk rør, fortynne dissosiasjon middel i ~ 5 volumer av 1x DPBS buffer. Triturate strengt 3-4 ganger med en P1000 pipette for å sikre at alle celler er dissosiert i enkeltceller.
Merk: Det er viktig å generere enkeltceller før sentrifugering eller klumper senere ikke kan dissosiert med letthet. Men ikke over-triturate da dette kan skade celle integritet. Telle antall celler og bruke den anbefalte andelen av celler til antistoff ratio, som tidligere har blitt optimalisert for minimal bakgrunn og maksimal signal deteksjon. - Sentrifuger konisk rør som inneholder celle fjæringen ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Aspirer supernatanten med forsiktighet for ikke å forstyrre celle pellet.
- Resuspend celle pellet grundig i fiksering/perm buffer for å generere en enkelt celle suspensjon og fikse på isen ved 4 ° c i 20 min. merknad for overføring til et 2 mL mikrosentrifugen rør. Videre, bruk av en 2 mL mikrosentrifugen tube på dette trinnet gjør det mulig for cellen pellet å sette på V-formet-hjørnet av røret, minimere celle tap under vask.
- Vask hver pellet med 1,8 mL av perm/vaskebuffer to ganger. Resuspend celle pellet grundig i Perm/vaskebuffer ved pipette blande 6 ganger med en P1000 pipette. Deretter sentrifuge, fjerne supernatanten og gjenta vaskeprosessen med 1,8 mL av perm/vaskebuffer.
- Resuspend celle pellet i Perm/vaskebuffer slik at det vil være 100 μL/individuell beis og deretter overføre celle suspensjonen til en 2 mL mikrosentrifugen tube.
Merk: Det er viktig å generere en enkelt celle suspensjon på dette trinnet før antistoff farging. Aggregater av celler vil ikke bli farget og dermed vil forvirre FACS analyse. Videre, bruk av en 2 mL mikrosentrifugen tube på dette trinnet gjør det mulig for cellen pellet å sette på V-formet-hjørnet av røret, minimere celle tap under vask. - Etter blanding celler i FACS buffer, alikvot dem i individuelle 2 mL rør (for både unstained kontroll og antistoff-farget prøver).
- Stain med anti-AFP-PE 0,33 μL per 150 000 celler i 30 min ved romtemperatur i mørket. For eksempel, for en 100 μL individuell beis, beis som følger: 0,33 μL av a-AFP PE og 100 μL av perm/vaskebuffer. Resuspend celler med P200 pipette godt for å sikre jevn farging.
Merk: Bare pipette-mix og ikke Vortex da dette kan redusere protein stabiliteten. - Vask, resuspend cellene to ganger i 1-2 mL av perm/vaskebuffer (1,9 mL/individuell beis) og sentrifuge ved 800 x g i 5 min ved 4 ° c. Vask celler med ikke mindre enn 1-2 mL av perm/vaskebuffer for å sikre tilstrekkelig vasking.
Merk: Bare pipette mix og ikke Vortex da dette kan redusere protein stabilitet. Etter sentrifugering, aspirer supernatanten nøye for å hindre at celler dislodging og fjerne så mye supernatanten som mulig for å minimere antistoff bære over og sikre en mer komplett vask. - Resuspend hver vasket pellet i 300 μL av perm/vaskebuffer og sil det gjennom et 100 μm filter i en FACS tube for å stamme ut store klumper av celler før FACS analyse.
- Analyser celler på en FACS ARIA Flow-flowcytometri på PE-kanalen. Analysere et minimum av 10 000 hendelser for hver enkelt flekk, og analysere hendelser i kraft av FSC-A/SSC-en analyse, Velg Cell singleter av gating på FSC-W/FSC-H etterfulgt av SSC-H/SSC-W.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter 24 h av APS differensiering, vil koloniene generelt vedta en annen morfologi enn udifferensierte kolonier samtidig med et tap av den lyse grensen som typisk omslutter hPSC kolonier. Morfologisk, primitive strek celler generelt har fillete grenser og er mer spredt og mindre kompakt enn hPSCs-dette er stemningsfull av en epitel-til-mesenchymal overgang som pluripotent epiblast celler differensiere og inntrengning i primitive stripe in vivo. Hvis kolonien størrelsen på hPSCs før differensiering var for stor, vil det være en åpenlyst hevet sentrum som omfatter udifferensierte celler. Kulturer som inneholder slike store klumper bør kastes, da disse udifferensierte koloni sentrene vil forvirre påfølgende differensiering. Hvis klumper av riktig størrelse og tetthet var belagt, er APS differensiering svært reproduserbar og ensartet, genererer en 99.3 ± 0,1% MIXL1-Gfp+ primitive stripe BEFOLKNING (MIXL1 er en primitiv strek markør)7. Merk at noen celle død er observert etter 24 h av APS differensiering.
Etter dag 2 av differensiering, primitive strek celler har differensiert i dag 2 definitive endoderm celler, de aller fleste som uttrykker SOX17 (figur 2) og FOXA2. I dusinvis av uavhengige eksperimenter med 14 hESC og hiPSC linjer (inkludert H1, H7, H9, HES2, HES3, BJC1, BJC3, HUF1C4 og HUF58C4), denne tilnærmingen skalerbar måte, konsekvent og effektivt generert rene definitive endoderm populasjoner (94,0% ± 3,1%)7. Denne metoden for å generere definitive endoderm fra hPSCs gir høyere prosentandeler av CXCR4+PDGFRA- endodermal populasjoner sammenlignet med andre endoderm-forming tilnærminger2,14.
Etter dag 3 av differensiering, har endoderm differensiert i foregut forfedre som vises mangekantet i form (figur 1). Senere, ved 6 dager med differensiering, den foregut forfedre differensiere til leveren bud forfedre uttrykke AFP, TBX3 og HNF4A (Figur 3). På tvers av tre hESC linjer (H1, H7, H9 hESCs), genererer denne metoden dag 6 AFP+ Liver forfedre form med en virkningsgrad på 89.0 ± 3.1% (figur 2). Endelig, etter 18 dager med leveren differensiering fra hPSCs, ALBUMIN+ hepatocytter-lignende celler vises. Morfologisk, de vises epitel, danner lyse grenser som minner om galle canaliculi (figur 1). På dette stadiet, cytoplasma av dagen 18 hPSC-avledet hepatocytter synes mørkere enn kjernen (figur 1).
Figur 1: skjematisk av differensiering strategi og morfologi av udifferensierte hPSCs, differensiering endoderm og hepatocytter-lignende celler. Differensiering prosessen og tidslinjen ble vist. Forkortelser: d = dag, hPSC = menneskelige Pluripotent stamceller, APS = fremre primitive strek, DE = definitive endoderm, PFG = bakre foregut, LB = lever bud forfedre, HP = hepatocytter forfedre, HEP = hepatocytter som celler. Scale bar = 400 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: prosent av dag 1 MIXL1 + primitive strek, dag 2 SOX17 + definitive (def) endoderm, dag 6 AFP + lever bud forfedre og alb + hepatocytter populasjoner som vist av FACS. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Immunostaining analyse av dag 6 lever forfedre. hPSC ble først differensiert i leveren bud forfedre, som var immunostained for lever knopp transkripsjon faktorer HNF4A (rød), TBX3 (grønn) samt cytoplasmatiske lever knopp markør AFP (rød). Kjerner ble counterstained med DAPI (blå) for å vurdere totalt celle nummer. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: celle seeding tetthet av hPSCs. Lav (venstre) og hensiktsmessig (midten og høyre) tetthet av celler seeded. Scale bar = 1 000 μm. Pilen peker på "broer" mellom kolonier av celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Base medium | Sammensetning av base medium |
| CDM2 | 1:1 IMDM/F12, 0,1% m/v PVA, 1% konsentrert lipider, 0,7 μg/mL humant rekombinant insulin, 15 μg/mL transferrin, 18 nM 1-thioglycerol |
| CDM3 | 1:1 IMDM/F12, 0,1% m/v PVA, 1% konsentrert lipider, 10% KOSR |
| CDM4 | 1:1 IMDM/F12, 1% konsentrert lipider, 15 μg/mL transferrin |
| CDM5 | CMRL, 10% KOSR, 1% Glutamax |
Tabell 1: sammensetning av kjemisk definerte medier CDM2, CDM3, CDM4 og CDM5.
| Differensiering stadier | Varighet | Faktorer | Doser | Base medium |
| Dag 1 primitive strek | 1 dag | Activin | 100 ng/mL | |
| CHIR99201 | 3 μM | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nM | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| Dag 2 definitive endoderm | 1 dag | Activin | 100 ng/mL | |
| DM3189 | 250 nM | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nM | |||
| Dag 3 bakre Foregut | 1 dag | A83-01 | 1 μM av | |
| TTNPB | 75 nM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| Dag 6 Liver bud forfedre | 2 dager | Activin | 10 ng/mL | |
| C59 | 1 μM av | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| Forskolin | 1 μM av | |||
| 1 dag | Activin | 10 ng/mL | ||
| CHIR99201 | 1 μM av | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| Forskolin | 1 μM av | |||
| Dag 12 hepatic forfedre | 6 dager | BMP4 | 10 μg/mL | |
| Osm | 10 ng/mL | |||
| Deksametason | 10 μM | |||
| Forskolin | 10 μM | CDM4 | ||
| Ro4929097 | 2 μM av | |||
| AA2P | 200 μg/mL | |||
| Insulin | 10 μg/mL | |||
| dag 18 hepatocytter | 6 dager | Deksametason | 10 μM | |
| Forskolin | 10 μM | CDM4 eller | ||
| Ro4929097 | 2 μM av | CDM5 | ||
| AA2P | 200 μg/mL | |||
| Insulin | 10 μg/mL |
Tabell 2: sammensetning av differensiering Media.
| Problem | Mulig årsak | Bød løsning |
| Celler i sentrum av kolonien skiller ikke | i) koloni størrelsen var overdrevent stor, celler i midten av store kolonier var ikke tilgjengelig for differensiering signaler | i) kontroller celle tellings technqiue. |
| II) ujevn fordeling av klumper som fusjonerte sammen i sentrum av brønnen (eller dens periferi), danner svært store kolonier | II) rist platen i et kors mote å jevnt distribuere klumper under plating, og sjekk under et mikroskop før du legger den inn i inkubator | |
| III) celler fikk utilstrekkelig differensiering signaler | III) Legg tilstrekkelige mengder differensiering Media: Tilsett 1 mL medium per brønn i en 12-brønn plate og 3 mL per brønn i en 6-brønn plate | |
| Dårlig effektivitet av differensiering | i) Start celle kulturen delvis differensiert | i) bruk en ny, høy kvalitet batch av udifferensierte hPSCs |
| II) koloniene var for tett seeded, danner en confluent ark av celler | II) Seed celler og telle celler nøyaktig for differensiering, og rist jevnt for å fordele dem | |
| III) gjenværende Media og uønskede signaler ble ikke vasket ut på grunn av utilstrekkelig vasking | III) rester mTeSR1 eller induksjon Media fra forrige stadium av differensiering vil blokkere differensiering; vaske celler med IMDM før du legger differensiering medium | |
| IV) vask for hardt; upassende vaske forhold vil sterkt forstyrre celle morfologi | IV) før du legger til enten differensiering medium, vask kort med IMDM. Bruk av DPBS (eller medier med forskjellige OSMOLARITETSSYSTEM eller kalde medier) eller forlenget vasking, vil kompromittere celle morfologi og levedyktighet | |
| v) forlenget eller forkortet periode med differensiering stadier, lengre eller kortere enn anbefalt. | v) Følg den anbefalte tidsberegningen for hvert trinn av differensiering. |
Tabell 3: potensielle problemer og mulige årsaker og løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden gjør det mulig generering av beriket bestander av lever knopp forfedre, og senere hepatocytter celler, fra hPSCs. Evnen til å generere beriket bestander av menneskelig leverceller er viktig for praktisk utnyttelse av slike celler. Tidligere metoder for å generere hepatocytter fra hPSCs gitt uren celle populasjoner som inneholder både lever og ikke-leverceller som, ved transplantasjon til gnagere, gitt bein og brusk i tillegg til leveren vev15. Derav eksplisitt undertrykkelse av ikke-leveren differensiering er avgjørende for å generere beriket lever populasjoner som kan være egnet for en rekke applikasjoner.
Spesielt er kontrollert plating av hPSCs i første trinn avgjørende for effektiv nedstrøms differensiering. Det er viktig å nøyaktig plate hPSCs på en viss tetthet for differensiering, og å jevnt distribuere disse hPSCs over brønnen eller plate under prosessen med plating. For eksempel, for hver brønn av en 12-brønn plate, frø 160 000 til 250 000 hPSCs per brønn; samlet, er det viktig å titrere celle seeding tetthet og til slutt teste celle tettheten som er hensiktsmessig for hver cellelinje (Figur 4). Hvis for mange hPSCs er sådd per brønn, vil de danne store kolonier, som vil påvirke differensiering effektivitet, som celler i midten av store kolonier er mindre tilgjengelig for differensiering signaler i forhold til celler i nærheten av periferien; kolonier av heterogene størrelser vil også presentere lignende problemer. Hvis celle tettheten er for lav (f.eks. under 200 000 celler/brønn av en 12-brønn plate), kan det være at det ikke er nok materiale for differensiering og omfattende celle død. Den passaging og seeding metoden beskrevet ovenfor genererer konsekvent hPSC klumper av passende størrelse for nedstrøms differensiering.
En begrensning av denne metoden er at hepatocytter celler generert er ikke identisk med voksen hepatocytter, som hPSC-avledede celler fortsatt uttrykke umodne leveren markør AFP. Videre er CYP3A4 enzymatisk aktivitet ca 55 ganger lavere i disse hPSC-avledet hepatocytter celler sammenlignet med primær voksen menneskelig hepatocytter. En kommende utfordring vil være å modne disse hPSC-avledet hepatocytter-lignende celler til fullverdig, voksen-lignende celler. En annen begrensning er at effektiv differensiering er svært avhengig av Start tettheten av celler og derfor er det svært viktig å frø på den anbefalte tettheten og jevnt spre dem over platen (tabell 3).
Overall, produserer denne protokollen lever knopp forfedre og hepatocytter-lignende celler på 89.0 ± 3.1% renhet i minst 3 hPSC linjer. Sekund, hepatocytter celler uttrykt leverenzymer, utskilles humant ALBUMIN og uttrykte høyere nivåer av lever gener enn celler generert ved hjelp av bevarte differensiering tilnærminger. Til slutt, den resulterende hepatocytter-lignende celler ikke bare viser visse hepatocytter funksjoner in vitro, men viktigst de kan fungere til en viss grad i Vivo, som de kan engraft en mus modell av kronisk leverskade og forbedre kortsiktig overlevelse2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Bing lim for diskusjoner og Stanford Institute for Stem Cell Biology & regenererende medisin for infrastruktur støtte. Dette arbeidet ble støttet av California Institute for regenererende Medicine (DISC2-10679) og Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (til L.T.A. og K.M.L.) og Stanford Beckman Center for Molecular og genetisk Medicine samt anonym, Baxter og DiGenova familier (til K.M.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| Human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| Human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| Human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
References
- Bernal, W., Wendon, J. Acute Liver Failure. New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Fisher, R. A., Strom, S. C. Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results. Transplantation. 82, 441-449 (2006).
- Dhawan, A. Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges. Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).
- Salama, H., et al. Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases. Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).
- Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice. Differentiation. 98, 25-34 (2017).
- Loh, K. M., et al. Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
- Zhao, D., et al. Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects. Cell Research. 23, 157-161 (2012).
- Si Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 297-305 (2010).
- Carpentier, A., et al. Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen. Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).
- Avior, Y., et al. Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes. Hepatology. 62, 265-278 (2015).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).
- Haridass, D., et al. Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice. The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).
