Summary
Detta protokoll specificerar en monolayer, serum fri metod för att effektivt generera hepatocyte-liknande celler från humana pluripotenta stamceller (hPSCs) i 18 dagar. Detta innebär sex steg som hpscs sekventiellt differentieras till mellanliggande cell-typer såsom primitiva strimma, definitiva endoderm, posterior framtarmen och lever bud stamceller innan de bildar hepatocyte-liknande celler.
Abstract
Levern avgiftar skadliga ämnen, utsöndrar vitala proteiner, och utför viktiga metaboliska aktiviteter, vilket upprätthåller livet. Följaktligen, leversvikt — som kan orsakas av kronisk alkoholintag, hepatit, akut förgiftning, eller andra förolämpningar — är ett allvarligt tillstånd som kan kulminera i blödning, gulsot, koma, och så småningom döden. Emellertid, metoder för att behandla leversvikt, samt studier av leverfunktion och sjukdom, har varit omintetgörs delvis av avsaknaden av ett rikligt utbud av mänskliga leverceller. Detta protokoll specificerar därför en effektiv differentiering av humana pluripotenta stamceller (hPSCs) i hepatocyte-liknande celler, vägledda av en utvecklingsplan som beskriver hur lever ödet specificeras i sex på varandra följande differentierings steg. Genom att manipulera utvecklingsmässiga signalering vägar för att främja levern differentiering och att uttryckligen undertrycka bildandet av oönskade cell öden, denna metod genererar effektivt populationer av mänskliga leverbud stamceller och hepatocyte-liknande celler av dagar 6 respektive 18 i PSC-differentiering. Detta uppnås genom en temporally-exakt kontroll av utvecklingsmässiga signaleringsvägar, som utövas av små molekyler och tillväxtfaktorer i ett serumfritt odlingsmedium. Differentiering i detta system sker i enskiktslager och ger hepatocyte-liknande celler som uttrycker karakteristiska hepatocyte enzymer och har förmågan att att en musmodell av kronisk leversvikt. Förmågan att effektivt generera ett stort antal humana leverceller in vitro har förgreningar för behandling av leversvikt, för läkemedels screening, och för mekanistiska studier av leversjukdom.
Introduction
Syftet med detta protokoll är att effektivt differentiera humana pluripotenta stamceller (hPSCs) till anrikade populationer av lever buds stamledare och hepatocyte-liknande celler2. Tillgång till en färdig försörjning av mänskliga leverprogenitorer och hepatocyte-liknande celler kommer att påskynda arbetet med att undersöka leverfunktion och sjukdom och kan möjliggöra nya cellulära transplantations terapier för leversvikt3,4, 5. Detta har visat sig utmanande tidigare eftersom hPSCs (som omfattar embryonala och inducerade pluripotenta stamceller) kan differentiera till alla cell-typer av människokroppen; Följaktligen har det varit svårt att uteslutande särskilja dem till en ren population av en enda cell-typ, såsom leverceller6.
För att exakt differentiera hPSCs till leverceller, först är det viktigt att förstå inte bara hur leverceller specificeras utan också hur icke-lever cell-typer utvecklas. Kunskap om hur icke-leverceller utvecklas är viktigt att logiskt undertrycka bildandet av icke-lever linjer under differentiering, därmed uteslutande vägleda hPSCs mot en lever öde2. För det andra är det viktigt att avgränsa de flera utvecklings steg genom vilka hPSCs differentierar mot ett lever öde. Det är känt att hpscs sekventiellt differentieras till flera cell-typer som kallas primitiva Streak (APS), definitiva endoderm (de), posterior framtarmen (PFG) och lever bud progenitorer (lb) innan de bildar hepatocyte-liknande celler (HEP). Tidigare arbete avslöjade de signaler som specificerar levern öde och de signaler som undertryckt bildandet av alternativa icke-lever cell-typer (inklusive mage, bukspottkörtel, och intestinal progenitorer) vid varje utvecklingsmässiga Lineage val2, 7 , 8.
Kollektivt, dessa insikter har gett upphov till en serum-fri, enskiktslager metod för att differentiera hpscs mot primitiv strimma, definitiv endoderm, posterior foregut, lever bud progenitorer och slutligen, hepatocyte-liknande celler2. Sammantaget metoden innebär sådd av hpscs i en enskiktslager på en lämplig densitet, förbereda sex cocktails av differentiering media (som innehåller tillväxtfaktorer och små molekyler som reglerar olika utvecklings-signalering vägar), och sekventiellt lägga dessa medier för att inducera differentiering under loppet av 18 dagar. Under processen behövs ingen passaging av celler. Notera, eftersom denna metod uttryckligen omfattar signaler som hämmar bildandet av icke-lever cell-typer, denna differentiering metod1 mer effektivt genererar lever stamceller och hepatocyte-liknande celler i jämförelse med bevarade differentierings metoder2,9,10,11,12. Dessutom möjliggör det protokoll som beskrivs i denna text snabbare generering av hepatocyter som i slutändan uttrycker högre nivåer av levertranskriptionsfaktorer och enzymer än de som produceras av andra protokoll9,10 , elva , 12.
Det protokoll som beskrivs här har vissa fördelar jämfört med aktuella differentierings protokoll. För det första innebär det enskiktslager differentiering av hpscs, vilket är tekniskt enklare jämfört med tredimensionella differentiering metoder, såsom de som förlitar sig på embryoid organ13. För det andra utnyttjar denna metod ett senare förskott varigenom definitiva endoderm-celler (en tidig föregångare till leverceller) effektivt och snabbt kan genereras inom 2 dagar efter hpsc-differentiering på2,7, vilket möjliggör efterföljande produktion av hepatocyter med ökad renhet. För det tredje, i Side-by-side jämförelser, de hepatocyte-liknande celler som produceras av denna metod2 producerar mer albumin och uttrycker högre nivåer av levertranskriptionsfaktorer och enzymer jämfört med hepatocyter som produceras på andra metoder10, 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av differentierings medier
Anmärkning: Se tabellen med material för tillverkarens information om de material och reagenser som används.
-
Beredning av bas kemiskt definierade medier (CDM)
Anmärkning: CDM2, CDM3, CDM4 och CDM5 är kemiskt definierade medier som används som bas medier för att differentiera hPSCs till leverceller i olika stadier. Sammansättningen av dessa medier finns i tabell 1.- För att göra CDM2 eller CDM3, Förbered en stamlösning som innehåller polyvinylalkohol (PVA). Lös upp 0,5 g PVA-pulver i 50 mL av Iscoves modifierade Dulbecco-medium (IMDM) för att generera ett PVA-lager på 10 mg/mL.
Anmärkning: Eftersom PVA inte löses upp lätt, Bered PVA/IMDM-blandningen i en konisk kolv med kontinuerlig omrörning vid ~ 50 ° c på en värmedyna. omrörning kan lätt uppnås med hjälp av en magnetomrörare. - När PVA är homogent upplöst i IMDM, ta bort PVA-lösningen från värmeplattan och låt den svalna till rumstemperatur.
- Använd ett sterilt, 0,2 μm filter för att filtrera PVA-lösningen.
- Förbered CDM2 och CDM3 genom att kombinera den filtrerade PVA från steg 1.1.1 och olika kommersiellt inköpta komponenter som beskrivs i tabell 1 och tabellen av material. Använd sterila filterenheter på 0,2 μm för att filtrera alla medier.
Anmärkning: Bas mediet kan förvaras vid 4 ° c men inte längre än 2 månader. - Förbered de återstående bas medierna CDM4 och CDM5 enligt tabell 1.
- För att göra CDM2 eller CDM3, Förbered en stamlösning som innehåller polyvinylalkohol (PVA). Lös upp 0,5 g PVA-pulver i 50 mL av Iscoves modifierade Dulbecco-medium (IMDM) för att generera ett PVA-lager på 10 mg/mL.
-
Beredning av differentierings medier
- För att förbereda lagerlösningar för små molekyler och tillväxtfaktorer, Rekonstituera dem enligt tillverkarens rekommendationer. För lagring, alikvot till sterila rör för att minska frys-Taw cykler och hålla vid-20 ° c eller som rekommenderas.
Anmärkning: Sammansättningen av differentierings mediet som skall användas vid olika differentierings stadier beskrivs i tabell 2 och i följande steg. - För att förbereda differentierings mediet, Tina först de frysta små molekylerna och/eller tillväxtfaktorerna vid rumstemperatur. Nästa, alikvot ut erforderlig mängd bas mediet. Slutligen, förbereda den slutliga differentieringen Media genom att lägga till de specificerade små molekyler och tillväxtfaktorer till bas mediet vid lämpliga koncentrationer (tabell 2).
Anmärkning: Nyberedda differentierings medium bör helst användas samma dag; Annars kan den förvaras vid 4 ° c och användas inom tre dagar. - Med hjälp av en pipett spets, blanda differentierings mediet flera gånger för att säkerställa kosttillskott är homogent fördelas innan du lägger mediet till celler (t. ex., tillsätt 1 ml differentiering medium till varje brunn i en 12-brunn tallrik.)
- För att förbereda lagerlösningar för små molekyler och tillväxtfaktorer, Rekonstituera dem enligt tillverkarens rekommendationer. För lagring, alikvot till sterila rör för att minska frys-Taw cykler och hålla vid-20 ° c eller som rekommenderas.
2. utsäde hPSCs på plattor vid definierade tätheter för differentiering
- Coat cellodling plaster som kommer att användas för sådd med hPSCs.
- Tina matrisen (t. ex. Geltrex) vid 4 ° c över natten före användningsdagen.
- Nästa dag, späd matrisen 1:100 genom att lägga till 500 μL av matrisen i 50 mL av kallt Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM)/F12. Eftersom matrisen är en hydrogel som oåterkalleligt Polymeriserar vid exponering för rumstemperatur, när du arbetar med matrisen, alltid hålla Matrix rören och media på isen.
- Anmärkning: Matrisen upplöst 1:100 i DMEM/F12 kan förvaras vid 4 ° c men bör användas inom 2 månader.
- För att belägga en odlings skylt med matrisen, Pipettera den utspädda matrisen in i erforderligt antal brunnar med lagom mängd Matrix lösning för att täcka ytan på brunnen (t. ex. Tillsätt 0,5 mL matris till en brunn på en 12-brunnsplatta eller 1 mL till en brunn på en 6- Bra skylt). Om det behövs, skaka plattan försiktigt för att se till att mat ris lösningen helt har täckt botten av brunnen.
- Lämna den matrisbelagda plattan i en inkubator på 37 ° c i minst 60 min. Vid denna temperatur, matrisen Polymeriserar för att bilda en tunn film på botten av brunnen.
- Anmärkning: Matrix-belagda plattor kan förvaras i inkubatorn 37 ° c och användas inom 3 dagar så länge matrisen inte har torkat upp.
- Aspirera den kvarvarande mat ris lösningen från de belagda brunnarna omedelbart före sådd av brunnarna med hPSCs.
- Och sågning av de belagda plattorna med hPSCsNOTE: dissociation Agent innehåller enzymer som separerar celler och det är viktigt att lämna hPSCs i dissociation agent för så kort tid span som möjligt.
- Till utsäde matris-belagda kultur plattor med hPSCs före differentiering, växa odifferentierade hPSCs att > 70% sammanlänkning i kommersiellt tillgängliga mTeSR1 medium (tabell över material) enligt tillverkarens protokoll. Det är viktigt att passage hPSCs innan de blir helt confluent, som hPSCs kan spontant differentiera vid hög sammanflödet.
Anmärkning: hpscs måste karyotypas att se till att det inte finns några kromosomavvikelser innan du använder dem för experiment. Den hpscs som används för detta differentierings protokoll upprätthölls i mTeSR1 media och blint som klumpar med EDTA att minimera karyotypic avvikelser. Karyotypiskt-onormal hpscs bör inte användas för differentiering, eftersom de kan föröka sig onormalt snabbt; således cell-seeding tätheter rekommenderas här är inte lämpliga för karyotypiskt-onormala celler. - Till utsäde hPSCs för differentiering, aspirera mTeSR1 från i stort sett-confluent hPSC kulturer plattan och lägga kommersiellt köpt dissociation agent (tabell över material) att separera hpscs, med bara tillräckligt dissociation agent för att täcka ytan av Tja eller skålen på vilken cellerna växer (t. ex., tillsätt 0,5 mL av dissociation agent per brunn av en 12-brunn tallrik, 1 mL per brunn av en 6-brunn tallrik eller 3 mL per 10 cm skålen).
- Inkubera hPSCs i dissociationsmedel vid 37 ° c i 5 min eller tills vissa kolonier börjar lossas. Knacka försiktigt på botten av brunnen/plattan flera gånger; efter flera minuter av dissociation, bör de flesta hPSC kolonier fritt komma i suspension.
- För att få bort separerade hpscs från plattan, tillsätt 2 ml/brunn av DMEM/F12 om du arbetar med en 6-brunn tallrik (eller 1 ml/brunn om att arbeta med en 12-brunn tallrik) att späda dissociation agent. Använd en serologisk pipett på 5 mL för att försiktigt Pipettera uppåt och nedåt flera gånger för att tvätta bort alla celler från brunnen. samla upp återsuspenderade enstaka celler i ett 50 mL koniskt rör. Tvätta plattan en andra gång med samma volym DMEM/F12 för att säkerställa återhämtning av alla hPSCs.
- Till 50 mL koniskt rör som innehåller cellerna, tillsätt DMEM/F12 för att späda ut den ursprungliga volymen av dissociationsmedel med 1:5-1:10 (t. ex. om dissociationsmedel ursprungliga volym var 1 mL, justera den totala volymen av cellsuspensionen till 10 mL med DMEM/F12 för att späda ut dissociation agent på 1:10)
- Centrifugera de insamlade hPSCs i ett 50 mL koniskt rör vid 350 x g i 3 min vid 4 ° c till pellets celler.
- I väntan på cellerna till pellets, aspirera matris från plattan där hPSCS kommer att seedade. Lägg sedan till tillräckliga mängder mTesR1 kompletterat med 1 μM kommersiellt erhållna tiazovivin (en farmakologisk berg hämmare) till mottagar brunnar för att täcka dem (t. ex. Tillsätt 0,5 mL mTeSR1 per brunn av en 12-brunnsplatta eller 1 mL mTeSR1 per brunn på en 6-borrtallrik).
Anmärkning: Thiazovivin vid en låg koncentration ingår i detta steg för att förbättra Single cellöverlevnad och därmed efterföljande sådd densitet hPSCs. - Efter centrifugering hpscs, försiktigt Aspirera supernatanten, lämnar inblandning pelleterat hpscs på botten av det koniska röret. Den supernatanten innehåller dissociation agent som kommer att hämma efterföljande vidhäftning av hPSCs och därmed är det viktigt att aspirera den stora majoriteten av supernatanten innan du fortsätter.
- Omsuspendera cellpelleten i mTeSR1 kompletterad med 1 μM tiazovivin. Med en P1000 pipett, försiktigt hackad 2-3 gånger för att jämnt Omsuspendera cellpelleten i en enda cellsuspension. Inte över-triturate cellen pellet som överdriven mekanisk kraft kommer att skada hPSCs och leda till dålig cellöverlevnad.
- Efter resuspension av hPSCs, Pipettera omedelbart 10 μL av suspensionen till en hemocytometern och räkna antalet celler. Det är viktigt att Pipettera celler för att räkna så snabbt som möjligt, eftersom gravitationen kommer att leda till hPSCs naturligt bosätta sig i botten av 50 mL röret, som kommer att blanda ihop korrekt cellräkning.
- Justera volymen på den återsuspenderade hPSCs med tiazovivin-kompletterad mTeSR1 för att uppnå önskad cell koncentration för plätering. Till exempel, efter justering av volymen av återsuspenderade hPSCs, tillsätt 0,5 mL av cellsuspensionen per brunn till utsäde 160000-250000 celler i varje brunn av en 12-brunn tallrik, vilket uppnår en total volym av 1 mL i varje brunn (0,5 mL Media lades till brunnen i steg 2.2.7). Om större eller mindre brunnar används, skala cell nummer/Media volymer upp eller ner i enlighet med detta.
Anmärkning: Det är viktigt att utsäde hPSCs på den angivna CELLTÄTHETEN. Alltför confluent hPSCs kommer inte att differentiera effektivt och under-confluent hPSCs kommer inte att överleva väl under differentieringen. - Skaka plattan i ett korsmönster (vänster, sedan höger, framåt, sedan bakåt) flera gånger för att se till att cellerna är jämnt fördelade över plattan/brunnen. Snurra inte plattan i en cirkelrörelse, eftersom cellerna kommer att bosätta sig i mitten av plattan/brunn. Typiskt, hPSCs kommer att börja ansluta sig till ytan av brunnen inom ~ 3-30 min. Tillåt celler att växa i minst 24 h innan du påbörjar differentiering.
- Till utsäde matris-belagda kultur plattor med hPSCs före differentiering, växa odifferentierade hPSCs att > 70% sammanlänkning i kommersiellt tillgängliga mTeSR1 medium (tabell över material) enligt tillverkarens protokoll. Det är viktigt att passage hPSCs innan de blir helt confluent, som hPSCs kan spontant differentiera vid hög sammanflödet.
3. differentiering av hPSCs i endodermala celler och Leverprogenitorer
- Efter hPSCs har pläterats i minst 24 timmar (som beskrivs i steg 2.2.12), innan du fortsätter med differentiering, kontrollera morfologin av celler under ett fas-kontrast Mikroskop, med särskild tonvikt på diametern och tätheten av pläterade hPSC kolonier.
Anmärkning: Helst bör klumpar vara lätt placerade och av lämplig storlek och densitet i hela brunnen innan steg 3,2. Stora (cirka > 400 μm) eller små kolonier (cirka < 200 μm) av hPSCs är inte användbara för differentiering (figur 4). Differentierings signalerna kommer inte att fungera jämnt i stora hPSC-kolonier, vilket leder till ineffektiv differentiering. Kolonier som är för små överlever inte väl under de första 3 dagarna av hPSC-differentiering i detta differentierings protokoll. Om tätheten av seedade hPSCs är korrekt, kommer hPSC kolonier ofta bildar "broar" av celler mellan dem och den totala sammanflödet kommer att vara ~ 30-50% innan du lägger dag 1 differentiering medium (figur 4). - Om kolonin storlekar är idealiska i steg 3,1, gå vidare till dag 1 av differentiering, vilket innebär differentiering av hPSCs i främre primitiva Streak (APS).
- Förbered dag 1 APS differentierings medium genom att blanda alla reagenser som beskrivs i tabell 2 med CDM 2 (tabell 1 och avsnitt 1,2) som bas medium. Pipet att blanda flera gånger för att säkerställa jämn fördelning av komponenterna i media.
- Aspirera att ta bort thiazovivin kompletteras mTeSR1 från den pläterade hPSCs och kort tvätta hPSCs med IMDM media. Tvätta inte med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i stället för IMDM, eftersom PBS saknar kalciumjoner (ca2 +) och därför är giftigt för hpscs; Det kommer att störa cellmorfologin.
- Efter den korta IMDM tvätta, Lägg dag 1 medium till hPSCs. Registrera tid och placera celler tillbaka i 37 ° c inkubator
- Fortsätt med de efterföljande differentierings stegen genom att förbereda (tabell 2) och addera respektive differentierings medium till cellerna på respektive dag (vid 24 h intervall) av differentiering ungefär samma tid på dagen (figur 1). Ersätt med färska medier dagligen, även om på varandra följande dagar av differentiering använda samma differentiering media. Mellan Media förändringar, tvätta celler en gång med IMDM media för att ta bort döda celler och rester av tidigare medelstora komponenter.
- Som differentiering fortskrider bortom levern knopp skede, cell nummer öka och därmed lägga till mer media till varje brunn av plattan för att säkerställa att mängden differentiering faktorer och näringsämnen är inte begränsande. Till exempel, tillsätt 1 mL differentierings medium till varje brunn av 12-väl initialt på dag 1 till 6 differentiering men tillsätt 1,5-2 mL av efterföljande differentiering media på senare dagar av differentiering (dag 7 till 18 av differentiering).
4. karakterisering av endodermala celler och Leverprogenitorer genom immunofärgning
- Förbered blockeringsbuffert: 10% Donkey serum + 0,1% Triton X100 i avjoniserat fosfat buffrad saltlösning (dpbs).
- Förbered färgbuffert: 1% Donkey serum + 0,1% Triton X100 i DPBS.
- Aspirera medium från celler i 12-brunn tallrik.
- Tillsätt 4% PARAFORMALDEHYD (i DPBS) i 15 min vid rumstemperatur för att fixera celler och tvätta sedan cellerna två gånger med DPBS.
- Lägg blockeringsbuffert för 1 h vid rumstemperatur för att blockera och permeabilisera de fasta cellerna.
- Aspirera den blockerande lösningen och tillsätt primär antikropp utspädd i färgbuffert. (Se tabell över material för utspädnings förhållanden för antikroppar.)
- Färga cellerna över natten vid 4 ° c.
- Tvätta celler tre gånger med 0,1% Triton X100 i DPBS.
- Lägg till sekundär antikropps fläck i infärgnings bufferten i 1 h vid rumstemperatur. (Se tabell över material för spädningar av sekundära antikroppar.)
- Ta bort den sekundära antikroppen och tillsätt DAPI i 5 minuter vid rumstemperatur för att utföra nukleär motfärgning.
- Tvätta två gånger med 0,1% Triton X100 i DPBS för att ta bort överflödig antikropp och DAPI.
- Genomför fluorescens-mikroskopi med en Zeiss-observatör D1. Alternativt, förvara plattan i 4 ° c tills bildbehandling utförs. För förväntat resultat, se diagram 3.
5. karakterisering av Leverprogenitorer med fluorescens aktiverad cell-sortering (FACS) analys
Anmärkning: Använd FACS för att exakt kvantifiera andelen AFP + differentierade LB-celler som uppstår vid dag 6 av differentiering. Följ samma steg för att kvantifiera andelen av ALB + differentierade hepatocyter vid dag 18 av differentiering.
- Konjugera en anti-AFP-antikropp.
- Tillsätt R-phycoerythrin till anti-AFP antikropp vid en koncentration av (0,55 μg/μL) med hjälp av R-phycoerythrin konjugation Kit (se tabell över material).
Anmärkning: Säkerställ att antikropparna renas och bereds i buffertar som inte innehåller aminer. Se till att mängden antikroppar som används i en märknings reaktion måste vara mindre än mängden PE (dvs 60 μg antikropp med 100 μg PE). Dålig konjugering av antikroppar kan leda till otillförlitliga resultat. - Tillsätt 1 μL modifieringsmedel för 10 μL antikropp som ska märkas. Blanda försiktigt.
- Ta bort R-PE-blandningen (100 μL) och Pipettera över blandningen direkt i det frystorkade R-PE-materialet.
- Placera locket tillbaka och Låt injektionsflaskan stå i 3 timmar i mörker vid rumstemperatur.
- Efter inkuberingen i 3 timmar eller mer, tillsätt 1 μL quencherreagens för 10 μL av den använda antikroppen. Konjugaten kan användas efter 30 min.
- Förvara konjugerad antikropp vid 4 ° c.
- Tvätta differentierade eller odifferentierade hPSCs i 6-well format med DMEM/F12.
- Kort behandla med dissociation agent (1 mL/brunn i en 6-brunn tallrik) för 5 min på rumstemperatur till cellerna lossa. Skörd och fläcken både odifferentierade hPSC och differentierade leverprogenitorceller identiskt och analysera parallellt i samma experiment för att säkerställa specificitet antikropp färgning.
- Knacka försiktigt på petriskål för att lossa celler. Använd en P1000 pipett för att lossa celler från plattan och samla in celler i ett 50 mL koniskt rör. Se till att cellerna har mestadels lossnat innan du fortsätter med nästa steg. Därefter tvätta brunnar två gånger mer med 1xDPBS buffert för att samla kvarvarande celler.
- I det 50 ml koniska röret, späd dissociationsmedel i ~ 5 volymer 1x DPBS buffert. Triturate rigoröst 3-4 gånger med en P1000 pipett för att säkerställa att alla celler separeras i enskilda celler.
Anmärkning: Det är absolut nödvändigt att generera enstaka celler före centrifugering eller klumpar därefter inte kan skiljas med lätthet. Emellertid, inte över-triturate eftersom detta kan skada cellernas integritet. Räkna antalet celler och använda den rekommenderade andelen celler till antikropps förhållandet, som tidigare har optimerats för minimal bakgrund och maximal signaldetektering. - Centrifugera koniskt rör som innehåller cellsuspensionen vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Aspirera supernatanten med omsorg för att inte störa cellpelleten.
- Omsuspendera cellpelleten grundligt i fixering/perm buffert för att generera en encellig suspension och Fix på is vid 4 ° c för 20 min. Anmärkning för överföring till ett 2 mL microcentrifugerör. Dessutom, användning av en 2 mL microcentrifug röret i detta steg gör det möjligt för cellpelleten att sätta in på V-formade-hörnet av röret, minimera cellförlust under tvättar.
- Tvätta varje pellet med 1,8 mL perm/tvättbuffert två gånger. Omsuspendera cellpelleten grundligt i Perm/tvättbuffert med pipett som blandas 6 gånger med en P1000 pipett. Sedan Centrifugera, ta bort supernatanten och upprepa tvättprocessen med 1,8 mL perm/tvättbuffert.
- Omsuspendera cellpelleten i Perm/tvättbuffert så att det kommer att finnas 100 μL/individuell fläck och därefter överföra cellsuspensionen till ett 2 mL microcentrifugerör.
Anmärkning: Det är absolut nödvändigt att generera en encellig suspension vid detta steg före antikropps färgning. Aggregat av celler kommer inte att färgas och därmed kommer att blanda ihop FACS analys. Dessutom, användning av en 2 mL microcentrifug röret i detta steg gör det möjligt för cellpelleten att sätta in på V-formade-hörnet av röret, minimera cellförlust under tvättar. - Efter ombildning celler i FACS buffert, alikvot dem i enskilda 2 ml rör (för både obefläckade kontroll och antikropp-färgade prover).
- Fläcken med anti-AFP-PE 0,33 μL per 150 000 celler för 30 min vid rumstemperatur i mörkret. Till exempel, för en 100 μL individuell fläck, fläcken enligt följande: 0,33 μL av a-AFP PE och 100 μL perm/tvättbuffert. Omsuspendera celler med P200 pipett väl för att säkerställa jämn färgning.
Anmärkning: Endast pipettblanda och skaka inte eftersom detta kan minska protein stabiliteten. - Tvätta, Omsuspendera cellerna två gånger i 1-2 mL perm/tvättbuffert (1,9 mL/individuell fläck) och centrifugera vid 800 x g i 5 min vid 4 ° c. Tvätta celler med inte mindre än 1-2 mL perm/tvättbuffert för att säkerställa tillräcklig tvätt.
Anmärkning: Pipettblanda och Använd inte Vortex eftersom detta kan minska protein stabiliteten. Efter centrifugering, Aspirera supernatanten noga för att förhindra att celler från att ta bort och avlägsna så mycket supernatanten som möjligt för att minimera antikropps överföring och säkerställa en mer komplett tvätt. - Omsuspendera varje tvättad pellet i 300 μL av perm/Wash buffert och Sila den genom ett 100 μm filter till ett FACS-rör för att sila ut stora klumpar av celler före FACS analys.
- Analysera celler på en FACS Aria flödescytometri på PE-kanalen. Analysera minst 10 000 händelser för varje enskild fläck, och tolka händelser med stöd av FSC-a/SSC-a-analys, Välj cell undertröjor genom att gating på FSC-w/FSC-h följt av SSC-h/SSC-w.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter 24 h av APS differentiering, kolonier kommer i allmänhet att anta en annan morfologi än odifferentierade kolonier samtidigt med en förlust av den ljusa gränsen som typiskt uppställer hpsc kolonier. Morfologiskt, primitiva strimma celler har i allmänhet trasiga gränser och är mer spridda och mindre kompakta än hPSCs-detta är suggestivt av en epitelial-till-mesenkymala övergång som pluripotenta epiblast celler differentierar och tränger in i den primitiva streck in vivo. Om kolonins storlek på hPSCs före differentiering var för stor, kommer det att finnas ett öppet upphöjt centrum som omfattar odifferentierade celler. Kulturer som innehåller sådana stora klumpar bör kasseras, eftersom dessa odifferentierade kolonin centra kommer att blanda ihop efterföljande differentiering. Om klumpar av rätt storlek och densitet var pläterade, APS differentiering är mycket reproducerbara och enhetliga, genererar en 99.3 ± 0.1% MIXL1-GFP+ primitiv Streak population (MIXL1 är en primitiv strimma markör)7. Observera att vissa celldöd observeras efter 24 h APS differentiering.
Vid dag 2 av differentiering, primitiva strimma celler har differentierat till dag 2 definitiva endoderm celler, de allra flesta som Express SOX17 (figur 2) och FOXA2. I dussintals oberoende experiment med 14 hESC och hiPSC linjer (inklusive H1, H7, H9, HES2, HES3, BJC1, BJC3, HUF1C4 och HUF58C4), detta tillvägagångssätt scalably, konsekvent och effektivt genererade rena definitiva endoderm populationer (94,0% ± 3,1%)7. Denna metod för att generera definitiva endoderm från hpscs ger högre procentandelar av CXCR4+PDGFRA- endodermala populationer jämfört med andra endoderm-Forming närmar sig2,14.
Vid dag 3 av differentiering, endoderm har differentierat in i framtarmen föregångare som verkar Polygonal formar in (bild 1). Senare, genom 6 dagar av differentiering, den framtarmen stamceller differentiera till leverbud progenitorer uttrycker AFP, TBX3, och HNF4A (figur 3). Över tre hESC-linjer (H1, H7, H9 hESCs) genererar denna metod dag 6 AFP+ lever-stamceller med en verkningsgrad på 89.0 ± 3,1% (figur 2). Slutligen, efter 18 dagar av lever differentiering från hPSCs, ALBUMIN+ hepatocyte-liknande celler visas. Morfologiskt, de verkar epitelial, bildar ljusa gränser som påminner om galla Canaliculi (figur 1). I detta skede, den cytoplasma av dagen 18 hPSC-derived hepatocyter verkar mörkare än kärnan (figur 1).
Figur 1: Schematisk differentieringstrategi och morfologi av odifferentierade hPSCs, differentierande endoderm och hepatocyte-liknande celler. Differentierings process och tidslinje visades. Förkortningar: d = dag, hPSC = humana pluripotenta stamceller, APS = främre primitiv strimma, DE = definitiva endoderm, PFG = posterior foregut, LB = lever bud progenitorer, HP = hepatocyte progenitorer, HEP = hepatocyte som celler. Skalstapel = 400 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: procent av dag 1 MIXL1 + primitiv strimma, dag 2 SOX17 + definitiv (def) endoderm, dag 6 AFP + lever bud stamceller och ALB + hepatocyte populationer som visas av FACS. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: immunofärgning analys av dag 6 lever stamceller. hPSC var först differentieras till lever bud progenitorer, som var immunostained för lever bud transkriptionsfaktorer HNF4A (röd), TBX3 (grön) samt cytoplasmiska levern bud markör AFP (röd). Kärnor var motmålat med DAPI (blå) för att bedöma totala cell nummer. Skalstapel = 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: cell sådd täthet för hPSCs. Låg (vänster) och lämplig (mitten och höger) densitet av celler seedade. Skalstapel = 1 000 μm. Pilen pekar på "broar" mellan kolonier av celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Bas medium | Sammansättning av bas mediet |
| CDM2 | 1:1 IMDM/F12, 0,1% m/v PVA, 1% koncentrerade lipider, 0,7 μg/mL humant rekombinant insulin, 15 μg/mL transferrin, 18 nM 1-tioglycerol |
| CDM3 | 1:1 IMDM/F12, 0,1% m/v PVA, 1% koncentrerade lipider, 10% KOSR |
| CDM4 | 1:1 IMDM/F12, 1% koncentrerade lipider, 15 μg/mL transferrin |
| CDM5 | CMRL, 10% KOSR, 1% Glutamax |
Tabell 1: sammansättning av kemiskt definierade medier CDM2, CDM3, CDM4 och CDM5.
| Differentiering arrangerar | Varaktighet | Faktorer | Doser | Bas medium |
| Dag 1 primitiv strimma | 1 dag | Activin | 100 ng/mL | |
| CHIR99201 | 3 μM | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nM | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| Dag 2 slutgiltig endoderm | 1 dag | Activin | 100 ng/mL | |
| DM3189 | 250 nM | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nM | |||
| Dag 3 posterior Foregut | 1 dag | A83-01 | 1 μM | |
| TTNPB | 75 nM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| Dag 6 lever bud progenitorer | 2 dagar | Activin | 10 ng/mL | |
| C59 | 1 μM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| Forskolin | 1 μM | |||
| 1 dag | Activin | 10 ng/mL | ||
| CHIR99201 | 1 μM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| Forskolin | 1 μM | |||
| Dag 12 lever progenitorer | 6 dagar | BMP4 | 10 μg/mL | |
| Osm | 10 ng/mL | |||
| Dexametason | 10 μM | |||
| Forskolin | 10 μM | CDM4 | ||
| Ro4929097 | 2 μM | |||
| AA2P | 200 μg/mL | |||
| Insulin | 10 μg/mL | |||
| dag 18 hepatocyter | 6 dagar | Dexametason | 10 μM | |
| Forskolin | 10 μM | CDM4 eller | ||
| Ro4929097 | 2 μM | CDM5 | ||
| AA2P | 200 μg/mL | |||
| Insulin | 10 μg/mL |
Tabell 2: sammansättningen av differentierings mediet.
| Problem | Möjlig orsak | Proffered lösning |
| Celler i centrera av kolonin gör åtskillnad mellan inte | i) kolonin storlek var överdrivet stor, celler i mitten av stora kolonier var inte tillgängliga för differentiering signaler | i) kontrollera cell inventering technqiue. |
| II) ojämn fördelning av klumpar som slagits samman i mitten av brunnen (eller dess periferi) och bildar mycket stora kolonier | II) skaka plattan på ett korssätt för att jämnt fördela klumpar under plätering, och kontrollera under ett Mikroskop innan du placerar den i inkubatorn | |
| III) cellerna fick otillräckliga differentierings signaler | III) tillsätt tillräckliga mängder differentierings medier: Tillsätt 1 mL medium per brunn i en 12-bra tallrik och 3 mL per brunn i en 6-brunn tallrik | |
| Dålig effektivitet differentiering | i) att starta cellkultur delvis differentierat | i) använda en ny, högkvalitativ sats av odifferentierade hPSCs |
| II) kolonierna var alltför tätt seedade och bildade ett konflualcellsark | II) frö celler och räkna celler exakt för differentiering, och skaka jämnt för att fördela dem | |
| III) kvarvarande media och oönskade signaler tvättades inte av på grund av otillräcklig tvätt | III) kvarvarande mTeSR1-eller induktions medier från det föregående stadiet av differentiering kommer att blockera differentiering. Tvätta celler med IMDM innan du lägger differentiering medium | |
| IV) tvätta för hårt; olämpliga tvätt förhållanden kommer att störa cellmorfologin kraftigt | IV) innan du lägger till antingen differentierings mediet, tvätta kort med imdm. Användning av DPBS (eller media med olika osmolaritet eller kallt medium) eller förlängd tvätt, kommer att äventyra cellmorfologi och lönsamhet | |
| v) förlängd eller förkortad period av differentierings stadier, längre eller kortare än rekommenderat. | v) följa de rekommenderade tiderna för varje differentierings etapp. |
Tabell 3: potentiella problem och möjliga orsaker och lösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod möjliggör generering av anrikade populationer av lever bud progenitorer, och därefter hepatocyte-liknande celler, från hPSCs. Förmågan att generera berikade populationer av mänskliga leverceller är viktigt för den praktiska användningen av sådana celler. Tidigare metoder för att generera hepatocyter från hPSCs gav oren cellpopulationer som innehåller både lever och icke-leverceller som, vid transplantation till gnagare, gav Ben och brosk förutom levervävnad15. Därför explicit dämpning av icke-lever differentiering är avgörande för att generera berikad lever populationer som kan vara lämpliga för en mängd olika tillämpningar.
Särskilt kontrollerad plätering av hPSCs i första steget är viktigt för effektiv nedströms differentiering. Det är viktigt att noggrant plattan hPSCs på en viss densitet för differentiering, och att jämnt fördela dessa hPSCs över brunnen eller plattan under processen för plätering. Till exempel, för varje brunn av en 12-bra tallrik, utsäde 160 000 till 250 000 hPSCs per brunn; Sammantaget är det absolut nödvändigt att titrera cell sådd tätheten och i slutändan testa den celltäthet som är lämplig för varje cellinje (figur 4). Om alltför många hPSCs är seedade per brunn, de kommer att bilda stora kolonier, vilket kommer att negativt påverka differentiering effektivitetsvinster, som celler i mitten av stora kolonier är mindre tillgängliga för differentiering signaler jämfört med celler nära periferin; kolonier av heterogena storlekar kommer också att presentera liknande frågor. Om cell tätheter är för låga (t. ex. under 200 000 celler/brunn av en 12-brunn tallrik), då det kanske inte finns tillräckligt med material för differentiering och omfattande celldöd kan observeras. Den passaging och sådd metod som beskrivs ovan genererar konsekvent hpsc klumpar av lämplig storlek för nedströms differentiering.
En begränsning av denna metod är att de hepatocyte-liknande celler som genereras är inte identiska med vuxna hepatocyter, som hPSC-härledda celler fortfarande uttrycker omogen lever markör AFP. Dessutom, CYP3A4 enzymatisk aktivitet är cirka 55 gånger lägre i dessa hPSC-derived hepatocyte-liknande celler jämfört med primära vuxna humana hepatocyter. En kommande utmaning kommer att vara att mogna dessa hPSC-derived hepatocyte-liknande celler till fullfjädrade, vuxna-liknande celler. En andra begränsning är att effektiv differentiering är extremt beroende av start tätheten hos celler och därför är det mycket viktigt att utsäde vid den rekommenderade densiteten och att jämnt skingra dem över plattan (tabell 3).
Sammantaget producerar detta protokoll leverknoppprogenitorer och hepatocytliknande celler vid 89.0 ± 3,1% renhet i minst 3 hPSC-linjer. För det andra, hepatocyte-liknande celler uttryckte leverenzymer, utsöndras humant ALBUMIN och uttryckte högre nivåer av levergener än celler som genereras med hjälp av bevarade differentiering metoder. Slutligen, den resulterande hepatocyte-liknande celler inte bara uppvisar vissa hepatocyte funktioner in vitro, men viktigast av allt de kan fungera i viss mån in vivo, eftersom de kan att en musmodell av kronisk leverskada och förbättra kortsiktiga överlevnad2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Bing lim för diskussioner och Stanford Institutet för stamcellsbiologi & regenerativ medicin för infrastrukturstöd. Detta arbete stöddes av California Institute for Regenerative Medicine (DISK2-10679) och Stanford-UC Berkeley Siebel Stem cell Institute (till L.T.A. och K.M.L.) och Stanford Beckman Center för molekylär och genetisk medicin samt den anonyma, Baxter och DiGenova familjer (till K.M.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| Human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| Human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| Human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
References
- Bernal, W., Wendon, J. Acute Liver Failure. New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Fisher, R. A., Strom, S. C. Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results. Transplantation. 82, 441-449 (2006).
- Dhawan, A. Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges. Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).
- Salama, H., et al. Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases. Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).
- Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice. Differentiation. 98, 25-34 (2017).
- Loh, K. M., et al. Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
- Zhao, D., et al. Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects. Cell Research. 23, 157-161 (2012).
- Si Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 297-305 (2010).
- Carpentier, A., et al. Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen. Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).
- Avior, Y., et al. Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes. Hepatology. 62, 265-278 (2015).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).
- Haridass, D., et al. Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice. The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).
