Summary
Bu protokol, 18 gün içinde insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSCs) hepatosit benzeri hücreleri verimli bir şekilde üretmek için bir monolayer, serum içermeyen bir yöntem ayrıntıları. Bu hpscs sırayla ilkel çizgi, kesin endoderm, posterior foregut ve karaciğer tomurcuk ataları hepatosit benzeri hücreler oluşturmadan önce gibi ara hücre türlerine ayırt olarak altı adım gerektirir.
Abstract
Karaciğer zararlı maddeleri detoxifies, hayati proteinleri salgıları ve önemli metabolik faaliyetleri yürütür, böylece yaşam sürdürüyor. Sonuç olarak, karaciğer yetmezliği-kronik alkol alımı, Hepatit, akut zehirlenme veya diğer hakaret neden olabilir-kanama, sarılık, koma ve sonunda ölüm sonuçlanabilir ciddi bir durumdur. Ancak, karaciğer yetmezliği tedavisinde yaklaşımlar, yanı sıra karaciğer fonksiyon ve hastalığın çalışmaları, insan karaciğer hücrelerinin bol tedarik eksikliği kısmen stymied olmuştur. Bu amaçla, bu protokol insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSCs), karaciğer kaderi altı ardışık farklılaşma adımları boyunca nasıl belirtildiğini açıklayan bir gelişimsel yol haritası tarafından yönlendirilen hepatosit benzeri hücrelere verimli farklılaşma ayrıntıları. Karaciğer farklılaşma teşvik ve açıkça istenmeyen hücre kaderlerinin oluşumunu bastırmak için gelişimsel sinyal yolları manipüle ederek, bu yöntem verimli insan karaciğer tomurcuk ataları ve hepatosit benzeri hücrelerin nüfusu üretir gün 6 ve 18 PSC farklılaşma, sırasıyla. Bu, küçük moleküller ve büyüme faktörleri tarafından serum içermeyen bir kültür ortamında uygulanan, gelişimsel sinyalizasyon yollarının geçici olarak hassas kontrolü yoluyla elde edilir. Bu sistemde farklılaşma monolayers oluşur ve karakteristik hepatosit enzimleri ifade ve kronik karaciğer yetmezliği bir fare modeli erit yeteneğine sahip hepatosit benzeri hücreler verir. Verimli bir şekilde insan karaciğer hücrelerinin çok sayıda üretmek için yetenek karaciğer yetmezliği tedavisi için etkileri vardır, ilaç taraması için, ve karaciğer hastalığının mekanik çalışmalar için.
Introduction
Bu protokol amacı verimli insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmektir (hpscs) karaciğer tomurcuk ataları ve hepatosit benzeri hücrelerin zenginleştirilmiş nüfus2. İnsan karaciğer ataları ve hepatosit benzeri hücreler hazır bir tedarik erişim karaciğer fonksiyon ve hastalık araştırmak için çabaları hızlandıracak ve karaciğer yetmezliği için yeni hücresel transplantasyon terapileri olanaklı hale gelebilir3,4, 5' i yapın. Bu hPSCs beri geçmişte zorlu kanıtlanmış (hangi embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücreleri dahil) insan vücudunun tüm hücre türlerine ayırt edebilirsiniz; Sonuç olarak, onları sadece tek bir hücre tipi saf bir nüfus içine ayırt etmek zor olmuştur, karaciğer hücreleri gibi6.
HPSCs 'i karaciğer hücrelerine tam olarak ayırt etmek için, ilk olarak karaciğer hücrelerinin sadece nasıl belirlenmesini değil, karaciğer hücresi türlerinin nasıl geliştiği de anlaşılması önemlidir. Nasıl non-karaciğer hücrelerinin geliştirmek bilgi mantıksal olarak farklılaşma sırasında karaciğer olmayan sırların oluşumunu bastırmak için önemlidir, böylece sadece bir karaciğer kader2doğru hpscs rehberlik. İkincisi, hPSCs bir karaciğer kaderi ayırt hangi aracılığıyla birden fazla gelişimsel adımları tanımlamak için esastır. Bu hpscs sırayla ilkel çizgi (APS), kesin endoderm (de), posterior foregut (PFG) ve karaciğer tomurcuk ataları (lb) olarak bilinen birden çok hücre türleri farklılaştırarak hepatosit benzeri hücreler (hep) şekillendirmeden önce bilinmektedir. Önceki çalışma, karaciğer kaderi ve diğer non-karaciğer hücre türleri (mide, pankreatik ve bağırsak progenitors dahil) oluşumunu bastırdı sinyalleri belirterek sinyalleri ortaya her gelişimsel soy seçim2, 7 , 8' den itibaren.
Toplu olarak, bu Öngörüler ilkel çizgi, kesin endoderm, posterior foregut, karaciğer tomurcuk ataları ve son olarak, hepatosit benzeri hücreler2hpscs ayırt etmek için bir serum-ücretsiz, tek tabakalı yöntemi yükselmişti. Genel yöntem, uygun bir yoğunlukta bir tek tabakalı hpscs tohumlama içerir, farklılaşma medya altı kokteyl hazırlanıyor (büyüme faktörleri ve çeşitli gelişimsel sinyalizasyon yollarını düzenleyen küçük molekülleri içeren), ve ardışık olarak 18 gün boyunca farklılaşma neden bu medyayı ekleyerek. Süreç boyunca, hücrelerin hiçbir geçiş gereklidir. Not, çünkü bu yöntem açıkça olmayan karaciğer hücre türleri oluşumunu bastırmak sinyalleri içerir, bu farklılaşma yaklaşımı1 daha verimli karaciğer ataları ve hepatosit gibi hücreler genişletici karşılaştırıldığında üretir farklılaşma yöntemleri2,9,10,11,12. Ayrıca, bu metinde açıklanan protokol, hepatik transkripsiyon faktörleri ve enzimlerin diğer protokoller tarafından üretilenden daha yüksek seviyelerde olduğunu ifade eden hepatositlerin daha hızlı oluşumunu sağlar9,10 , 11 ' i , 12' ye kadar.
Burada açıklanan protokol mevcut farklılaşma protokolleri üzerinde bazı avantajları vardır. İlk olarak, üç boyutlu farklılaşma yöntemleri ile karşılaştırıldığında Teknik olarak daha basit olan hpscs Tek tabakalı farklılaşma gerektirir, gibi embriyoid organları güvenenler gibi13. İkinci olarak, bu yöntem son bir avans bu nedenle kesin endoderm hücreleri (karaciğer hücrelerine erken bir ön) verimli ve hızlı bir şekilde 2 gün içinde HPSC farklılaşma2,7içinde oluşturulan olabilir, böylece sonraki etkinleştirme artan saflık ile hepatosit üretimi. Üçüncü olarak, yan yana karşılaştırmalar, bu yöntem tarafından üretilen hepatosit benzeri hücreler2 daha fazla albumin üretmek ve hepatik transkripsiyon faktörleri ve enzimlerin diğer yöntemlerle üretilen hepatositlere kıyasla daha yüksek düzeyde ifade10, 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. farklılaşma ortamının hazırlanması
Not: Kullanılan malzemeler ve reaktifler ile ilgili üretici bilgileri için malzeme tablosuna bakın.
-
Baz kimyasal olarak tanımlanan medyanın hazırlanması (CDM)
Not: CDM2, CDM3, CDM4 ve CDM5 çeşitli aşamalarında karaciğer hücreleri Için hPSCs ayırt etmek için temel Medias kullanılan kimyasal olarak tanımlanır ortam. Bu Medias bileşimi Tablo 1' de bulunabilir.- CDM2 veya CDM3 yapmak için, polivinil alkol (PVA) içeren bir hisse senedi çözümü hazırlayın. 10 mg/mL PVA stok oluşturmak için Iscove 'un modifiye Dulbecco 'nun Orta (ıMDM) 50 mL 'de 0,5 g PVA tozu çözülür.
Not: PVA kolayca Çözünmezse, PVA/ıMDM karışımından kesintisiz karıştırma ile konik bir Flask hazırlayın ~ 50 °C ' de ısıtma yastığı üzerinde; karıştırma kolayca manyetik karıştırıcı kullanılarak elde edilebilir. - PVA, ıMDM 'de homojen bir şekilde çözündüğünde, PVA çözümünü ısıtma yastığı üzerinden çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
- PVA çözümünü filtrelemek için steril, 0,2 μm filtre kullanın.
- CDM2 ve CDM3, süzülmüş PVA 'yı adım 1.1.1 ve ticari olarak satın alınan çeşitli bileşenlerden Tablo 1 ve malzeme tablosundaözetlenen şekilde birleştirerek hazırlayın. Tüm medyayı filtrelemek için steril, 0,2 μm filtre üniteleri kullanın.
Not: Temel ortam 4 °C ' de saklanabilir ancak 2 aydan uzun sürmez. - Kalan temel ortam CDM4 ve CDM5 aşağıdaki Tablo 1hazırlayın.
- CDM2 veya CDM3 yapmak için, polivinil alkol (PVA) içeren bir hisse senedi çözümü hazırlayın. 10 mg/mL PVA stok oluşturmak için Iscove 'un modifiye Dulbecco 'nun Orta (ıMDM) 50 mL 'de 0,5 g PVA tozu çözülür.
-
Farklılaşma medyaları hazırlanması
- Küçük moleküller ve büyüme faktörleri için stok çözümlerini hazırlamak için, üreticilerin tavsiyelerine göre onları yeniden oluşturur. Depolama için, donma çözme döngülerini azaltmak ve-20 °c ' de ya da tavsiye edilen şekilde tutmak için steril borularının içine kısım.
Not: Çeşitli farklılaşma aşamalarında kullanılacak farklılaşma ortamının bileşimi Tablo 2 ' de ve aşağıdaki adımlarda açıklanmıştır. - Farklılaşma ortamını hazırlamak için ilk olarak dondurulmuş küçük molekülleri ve/veya büyüme faktörlerini oda sıcaklığında çözün. Sonra, temel orta gerekli miktarda dışarı kısım. Son olarak, belirtilen küçük molekülleri ve büyüme faktörlerini uygun konsantrasyonlarda temel ortama ekleyerek son farklılaşma medyasını hazırlayın (Tablo 2).
Not: Taze hazırlanmış farklılaşma ortamı, aynı gün ideal şekilde kullanılmalıdır; Aksi takdirde 4 °C ' de depolanabilir ve üç gün içinde kullanılabilir. - Bir pipet ucu kullanarak, takviyeleri homojen bir şekilde orta hücrelere eklemeden önce dağıtıldığından emin olmak için farklılaşma orta birkaç kez karıştırın (örneğin, her iyi bir 12-kuyu plakasının 1 mL farklılaşma orta ekleyin.)
- Küçük moleküller ve büyüme faktörleri için stok çözümlerini hazırlamak için, üreticilerin tavsiyelerine göre onları yeniden oluşturur. Depolama için, donma çözme döngülerini azaltmak ve-20 °c ' de ya da tavsiye edilen şekilde tutmak için steril borularının içine kısım.
2. farklılaşma için tanımlanan yoğunluklarda plakalar üzerine tohum hPSCs
- HPSCs ile tohumlama için kullanılacak Coat hücre kültürü plastikler.
- Matris (örneğin, Geltrex), kullanım gününden bir gece önce 4 °C ' de çözüyor.
- Ertesi gün, matrisin 500 μL '50 sini soğuk Dulbecco 'nun değiştirilmiş kartal Orta (DMEM)/F12 ' ye ekleyerek matris 1:100 seyreltin. Matris, matris ile çalışırken, oda sıcaklığına maruz kaldıktan sonra geri dönülemez şekilde polimerize olan bir hidrojel olduğundan, matris tüpleri ve medyayı her zaman buzda tutun.
- Not: DMEM/F12 'de çözülmüş matris 1:100, 4 °C ' de depolanabilir ancak 2 ay içinde kullanılmalıdır.
- Matris ile bir kültür plaka kat için, kuyu yüzeyi kapsayacak şekilde matris çözüm sadece yeterli hacim kullanarak kuyuların gerekli sayısına seyreltilmiş matris pipet (örneğin, bir iyi bir 12-kuyu plaka veya 1 mL bir kuyu için Matrix 0,5 mL eklemek 6-bir iyi iyi plaka). Gerekirse, matris çözeltisi tam kuyu alt kaplı olduğundan emin olmak için hafifçe plaka sallayın.
- Matris kaplı plakayı 37 °C ' lik bir kuluçte en az 60 dakika içinde bırakın. Bu sıcaklıkta matris, kuyu dibinde ince bir film oluşturmak için polimerleştirir.
- Not: Matris kaplı plakalar 37 °C ' de tutulabilir ve matris kurumamış olduğu sürece 3 gün içinde kullanılabilir.
- Kalan matris çözümünü, kuyuları hPSCs ile tohumlama işleminden hemen önce kaplanmış kuyulardan aspirate.
- Geçmeli ve kaplı levhalar hpscsnot ile tohumlama: ayrışma aracı hücreleri ayırmak enzimleri içerir ve hpscs ayrışma aracısına mümkün olduğunca kısa bir TimeSpan bırakmak önemlidir.
- Farklılaşma öncesinde hPSCs ile matris kaplı kültür plakaları tohum için, >% 70 konfluency ticari olarak kullanılabilir mTeSR1 Orta (malzeme tablosu) üreticinin protokole göre farklılaşmamış hpscs büyümek. HPSCs kendiliğinden yüksek konfluence ayırt olabilir gibi onlar tam confluent haline önce hPSCs geçiş için önemlidir.
Not: hpscs, deney için kullanmadan önce kromozomal anormalliklerin olmadığından emin olmak için karyotiplenmelidir. Bu farklılaşma protokolü için kullanılan hPSCs mTeSR1 medyada tutulan ve karyotifik anomalileri en aza indirmek için EDTA ile kümeleri olarak geçilmiş. Karyotypically-anormal hPSCs farklılaşma için kullanılmamalıdır, onlar anormal hızla çoğalabilir gibi; Böylece hücre-tohumlama yoğunlukları burada tavsiye karyotypically-anormal hücreler için uygun değildir. - Ayrımlama için çekirdek hpscs için, büyük ölçüde-confluent HPSC kültürler plaka mTeSR1 Aspire ve ticari satın ayrışma Ajan eklemek (malzeme tablosu) hpscs ayırmak için, sadece yeterli ayrışma Ajan yüzeyini kapsayacak şekilde kullanarak iyi ya da hangi hücrelerin büyüyor (örneğin, bir 12-kuyu plaka başına ayrışma Ajan 0,5 ml eklemek, 1 ml iyi bir 6-kuyu plaka veya 3 ml başına 10 cm çanak).
- 37 °C ' de 5 dakika ya da bazı koloniler dağılmaya başlayana kadar hPSCs 'de dissosyasyon ajanında inkübasyon yapın. Hafifçe iyi/plaka birkaç kez alt dokunun; dissociation birkaç dakika sonra, çoğu hPSC koloniler serbestçe süspansiyon içine gelmelidir.
- Bir 6-well plaka (ya da 1 ml/iyi bir 12-Well plaka ile çalışıyorsanız) ayrışma ajanını seyreltmesi için plaka dan Disosiye hpscs ayırmak için, dmem/F12 2 ml/Well ekleyin. Kuyu yüzeyinden tüm hücreleri yıkamak için birden çok kez yavaşça yukarı ve aşağı pipet 5 mL serolojik pipet kullanın; 50 mL konik tüpte resuspended tek hücreleri toplayın. Tüm hPSCs kurtarma sağlamak için DMEM/F12 aynı hacim ile plaka ikinci kez yıkayın.
- 50 ml konik tüp hücreleri içeren, 1:5-1:10 tarafından ayrışma Ajan orijinal hacminin seyreltmesi için dmem/F12 ekleyin (örneğin, kesilme aracı orijinal hacmi 1 ml ise, hücre süspansiyon toplam hacmi ayarlayın 10 ml dmem/F12 ile seyreltmesi için 1:10 adresindeki ayrışma Agent)
- Toplanan hPSCs 'yi 4 °C ' de 3 dk için 350 x g 'de 50 ml 'lik konik tüpte Pelet hücrelerine santrifüjler.
- Hücreleri Pellet için beklerken, hpscs 'nin tohumlu olduğu plakalı matris Aspire. Sonra, 1 μM ticari olarak elde edilen thiazovivin (bir farmakolojik kaya inhibitörü) onları kapsayacak şekilde alıcı kuyuları ile tamamlayıcı mTesR1 yeterli miktarda ekleyin (örneğin, eklemek 0,5 mL mTeSR1 başına bir 12-kuyu plaka veya 1 mL mTeSR1 iyi başına bir 6-kuyu plaka).
Not: Thiazovivin düşük konsantrasyonda Bu adımda tek hücreli hayatta kalma ve dolayısıyla hPSCs sonraki tohumlama yoğunluğu geliştirmek için dahil edilir. - Hpscs santrifüpten sonra, özenle supernatant Aspire, konik tüpün altında pelleted hpscs bırakarak. Süpernatant hpscs sonraki yapışma inhibe edecek ve böylece, devam etmeden önce süpernatant büyük çoğunluğu Aspire önemlidir ayrışma Ajan içerir.
- MTeSR1 içinde hücre Pelet resuspend thiazovivin 1 μM ile tamamlayıcı. Bir P1000 pipet ile, hafifçe tek bir hücre süspansiyon içine hücre Pelet eşit pelletini 2-3 kez triturate. Aşırı mekanik kuvvet hpscs zarar ve kötü hücre hayatta kalma yol açacak gibi hücre Pelet aşırı triturate yapmayın.
- Hpscs Resuspension sonra, hemen bir hemasitometre içine süspansiyon 10 μL pipet ve hücre sayısını saymak. Yerçekimi hPSCs doğal olarak 50 mL tüpünün altına yerleşmek için yol açacak gibi, mümkün olan en kısa sürede sayma için hücreleri pipet önemlidir, hangi doğru hücre sayımı konur.
- Kaplama için istenen hücre konsantrasyonu elde etmek için thiazovivin-tamamlayıcı mTeSR1 ile resuspended hPSCs hacmini ayarlayın. Örneğin, yeniden resuspended hPSCs hacmini ayarladıktan sonra, her iyi bir 12-kuyu plakasının her bir kuyu içine tohum 160000-250000 hücrelere iyi başına hücre süspansiyon 0,5 mL ekleyin, böylece her iyi 1 mL toplam hacmi elde (0,5 mL medya iyi adım 2.2.7 eklenmiştir). Daha büyük veya daha küçük kuyular kullanılırsa, hücre numaralarını/ortam birimlerini yukarı veya aşağı göre ölçeklendirin.
Not: Belirtilen hücre yoğunluğunda hPSCs tohum önemlidir. Aşırı konfluent hPSCs verimli ve altında-confluent hPSCs farklılaşma sırasında iyi hayatta olmayacaktır ayırt olmaz. - Hücrelerin plaka/kuyu boyunca eşit olarak dağıtıldığından emin olmak için birkaç kez çapraz desenle (sol, sonra sağ; ileri, sonra geri) plakayı sallayın. Hücreler plaka merkezi/iyi yerleşecek gibi, dairesel bir hareket içinde plaka girdap yok. Genellikle, hPSCs içinde kuyu yüzeyine yapışması başlayacaktır ~ 3-30 min. hücrelerin farklılaşma başlatmadan önce en az 24 saat büyüymesine Izin verin.
- Farklılaşma öncesinde hPSCs ile matris kaplı kültür plakaları tohum için, >% 70 konfluency ticari olarak kullanılabilir mTeSR1 Orta (malzeme tablosu) üreticinin protokole göre farklılaşmamış hpscs büyümek. HPSCs kendiliğinden yüksek konfluence ayırt olabilir gibi onlar tam confluent haline önce hPSCs geçiş için önemlidir.
3. hPSCs endodermal hücreler ve karaciğer progenitors içine farklılaşma
- HPSCs en az 24 saat (adım 2.2.12 açıklandığı gibi) için kaplama olduktan sonra, farklılaşma ile devam etmeden önce, bir faz-kontrast mikroskop altında hücrelerin morfoloji kontrol, çap ve kaplama hPSC kolonilerin yoğunluğu belirli bir vurgu ile.
Not: İdeal olarak, kümeleri kolayca aralıklı ve uygun boyut ve yoğunluk boyunca iyi önce adım 3,2 olmalıdır. Büyük (yaklaşık > 400 μm) veya küçük koloniler (yaklaşık < 200 μm) hPSCs farklılaşma için kullanılabilir değildir (Şekil 4). Farklılaşma sinyalleri büyük hPSC kolonileri boyunca eşit hareket etmez, verimsiz farklılaşma yol açacaktır. Çok küçük olan koloniler, bu farklılaşma protokolünde hPSC farklılaşma ilk 3 gün boyunca iyi hayatta değildir. Hpscs seribaşı yoğunluğu doğruysa, HPSC kolonileri genellikle aralarında hücrelerin "köprüler" oluşturur ve genel konfluence olacak ~ 30-50 gün eklemeden önce 1 farklılaşma ortamı (Şekil 4). - Koloni boyutları adım 3,1 ' te ideal ise, hPSCs 'nin anterior ilkel çizgi (APS) farklılaşması gerektiren farklılaşma günü 1 ' e geçin.
- Tablo 2 ' de CDM 2 (tablo 1 ve Bölüm 1,2) kullanarak temel ortam olarak özetlenen tüm reaktifleri karıştırarak gün 1 APS farklılaşma ortamı hazırlayın. Ortamlardaki bileşenlerin bile dağılımını sağlamak için birkaç kez karıştırmak için pipet.
- Thiazovivin mTeSR1 takviyalı hPSCs kaldırmak için aspirate ve kısaca ıMDM medya ile hPSCs yıkayın. PBS kalsiyum iyonları (CA2 +) yoksun ve böylece hpscs için toksik olduğu gıbı, ımdm yerine fosfat tamponlu tuzlu (PBS) ile yıkayın etmeyin; hücre morfolojisi bozacak.
- Kısa ıMDM yıkama sonra gün 1 orta hPSCs ekleyin. Saati kaydedin ve hücreleri 37 °C ' ye geri yerleştirin.
- Sonraki farklılaşma adımlarına (Tablo 2) hazırlayarak ve ilgili farklılaşma ortamını, günün aynı saatinde (Şekil 1), ilgili günlerde (24 saat aralıklarla) farklılaşma için hücrelere ekleyerek devam edin. Her gün taze medya ile değiştirin, ardışık gün ayrımı aynı farklılaşma ortamını kullansa bile. Medya değişiklikleri arasında, ölü hücreleri ve önceki orta parçaların kalıntısını çıkarmak için hücreleri bir kez ıMDM medyasında yıkayın.
- Farklılaşma karaciğer tomurcuk aşamasının ötesinde ilerledikçe, hücre numaraları artar ve bu nedenle, farklılaşma faktörleri ve besin miktarını sınırlamak değil sağlamak için her iyi plaka daha fazla medya ekleyin. Örneğin, her kuyu için 1 mL farklılaşma ortamı ekleyin 12-iyi başlangıçta 1 ile 6 arasında farklılaşma ancak daha sonraki günlerde farklılaşma (gün 7-18 farklılaşma) üzerinde 1.5-2 mL sonraki farklılaşma medya ekleyin.
4. Immünostasyon tarafından endodermal hücreler ve karaciğer progenitors karakterizasyonu
- Engelleme arabelleği hazırlayın:% 10 eşek serum + 0,1% Triton X100 deiyonize fosfat tamponlu tuzlu (DPBS).
- Boyama tamponu hazırlayın: 1% eşek serum + 0,1% Triton X100 DPBS içinde.
- 12-kuyu plaka hücrelerinden aspirate orta.
- Hücreleri düzeltmek ve ardından hücreleri dpbs ile iki kez yıkamak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 civarında formaldehite (dpbs) ekleyin.
- Sabit hücreleri engellemek ve nüfuz etmek için oda sıcaklığında 1 h engelleme arabelleği ekleyin.
- Engelleme çözümünü aspirate ve boyama tamponunun içinde seyreltilmiş primer antikor ekleyin. (Bkz. antikorlar seyreltme oranları için malzeme tablosu .)
- Hücreleri 4 °C ' de gece leke.
- DPBS 'de% 0,1 Triton X100 ile hücreleri yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat için boyama tampon ikincil antikor leke ekleyin. (Bkz. ikincil antikorların dilüsyonları için malzeme tablosu .)
- İkincil antikor çıkarın ve nükleer counterstain yapmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DAPı ekleyin.
- Aşırı antikor ve DAPı 'yi kaldırmak için DPBS 'de% 0,1 Triton X100 ile iki kez yıkayın.
- Zeiss Observer D1 ile floresan mikroskopisi gerçekleştirin. Alternatif olarak, görüntüleme gerçekleştirilene kadar plaka 4 °C ' de saklayın. Beklenen sonuçlar için bkz: Şekil 3.
5. floresans aktif hücre-sıralama (FACS) analizi ile karaciğer progenitors karakterizasyonu
Not: Dış AFP + farklılaştırılmış LB hücrelerinin yüzdesini kesin olarak ölçmek için FACS kullanarak 6. 18. farklılaşma sırasında ALB + farklılaştırılmış hepatositlerin yüzdesini ölçmek için aynı adımları izleyin.
- Bir anti-AFP antikor Conjugate.
- R-phycoerythrin konjugasyon kiti kullanılarak (0,55 μg/μL) konsantrasyon karşıtı-AFP antikor için R-phycoerythrin ekleyin (bkz. malzeme tablosu).
Not: Antikorlar saflaştırılmış ve aminler içermeyen arabellekleri reconstituted emin olun. Bir etiketleme reaksiyonunda kullanılan antikor miktarının PE miktardan daha az olması gerektiğinden emin olun (örn. 100 μg PE ile 60 μg antikor). Antikorların kötü konjugasyonu güvenilir olmayan sonuçlara yol açabilir. - Etiketlenecek 10 μL antikor için 1 μL değiştirici reakajın ekleyin. Yavaşça karıştırın.
- R-pe karışımından (100 μL) çıkarın ve yukarıdaki karışımı doğrudan liyofilize R-PE malzemesine pipet atın.
- Kap geri yerleştirin ve oda sıcaklığında karanlıkta 3 saat boyunca şişe ayakta bırakın.
- 3 saat veya daha fazla süre için inküreden sonra, 10 μL antikor için 1 μL giderici reaktif ekleyin. Konjugat 30 dakika sonra kullanılabilir.
- 4 °c ' de konjuge antikor saklayın.
- Ayrıştırılmış veya ayırt edilmemiş hPSCs DMEM/F12 ile 6-well formatında yıkayın.
- Hücreler ayrılıncaya kadar oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ayrışma ajanı (6-kuyu plakasında 1 mL/Well) ile kısaca tedavi edin. Hasat ve her iki farklılaşmayan HPSC ve farklılaşmış karaciğer progenitör hücreleri aynı şekilde leke ve antikor boyama özgüllüğü sağlamak için aynı deney paralel olarak analiz.
- Hücreleri ayırmak için Petri tabağı hafifçe dokunun. Plaka kapalı hücreleri ayırmak ve 50 mL konik tüp hücreleri toplamak için bir P1000 pipet kullanın. Bir sonraki adıma geçmeden önce hücrelerin çoğunlukla ayrılmış olduğundan emin olun. Daha sonra, kalan hücreleri toplamak için 1xDPBS tampon ile iki kez daha yıkayın kuyuları.
- 50mL konik tüpte, ~ 5 hacimde 1x DPBS tampon içinde seyreltmeli disajasyon ajanı. Triturate, tüm hücrelerin tek hücrelere dağıldığından emin olmak için bir P1000 pipet ile titizlikle 3-4 kez.
Not: Santrifüjleme veya kümeleri öncesinde tek hücreler oluşturmak zorunludur, daha sonra kolaylıkla Disosiye edilemez. Ancak, bu hücre bütünlüğünü zarar verebilir gibi aşırı triturate yok. Hücrelerin sayısını saymak ve daha önce minimal arka plan ve maksimal sinyal algılama için optimize edilmiş antikor oranı, hücrelerin önerilen oranını kullanın. - 4 °C ' de 5 dak için 300 x g 'de hücre süspansiyonunu içeren santrifüj konik tüp.
- Hücre peletini rahatsız etmek için değil bakım ile süpernatant aspirate.
- Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için sabitleme/perus tamponunun içine resuspend hücre Pelet ve 4 °C ' de buz üzerinde düzeltme 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için 20 dk. Not. Ayrıca, bu adımda 2 mL mikrosantrifüjlük tüpün kullanımı, hücre Pelet tüpün V şeklinde-köşesinde yatırmak için sağlar, yıkanmaları sırasında hücre kaybını minimize.
- Her Pelet ile yıkayın 1,8 ml Perm/yıkama tampon iki kez. Bir P1000 pipet ile 6 kez karıştırma pipet tarafından Perm/Wash tampon iyice resuspend hücre Pelet. Sonra, santrifüjün, süpernatant kaldırmak ve 1,8 ml Perm/yıkama tampon ile yıkama işlemini tekrarlayın.
- Yeniden resuspend hücre Pelet Perm/yıkama tampon böylece 100 μL/bireysel leke olacak ve daha sonra 2 mL mikrosantrifüjü tüp içine hücre süspansiyonu aktarmak.
Not: Antikor boyama öncesinde bu adımda tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak zorunludur. Hücrelerin toplamları lekelenmez ve böylece FACS Analizi konacak. Ayrıca, bu adımda 2 mL mikrosantrifüjlük tüpün kullanımı, hücre Pelet tüpün V şeklinde-köşesinde yatırmak için sağlar, yıkanmaları sırasında hücre kaybını minimize. - FACS arabelleğinde resuspending hücreler sonra, bireysel 2 ml tüpler içine kısım (hem lekelenmiş kontrol ve antikor-lekeli örnekler için).
- Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika için 150.000 hücre başına Anti-AFP-PE 0,33 μL ile leke. Örneğin, bir 100 μL bireysel leke için, aşağıdaki gibi leke: 0,33 μL a-AFP PE ve 100 μL Perm/Wash tampon. P200 pipet ile resuspend hücreler bile boyama sağlamak için.
Not: Sadece pipet-mix ve bu protein stabilitesi azaltabilir gibi Vortex yok. - Yıkama, iki kez 1-2 ml Perm/yıkama tampon (1,9 ml/bireysel leke) ve 4 °c ' de 5 dakika için 800 x g santrifüjler hücreleri yeniden pelletini. Yeterli yıkama sağlamak için az 1-2 mL Perm/yıkama tamponunu içeren hücreleri yıkayın.
Not: Sadece pipet karışımı ve bu protein stabilitesi azaltabilir gibi Vortex yok. Santrifübe sonra, dikkatlice dislodging hücreleri önlemek ve antikor Carry-Over en aza indirmek ve daha eksiksiz bir yıkama sağlamak için mümkün olduğunca çok süpernatant kaldırmak için süpernatant Aspire. - Her yıkanmış Pelet 300 μL Perm/Wash tampon resuspend ve bir 100 μm filtre üzerinden bir FACS tüp içine germek hücreleri büyük kümeleri için önce FACS Analizi gerin.
- PE kanalındaki FACS Aria akış sitometri üzerindeki hücreleri analiz edin. Her bir leke için en az 10.000 olayları analiz edin ve FSC-a/SSC-a analizi sayesinde olayları ayrıştırın, SSC-h/SSC-w tarafından izlenen FSC-w/FSC-h üzerinde gating tarafından hücre tekli seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
APS farklılaşma 24 h sonra, koloniler genellikle hPSC kolonileri circumscribes parlak sınır kaybı ile uyumlu farklılaşmış koloniler daha farklı bir morfoloji benimsemeye olacaktır. Morfolojik, ilkel çizgi hücreleri genellikle düzensiz sınırları var ve daha Spread ve hPSCs daha az kompakt-bu pluripotent epiblast hücreleri ayırt ve ilkel içine giriþ olarak epitelyal-mesenkimal geçiş uyarılıdır çizgi in vivo. Farklılaşma öncesinde hPSCs kolonisi boyutu çok büyükse, farklılaşmış hücreleri içeren bir overtly-yükseltilmiş merkezi olacaktır. Böyle büyük kümeleri içeren kültürler atılmalıdır, bu farklılaşmaz koloni merkezleri sonraki farklılaşma konacak gibi. Doğru boyut ve yoğunluğun kümeleri kaplama olsaydı, APS farklılaşma son derece tekrarlanabilir ve üniforma, bir 99.3 ± 0.1% MIXL1-Gfp+ ilkel çizgi nüfus (MIXL1 ilkel bir çizgi Marker)7üreten. Bazı hücre ölümünde APS farklılaşma 24 h sonra gözlenen unutmayın.
2. gün farklılaşma, ilkel çizgi hücreleri gün içine ayırt 2 kesin endoderm hücreleri, büyük çoğunluğu hangi ekspres SOX17 (Şekil 2) ve FOXA2. 14 hESC ve hiPSC hatları (H1, H7, H9, HES2, HES3, BJC1, BJC3, HUF1C4 ve HUF58C4 dahil) ile bağımsız deneylerde düzinelerce, bu yaklaşım scalably, tutarlı ve verimli bir şekilde saf kesin endoderm nüfus (94,0% ± 3,1%)7oluşturulur. Hpscs gelen kesin endoderm oluşturmak için bu yöntem daha yüksek yüzdeleri CXCR4+PDGFRA- endodermal nüfus diğer endoderm şekillendirme yaklaşımlar2,14karşılaştırıldığında verir.
3. gün farklılaşma ile endoderm, çokgen formda görünen foregut progenenlerine ayrılır (Şekil 1). Daha sonra, 6 gün farklılaşma ile foregut progenatörler AFP, TBX3 ve HNF4A (Şekil 3) ifade karaciğer tomurcuk ataları ayırt. Üç HESC hatları (H1, H7, H9 hescs) boyunca, bu yöntem, 6 AFP+ karaciğer ataları form 89.0 ± 3.1% verimlilik (Şekil 2) oluşturur. Son olarak, hPSCs karaciğer farklılaşma 18 gün sonra, ALBUMıN+ hepatosit benzeri hücreler görünür. Morfolojik olarak, epitelyal görünürler, safra kanallarının anımsatan parlak sınırlar oluşturur (Şekil 1). Bu aşamada, günün sitoplazması 18 hPSC-türetilen hepatositler çekirdeğden daha koyu görünür (Şekil 1).
Şekil 1: farklılaşma stratejisi ve farklılaşılmış hPSCs morfolojisi, endoderm ve hepatosit benzeri hücreleri ayırt etmek Için şematik. Farklılaşma süreci ve zaman çizelgesi gösterildi. Kısaltmalar: d = gün, hPSC = insan pluripotent kök hücreleri, APS = anterior ilkel çizgi, DE = kesin endoderm, PFG = posterior foregut, LB = karaciğer tomurcuk progenitors, HP = hepatosit progenitors, HEP = hücreler gibi hepatosit. Ölçek çubuğu = 400 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: gün yüzdesi 1 MIXL1 + ilkel çizgi, gün 2 SOX17 + kesin (def) endoderm, gün 6 AFP + karaciğer tomurcuk ataları ve Alb + hepatosit nüfusu FACS tarafından gösterildiği gibi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: gün 6 karaciğer progeninlerin Immünostatik analizi. hPSC ilk karaciğer tomurcuk transkripsiyon faktörleri HNF4A (kırmızı), TBX3 (yeşil) yanı sıra sitoplazmik karaciğer tomurcuk Marker AFP (kırmızı) için immünostene edildi karaciğeri tomurcuklanmış progenitors içine ayırt edildi. Çekirdekler, toplam hücre numarasını değerlendirmek için DAPı (mavi) ile karşı koyanmış. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: hPSCs hücre tohumlama yoğunluğu. Hücrelerin düşük (sol) ve uygun (orta ve sağ) yoğunluğu süloş. Ölçek çubuğu = 1.000 μm. Ok hücreleri koloniler arasında "köprüler" işaret. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Temel orta | Temel orta bileşimi |
| CDM2 | 1:1 ıMDM/F12, 0,1% m/v PVA, 1% konsantre lipidler, 0,7 μg/mL insan rekombinant Insülin, 15 μg/mL transferrin, 18 nM 1-thioglycerol |
| CDM3 | 1:1 ıMDM/F12, 0,1% m/v PVA,% 1 konsantre lipidler,% 10 KOSR |
| CDM4 | 1:1 ıMDM/F12,% 1 konsantre lipidler, 15 μg/mL transferrin |
| CDM5 | CMRL,% 10 KOSR,% 1 Glutamax |
Tablo 1: kimyasal olarak tanımlanan medya CDM2, CDM3, CDM4 ve CDM5 bileşimi.
| Farklılaşma aşamaları | Süre | Faktörler | Doz | Temel orta |
| 1. gün Ilkel Streak | 1 gün boyunca | Aktivin | 100 ng/mL | |
| CHIR99201 | 3 μM ' si | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nM | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| 2. gün kesin endoderm | 1 gün boyunca | Aktivin | 100 ng/mL | |
| DM3189 | 250 nM | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nM | |||
| 3. gün posterior foregut | 1 gün boyunca | A83-01 | 1 μM cinsinden | |
| Türkçe | 75 nM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| Gün 6 karaciğer Bud ataları | 2 gün boyunca | Aktivin | 10 ng/mL | |
| C59 | 1 μM cinsinden | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| Forskolin | 1 μM cinsinden | |||
| 1 gün boyunca | Aktivin | 10 ng/mL | ||
| CHIR99201 | 1 μM cinsinden | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| Forskolin | 1 μM cinsinden | |||
| 12. gün hepatik projenatörler | 6 gün var | BMP4 | 10 μg/mL | |
| Osm | 10 ng/mL | |||
| Deksametazon | 10 μM kadar | |||
| Forskolin | 10 μM kadar | CDM4 | ||
| Ro4929097 | 2 μM ' si | |||
| AA2P | 200 μg/mL | |||
| Insülin | 10 μg/mL | |||
| 18. gün hepatosit | 6 gün var | Deksametazon | 10 μM kadar | |
| Forskolin | 10 μM kadar | CDM4 veya | ||
| Ro4929097 | 2 μM ' si | CDM5 | ||
| AA2P | 200 μg/mL | |||
| Insülin | 10 μg/mL |
Tablo 2: farklılaşma ortamının bileşimi.
| Sorun | Olası neden | Proffered çözüm |
| Koloninin merkezindeki hücreler farklılaştırmaz | i) koloni büyüklüğü aşırı büyükse, büyük kolonilerin ortasındaki hücreler farklılaşma sinyallerine erişilemiyor | i) hücre sayımı technqiue kontrol edin. |
| ii) çok büyük koloniler oluşturan kuyu (veya çevre) merkezinde birlikte birleştirilmiş kümeleri düzensiz dağılımı | ii) kaplama sırasında kümeleri eşit olarak dağıtmak için çapraz moda plakayı sallayın ve kuluçta yerleştirmeden önce mikroskop altında kontrol edin | |
| iii) hücreler yetersiz farklılaşma sinyalleri aldı | iii) ayırt edici ortamlar için yeterli miktarda ekleyin: 12 kuyu plakasında iyi başına 1 mL orta ve 6-kuyu plakasında da 3 mL ekleyin | |
| Farklılaşma kötü verimlilik | i) hücre kültürünü kısmen ayırt etmeye başlama | i) farklı hPSCs yeni, yüksek kaliteli toplu kullanma |
| ii) koloniler çok yoğun bir şekilde tohumlandı, bir hücre tabakası oluşturarak | i) tohum hücreleri ve farklılaşma için doğru hücreleri saymak, ve onları dağıtmak için eşit sallayın | |
| iii) yetersiz yıkama nedeniyle kalıntı medya ve istenmeyen sinyaller yıkanmadı | iii) farklılaşma önceki aşamasından kalan mTeSR1 veya indüksiyon medya farklılaşması engeller; farklılaşma ortamı eklemeden önce ıMDM ile yıkama hücreleri | |
| iv) yıkama çok sert; uygunsuz yıkama koşulları ciddi hücre morfolojisi bozacak | iv) farklılaşma ortamını eklemeden önce ıMDM ile kısa bir süre yıkayın. Dpbs kullanımı (veya farklı Osmolarite veya soğuk medya ile medya) veya genişletilmiş yıkama, hücre Morfoloji ve canlılığı ödün verecektir | |
| v) uzun veya kısa süreli diferrelendirme aşamaları, tavsiye edilen fazla. | v) farklılaşma her aşaması için önerilen zamanlamalara uyun. |
Tablo 3: olası sorunlar ve olası nedenleri ve çözümleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem, karaciğer tomurcuk progenitors zenginleştirilmiş nüfus üretimi sağlar ve daha sonra hepatosit benzeri hücreler, hPSCs dan. İnsan karaciğer hücrelerinin zenginleştirilmiş nüfus oluşturmak için yeteneği bu tür hücrelerin pratik kullanımı için önemlidir. Önceki yöntemler hPSCs gelen hepatositler üretmek için karaciğer ve non-karaciğer hücreleri hem de içeren ezik hücre nüfus sağladı, kemirgenler içine transplantasyon üzerine, karaciğer dokusu ek olarak kemik ve kıkırdak vermiştir15. Bu nedenle non-karaciğer farklılaşma açık bastırılması uygulamalar çeşitli için uygun olabilir zenginleştirilmiş karaciğer nüfus oluşturmak için önemlidir.
Özellikle, ilk adımda hPSCs kontrollü kaplama verimli aşağı farklılaşma için gereklidir. Doğru bir şekilde farklılaşma için belirli bir yoğunlukta hPSCs plaka ve kaplama işlemi sırasında iyi veya plaka üzerinde bu hPSCs eşit dağıtmak için önemlidir. Örneğin, her iyi bir 12-kuyu plaka, tohum 160.000 için 250.000 hPSCs iyi başına; Genel olarak, hücre tohumlama yoğunluğu titrat ve sonuçta her hücre hattı için uygun hücre yoğunluğu test etmek zorunludur (Şekil 4). Eğer çok fazla hpscs iyi başına seribaşı, onlar büyük kolonilerin ortasında hücreler çevre yakın hücrelere kıyasla farklılaşma sinyalleri için daha az erişilebilir olduğu gibi, farklılaşma verimliliklerini olumsuz etkileyecek büyük koloniler, oluşturacaktır; heterojen boyutlarda koloniler de benzer konular sunacak. Hücre yoğunlukları çok düşükse (örn. 200.000 altındaki hücreler/12-kuyu plakasının kuyusu), farklılaşma için yeterli malzeme olmayabilir ve geniş hücre ölümü görülebilir. Yukarıda açıklanan geçiş ve tohumlama yöntemi, aşağı yukarı ayrım için uygun boyutta hPSC kümeleri üretir.
Bu yöntemin bir sınırlaması, oluşturulan hepatosit benzeri hücreler yetişkin hepatositler için aynı değildir, hPSC türeyen hücreler hala olgunlaşmamış karaciğer Marker AFP ifade gibi. Dahası, CYP3A4 enzimatik aktivite yaklaşık 55 kez bu hPSC-türetilen hepatosit benzeri hücrelerde daha düşük primer yetişkin insan hepatositlere kıyasla. Yaklaşan bir meydan okuma bu hPSC-türeyen hepatosit benzeri hücreler tam teşekküllü, Yetişkin benzeri hücrelere olgun olacaktır. İkinci bir sınırlama, verimli farklılaşma hücrelerinin başlangıç yoğunluğuna son derece bağımlıdır ve bu nedenle, önerilen yoğunlukta tohum ve plaka boyunca eşit şekilde dağıtılması çok önemlidir (Tablo 3).
Genel olarak, bu protokol en az 3 HPSC hatları 89.0 ± 3.1% saflık karaciğer tomurcuk ataları ve hepatosit benzeri hücreler üretir. Ikinci olarak, hepatosit benzeri hücreler karaciğer enzimleri ifade, insan ALBUMıN salgılanan ve daha yüksek düzeyde karaciğer genleri ifade farklılaşma yaklaşımlar kullanılarak oluşturulan hücrelere göre. Son olarak, sonuç hepatosit benzeri hücreler sadece bazı hepatosit fonksiyonları içinde vitro sergiler, ama en önemlisi onlar bir dereceye kadar fonksiyon olabilir Vivo, onlar kronik karaciğer hasarı bir fare modelini diopter ve kısa vadeli hayatta kalma geliştirmek2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz tartışmalar için Bing Lim için teşekkür ederiz ve Stanford kök hücre Biyoloji Enstitüsü & rejeneratif tıp altyapı desteği için. Bu çalışma California Enstitüsü rejeneratif tıp (DISC2-10679) ve Stanford-UC Berkeley Siebel kök hücre Enstitüsü (L.T.A. ve K.M.L.) ve Stanford Beckman merkezi moleküler ve genetik tıp yanı sıra Anonymous tarafından desteklenmektedir Baxter ve DiGenova aileleri (K.M.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| Human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| Human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| Human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
References
- Bernal, W., Wendon, J. Acute Liver Failure. New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Fisher, R. A., Strom, S. C. Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results. Transplantation. 82, 441-449 (2006).
- Dhawan, A. Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges. Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).
- Salama, H., et al. Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases. Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).
- Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice. Differentiation. 98, 25-34 (2017).
- Loh, K. M., et al. Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
- Zhao, D., et al. Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects. Cell Research. 23, 157-161 (2012).
- Si Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 297-305 (2010).
- Carpentier, A., et al. Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen. Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).
- Avior, Y., et al. Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes. Hepatology. 62, 265-278 (2015).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).
- Haridass, D., et al. Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice. The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).
