Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בחינה כמותית של רגישות לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae ATP-ניצול אגרגטים באמצעות מבחני מסחרי, חי/מת מכתים

Published: February 8, 2019 doi: 10.3791/58978
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2
1Department of Marine Biotechnology and Resources, National Sun Yat-Sen University, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

Summary

Assay ATP-מדידה פשוטה של חיים/מתים מכתים שיטת שימשו כדי לכמת והמחש Neisseria gonorrhoeae הישרדות לאחר הטיפול עם צפטריאקסון. פרוטוקול זה ניתן להרחיב לבחון את ההשפעות מיקרוביאלית של כל אנטיביוטיקה, ניתן להשתמש כדי להגדיר את הריכוז המעכב מינימלי של אנטיביוטיקה biofilms חיידקי.

Abstract

הופעתה של עמידים לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae (GC) איום בריאותי ברחבי העולם, מדגיש את הצורך לזהות אנשים נכשלים טיפול. חיידק גראם שליליים זה גורם זיבה באופן בלעדי אצל בני אדם. במהלך זיהום, הוא מסוגל טופס אגרגטים ו/או biofilms. הבדיקה הריכוז המעכב המינימלי (MIC) משמש כדי לקבוע את הרגישות לאנטיביוטיקה וכדי להגדיר את הטיפול המתאים. עם זאת, המנגנון של בהשמדה ויוו ויחסה תוצאות מעבדה לא ידועים. פותחה שיטה זה בוחן כיצד GC צבירת משפיע על רגישות לאנטיביוטיקה ואת מציגה את הקשר בין גודל צבירה של רגישות לאנטיביוטיקה. כאשר הצבירה GC, הם עמידים יותר בפני אנטיביוטיקה להרוג, עם חיידקים במרכז ששרדו צפטריאקסון טיפול טובים יותר מאלו בפריפריה. הנתונים מצביעים כי צבירת gonorrhoeae ש יכול להפחית את הרגישות צפטריאקסון, אשר אינה משתקפת באמצעות השיטות מיקרופון המבוסס על צלחת אגר רגיל. השיטה שבה נעשה שימוש במחקר זה יאפשר לחוקרים לבדוק את הרגישות בקטריאלי בתנאים הרלוונטית קלינית.

Introduction

זיבה היא שנפוצה במגע מיני זיהום (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), diplococcal חיידק גראם שליליים, הוא סוכן סיבתי של המחלה. סימפטומים של זיהום הגניטלי עלולה לגרום לכאב במהלך מתן שתן מוכללת מכאבים באברי המין, הפרשות השופכה. זיהום לעיתים קרובות ללא תסמינים2,3,4,5, זה מאפשר קולוניזציה המורחבת. זיהומים אלה ללא טיפול הם דאגה בריאות קשות, הן בעלות פוטנציאל כדי להקל על שידור של האורגניזם, זה יכול לגרום לסיבוכים כגון מחלה דלקתית של האגן (PID), והופץ על ידי זיבה הזיהום (DGI)6. זיבה עמידים לאנטיביוטיקה היא משבר בריאות הציבור העיקריים של הגדלת נטל חברתי-כלכלי7. הרגישות מופחתת צפלוספורינים הביא שינוי משטר טיפול אנטיביוטיקה יחיד לטיפול כפול, המשלב azithromycin או דוקסיציקלין עם צפטריאקסון8. הכשל מוגברת של צפטריאקסון, azithromycin9,10, בשילוב עם זיהומים אסימפטומטיים, מדגיש את הצורך להבנת כשלים טיפול בזיבה.

המבחן הריכוז המעכב המינימלי (MIC), כולל אגר דילול ולדיסק דיפוזיה בדיקות, שימשה הבדיקה הרפואית סטנדרטי לזיהוי עמידות בפני אנטיביוטיקה. עם זאת, לא ברור אם הבדיקה מיקרופון משקף חיידקים עמידות לאנטיביוטיקה ויוו. היווצרות biofilms חיידקי תורמת ההישרדות של החיידקים בנוכחות ריכוזים אחרים של אנטיביוטיקה: הבדיקה מיקרופון אין אפשרות לזהות את אפקט11. כי GC יכול ליצור biofilms על משטחים הרירית12, אנחנו משערים אנטיביוטיקה זה הרגישות בתוך אגרגטים יהיה שונה כי ראיתי ב- GC בודדים. בנוסף, מחקרים הראו כי שלב שלוש מולקולות על פני משתנה, פילי, חלבונים הקשורים אטימות (אופה), lipooligosaccharides (לוס), המסדירים את האינטראקציות הבין-חיידק, להוביל אגרגטים בגדלים שונים13, 14 , 15. התרומה של רכיבים אלה כדי עמידות לאנטיביוטיקה לא נבדקה עקב המחסור של שיטות נאותה.

כיום, ישנן מספר שיטות למדידת biofilm מיגור. כמותיים השיטה הנפוצה ביותר היא על ידי מדידת שינויים ביומסה באמצעות קריסטל ויולט מכתים16. עם זאת, השיטה דורשת משמעותי מניפולציה ניסויית, אשר יכולים ליצור פוטנציאל שגיאות ניסוי חזרה17. שיטת צביעת חי/מת המשמשת כאן מאפשר הדמיה של חיידקים מתים וחיים והפצה שלהם בתוך biofilm. עם זאת, המבנה biofilm יכול להוות מכשול פיסי אשר מפחית את צבען חדירה. לכן, לכמת חיידקים חיים/מתים בתוך קבוצה, ההכתמה היא מוגבלת biofilms קטן או קודמן-microcolonies או הסיכומים שלה. שיטות אחרות, לרבות אגר דילול ולדיסק דיפוזיה הבדיקות, אינם יכולים למדוד את ההשפעות של צבירה. לבחון GC הרגישות תוך צבירת לאחר חשיפה לאנטיביוטיקה, שיטה אידיאלית צריך לקיים את שניהם assay כמותיים שיכול למדוד לחיות חיידקים והמחש ההפצה שלהם.

ההליך המתואר כאן משלב המדידה של ATP-ניצול, חי/מת מכתים הנועד באופן כמותי, בחנו ויזואלית GC הרגישות בתוך אגרגטים בנוכחות אנטיביוטיקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

תחזוקה כללית של זנים GC

  1. פסים gonorrhoeae ש זנים על אגר חוזרת עם 1% קלוג תוספי תזונה18 (טבלה 1, בטבלה 2) ממניות מקפיא, דגירה 37 ° C עם 5% CO2 במשך 16-18 ח' שימוש MS11 לבטא משתנה-שלב Opa (MS11Opa +), לא אופה (MS11ΔOpa), או לוס קטום (MS11ΔLgtE).
  2. בזהירות לבחור pili שלילי (המושבה ללא קצה כהה) או חיובית (המושבה עם קצה כהה) מושבות מהמאמץ כל מבוסס על המושבה מורפולוגיה19 באמצעות מיקרוסקופ אור ויבתר פס על גבי צלחת חוזרת חדשה.
  3. דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 16-18 שעות לפני השימוש.

2. הכדאיות כימות של הצטברויות של GC

  1. לאסוף GC באמצעות של המוליך סטרילי. ספוגית GC מהצלחת ו- GC להשעות מחדש במרק ומחוממת מראש (GCP, טבלה 3) בתוספת NaHCO 4.2%3 ו- 1% קלוג פתרונות18. השתמש ספקטרופוטומטר באורך-גל של 650 nm (OD650 1 = ~ 1 x CFU 109/mL) כדי לקבוע ריכוז חיידקים על תנאי.
  2. התאם את הריכוז של GC ~ 1 x 108 CFU/mL.
  3. להוסיף µL 99 של השעיה GC מנוכי עונתיות לתוך בארות של צלחת 96-ובכן.
  4. דגירה את הצלחת. בשביל 6-אייץ ' ב 37 ° C עם 5% CO2 כדי לאפשר את החיידקים להפעיל עליה פונקציית צבירה.
  5. להוסיף 1 µL של טורי צפטריאקסון מדולל (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0.2 µg/mL) כל טוב. להשאיר מספר בארות לא מטופל לשמש כפקדי.
  6. דגירה את הצלחת במשך 24 שעות ביממה ב 37 ° C עם 5% CO2.
  7. Sonicate התליה 3 פעמים ב מכל קידוח עבור 5 s ב 144 W ו-20 קילו-הרץ.
  8. להוסיף 100 µL של ניצול ATP זמינים מסחרית, זוהר ריאגנט לבאר כל, פיפטה למעלה-למטה עבור 3 פעמים, ואת תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2.
  9. בזהירות להעביר µL 150 של תערובת מכל קידוח לתוך באר חדשה ב microplate שחור 96-ובכן ולהימנע היכרות עם בועות.
  10. למדוד את ספיגת כל הבאר-560 nm באמצעות קורא צלחת.
  11. לחשב שיעור ההישרדות לפי היחס של הקריאה שהושג לאחר הטיפול צפטריאקסון טורי לקריאת מבארות ללא טיפול.

3. קרינה פלואורסצנטית ניתוח מיקרוסקופי של חי/מת האגרגטים GC

  1. לאסוף GC באמצעות של המוליך סטרילי. ספוגית GC מהצלחת ו- GC מחדש להשעות מראש ומחוממת GCP מדיה בתוספת 1% קלוג תוספי תזונה.
  2. לקבוע את מספר החיידקים על ידי ספקטרופוטומטר באורך-גל של 650 nm ולהתאים את הריכוז של GC ~ 1 x 107 CFU/mL.
  3. להוסיף µL 198 GC השעיה לתוך צ'יימברס 8-ובכן coverslip למטה.
  4. דגירה התא עבור 6-אייץ ' ב 37 ° C עם 5% CO2 כדי לאפשר היווצרות צבירה.
  5. להוסיף 2 µL של צפטריאקסון (µg 100/mL או דילולים שונים) כל טוב בתוך בכל מצב צבירה. תקופת דגירה של הזמן המבוקש ב 37 ° C עם 5% CO2.
  6. הוסף µL 0.6 תערובת פתרון מכתימים חי/מת לבאר כל ' תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2.
  7. רוכשים את Z-סדרת תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (מיקרוסקופ המקביל יכול לשמש).
  8. לנתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ למדידת גודל אגרגטים GC היחס עוצמת קרינה פלואורסצנטית (FIR) של חיים-אל-מת מכתים במצטבר לכל.

4. תמונות ניתוח

  1. הערכה של גודל האגרגטים חיידקי.
    1. פתח ImageJ ופתח תמונה על-ידי גרירת קובץ תמונה מסוג raw לשורת התפריטים ImageJ.
    2. לחץ על קווים חופשיים בשורת התפריטים ImageJ ותזיזו את האזור של כל מצבור בתמונה.
    3. לחץ על ניתוח | מדד בשורת התפריטים ImageJ.
    4. להשיג את המספר בחלון חדש תחת העמודה באזור .
  2. כימות של חיים-אל-מת יחס של הסיכומים
    1. פתח ImageJ ופתח תמונה על-ידי גרירת קובץ תמונה מסוג raw לשורת התפריטים ImageJ.
    2. לחץ על ניתוח | לקבוע מידות בשורת התפריטים ImageJ.
    3. בדוק את צפיפות משולבים בחלון המוקפץ ' ולחץ על ' אישור'.
    4. לחץ על התמונה | צבע | ערוצי כלי שורת התפריטים, בחר צבע.
    5. בדוק בערוץ 1 כמו זריחה על חיידקים חיים מכתים.
    6. לחץ על קווים חופשיים בשורת התפריטים ImageJ ותזיזו את האזור של כל מצבור.
    7. לחץ על ניתוח | מדד בשורת התפריטים ImageJ.
    8. להשיג את המספר תחת העמודה IntDen .
    9. בדוק בערוץ 2 כמו זריחה על צביעת חיידקים מתים. חזור על שלבים 4.2.6-4.2.8.
    10. להשיג את היחס לחיות-אל-מת על-ידי חלוקת מספר מהשלב 4.2.8 לפי מספר מהשלב 4.2.9.
  3. ניתוח סטטיסטי
    1. פתח GraphPad מנסרה, הזן את המספרים המתקבלים ImageJ אל העמודה הרצויה.
    2. לחץ על Analyze ובחר t בדיקות תחת העמודה ניתוחים.
    3. בדוק את העמודה הרצויה עבור השוואה ' ולחץ על ' אישור'.
    4. להשיג ערך P מתחת לחלון ניתוח .
    5. בחר את הרגרסיה הליניארית תחת ניתוחים XY מ שלב 4.3.3
    6. להשיג את R בריבוע ואת ערך-P מתחת לחלון ניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שתי שיטות הועסקו: assay ניצול של ATP ואת וזמינותו מוכתמים חי/מת. התוצאות ניתן להיות משולב או בנפרד המשמש לבחינת הישרדות חיידקי בתוך אגרגטים לאחר טיפול אנטיביוטי. ATP הניצול וזמינותו הוכח כדי למדוד במדויק קיימא חיידקים S. aureus biofilms20,21. כאן, פיל + MS11Opa + זן שימש לבחון את התפקיד של צבירת GC רגישות לאנטיביוטיקה. Non-המצטברים MS11Opa + פיל +, MS11Opa צבור + פיל +, או המצטברים, ואז ע י sonication MS11Opa + לפיל + שטופלו דילולים טורי של צפטריאקסון, ATP נמדדת רמה (איור 1א'). השוואת שיעור הישרדות עם או בלי טיפול אנטיביוטי, GC מראש צבורים היו הישרדות גבוה יותר באופן משמעותי מאשר GC שאינם לצבירה או משובשות צבירה עם שווה או מעל µg/mL 0.015 של צפטריאקסון (MIC אגר דילול במבחן ( בטבלה 4)). MS11Opa + פיל-, MS11ΔOpa או MS11ΔLgtE, אשר יש דילול אגר מיקרופון (טבלה 4), אותו אבל טופס אגרגטים קטנים יותר, וצילומי בהשוואה לפיל + MS11Opa + (איור 1B). פיל MS11Opa + +, ויוצרים אגרגטים גדולים יותר, הייתה הרמה הגבוהה ATP עם טיפול צפטריאקסון מאשר זנים מוטציה.

חי/מת מכתים שימש מספר מחקרים biofilm/צבירת-הקשורים22,23. כדי לקבוע את ההשפעה של צבירת, מראש המצטברים MS11Opa + פיל + היה מטופל עם או בלי צפטריאקסון עם תמונה. פעולה זו מאפשרת הדמיה (אשר ניתן לכמת) והן את ההפצה של GC בשידור חי ומת לאחר טיפול אנטיביוטי (איור 2א- השאיר שני לוחות). חיידקים מתים (אדום) היו ממוקמות בעיקר השכבות החיצוניות ואילו GC בשידור חי (ירוק) היו ממוקמים בעיקר בתחום הליבה של אגרגטים צפטריאקסון מטופלים. הליך זה בוצעה עם MS11Opa + פיל-, MS11ΔOpa או MS11ΔLgtE, כדי לבחון את גודל צבירת וקצב הישרדות (איור 2א). MS11Opa + לפיל + הוצגה צורה הגדול ביותר, MS11Opa + פיל-מצרפי הקטן ביותר (איור 2א, ב'). MS11Opa + לפיל + אגרגטים היו עדיין בחיים בשכבת הליבה ואילו GC ב מצרפי רופף קטן של MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + פיל-, MS11ΔLgtEPil + היו מתים (איור 2א, ג). בהתבסס על הגודל ועל הישרדות, ניתן להתוות גרף המתאם לבחון את קשרי הגומלין בין גודל צבירת והישרדות לאנטיביוטיקה (איור 2D).

Table 1
טבלה 1: מתכון 1 ליטר צלחת אגר חוזרת.

Table 2
טבלה 2: מתכון 1 ליטר של 100 x תוספת של קלוג.

Table 3
טבלה 3: מתכון 1 ליטר של מדיה GCP התפתחות חיידקים.

Table 4
בטבלה 4: מינימום הריכוז המעכב זנים GC שטופלו צפטריאקסון. פיל MS11Opa + +, MS11ΔOpa, MS11ΔLgtE ו- MS11Opa + פיל - היו מבוגרים, הושעו ב- GCP. אגר דילול הבדיקה בוצעה ואז עם ריכוז טורי של צפטריאקסון מ- 0.0016 - 0.25 µg/mL.

Figure 1
איור 1 : נציג נתונים של שיעור ההישרדות של GC צבורים תחת טיפול צפטריאקסון מאת ATP-הניצול וזמינותו. (א) הישרדות לדרג השוואה של פיל + MS11Opa + ההשעיה ללא מראש צבירה, צבירה מראש עבור 6-אייץ ' או שיבוש לאחר סיכום מראש להשוואה שיעור הישרדות 6-אייץ (B) של 6 שעות המצטברים MS11Opa + לפיל + עם MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + פיל, או MS11ΔLgtEPil +- הראו ממוצע הערכים (±SD) מתקבלים מן 3 ניסויים עצמאית. p < 0.001; p < 0.01; p < 0.05. איור זה היה שפורסמו בעבר 24 והוא משמש עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : נציג נתונים של התפלגות חיידקים חיים/מתים בתוך אגרגטים תחת טיפול צפטריאקסון. (א) קדם המצטברים לפיל + MS11Opa +, MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + פיל-, או MS11ΔLgtEPil + היה גם מתפשט בתוך נוכחות או היעדרות של צפטריאקסון 1 µg/mL עבור ה 2 היו אז צבעונית להמחיש קיימא (ירוק) ו- GC המלח (אדום) אגרגטים דמיינו בעזרת מיקרוסקופ קונפוקלי קרינה פלואורסצנטית סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. תמונות ואז נותחו עבור גודל צבירה (B) ו- (ג) יחס של חיים-אל-מת GC (D) גרף המתאם ואז נוצר. הראו ממוצע הערכים (SD) מתקבלים מן > 40 תמונות של 3 ניסויים עצמאית. p < 0.001; p < 0.01; p < 0.05. איור זה היה שפורסמו בעבר 24והוא משמש עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חיידקים יכולים ליצור biofilms במהלך זיהום של הגוף האנושי. בדיקת מיקרופון מסורתיות אינן משקפות בהכרח את הריכוז הדרוש כדי למגר חיידקים ממבנה biofilm. כדי לבדוק את ההשפעות antimicrobials על ממבנה biofilm, שיטות בהתבסס על biofilm ביומסה, כמו גם plating CFUs יכול להיות מוטעים עקב ההשפעה של מבנה biofilm. לדוגמה, שיטת ציפוי פועלת רק אם biofilm עלולות להפגע. לפיכך, CFU שהושג עשוי להיות נמוך יותר מאשר מספר חיידקים מעשית בפועל. להמחיש חיידקים מתים וחיים בתוך biofilm הוקמו למדידת ההישרדות של החיידקים בתוך biofilm, עם זאת, בהתאם מבנה צפיפות של biofilm, ההכתמה עלול להיכשל לחדור לתוך biofilm התוצאה שיעור הישרדות לא מדויקות ולא הערכתי כראוי.

השיטה כאן משתמש כמותית והן assay ויזואליזציה כדי למדוד הישרדות חיידקי לאחר טיפול של אגרגטים. היתרון של שיטה זו הוא כי זה מודד את הישרדות חיידקי בסביבה קרובה יותר מה שנראה ב זיהום אמיתי. שיעור הישרדות ההבדלים בין חיידקים צבור שאינם מצטברים יאפשר לנו לקבוע אם המיקרופון במבחנה בקורלציה עם המיקרופון ויוו.

ATP הניצול וזמינותו, אשר מודד ייצור ATP, באפשרותך למדוד באופן כמותי את ההישרדות של אגרגטים. וזמינותו רגיש יותר, באפשרותך להבחין בין הודעת הישרדות בין הבדלים קטנים בריכוז לאנטיביוטיקה, לעומת מבחני דומים אחרים. עם זאת, עקב הרגישות הגבוהה של זה וזמינותו, הבטחה של פירוק תא החיידק הוא קריטי. לכן, צעד sonication היה בשימוש. בנוסף, לא ניתן להשתמש בשיטה זו כדי למדוד את הישרדות חיידקי ויוו בשל כמות גדולה של ATP המייצרים התאים המארחים זה יכול להסתיר. את רמת ATP חיידקי. יתר על כן, האינטראקציה של התאים המארחים עם חיידקים עשוי להשפיע על ייצור ATP חיידקי. שימוש assay הזה על חיידקים עם פיגמנטים עשויים להיות הגבלת כפי הפיגמנטים עלולים להפריע הקריאה.

הכתם חי/מת כבר בשימוש נרחב במחקרים biofilm. עם זאת, החדירה של צבעים צביעת ייתכן כתם רק חיידקים החיצוני ביותר, ואילו הליבה עלול להיות מוכתמים. לכן, זה יכול לשמש רק עבור ויזואליזציה אך לא כמת, עקב הפצה אחידה של לצבוע. אנו המשמש אגרגטים קטנים זה מכתים, הפגינו ש-assay זה יכול לשמש כדי לכמת את ההישרדות הכוללת חיידקי בתוך מצרפי. יתר על כן, הפקדים ואתאיזם נדרשים עבור התאמת את הריכוז של לצבוע חיידקים שונים.

בשילוב עם פרוטוקול מיקרופון, ATP ניצול הכתם assay, חי/מת יכול לשמש שיטה יעילה לנתח באופן כמותי, מבחינה ויזואלית N.gonorrhoeae , כמו גם הצטברויות של חיידקי25,26. היישום של פרוטוקול משולב יכול לספק הבנה טובה יותר של היווצרות המחלה יחד עם שימושים מגוונים שלה והתרופות הקרנה המבוססת על חיידקים biofilms. שיטה זו עשוי לשקף באופן מדויק יותר את ויוו מיקרופון של אנטיביוטיקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של המכון הלאומי לבריאות D.C.S., W.S. AI123340. ל', סי-וו. וו, איי. סי., והסתייעות E.N. ב חלק/להשתתף בתוכנית "בשנה הראשונה חדשנות & מחקר ניסיון" ממומן על ידי אוניברסיטת מרילנד. התורמים שחיים היה אין תפקיד לימוד עיצוב, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם, או אופן ההכנה של כתב היד. אנו להכיר UMD CBMG הדמיה הליבה עבור כל הניסויים מיקרוסקופ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x Kellogg's supplement
Agar United States Biological A0930
BacTiter Assay  Promega G8232
Ceftriaxone TCI C2226
Difco GC medium base  BD 228950
Ferric nitrate, nonahydrate  Sigma-Aldrich 254223-10G
Glucose Thermo Fisher Scientific BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder Fisher Scientific BP379-100
BacLight live/dead staining Invitrogen L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP329-1
Proteose Peptone  BD Biosciences 211693
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-10
Soluble Starch Sigma-Aldrich S9765
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754-5G
Equipment
Petri Dishes VWR 25384-302
8-well coverslip-bottom chamber  Thermo Fisher Scientific 155411
96-well tissue culture plates  Corning, Falcon 3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) Nuaire 32776
CO2 Incubator Fisher Scientific  Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber Leica SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate  Corning 3904
Glomax Illuminator  Promega E6521
Pipette tips (0.1-10 µL) Thermo Fisher Scientific 02-717-133
Pipette tips (1000 µL) VWR 83007-382
Pipette tips (200 µL) VWR 53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV Pharmacia Biotech 80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes VWR 21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) Sorenson BioScience 16070
Sterile polyester-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-122
Sonicator Kontes Equivelent to 9110001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
  2. den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
  3. Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
  4. Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
  5. Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , accessed Oct 5 (2011).
  6. Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
  7. Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
  8. Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
  9. Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
  10. Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
  11. Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
  12. Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
  13. Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  14. Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
  15. LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
  16. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).
  17. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  18. White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
  19. Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
  20. Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
  21. Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
  22. Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
  23. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
  24. Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
  25. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
  26. Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 144 זיבה עמידות לאנטיביוטיקה ירד הרגישות biofilm צבירה כימות ויזואליזציה
בחינה כמותית של רגישות לאנטיביוטיקה <em>Neisseria gonorrhoeae</em> ATP-ניצול אגרגטים באמצעות מבחני מסחרי, חי/מת מכתים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L. C., Wagner, J., Capino, A., … More

Wang, L. C., Wagner, J., Capino, A., Nesbit, E., Song, W., Stein, D. C. Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining. J. Vis. Exp. (144), e58978, doi:10.3791/58978 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter