Summary
采用简单的 atp 测量法和活死染色法对头孢曲松治疗后淋病奈瑟菌的生存率进行了定量和可视化。该方案可以扩展到检查任何抗生素的抗菌作用, 并可用于确定细菌生物膜中抗生素的最小抑制浓度。
Abstract
抗生素耐药淋病奈瑟菌 (gc) 的出现是一个世界性的健康威胁, 并突出表明需要确定未能通过治疗的个人。这革兰氏阴性细菌在人完全导致淋病。在感染过程中, 它能够形成聚集体和/或生物膜。最低抑制浓度 (mic) 测试用于确定对抗生素的敏感性, 并确定适当的治疗方法。然而, 体内根除的机制及其与实验室结果的关系尚不清楚。一种研究气相色谱聚集对抗生素敏感性的影响, 并显示聚集大小与抗生素敏感性之间的关系的方法。当 gc 集料时, 它们对抗生素的杀灭有更强的抵抗力, 中心中的细菌比外围的头孢曲松治疗效果更好。结果表明, 淋病 n 聚集可以降低其对头孢曲松的易感性, 这在标准的琼脂片 mic 方法中没有得到反映。本研究中使用的方法将使研究人员能够在临床相关条件下测试细菌敏感性。
Introduction
淋病是一种常见的性传播感染 (sti)1。淋病奈瑟菌(gc), 革兰氏阴性的双球菌细菌, 是这种疾病的病原体。生殖器感染的症状可导致排尿疼痛、全身生殖器疼痛和尿道分泌物。感染往往是无症状的 2,3,4,5, 这允许延长定植。这些未经治疗的感染是一个主要的健康问题, 因为它们有可能促进机体的传播, 这可能导致并发症, 如盆腔炎 (pid) 和传播的淋球菌感染 (dgi)6。抗生素耐药淋病是一个重大的公共卫生危机和日益沉重的社会经济负担7。头孢菌素易感性降低, 导致治疗方案从单一抗生素转变为双重治疗, 将阿奇霉素或多西环素与头孢曲松8结合起来。头孢曲松和阿奇霉素9,10的失败增加, 再加上无症状感染, 突出表明需要了解淋病治疗失败。
最低抑制浓度 (mic) 试验, 包括琼脂稀释和圆盘扩散试验, 已被用作识别抗生素耐药性的标准医学试验。然而, 目前尚不清楚 mic 测试是否反映了细菌在体内的抗生素耐药性。细菌生物膜的形成有助于细菌在抗生素的杀菌浓度存在下的生存: mic 测试无法检测到这种效果11。因为 gc 可以在黏膜表面形成生物膜 12, 我们假设聚集体中的抗生素敏感性将不同于在单个 gc 中看到的。此外, 研究表明, 三相可变表面分子, 皮利, 与蛋白相关的蛋白质 (opa) 和胶质类高糖, 调节细菌间相互作用, 导致不同大小的聚集体 13,14,15. 由于缺乏适当的方法, 这些成分对抗生素抗药性的贡献没有得到审查。
目前, 有几种方法来衡量生物膜的根除。最广泛使用的定量方法是用结晶紫罗兰色染色16测量生物量的变化。然而, 该方法需要大量的实验操作, 这可能会产生错误的实验重复17。这里使用的活体/死染色方法允许显示活细菌和死细菌及其在生物膜中的分布。然而, 生物膜结构可以作为一个物理屏障, 减少染料渗透。因此, 为了量化一个群体中的活死细菌, 染色仅限于小生物膜或其前世菌-微菌落或聚集物。其他方法, 包括琼脂稀释和圆盘扩散试验, 无法测量聚集的影响。要检测抗生素暴露后聚集中的 gc 敏感性, 一种理想的方法需要进行定量检测, 以测量活菌并显示其分布。
这里描述的程序结合了 atp 利用测量和活/死染色检测, 以定量和直观地检查在抗生素存在的集合体中的 gc 敏感性。
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Protocol
1. 气相色谱菌株的一般维护
- 在 gck 琼脂上加入 1% kellogg 补充剂18 (表 1, 表 2), 从冷冻库中补充 1% (表 1, 表 2), 并在16-18小时内孵育 37°c, 5% co 2. 使用 ms11 表示相位变量 opa (ms11opa+), no opa (ms11 opa ) ,或截断的 los (ms11 lgte)。
- 根据菌落形态 19, 利用解剖光显微镜和条纹到新的 gck 板上, 从每个菌株中仔细地选择皮里负 (没有暗边缘的菌落) 或阳性 (有暗边缘的菌落) 菌落.
- 使用前, 用 5% co 2 在37°c 下进行16至18小时的培养。
2. 气相色谱聚合的可行性量化
- 使用无菌施药器收集 gc。从板上擦拭 gc, 并在预热肉汤 (gcp,表 3) 中重新悬浮 gc, 辅以4.2% 的 nahco3和1% 的 kellogg 溶液18。使用波长为650纳米 (od650 的1 = ~ 1 x 109 chuml) 的分光光度法测定悬浮细菌的浓度。
- 将 gc 浓度调整为 ~ 1 x 10 8 chuml。
- 在96孔板的井中加入99μl 调整后的 gc 悬浮液。
- 在37°c 下将板材加氢 6小时, 用5% 的 co2 使细菌聚集。
- 在每口井中加入1μl 的系列稀释头孢曲松 (1000、100、50、25、12.5、6.2、3.1、1.5、0.8、0.4、0.2μg/ml)。不处理一些水井作为控制。
- 用5% 的 co2 在37°c 下将板材培育 24小时.
- 在每口井中对悬浮液进行 3次, 在 144 w 和20千赫的情况下保持5秒。
- 在每口井中加入100μl 的 atp 利用辉光试剂, 上下液器 3次, 并在37°c 孵育 15分钟, 用5% 的 co 2 孵育.
- 在96孔黑色微板中, 小心地将150μl 的混合物从每口井转移到新井中, 避免引入气泡。
- 使用板式读取器测量每口井在560纳米的吸收率。
- 用连续头孢曲松处理后获得的读数与未经处理的井的读数之比计算成活率。
3. 气相色谱集料活体死亡的荧光显微镜分析
- 使用无菌施药器收集 gc。从板中擦拭 gc, 并在预热的 gcp 介质中再悬浮 gc, 再添加1% 的凯洛格补充剂。
- 用分光光度法测定波长为650纳米的细菌数量, 并将 gc 浓度调整为 ~ 1x 10 7 chuml。
- 在8井盖层底部腔中加入198μl 的 gc 悬浮液。
- 在37°c 下, 用5% 的 co2 将腔体培养 6小时,以形成聚集。
- 在每个聚集条件下, 将头孢曲松 (100μgml 或各种稀释剂) 添加2μl。用 5% co2 在37°c 下孵化所需时间.
- 在每口井中加入0.6μl 的活/死染色液混合物, 在37°c 下孵育 20分钟, 其中5% 为co2。
- 使用共聚焦显微镜获取 z 系列图像 (可使用等效显微镜)。
- 利用 imagej 软件对图像进行分析, 以测量各集料中 gc 集料的大小和活死染色的荧光强度比 (fir)。
4. 图像分析
- 细菌聚集体大小的估计。
- 打开 imagej, 然后通过将原始图像文件拖到 imagej 菜单栏来打开图像。
- 单击 imagej 菜单栏中的"手绘线条" , 然后在图像中圈出每个聚合的区域。
- 单击 "分析"在 imagej 菜单栏中测量。
- 在"区域"列下的新窗口中获取数字。
- 聚合的活死比的量化
- 打开 imagej, 然后通过将原始图像文件拖到 imagej 菜单栏来打开图像。
- 单击 "分析"在 imagej 菜单栏中设置测量值。
- 检查弹出窗口中的集成密度, 然后单击 "确定"。
- 点击图片颜色选择通道工具在菜单栏中, 然后选择 "颜色"。
- 检查通道 1作为荧光的活菌染色。
- 单击 imagej 菜单栏中的"手绘线条" , 然后对每个聚合的区域进行圆圈。
- 单击 "分析"在 imagej 菜单栏中测量。
- 获取"intden " 列下的数字。
- 检查通道 2作为荧光的死细菌染色。重复步骤 4.2.6-4.2.8。
- 通过将数字4.2.8 与步骤4.2.9 的数字划分为 "活到死比率" 来获取。
- 统计分析
- 打开 "图形垫棱镜", 输入从 imagej 获得的数字到所需的列。
- 单击 "分析",然后在"列分析"下选择"t 测试"。
- 检查所需的列进行比较, 然后单击 "确定"。
- 获取"分析" 窗口下的 p 值。
- 从步骤 4.3.3中选择 xy 分析下的线性回归
- 获取 "分析" 窗口下的r-平方和 p 值。
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Representative Results
采用了 atp 利用法和活死染色法两种方法。这些结果可以结合使用, 也可以单独用于在抗生素治疗后检测集料中细菌的存活情况。atp 利用试验已被证明可以准确地测量 20、21牛科生物膜中的活细菌。在这里, MS11Opa+Pil+ 菌株被用来研究 gc 聚集在抗生素敏感性中的作用。非聚集 MS11Opa+Pil+、聚合 MS11Opa+Pil+ 或聚合, 然后被超声 MS11Opa+Pil+ 破坏, 用头孢曲松的连续稀释和 atp 水平测量 (图 1a) 进行处理。在比较抗生素治疗和不使用抗生素治疗的成活率时, 预配气相色在于非聚集或聚集干扰的 gc 的存活率明显高于头孢曲松的0.15μg/ml 等于或高于 (mic 来自琼脂稀释试验 ( mic) (表 4))。MS11Opa+Pil-、ms11 opa 或 ms11 lgte 具有相同的琼脂稀释 mic (表 4), 但形成较小的聚集体, 并与 MS11Opa+Pil+ 进行了比较 (图 1b)。头孢曲松处理的 MS11Opa+Pil+ 形成较大的集料, 其 atp 水平高于突变菌株。
在几项与生物膜聚合有关的研究中, 有 22,23。为了确定聚集的效果, 用或不使用头孢曲松进行了预聚合 MS11Opa+Pil+, 并进行了成像。这使得在抗生素治疗后的可视化 (可量化) 和活的和死的 gc 的分布 (图 2a-左两个面板)。死细菌 (红色) 主要位于外层, 而活的 gc (绿色) 主要位于头孢曲松处理的集料的核心。此过程是使用 MS11Opa+Pil-、ms11 opa 或 ms11 lgte 来检查聚合大小和存活率 (图 2a)。MS11Opa+Pil+ 被证明是最大和 MS11Opa+Pil-最小的聚合 (图 2a, b)。MS11Opa+Pil+ 集合体在核心层中仍然有效, 而 ms11 opepil +、MS11Opa+Pil-和 ms11 lgtepil + 的小松散集合中的 gc 已死亡 (图 2a, c)。根据大小和存活率, 可以绘制相关图来检验聚集大小与抗生素存活率之间的关系 (图 2d)。
表 1: gck 琼脂板 1 l 的配方。
表 2: 100x kellogg 补充的1升食谱。
表 3: gcp 细菌生长培养基1升的配方。
表 4: 头孢曲松治疗的气相色谱菌株的最低抑菌浓度.MS11Opa+Pil+、ms11 opa、ms11 lgte 和 MS11Opa+Pil 在 gcp 中生长和悬浮。然后用0.0016-0.25 μgl 的头孢曲松连续浓度进行琼脂稀释试验。
图 1: 用 atp 利用法处理头孢曲松对聚合气相色谱的成活率有代表性.(a) MS11Opa+Pil+ 悬浮液的存活率比较, 不进行预聚集, 预聚集 6小时, 或预聚集6小时后破坏. (b) 6小时的生存率比较, 6小时与 ms11 opil +, ms11opa +pil-或 ms11 lgtepil +。显示的是从三个独立实验中获得的平均值 (±sd)。p < 0.001;* *p < 0.01;*p < 0.05。此数字以前是 24 ,并在允许的情况下使用。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 头孢曲松处理后, 在集料内分布的活死细菌分布的代表性数据.(a) 预聚合 MS11Opa+Pil+、ms11 opapil +、MS11Opa+Pil-或 ms11 lgtepil + 在存在或不存在1μgl 头孢曲松的情况下孵育 2小时. 然后将骨料染色, 使其可视化 (绿色) 和死亡 (红色) gc, 并与共聚焦荧光显微镜。缩放条: 50μm. 然后分析图像的 (b) 聚集大小和 (c) 与活死 gc 的比率和 (d) 相关图, 然后创建一个相关图。显示的是从 > 40 张图像中获得的三个独立实验的平均值 (sd)。p < 0.001;* *p < 0.01;*p < 0.05。此数字以前是 24 ,并在允许的情况下使用。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
细菌在人体感染过程中可以形成生物膜。传统的 mic 检测可能无法反映消除生物膜中细菌所需的浓度。为了测试抗菌素对生物膜的影响, 由于生物膜结构的影响, 基于生物膜生物量和电镀 cfu 的方法可能是错误的。例如, 只有当生物膜可能被破坏时, 电镀方法才有效。因此, 获得的 cfu 可能低于实际的活细菌数量。在生物膜内发现了死亡和活细菌的视觉, 以测量生物膜内细菌的存活, 然而, 根据生物膜的结构和密度, 染色可能无法渗透到生物膜中, 从而导致不准确和低估的存活率。
这里的方法使用定量和可视化的方法来测量细菌的生存期治疗后的聚合物。这种方法的优点是, 它可以在更接近实际感染的环境中测量细菌的存活率。非聚集细菌和聚集细菌之间的存活率差异将使我们能够确定体外 mic 是否与体内 mic 相关。
测量 atp 产量的 atp 利用率测定可以定量地测量集料的成活率。该检测更敏感, 可以区分抗生素浓度的微小差异之间的生存, 与其他类似的检测。然而, 由于这种检测的高灵敏度, 保证细菌细胞裂解是至关重要的。因此, 使用了超声步骤。此外, 由于宿主细胞产生大量 atp, 可以掩盖细菌 atp 水平, 因此不能使用这种方法来测量细菌在体内的存活情况。此外, 宿主细胞与细菌的相互作用可能会影响细菌 atp 的产生。对含有色素的细菌进行这种检测可能会受到限制, 因为色素可能会干扰阅读。
活-死染色已被广泛应用于生物膜研究中。然而, 染色染料的渗透可能只染色最外层的细菌, 而核心可能不会染色。因此, 由于染料分布不均, 它只能用于可视化, 而不能用于定量。我们使用小的聚集体进行这种染色, 并证明这种检测方法可以用来量化聚集体中的细菌的整体存活。此外, 还需要负控制和阳性控制来调整不同细菌的染料浓度。
结合 mic 协议, atp 利用试验和生活染色可作为定量和直观分析淋病及其他细菌聚集的有效方法 25, 26.综合协议的应用可以使人们更好地了解疾病的形成及其在基于细菌生物膜的药物筛选中的多功能用途。这种方法可以更准确地反映抗生素的体内mic。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究所向 d. c. s. 和 w. s. ai123340 提供的赠款的支持。l.-c. w.、j. w.、a. c. 和 e. n. 在参与马里兰州立大学资助的 "第一年创新 & 研究经验" 项目中得到了支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备手稿方面没有任何作用。我们承认 umd cbmg 成像核心用于所有显微镜实验。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
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