Summary
En enkel mätning av ATP-analysen och live/dead färgning metod användes för att kvantifiera och visualisera Neisseria gonorrhoeae överlevnad efter behandling med ceftriaxon. Detta protokoll kan utvidgas till att undersöka de antimikrobiella effekterna av alla antibiotika och kan användas för att definiera den minsta hämmande koncentrationen av antibiotika i bakteriell biofilm.
Abstract
Uppkomsten av antibiotikaresistenta Neisseria gonorrhoeae (GC) är en världsomspännande hälsorisk och belyser behovet av att identifiera individer som misslyckas behandling. Denna gramnegativa bakterie orsakar gonorré uteslutande hos människor. Under infektion är det kunna bilda aggregat eller biofilmer. Det minsta hämmande koncentrationen (MIC) testet används för att fastställa känslighet för antibiotika och fastställa lämplig behandling. Mekanismen av utrotning i vivo och dess relation till laboratorieresultat är dock inte kända. En metod som undersöker hur GC aggregering påverkar Antibiotikakänslighet och visar förhållandet mellan sammanlagda storlek och Antibiotikakänslighet utvecklades. När GC samlade, de är mer motståndskraftiga mot antibiotika dödande, överlevande med bakterier i stadens ceftriaxon behandling bättre än de i periferin. Data visar att N. gonorrhoeae aggregation kan minska dess känslighet för ceftriaxon, vilket inte speglas med standard agar plattan-baserade MIC metoder. Den metod som används i denna studie gör att forskare att testa bakteriell känslighet under kliniskt relevanta förhållanden.
Introduction
Gonorré är en gemensam sexuellt överförbara infektioner (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), en gramnegativa diplococcal bakterie, är vilka smittämnen av denna sjukdom. Symtomen vid genital infektion kan leda till smärta vid urinering, generaliserad genital smärta och urinrörets ansvarsfrihet. Infektionen är ofta asymtomatiska2,3,4,5, och Detta tillåter för utökade kolonisering. Dessa obehandlade infektioner är ett betydande hälsoproblem, eftersom de har potential att underlätta överföring av organismen och detta kan leda till komplikationer såsom inflammatoriska sjukdomar (PID) och spridas uretra infektion (DGI)6. Antibiotikaresistenta gonorré är en större folkhälsokris och en ökande socioekonomisk börda7. Minskad känslighet för cefalosporiner har resulterat i behandlingsregim förändring från en enda antibiotika till dubbla terapi, som kombinerar azitromycin eller doxycyklin med ceftriaxon8. Ceftriaxon och azitromycin9,10, i kombination med asymtomatiska infektioner, ökad misslyckande belyser behovet av förståelse gonorré behandling misslyckanden.
Den minsta hämmande koncentrationen (MIC) test, inklusive agar utspädning och skiva diffusion tester, har använts som standard medicinsk test för att identifiera motstånd mot ett antibiotikum. Det är dock oklart om MIC testet återspeglar bakteriell antibiotikaresistens invivo. Bildandet av bakteriell biofilm bidrar till överlevnaden av bakterier i närvaro av bactericidal koncentrationer av antibiotika: MIC testning är inte upptäcka denna effekt11. Eftersom GC kan bilda biofilmer på slemhinnorna12, vi hypotes att antibiotika känslighet inom aggregat skulle vara annorlunda än sett i enskilda GC. Dessutom, har studier visat att trefas variabel yta molekyler, Pili, opacitet-associerade protein (Opa), och lipooligosaccharides (LOS), som reglerar mellan bakterien interaktioner, leda till olika storlek aggregat13, 14 , 15. bidraget av dessa komponenter till antibiotikaresistens har inte undersökts på grund av avsaknaden av lämpliga metoder.
För närvarande finns det flera metoder att mäta biofilm utrotning. Den mest använda kvantitativa metoden är genom att mäta förändringar i biomassa med hjälp av kristallviolett färgning16. Metoden kräver dock betydande experimentella manipulation, som potentiellt kan generera fel i experimentet upprepas17. Den live/dead färgningsmetod som används här tillåter visualisering av levande och döda bakterier och deras fördelning inom biofilmen. Dock kan biofilm struktur posera som en fysisk barriär som minskar dye penetration. Därför, för att kvantifiera live/dead bakterier inom en grupp, färgningen är begränsad till små biofilmer eller dess föregångare-microcolonies eller aggregeringar. Andra metoder, inklusive agar utspädning och skiva diffusion testerna, är inte kunna mäta effekterna av aggregering. För att undersöka GC känslighet inom aggregering efter antibiotika exponering, en idealisk metod skulle måste för att ha både en kvantitativ analys som kan mäta levande bakterier och visualisera deras fördelning.
Proceduren som beskrivs här kombinerar en ATP-utnyttjande-mätning och en live/dead färgning assay att kvantitativt och visuellt undersöka GC känslighet inom aggregat i närvaro av antibiotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. allmänt underhåll av GC stammar
- Strimma N. gonorrhoeae stammar på GCK agar med 1% Kellogg kompletterar18 (tabell 1, tabell 2) från frys bestånd och inkubera 37 ° C med 5% CO2 för 16-18 h. användning MS11 uttrycker fas-variabel Opa (MS11Opa +), ingen Opa (MS11ΔOpa), eller en stympad LOS (MS11ΔLgtE).
- Försiktigt plocka pili negativa (koloni utan mörk kant) eller positiva (koloni med mörk kant) kolonier från varje stam baserat på kolonin morfologi19 använda en dissekera ljusmikroskop och streak på nya GCK plåt.
- Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 för 16-18 h före användning.
2. bärkraft kvantifiering av GC aggregeringar
- Samla GC med en steril applikator. Provstickan GC från plattan och resuspendera GC i förväg värmde buljong (GCP, tabell 3) kompletteras med 4,2% NaHCO3 och 1% Kellogg lösningar18. Använda spektrofotometri vid en våglängd på 650 nm (en OD650 1 = ~ 1 x 109 CFU/mL) att bestämma koncentrationen av suspenderade bakterier.
- Justera GC koncentration till ~ 1 x 108 CFU/mL.
- Tillsätt 99 µL av justerade GC suspensionen i brunnar i en plattan med 96 brunnar.
- Inkubera plattan för 6 h vid 37 ° C med 5% CO2 att tillåta bakterier till samlade.
- Tillsätt 1 µL av seriell utspädda ceftriaxon (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6.2, 3.1, 1,5, 0,8, 0.4, 0,2 µg/mL) i varje brunn. Lämna några brunnar obehandlade för att tjäna som kontroller.
- Inkubera plattan för 24 h vid 37 ° C med 5% CO2.
- Sonikera upphängningen 3 gånger i varje brunn för 5 s på 144 W och 20 kHz.
- Tillsätt 100 µL av kommersiellt tillgängliga ATP utilization glöd reagens i varje brunn, Pipettera upp- och ner för 3 gånger, och inkubera i 15 minuter vid 37 ° C med 5% CO2.
- Försiktigt överföra 150 µL av blandningen från varje brunn i en ny brunn i en 96-väl svart mikroplattan och undvika att införa bubblor.
- Mät absorbansen hos varje brunn på 560 nm med plattan läsaren.
- Beräkna överlevnaden av förhållandet mellan det gradtal som erhålls efter serial ceftriaxon behandling till att läsa från obehandlade brunnar.
3. fluorescens Mikroskopisk analys av Live/Dead av GC aggregat
- Samla GC med en steril applikator. Provstickan GC från plattan och resuspendera GC i förväg värmde GCP media plus 1% Kellogg kosttillskott.
- Bestämma antalet bakterier genom spektrofotometri vid en våglängd på 650 nm och justera koncentrationen av GC till ~ 1 x 107 CFU/mL.
- Tillsätt 198 µL av GC suspensionen in i 8-väl täckglas-botten kammare.
- Inkubera i kammaren för 6 h vid 37 ° C med 5% CO2 att tillåta aggregering bildandet.
- Tillsätt 2 µL av ceftriaxon (100 µg/mL eller olika spädningar) i varje brunn inom varje aggregation tillstånd. Inkubera i önskad tid vid 37 ° C med 5% CO2.
- Tillsätt 0.6 µL av live/dead färgning lösning blandning i varje brunn och Inkubera under 20 minuter vid 37 ° C med 5% CO2.
- Förvärva Z-serie bilder med confocal Mikroskop (en motsvarande mikroskopet kan användas).
- Analysera bilderna med ImageJ mjukvara för mätning av storleken på GC aggregat och fluorescens intensitet förhållandet (FIR) live-till-döda färgning i varje aggregat.
4. bildanalys
- Uppskattning av storleken på bakteriell aggregat.
- Öppna ImageJ och öppna en bild genom att dra en raw-bildfilen till menyraden ImageJ.
- Klicka på Frihandslinjer i ImageJ menyraden och cirkeln området varje aggregeringsnivå i bilden.
- Klicka på analysera | Åtgärd i ImageJ menyraden.
- Ta reda på i ett nytt fönster under kolumnen område .
- Kvantifiering av live-till-döda förhållandet mellan aggregeringar
- Öppna ImageJ och öppna en bild genom att dra en raw-bildfilen till menyraden ImageJ.
- Klicka på analysera | Ange mått i ImageJ menyraden.
- Kontrollera integrerad tätheten i popup-fönstret och klicka på OK.
- Klicka på bilden för | Färg | Kanaler verktyg i menyraden och välj färg.
- Kontrollera kanal 1 som fluorescensen för levande bakterier färgning.
- Klicka på Frihandslinjer i ImageJ menyraden och cirkeln området varje aggregeringsnivå.
- Klicka på analysera | Åtgärd i ImageJ menyraden.
- Ta reda på under IntDen kolumn.
- Kontrollera kanal 2 som fluorescensen för döda bakteriell färgning. Upprepa steg 4.2.6-4.2.8.
- Få live-till-döda förhållandet genom att dividera antalet från steg 4.2.8 av från steg 4.2.9.
- Statistisk analys
- Öppna GraphPad Prism och ange de siffror som erhålls från ImageJ till önskad kolumn.
- Klicka på analysera och välj t tester under kolumnen analyser.
- Kontrollera att önskad kolumn för jämförelse och klicka på OK.
- Skaffa P-värde under fönster .
- Välj Linjär Regression under XY analyser från steg 4.3.3
- Hämta R-torget och P-värde under fönstret analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Två metoder var anställda: ett ATP utilization test och en live/dead färgning assay. Resultaten kan antingen tillsammans eller individuellt används för att undersöka bakteriell överlevnad inom aggregat efter antibiotikabehandling. ATP utilization analysen har visat att mäta exakt livskraftiga bakterier i S. aureus biofilmer20,21. Här, användes MS11Opa + Pil + stam för att undersöka rollen som GC aggregation i Antibiotikakänslighet. Icke-aggregerade MS11Opa + Pil +, aggregerade MS11Opa + Pil +, eller aggregerade och då störs av ultraljudsbehandling MS11Opa + Pil + behandlades med seriespädningar av ceftriaxon och ATP nivå mäts (figur 1A). Vid jämförelse mellan procent överlevnad med och utan behandling med antibiotika, hade försammanställda GC betydligt högre överlevnad än icke-aggregerade eller aggregering-stört GC med lika eller bättre än 0,015 µg/mL ceftriaxon (MIC från agar utspädning test ( Tabell 4)). MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa eller MS11ΔLgtE, som har samma agar utspädning MIC (tabell 4), men form mindre aggregat, undersöktes och jämfört med MS11Opa + Pil + (figur 1B). MS11Opa + Pil +, bildar större aggregat, hade den högre ATP-nivån med ceftriaxon behandling än de muterade stammarna.
Live/dead färgning har använts i flera biofilm/aggregation-relaterade studier22,23. Att bestämma effekten av aggregering, pre aggregerade MS11Opa + Pil + var behandlade med eller utan ceftriaxon och avbildas. Detta tillåter både visualisering (som kan kvantifieras) och fördelningen av levande och döda GC efter antibiotikabehandling (figur 2A- vänster två paneler). Döda bakterier (röd) lokaliserades till stor del på de yttre lagren medan levande GC (grön) var belägna främst i kärnan av ceftriaxon behandlade aggregat. Denna procedur utfördes med MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa eller MS11ΔLgtE, för att undersöka aggregering storlek och survival rate (figur 2A). MS11Opa + Pil + visades att bilda den största och MS11Opa + Pil-minsta aggregaten (figur 2A, B). MS11Opa + Pil + aggregat var fortfarande lever i kärnan lagret medan GC i de små lös aggregat av MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, och MS11ΔLgtEPil + var döda (figur 2A, C). Baserat på storlek och överlevnad, kan en korrelation graf ritas att undersöka förhållandet mellan aggregering storlek och antibiotika överlevnad (figur 2D).
Tabell 1: Recept för 1 L GCK agarplatta.
Tabell 2: Recept för 1 L 100 x Kelloggs tillägg.
Tabell 3: Recept för 1 L av GCP bakteriell tillväxt medier.
Tabell 4: minsta hämmande koncentrationen av GC stammar behandlad med ceftriaxon. MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpa, MS11ΔLgtE och MS11Opa + Pil - var vuxit och upphängd i GCP. Agar utspädning testet utfördes sedan med seriell koncentration av ceftriaxon från 0.0016 - 0,25 µg/mL.
Figur 1 : Representativa uppgifter av överlevnaden av aggregerade GC under ceftriaxon behandling av ATP-utnyttjande assay. (A) överlevnad Betygsätt jämförelse av MS11Opa + Pil + fjädring utan före sammanläggning, före sammanläggning för 6 h eller störa efter före sammanläggning för 6 h. (B) överlevnad jämförelse av 6 h aggregerade MS11Opa + Pil + med MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil- eller MS11ΔLgtEPil +. Visas erhålls medelvärdena (±SD) från tre oberoende experiment. p < 0,001; p < 0,01; p < 0,05. Denna siffra var tidigare publicerade 24 och används med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa uppgifter av live/dead bakterier distribution inom aggregat under behandling med ceftriaxon. (A) före aggregerade MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, eller MS11ΔLgtEPil + var antingen inkuberas i närvaro eller frånvaro av 1 µg/mL ceftriaxon för 2 h. aggregat var sedan färgas för att visualisera livskraftiga (grön) och döda (röd) GC och visualiseras med Confocal fluorescens Mikroskop. Skalstapeln: 50 µm. bilder analyserades sedan för (B) aggregering storlek och (C) förhållandet mellan live-till-döda GC och (D) en korrelation graf skapades då. Visas erhålls medelvärdena (SD) från > 40 bilder av tre oberoende experiment. p < 0,001; p < 0,01; p < 0,05. Denna siffra var tidigare publicerade 24och används med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakterier kan bilda biofilmer under infektion av den mänskliga kroppen. Traditionella MIC tester kanske inte återspeglar den koncentration som behövs för att utrota bakterier i en biofilm. För att testa antimikrobiella effekter på en biofilm, kan metoder baserade på biofilm biomassa samt plätering CFUs vara felaktiga på grund av effekterna av biofilm struktur. Till exempel fungerar plätering metoden bara om biofilmen kan störas. Den CFU erhålls kan därför vara lägre än det faktiska antalet livskraftiga bakterier. Visualisera döda och levande bakterier inom biofilmen har fastställts för att mäta överlevnaden av bakterier inom biofilm, dock beroende på struktur och densitet av biofilm, färgningen kan inte tränga in i biofilm och resultera i en missvisande och underskattat överlevnaden.
Metoden här använder både en kvantitativ och en visualisering test för att mäta bakteriell överlevnad efter behandling av aggregat. Fördelen med denna metod är att den mäter den bakteriella överlevnaden i en miljö som är närmare vad som syns i en riktig infektion. Survival rate skillnaderna mellan icke-aggregerade och aggregerade bakterier ger oss möjlighet att avgöra om in vitro-MIC korrelerar med invivo MIC.
ATP utilization analysen, som mäter ATP produktionen, kan kvantitativt mäta överlevnaden av aggregat. Analysen är känsligare och kan skilja överlevnad mellan små skillnader i antibiotiska koncentrationen, jämfört med andra liknande analyser. Men på grund av hög känslighet av denna analys är kvalitetssäkring av bakteriell cell lysis kritisk. Därför användes ett ultraljudsbehandling steg. Dessutom kan inte denna metod användas för att mäta bakteriell överlevnad i vivo på grund av den stora mängden ATP som värdceller producerar som kan maskera den bakteriella ATP-nivån. Samspelet mellan värdceller och bakterier kan dessutom påverka bakteriell ATP produktionen. Med denna analys på bakterier med pigment kan vara begränsande eftersom pigmenten kan störa läsningen.
Live/dead fläcken har använts i biofilm studier. Genomträngningen av de färgning färgämnena kan dock färga bara den yttersta bakterien, medan kärnan inte får färgas. Det kan därför bara användas för visualisering men inte kvantifiering, på grund av ojämn fördelning av färgämnet. Vi använde små aggregat för denna färgning och visade denna analys kan användas för att kvantifiera den övergripande bakteriell överlevnaden inom aggregaten. Dessutom behövs negativa och positiva kontroller för justering av koncentrationen av färgen för olika bakterier.
I kombination med protokollet MIC, kan ATP utilization assay och live/dead fläcken fungera som en effektiv metod att kvantitativt och visuellt analysera N.gonorrhoeae samt andra bakteriella aggregeringar25,26. Tillämpningen av kombinerade protokollet kunde ge en bättre förståelse av sjukdom bildas tillsammans med dess mångsidiga användningsområden i drogkontroll baserat på bakterier biofilmer. Denna metod återspeglar mer exakt den i vivo MIC av ett antibiotikum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ett stipendium från National Institute of Health att D.C.S. och W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., och E.N. stöddes i del/delta i ”The första årets Innovation & forskning Experience”-programmet finansieras av University of Maryland. Finansiärerna hade ingen roll i studie design, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra, eller beredning av manuskriptet. Vi erkänner UMD CBMG Imaging kärnan för alla mikroskopi experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
References
- CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
- Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
- Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
- Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , accessed Oct 5 (2011).
- Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
- Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
- Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
- Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
- Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
- Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
- Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
- Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
- LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).
- Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
- White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
- Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
- Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
- Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
- Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
- Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
- Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
- Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).
