Summary
Um simples ensaio de medição da ATP e método de coloração ao vivo/morto foram usados para quantificar e Visualizar Neisseria gonorrhoeae sobrevivência após o tratamento com ceftriaxona. Este protocolo pode ser estendido para examinar os efeitos antimicrobianos de qualquer antibiótico e pode ser usado para definir a concentração inibitória mínima dos antibióticos em biofilmes bacterianos.
Abstract
O surgimento de resistentes aos antibióticos Neisseria gonorrhoeae (GC) é uma ameaça para a saúde no mundo e destaca a necessidade de identificar as pessoas que não o tratamento. Esta bactéria Gram-negativa causa a gonorreia exclusivamente em seres humanos. Durante a infecção, é capaz de agregados de forma e/ou biofilmes. O teste de concentração inibitória mínima (CIM) é usado para determinar a susceptibilidade aos antibióticos e definir o tratamento adequado. No entanto, o mecanismo de erradicação em vivo e sua relação com os resultados de laboratório não são conhecidos. Foi desenvolvido um método que examina como GC agregação afeta a susceptibilidade aos antibióticos e mostra a relação entre tamanho de agregação e suscetibilidade aos antibióticos. Quando agregado de GC, são mais resistentes ao antibiótico matar, com bactérias no centro sobrevivendo ceftriaxona tratamento melhor do que aqueles na periferia. Os dados indicam que a agregação de N. gonorrhoeae pode reduzir sua susceptibilidade à Ceftriaxona, que não é reflectida usando os métodos MIC de baseados em placa de ágar padrão. O método utilizado neste estudo permitirá aos pesquisadores testar susceptibilidade bacteriana em condições clinicamente relevantes.
Introduction
Gonorreia é que um comum sexualmente transmissíveis infecção (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), uma bactéria Gram-negativa de diplococcal, é o agente causador da doença. Sintomas de infecção genital podem resultar em dor durante a micção, dor genital generalizada e descarga uretral. Infecção é frequentemente assintomática2,3,4,5, e isto permite a colonização estendida. Estas infecções não tratadas são uma preocupação de saúde importantes, como eles têm o potencial para facilitar a transmissão do organismo e isto pode levar a complicações como doença inflamatória pélvica (DIP) e disseminado de Infecção gonocócica (DGI)6. Resistentes aos antibióticos gonorreia é uma crise de saúde pública e um crescente fardo socioeconômico7. Suscetibilidade reduzida às cefalosporinas, resultou em mudança de regime de tratamento de um único antibiótico a terapia dupla, que combina a azitromicina ou doxiciclina com ceftriaxone8. O maior fracasso de ceftriaxona e azitromicina9,10, em combinação com infecções assintomáticas, destaca a necessidade de compreender as falhas do tratamento de gonorreia.
O teste de concentração inibitória mínima (CIM), incluindo o ágar diluição e disco difusão testes, tem sido usado como o exame médico padrão para a identificação de resistência a um antibiótico. No entanto, não está claro se o MIC teste reflete a resistência antibiótica bacteriana in vivo. A formação de biofilmes bacterianos contribui para a sobrevivência de bactérias na presença de concentrações bactericidas de antibiótico: testando o MIC é incapaz de detectar este efeito11. Porque o GC pode formar biofilmes sobre superfícies mucosas12, nós hypothesize que antibiótico suscetibilidade dentro agregados seria diferente daquele visto no GC individual. Além disso, estudos têm mostrado que trifásico moléculas de superfície variável, Pili, associada a opacidade da proteína (Opa), e lipooligosaccharides (LOS), que regulam interações inter bactérias, conduzir a diferentes agregados tamanho13, 14 , 15. a contribuição destes componentes de resistência aos antibióticos não tem sido examinada devido à falta de métodos apropriados.
Atualmente, existem vários métodos para medir a erradicação do biofilme. O método quantitativo mais amplamente utilizado é medindo as mudanças na biomassa usando cristal violeta mancha16. No entanto, o método requer manipulação experimental significativa, que potencialmente pode gerar erros no experimento repetições17. O método de coloração ao vivo/morto usado aqui permite a visualização de bactérias vivas e mortas e sua distribuição dentro do biofilme. No entanto, a estrutura do biofilme pode posar como uma barreira física que reduz a penetração do corante. Portanto, para quantificar as bactérias ao vivo/morto dentro de um grupo, a coloração é limitada a pequenas biofilmes seu precursor-microcolonies ou agregações. Outros métodos, incluindo os testes de difusão diluição e disco de ágar, não são capazes de medir os efeitos de agregação. Para examinar a susceptibilidade de GC dentro de agregação após a exposição aos antibióticos, um método ideal seria preciso ter ambos um ensaio quantitativo que pode medir vivem bactérias e visualizar sua distribuição.
O procedimento descrito aqui combina uma medição de utilização de ATP e ao vivo/morto coloração do ensaio para quantitativamente e examinar visualmente a susceptibilidade de GC dentro agregados na presença de antibióticos.
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Protocol
1. manutenção de cepas de GC
- Raia de cepas de N. gonorrhoeae em ágar GCK com 1% Kellogg suplementos18 (tabela 1, tabela 2) dos estoques de congelador e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 para 16-18 h. uso MS11 expressando Opa de fase variável (MS11Opa +), nenhuma Opa (MS11ΔOpa), ou um LOS truncado (MS11ΔLgtE).
- Escolha cuidadosamente pili negativo (colônia sem borda escura) ou positivo (colônia com borda escura) colónias de cada estirpe baseado na colônia morfologia19 usando um microscópio de luz dissecação e raia em uma nova placa GCK.
- Incube a 37 ° C com 5% de CO2 para 16-18 h antes do uso.
2. quantificação de viabilidade de agregações de GC
- Recolha o GC usando um aplicador estéril. Cotonete GC da placa e ressuspender GC em caldo previamente aquecido (GCP, tabela 3) suplementado com 4,2% NaHCO3 e 1% de soluções Kellogg18. Usar espectrofotometria a um comprimento de onda de 650 nm (uma OD650 de 1 = ~ 1 x 109 UFC/mL) para determinar a concentração de bactérias suspensas.
- Ajustar a concentração de GC para ~ 1 x 108 UFC/mL.
- Adicione 99 µ l de suspensão de GC ajustado em poços de uma placa de 96 poços.
- Incubar a placa de 6 h a 37 ° C com 5% de CO2 para permitir que as bactérias para agregar.
- Adicione 1 µ l de serial ceftriaxona diluída (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0,2 µ g/mL) em cada poço. Embora alguns poços não tratados para servir como controles.
- Incube a placa por 24 h a 37 ° C com 5% de CO2.
- Proceda à sonicação a suspensão 3 vezes em cada poço para 5 s em 144 W e 20 kHz.
- Adicione 100 µ l de reagente de brilho disponível comercialmente ATP utilização em cada poço, pipetar acima- e abaixo por 3 vezes e incube por 15 min a 37 ° C com 5% de CO2.
- Com cuidado transferir 150 µ l de mistura de cada poço em um novo poço em uma microplaca de 96 poços negro e evitar a introdução de bolhas.
- Medir a absorvância de cada poço em 560 nm, utilizando o leitor de placa.
- Calcule a taxa de sobrevivência pela relação da leitura obtida após o tratamento de ceftriaxona serial para a leitura de poços não tratados.
3. a análise microscópica de Live/mortos dos agregados de GC fluorescência
- Recolha o GC usando um aplicador estéril. Cotonete GC da placa e ressuspender GC na mídia GCP previamente aquecido além de 1% Kellogg suplementos.
- Determinar o número de bactérias por espectrofotometria a um comprimento de onda de 650 nm e ajustar a concentração de GC para ~ 1 x 107 UFC/mL.
- Adicione 198 µ l de suspensão de GC em câmaras de 8 poços lamela-inferior.
- Incube a câmara para 6 h a 37 ° C com 5% de CO2 para permitir a formação de agregação.
- Adicione 2 µ l de ceftriaxona (100 µ g/mL ou várias diluições) em cada poço dentro de cada condição de agregação. Incube a 37 ° C com 5% de CO2, o tempo desejado.
- Adicionar 0,6 µ l de mistura de solução coloração viva/morta em cada poço e incube por 20 min a 37 ° C com 5% de CO2.
- Adquira imagens de Z-series, usando um microscópio confocal (um microscópio equivalente pode ser usado).
- Analise as imagens usando o software ImageJ para medição do tamanho de agregados de GC e a relação de intensidade de fluorescência (FIR) de viver-mortos coloração em cada agregado.
4. análise de imagens
- Estimativa do tamanho de agregados de bactérias.
- Abra o ImageJ e abra uma imagem arrastando um arquivo de imagem raw para a barra de menus do ImageJ.
- Clique em Linhas à mão livre na barra de menus do ImageJ e um círculo no local de cada agregação na imagem.
- Clique em analisar | Medida na barra de menus do ImageJ.
- Obter o número em uma nova janela na coluna de área .
- Quantificação da relação ao vivo-mortos de agregações
- Abra o ImageJ e abra uma imagem arrastando um arquivo de imagem raw para a barra de menus do ImageJ.
- Clique em analisar | Definir medidas na barra de menus do ImageJ.
- Verifique a densidade integrada na janela pop-up e clique Okey.
- Clique na imagem | Cor | Ferramenta de canais na barra de menu e selecione uma cor.
- Verifique o canal 1 como a fluorescência para coloração de bactérias vivas.
- Clique em Linhas à mão livre na barra de menus do ImageJ e um círculo no local de cada agregação.
- Clique em analisar | Medida na barra de menus do ImageJ.
- Obter o número na coluna IntDen .
- Verifique o canal 2 como a fluorescência para a mancha bacteriana morto. Repita as etapas 4.2.6-4.2.8.
- Obter a relação de viver-mortos, dividindo o número da etapa 4.2.8 pelo número da etapa 4.2.9.
- Análise estatística
- Abra o GraphPad Prism e digite os números obtidos do ImageJ para a coluna desejada.
- Clique em analisar e selecionar testes t sob análises de coluna.
- Verifique a coluna desejada para comparação e clique Okey.
- Obter o P-valor sob a janela de análise .
- Selecione a Regressão Linear , sob análises XY da etapa 4.3.3
- Obter o R-quadrado e o P-valor sob a janela de análise.
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Representative Results
Foram utilizados dois métodos: um ensaio de utilização do ATP e um ensaio de coloração ao vivo/morto. Os resultados podem ser combinados ou usados individualmente pela análise de sobrevivência bacteriana dentro agregados após tratamento com antibióticos. O ensaio de utilização de ATP foi mostrado para medir com precisão viáveis bactérias S. aureus biofilmes20,21. Aqui, MS11Opa + Pil + estirpe foi usado para examinar o papel de agregação de GC na susceptibilidade aos antibióticos. + MS11Opa + Pil non-agregados, agregado MS11Opa + Pil +, ou agregados e, em seguida, interrompida por sonication MS11Opa + Pil + foram tratados com diluições em série de ceftriaxona e o ATP nível medido (Figura 1A). Comparando a sobrevivência por cento com e sem tratamento com antibióticos, GC pré-agregados tiveram sobrevivência significativamente maior do que o GC não agregadas ou agregação-interrompido com igual ou superior a 0,015 µ g/mL de ceftriaxona (MIC de teste de ágar diluição ( Tabela 4)). MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa ou MS11ΔLgtE, que tem a mesma diluição de ágar MIC (tabela 4), mas menores agregados de forma, foi examinado e comparado com Pil + MS11Opa + (Figura 1B). MS11Opa + Pil +, formando agregados maiores, tinha o maior nível de ATP com ceftriaxone tratamento do que as cepas mutantes.
Ao vivo/morto coloração tem sido utilizado em diversos estudos relacionados com o biofilme/agregação22,23. Para determinar o efeito de agregação, pré-agregados MS11Opa + Pil + foi tratada com ou sem ceftriaxona e fotografada. Isto permite visualização (que pode ser quantificada) e a distribuição de GC ao vivo e morto após tratamento antibiótico (Figura 2A- deixada dois painéis). Bactérias mortas (vermelho) foram em grande parte localizadas às camadas externas enquanto que GC ao vivo (verde) foram localizados principalmente no núcleo de agregados de ceftriaxona Tratado. Este procedimento foi realizado com MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa ou MS11ΔLgtE, para examinar a agregação tamanho e sobrevivência taxa(Figura 2). MS11Opa + Pil + mostrou-se para formar a maior e MS11Opa + Pil-os agregados menores (Figura 2A, B). MS11Opa + Pil + agregados ainda estavam vivos na camada núcleo Considerando que GC nos pequenos agregados soltos de MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, e MS11ΔLgtEPil + foram mortos (Figura 2A, C). Com base no tamanho e na sobrevivência, um gráfico de correlação pode ser plotado para examinar a relação do tamanho de agregação e sobrevivência antibiótica (Figura 2D).
Tabela 1: Receita para 1 L de GCK placa de ágar.
Tabela 2: Receita para 1 L de 100 x suplemento de Kellogg.
Tabela 3: Receita para 1 L de GCP Media de crescimento bacteriano.
Tabela 4: concentração inibitória mínima de cepas de GC tratados com ceftriaxona. Pil + MS11Opa +, MS11ΔOpa, MS11ΔLgtE e MS11Opa + Pil - foram cultivados e suspenso no GCP. Teste de ágar diluição realizou-se em seguida com serial concentração de ceftriaxona de 0.0016 - 0,25 µ g/mL.
Figura 1 : Dados representativos da taxa de sobrevivência de agregados GC sob tratamento de ceftriaxona por ensaio de ATP-utilização. Taxa de sobrevivência do (A) comparação de MS11Opa + Pil + suspensão sem pre-agregar, pre-agregar para 6 h ou interromper depois pre-agregando para comparação de taxa de sobrevivência de h. 6 (B) de 6 h agregados MS11Opa + Pil + com MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, ou MS11ΔLgtEPil +. Mostrados são os valores médios (±SD) obtidos de três experimentos independentes. p < 0,001; p < 0,01; p < 0,05. Esta figura foi previamente publicado 24 e é usada com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Dados representativos da distribuição de bactérias ao vivo/morto dentro agregados sob tratamento ceftriaxona. (A) pré-agregados Pil + MS11Opa +, MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, ou MS11ΔLgtEPil + era também incubadas na presença ou ausência de 1 µ g/mL ceftriaxona para agregados de 2 h. depois foram manchados para visualizar viável (verde) e GC mortos (vermelho) e visualizados com microscópio de fluorescência confocal. Barra de escala: 50 µm. imagens foram então analisadas por tamanho de agregação (B) e (C) razão de viver-mortos GC e (D) um gráfico de correlação foi então criado. Mostrados são os valores médios (SD) obtidos de > 40 imagens de três experimentos independentes. p < 0,001; p < 0,01; p < 0,05. Esta figura foi previamente publicado 24e é usada com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As bactérias podem formar biofilmes durante a infecção do organismo humano. Teste de MIC tradicional pode não refletir a concentração necessária para erradicar as bactérias em um biofilme. Para testar os efeitos de agentes antimicrobianos em um biofilme, métodos baseados em biomassa de biofilme, bem como do chapeamento CFUs podem ser errôneos devido ao impacto da estrutura do biofilme. Por exemplo, o método de chapeamento só funciona se o biofilme pode ser interrompido. Daí, o UFC obtida pode ser menor que o número real de bactérias viáveis. Visualização ao vivo e mortas bactérias dentro do biofilme foram estabelecidas para a sobrevivência das bactérias dentro biofilme de medição, no entanto, dependendo da estrutura e densidade de biofilme, a coloração pode falhar penetrar o biofilme e resultar em uma taxa de sobrevivência de imprecisas e subestimado.
O método aqui usa um quantitativo e um ensaio de visualização para medir sobrevivência bacteriana após tratamento de agregados. A vantagem deste método é que mede a sobrevivência bacteriana em um ambiente que está mais próximo ao que é visto em uma infecção real. As diferenças de taxa de sobrevivência entre bactérias agregadas e não agregadas nos permitirá determinar se o MIC in vitro correlaciona-se com o MIC in vivo.
O ensaio de utilização de ATP, que mede a produção de ATP, medir quantitativamente a sobrevivência dos agregados. O ensaio é mais sensível e pode diferenciar sobrevivência entre pequenas diferenças na concentração de antibiótico, em comparação com outros ensaios semelhantes. No entanto, devido à alta sensibilidade deste teste, garantia de lise celular bacteriana é crítica. Portanto, utilizou-se um passo sonication. Além disso, este método não pode ser usado para medir a sobrevivência bacteriana in vivo, devido à grande quantidade de ATP que produzem células hospedeiras que pode mascarar o nível de ATP bacteriano. Além disso, a interação das células do hospedeiro com bactérias pode afetar a produção de ATP bacteriana. Usando este ensaio sobre as bactérias com pigmentos pode ser um fator limitante como os pigmentos podem interferir com a leitura.
A mancha de viver/mortos tem sido amplamente utilizada em estudos de biofilme. No entanto, a penetração dos corantes coloração pode manchar somente as bactérias ultraperiféricas, Considerando que o núcleo não pode ser manchado. Portanto, só pode ser usada para a visualização, mas não a quantificação, devido à distribuição desigual do corante. Nós usamos pequenos agregados para esta coloração e demonstrado que neste ensaio pode ser usado para quantificar a sobrevivência global bacteriana dentro os agregados. Além disso, controles positivos e negativos são necessárias para regular a concentração do corante para diferentes bactérias.
Em combinação com o protocolo do MIC, a mancha de ensaio e ao vivo/morto de utilização do ATP pode servir como um método eficaz para quantitativamente e visualmente analisar N.gonorrhoeae , bem como outras agregações bacterianas25,26. A aplicação do protocolo combinado poderia fornecer uma melhor compreensão da formação da doença juntamente com seus usos versátil no rastreio de drogas baseado em biofilmes de bactérias. Esse método pode refletir com mais precisão o na vivo MIC de um antibiótico.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma concessão do Instituto Nacional de saúde para a Premier e W.S. AI123340. L.-CW, J.W., ar-condicionado, e E.N. foram apoiados em parte/participação no programa de "O primeiro ano inovação & pesquisa experiência" financiado pela Universidade de Maryland. Os financiadores não tinham qualquer papel no estudo design, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Reconhecemos o UMD CBMG Imaging Core para todos os experimentos de microscopia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
References
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