Summary
Temos desenvolvido uma matriz de electrocorticographic todo-cortical para o sagui comum que continuamente cobre quase toda a superfície lateral do córtex, a partir dos polos frontais e occipital polo para o temporal. Este protocolo descreve um procedimento de implantação crônica da matriz no espaço epidural do cérebro sagui.
Abstract
Eletrocorticografia (ECoG) permite o monitoramento dos potenciais de campo elétrico do córtex cerebral com alta resolução spatiotemporal. Recente desenvolvimento de eletrodos de ECoG finos, flexíveis permitiu a condução de gravações estáveis da atividade cortical em grande escala. Temos desenvolvido uma matriz de ECoG todo-cortical para o sagui comum. A matriz continuamente cobre quase toda a superfície lateral do hemisfério cortical, do polo occipital para o temporal e frontais poloneses, e captura cortical de toda a atividade neural em um único tiro. Este protocolo descreve um procedimento de implantação crônica da matriz no espaço epidural do cérebro sagui. Saguis têm duas vantagens em relação a gravações de ECoG, sendo a organização homóloga de estruturas anatômicas em humanos e macacos, incluindo complexos frontais, parietais e temporais. A outra vantagem é que o cérebro de sagui é lissencephalic e contém um grande número de complexos, que são mais difíceis de acessar em macacos com ECoG, que são expostos à superfície do cérebro. Esses recursos permitem o acesso directo à maioria das áreas corticais abaixo da superfície do cérebro. Este sistema oferece uma oportunidade para investigar o processamento com alta resolução em um milissegundo sub ordem no tempo e milímetros no espaço global de informação cortical.
Introduction
Cognição requer a coordenação de ensembles neurais através de redes cerebral generalizada, particularmente o neocórtex que é bem desenvolvido nos seres humanos e acreditado para ser envolvido em comportamentos cognitivos mais elevados. No entanto, como o neocórtex alcança esse comportamento cognitivo é um problema não resolvido no campo da neurociência. Recente desenvolvimento de eletrodos electrocorticographic fino, flexível (ECoG) permite a condução de gravações estáveis de atividade cortical em grande escala1. Fujii e colegas desenvolveram uma matriz de ECoG todo-cortical para macaco macacos2,3. A matriz continuamente abrange quase todo lateral córtex, do polo occipital para os polos frontais e temporais e captura a atividade neural cortical-todo de uma só vez. Ainda mais, nós desenvolvemos este sistema para aplicação no sagui comum4,5, um macaco pequeno, novo-mundo com genética manipulability6,7. Este animal tem várias vantagens em comparação com outras espécies. O visual, auditivo, somatossensorial, motor e áreas corticais frontais desta espécie foram previamente mapeados e relatou ter organização homóloga básica para as mesmas áreas em seres humanos e macacos8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. seus cérebros são lisos, e áreas corticais mais laterais são expostas na superfície do córtex, que é mais difícil de acesso com ECoG em macacos. Baseado sobre esses recursos, o sagui é adequado para estudos de electrocorticographic. Além disso, saguis exibem comportamentos sociais e têm sido propostos para servir como um modelo de candidato de comportamentos sociais humanos17.
Este protocolo descreve um procedimento de implantação epidural da matriz ECoG na superfície de toda a lateral do córtex em um Sagui. Ele fornece uma oportunidade para monitorar a atividade cortical em grande escala de Neurociências cortical de primatas, incluindo sensorial, motor, domínios cognitivos e sociais mais elevados.
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Protocol
Este protocolo foi realizado em 6 saguis comuns (4 machos, 2 fêmeas; peso corporal = 320-470 g; idade = 53-14 meses). Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as recomendações dos institutos nacionais de saúde orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética de RIKEN (n. º H28-2-221(3)). Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob anestesia, e todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais utilizados, bem como o seu desconforto.
1. preparação
- Obter uma imagem estrutural de ressonância magnética (MRI) de cada individual do cérebro. Isto será usado para identificar posições de eletrodo através do registo com um sagui cérebro atlas e computador tomografia computadorizada (TC).
- Preparação da matriz ECoG: preparar uma matriz personalizado de ECoG multicanal (figura 1A). Uma matriz de ECoG 96ch consiste em duas folhas com eletrodos de 32 e 64. Para acomodar as diferenças individuais no tamanho do cérebro, a matriz de ECoG tem um braço flexível. O braço pode cobrir o polo temporal, dependendo da forma individual do cérebro. Coloca os eletrodos de referência enfrentando oposta os eléctrodos de ECoG e os eletrodos de terra virada para a mesma direção.
- Montar a matriz de ECoG com um caso de conector (figura 1B) e selar as lacunas do conector (Figura 1) usando cola acrílica para impedir a entrada de líquido durante a cirurgia. Esterilize a matriz com gás de óxido de etileno.
- Preparar e esterilizar os instrumentos.
Nota: Todos os instrumentos utilizados estão listados na Tabela de materiais.
2. a implantação de matriz ECoG
Nota: Retire a ingestão de alimentos e de líquidos maiores do que 4 h antes da cirurgia. Execute todas as etapas cirúrgicas com técnica asséptica, utilizando instrumentos e luvas esterilizadas.
-
Procedimentos antes da implantação
- Induzi a anestesia no sagui por injeção intramuscular (IM) da cetamina (15 mg/kg) 5 min após a injeção de atropina (0,08 mg/kg) im.
- Anestesia e manter a anestesia com isoflurano (1-3% diluída com uma mistura de óxido nitroso/oxigênio) dependendo do estado fisiológico do animal, que deve ser continuamente monitorado. Certifique-se de que a taxa de coração é 130-180 BPM e monitor de temperatura e saturação de oxigênio do sangue arterial (SpO2) continuamente para avaliar a condição do animal.
- Barbear-se no topo da cabeça do animal com tosquiadeiras e um removedor do cabelo. Enxágue totalmente creme depilatório fora a pele com gaze molhada, ou causará danos à pele.
- Administrar um antibiótico (cefovecin; 16 mg/kg s.c.), anti-hipertensivos (furosemida; 2,0 mg/kg i.m.) e Anti-hemorrágicos (carbazochrome sulfonato de sódio hidratado; 0,2 mg/kg i.m.).
- Coloque o animal em uma armação estereotáxica. Neste momento, aplica geleia de lidocaína a 2% para o orelha-bares e pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura e dor pós-operatória.
- Desinfetar a área cirúrgica com solução de iodo e cubra-o com cortinas esterilizadas. Aplica a geleia de lidocaína a 2% para o local da incisão da pele.
-
Procedimentos de implantação
- Faça uma incisão da pele através da linha mediana do couro cabeludo com um bisturi, com cerca de 4 cm. Desanexe o músculo temporal do crânio com uma cureta até toda a área cirúrgica é exposta. Limpar os tecidos na superfície do crânio e parar o sangramento completamente com a hemostasia de pressão e com a cera para osso, se necessário. Envolva a borda da pele e músculos com gaze umedecida. Manter a gaze umedecida durante a cirurgia.
- Coloque a borda frontal da matriz para a borda do polo frontal. Marque uma área planejada para a craniotomia, fendas e buracos no crânio com um lápis estéril. A localização de craniotomia dependerá o design da matriz (Figura 2).
- Perfure a craniotomia andando mark 1, conforme mostrado na Figura 2. Durante a perfuração do osso, sopro de ar na vanguarda para manter uma visão clara para o cirurgião. Em seguida, corte o osso ao redor marca 2, como o pedaço de osso ainda será anexado a dura-máter no centro. Levante a peça suavemente de um lado e retire a dura-máter com uma espátula. Este processo deve ser realizado lenta e cuidadosamente, ou isso vai desfazer a dura-máter facilmente.
- Retire o pedaço de osso as pontas de osso e enrole a peça com gaze umedecida, como esta peça será devolvida após a implantação da matriz.
- Realize craniotomia 3 e 4, conforme mostrado na Figura 2. Estes permitem a inserção de eletrodos no orbitofrontal e áreas occipitais, respectivamente.
- Broca fendas na marca 5 como mostrado na Figura 2. Estas fendas permitem exame de matriz para garantir que ele está inserido corretamente.
- Agora será exposta a dura-máter. Lave a área com soro fisiológico e parar o sangramento com pressão hemostasia e uma esponja de gelatina, se necessário. A borda da craniotomia aberta pode precisar de ser limpo com uma cureta ou osso rongeur.
- Transforme as fendas (marcadas 6 na Figura 2), que são colocados os eletrodos de referência. Coloca os eletrodos de referência no espaço peridural nas áreas sensório-motor e occipitais de contra-lateral. A posição deve ser determinada de acordo com as necessidades específicas de experimentais.
- Faça furos de parafuso em quatro pontos em torno de cada haste do conector com um parafuso de 1.0 mm (cruzes na Figura 2). Para evitar danos para a dura-máter, insira uma espátula sob o crânio. Esses buracos devem ser ortogonais contra o crânio. Em seguida, instale parafusos PEEK (1,4 x 2.5 mm) como escoras para consertar o conector no crânio.
- Inserir a matriz de ECoG no espaço epidural. Uso flathead fórceps para armazenar a matriz.
Nota: A matriz deve ser inserida sem dobrar. Se a matriz é dobrada, crie um espaço adequado, inserindo uma espátula entre o crânio e a dura-máter. Se a dobra foi causada pelo tamanho relativamente pequeno do cérebro, corte alguns dos eletrodos. - Fixe os eletrodos de referência e o chão com um acrílico dental. Coloca os eletrodos de referência no espaço peridural e eletrodos de terra na superfície craniana. Os dois contatos devem enfrentar o crânio.
- Volte a colocar o pedaço de osso e fixar a coifa conector e cabeça para a caveira com dental acrílico sobre os parafusos.
- Sutura da pele com nylon 6-0 na testa e cabeça traseira e corrigir a pele para os lados do conector usando fechamentos de pele.
-
Procedimentos pós-implantação
- Retire o animal da armação estereotáxica. Certifique-se de que o animal é mantido quente e fornecido com oxigênio durante as etapas a seguir.
- Imediatamente após a cirurgia, injete o animal com meloxicam (0,3 mg/kg i.m.) para diminuir a dor pós-operatória. Administrar um antiinflamatório corticosteroide (Dexametasona; 2,0 mg/kg i.m.) e infusão subcutânea (solução de lactato de Ringer; 5,0 mL), incluindo famotidine (0,5 mg/kg), como um gastroprotectant.
Nota: Um uso simultâneo de AINEs com esteroides tem um potencial para efeitos colaterais gastrointestinais. - Depois que o animal se recuperou (confirme a frequência cardíaca e SpO2), remover a monitorização de sinais vitais e transferir o animal para a UTI para 2-3 dias.
3. tratamento pós-operatório
Nota: Normalmente demora 5 dias para os animais para se recuperar completamente da cirurgia.
- Para evitar inchaço de cérebro, administre a dexametasona antiinflamatório corticosteroide (2,0 mg/kg), duas vezes por dia no primeiro dia após a cirurgia. Em seguida, reduza a dose de 1,5 mg/kg duas vezes por dia nos segundo e terceiros dias e 1 mg/kg duas vezes por dia no quarto dia.
- Administrar o alívio da dor (meloxicam, 0,1 mg/kg oral, uma vez por dia) e um anti-hemorrágicos (carbazochrome de sódio sulfonate hidrato; 0,2 mg/kg i.m.; duas vezes por dia) durante 5 dias após a cirurgia.
Nota: No nosso caso, 1-2 dias após a cirurgia, alguns saguis (3 de 6) tornou-se menos ativo e vomitou. Isso pode ter sido causado pelo aumento da pressão intracraniana devido a um coágulo de sangue. Quando saguis apresentaram esses sintomas, nós reabriu a cabeça e removido o coágulo sob anestesia geral (Alfaxalona). Se não houvesse nenhuma dobra da matriz ECoG durante a implantação, o coágulo de sangue foi provavelmente no espaço entre a matriz e onde o pedaço de osso foi retornado. Neste caso, o coágulo de sangue pode ser lavado afastado pela execução salina no espaço usando um cateter. Este procedimento geralmente leva a recuperação do animal. -
Identificação de locais de eletrodo
- Cerca de 1 semana após a cirurgia, realize um exame de tomografia computadorizada (TC) do computador da cabeça do animal.
Nota: Esta é uma boa oportunidade para verificar se os sinais podem ser registrados corretamente. Abra a caixa do conector e remover qualquer coágulos de sangue, se eles estiverem presentes. - Alinhe a T2-weighted MRI para coordenadas estereotáxicos usando AFNI software18 (https://afni.nimh.nih.gov) (Figura 3A). Alinhe a imagem de CT em imagens de T2-weighted anatômica ressonância magnética com AFNI (Figura 3B). Registre um atlas do cérebro de sagui de MRI (Figura 3) com AFNI e formigas19.
- Cerca de 1 semana após a cirurgia, realize um exame de tomografia computadorizada (TC) do computador da cabeça do animal.
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Representative Results
A matriz de ECoG todo-cortical pode capturar simultaneamente atividade neuronal da totalidade de um hemisfério. A Figura 4 mostra exemplos de potenciais evocados auditivos (AEPs) de várias áreas auditivas em um sagui acordado. ECoG gravações foram conduzidas em condições de escuta passivas. Cada sagui foi exposto aos estímulos auditivos, que consistia de tons puros randomizados com 20 tipos de frequência. Em seguida, calculamos AEPs calculando a média ECoGs alinhados com onsets dos tons. Foram observadas formas de onda diferentes de menor e maior auditivas áreas, o que indica que a resolução espacial de nossa matriz de ECoG pode capturar informações diferentes de processamento em diferentes áreas corticais.
Figura 1: preparação de uma matriz de ECoG. (A) 32 e 64 ECoG matrizes (canto inferior esquerdo e direito), um caso de conector (superior esquerdo) e um front-end para os sistemas de gravação (superior direito). O "G" e "R" de cada matriz indicam grand e referência eletrodos, respectivamente. (B) matriz de ECoG montado. (C) todas as lacunas (retângulos vermelhos) devem ser seladas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: um exemplo da craniotomia. (A), o preto cinza e espessura fina linhas indicam contornos da matriz ECoG e área planejada de craniotomia, respectivamente. As cruzes correspondem aos orifícios de âncora. O número um círculo indica a ordem de perfuração. (B) um exemplo CT imagem da craniotomia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: localização de cada eletrodo. (A) T2-weighted MRI, CT (B) e (C) eletrodo locais sobre o atlas. O atlas usado neste manuscrito é o Woodward versão 3-d baseado no atlas Hashikawa20, que é um mapa de MRI-cytoarchitectual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: exemplos de potenciais evocados auditivos. (A) área auditiva do macaco j (B) exemplos de AEPs. Eletrodos localizados em diferentes áreas auditivas mostram formas de onda diferentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 09:00 | Começam os preparativos |
| 10:00 | Faça uma incisão da pele |
| Exposição do crânio (10 min) | |
| Craniotomia (30 min) | |
| 11:00 | Começa a inserir a matriz |
| Inserir a matriz (60 min) | |
| 12:30 | Pele perto |
Tabela 1: Recomendado o curso do tempo da cirurgia.
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Discussion
Para uma implantação bem-sucedida, animais deverá ser fornecidos com nutrição adequada antes e depois da cirurgia. Curto tempo de operação também é importante para otimizar a recuperação do animal. Preparações devem ser terminadas pelo menos um dia antes da cirurgia. Para reduzir o tempo de funcionamento, recomenda-se a formação prévia de craniotomia com inserção de matriz de eletrodo em animais terminados para outros fins experimentais. A tabela 1 mostra um exemplo do curso de tempo para este protocolo.
Nós modificamos o tratamento de procedimento e pós operatório de anestesia em uma base caso-a-caso. Neste vídeo protocolo, os animais foram anestesiados em mantiveram usando uma mistura de isoflurano e oxigénio fornecido através de intubação traqueal. Isoflurano pode ser substituído com sevoflurano e intubação traqueal pode ser substituída com uma máscara. Em outros casos, estamos anestesiados animais com injeção intramuscular de uma mistura de cetamina e medetomidina. Neste caso, os animais foram inicialmente sedados com butorfanol (0,2 mg/kg i.m.) e anestesia cirúrgica foi conseguida com uma mistura de cetamina (30 mg/kg i.m.) e medetomidina (0,35 mg/kg i.m.).
Porque ECoG diretamente registra alterações em campos elétricos, sua resolução temporal é limitada pelo sistema de gravação. A resolução de tempo máximo de nosso sistema de gravação é de 30 kHz. Nós geralmente amostradas sinais a uma taxa de amostragem de 1 kHz e descobriram que este para ser suficiente para extração de informações sensoriais/motor.
Resolução espacial é dependente do projeto do eletrodo. Neste protocolo, cada contato eletrodo 0,8 mm de diâmetro e uma distância inter eletroda de 2,5 mm. Observamos diferentes formas de onda de três eletrodos localizados em diferentes áreas auditivas e separados por 2,5 mm (ch18, ch19, ch20 na Figura 4). Assim, a resolução espacial dos nossos eléctrodos é estimada em menos de 2,5 mm. Em alguns casos, contatos eletrodo localizavam-se mais pròxima um com o outro. Nestes casos, a resolução espacial foi mais fina.
Gravamos com êxito a longo prazo, neuronais sinais com boa qualidade. Em um caso, o conector e dental acrílico foram desanexados do crânio, e o eletrodo foi quebrada a 4 meses após a cirurgia. Isso foi causado pelo crescimento do tecido devido ao sangue ser contido entre o acrílico dental e crânio durante a cirurgia. Outro sagui foi encerrada devido a uma exigência experimental 5 meses após a cirurgia. Quatro animais ainda estão participando de experimentos (1 ano, 7 meses, 4 meses, e 4 meses após a cirurgia, respectivamente).
ECoG matrizes são normalmente implantados no espaço subdural em humanos e macacos. No entanto, menos invasivas implantações peridural são mais adequadas para saguis, porque eles são animais delicados. A dura-máter fina importa de saguis permitidas-nos monitorar os sinais de alta frequência cerebral, mesmo se a matriz de ECoG foi implantada sobre a dura-máter. Uma das desvantagens da peridural implantação é dificuldade de acesso a qualquer córtex dentro de um sulco e o córtex de linha média. Aproximando-se destes córtices requer incisão da dura-máter. Além disso, como matrizes de ECoG são eletrodos de superfície, é difícil especificar a fonte de sinal em termos de profundidade cortical. A fim de compreender informações precisas de processamento no córtex, é necessário incluir outros métodos, tais como eletrodos de profundidade ou óptico de imagem. Apesar dessas limitações, nosso método pode fornecer a introspecção nova processamento cortical de informações. Por exemplo, agência sensorial foi crida a surgir através de interações rápidas entre as zonas frontais e sensoriais; no entanto, seus mecanismos permanecem pouco claras, uma vez que este fluxo de informações rápidas, em grande escala, cortical é difícil de controlar sem o método apresentado aqui.
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Disclosures
MK é aplicar para uma patente na matriz de ECoG todo-cortical ela ter usado neste protocolo (n º 2018-210975).
Acknowledgments
Agradecemos Yuri Shinomoto, para a prestação de cuidados com animais, formação e gravações acordadas. As matrizes de ECoG foram fabricadas pela Cir-Tech (www.cir-tech.co.jp). Além disso, gostaríamos de agradecer a Editage (www.editage.jp) para a edição de língua inglesa. Este trabalho foi financiado mapeando o cérebro por Neurotechnologies integrado para estudos de doença (cérebro/mente), a agência de Japão para pesquisa médica e desenvolvimento (AMED) (JP18dm0207001), o projeto de Ciências do cérebro do centro para iniciativas de ciência romance ( CNSI), os institutos nacionais de ciências naturais (NINS) (BS291004, M.K.) e pela sociedade de Japão para a promoção da ciência (JSPS) KAKENHI (JP17H06034, M.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker (100 cc) | Outocrave | ||
| Cotton ball | Outocrave | ||
| Absorption triangles | Fine Science Tools Inc. | 18105-03 | Outocrave |
| Cotton swab with fine tip | Clean Cross Co., Ltd. | HUBY340 BB-013 | Outocrave |
| Gauze | Outocrave | ||
| Towel forceps | Outocrave | ||
| Scalpel handle | Outocrave | ||
| Needle Holder | Outocrave | ||
| Iris Scissor | Outocrave | ||
| Micro-Mosquito Forceps | Outocrave | ||
| Adson, 1x2 teeth | Outocrave | ||
| Bone Curette | Outocrave | ||
| Micro spatura | Fine Science Tools Inc. | 10091-12 | Outocrave |
| Needle Holders, 12.5 cm, Curved, Smooth Jaws | World Precision Instruments | 14132 | Outocrave |
| Vessel Dilator, 12 cm, 0.1 mm tip | Fine Science Tools Inc. | 18131-12 | Outocrave |
| Vessel Dilator, 12 cm, 0.2 mm tip | Fine Science Tools Inc. | 18132-12 | Outocrave |
| Fine-tipped rongeur | Fine Science Tools Inc. | 16221-14 | Outocrave |
| Manipurator of a stereotaxic frame | Gas sterilization | ||
| Wrench for the manipurator | Gas sterilization | ||
| Hand-made fixture for the connector | Gas sterilization | ||
| Silicon cup for dental acril | Gas sterilization | ||
| Silicon cup hlder | Gas sterilization | ||
| Paintbrush | Gas sterilization | ||
| Pencil | Gas sterilization | ||
| Micro screw, 1.4 mm x 2.0 mm | Nippon Chemical Screw Co., Ltd. | PEEK/MPH-M1.4-L2 | Gas sterilization |
| Screw driver for the micro screw | Gas sterilization | ||
| Micromotor handpiece of a drill | Gas sterilization | ||
| Stainless steel burr, 1.4 mm | Gas sterilization | ||
| Stainless steel burr, 1.0 mm | Gas sterilization | ||
| Drill bit, 1.2 mm | Gas sterilization | ||
| Rubber air blower | Gas sterilization |
References
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