Summary
Hemos desarrollado una gama de electrocorticográfica todo cortical para el tití común que continuamente cubre casi toda la superficie lateral de la corteza, de los polos frontal y occipital polo a lo temporal. Este protocolo describe un procedimiento de implantación crónica de la matriz en el espacio epidural del cerebro tití.
Abstract
Electrocorticography (ECoG) permite el monitoreo de potenciales de campo eléctrico de la corteza cerebral con alta resolución espaciotemporal. Reciente desarrollo de electrodos ECoG delgados y flexibles ha permitido la conducción estable de grabaciones de la actividad cortical a gran escala. Hemos desarrollado una gama de ECoG todo cortical para el tití común. La matriz continuamente cubre casi toda la superficie lateral del hemisferio cortical, desde el polo occipital al temporal y frontal de los postes, y capta actividad neuronal cortical todo en una sola toma. Este protocolo describe un procedimiento de implantación crónica de la matriz en el espacio epidural del cerebro tití. Los titíes tienen dos ventajas con respecto a grabaciones de ECoG, uno de ellos la organización homóloga de estructuras anatómicas en los seres humanos y macacos, incluyendo complejos frontales, parietales y temporales. La otra ventaja es que el cerebro de tití es lissencephalic y contiene un gran número de complejos, que son más difíciles de acceder en macacos con ECoG, que exponen a la superficie del cerebro. Estas características permiten acceso directo a áreas corticales más debajo de la superficie del cerebro. Este sistema proporciona una oportunidad para investigar el procesamiento con alta resolución en un orden de los milisegundos en tiempo y orden de milímetros en el espacio cortical global de la información.
Introduction
La cognición requiere la coordinación de conjuntos neuronales a través de redes de cerebro generalizado, especialmente el Neocórtex que es bien desarrollada en los seres humanos y cree que involucrarse en comportamientos cognitivos superiores. Sin embargo, cómo el neocortex alcanza este comportamiento cognitivo es una cuestión sin resolver en el campo de la neurociencia. Reciente desarrollo de electrodos electrocorticográfica delgada y flexible (ECoG) permite la conducción de grabaciones estables de actividad cortical a gran escala1. Fujii y sus colegas han desarrollado un arsenal de ECoG todo cortical para macaque monos2,3. La matriz continuamente cubre casi la corteza lateral entera, desde el polo occipital a los polos temporales y frontales y captura la actividad neuronal cortical todo en una sola toma. Además hemos desarrollado este sistema para la aplicación en el marmoset común4,5, un mono pequeño, el nuevo mundo con genética manipulability6,7. Este animal tiene varias ventajas en comparación con otras especies. El visual, auditivo, somatosensorial, motor y las áreas corticales frontales de esta especie han sido previamente asignadas y tienen básica organización homóloga a las mismas áreas en los seres humanos y macacos8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. sus cerebros son lisos, y las áreas corticales más laterales están expuestas a la superficie de la corteza, que es más difícil de acceso con ECoG en macacos. Basado en estas características, el tití es adecuado para estudios electrocorticográfica. Además, los titíes exhiben comportamientos sociales y se han propuesto para servir como un modelo de candidato de comportamientos sociales humanos17.
Este protocolo describe un procedimiento epidural de la implantación de la matriz de ECoG en la superficie entero lateral de la corteza en un tití común. Proporciona una oportunidad para controlar la actividad cortical a gran escala de Neurociencia cortical de primates, incluyendo el sensorial, motor, dominios cognitivos y sociales superiores.
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Protocol
Este protocolo se ha realizado en monos tití común 6 (4 machos, 2 hembras, peso = 320-470 g; edad = 14-53 meses). Todos los procedimientos se llevaron a cabo con arreglo a las recomendaciones de los institutos nacionales de salud directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio. El protocolo fue aprobado por el Comité de ética de RIKEN (no. H28-2-221(3)). Todos los procedimientos quirúrgicos fueron realizados bajo anestesia, y se hicieron todos los esfuerzos para reducir el número de animales utilizados así como de sus molestias.
1. preparación
- Obtener una imagen de resonancia magnética estructural (MRI) de cada cerebro individual. Esto se utilizará para identificar posiciones de los electrodos a través del registro con un tití atlas y equipo tomografía cerebral (TC).
- Preparación de la matriz de ECoG: preparar una matriz modificada para requisitos particulares de ECoG multicanal (figura 1A). Una matriz de ECoG de 96ch consta de dos hojas con 32 y 64 electrodos. Para dar cabida a las diferencias individuales en el tamaño del cerebro, la matriz de ECoG tiene un brazo flexible. El brazo puede cubrir el polo temporal, dependiendo de la forma del cerebro individual. Coloque los electrodos de referencia frente a frente a los electrodos ECoG y los electrodos de tierra frente a la misma dirección.
- Montar la matriz de ECoG con una caja de conector (figura 1B) y sellar huecos del conector (figura 1) utilizando pegamento de acrílico para evitar la entrada de líquido durante la cirugía. Esterilizar el array con gas de óxido de etileno.
- Preparar y esterilizar instrumentos.
Nota: Todos los instrumentos utilizados se muestran en la Tabla de materiales.
2. implantación de ECoG matriz
Nota: Retirar la ingestión de alimentos o líquidos superiores a 4 h antes de la cirugía. Realizar todos los pasos quirúrgicos con técnica aséptica, utilizando instrumentos y guantes esterilizados.
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Procedimientos pre-implante
- Inducir la anestesia en el tití por inyección intramuscular (i.m.) de ketamina (15 mg/kg) 5 min después de la inyección de atropina (0,08 mg/kg) im.
- Anestesiar y mantener la anestesia con isoflurano (1-3% diluido con una mezcla de óxido nitroso/oxígeno) dependiendo del estado fisiológico del animal, que deben ser continuamente vigilados. Asegúrese de que pulso 130-180 BPM y monitor de la temperatura corporal y la saturación de oxígeno de la sangre arterial (SpO2) continuamente para juzgar la condición del animal.
- Cepille la parte superior de la cabeza del animal con tijeras y un removedor de pelo. Enjuague completamente crema de depilación de la piel con una gasa húmeda, o causará daño a la piel.
- Administrar un antibiótico (cefovecin; 16 mg/kg s.c.), antihipertensivos (furosemida; 2,0 mg/kg i.m.) y antihemorrágicas (carbazochrome sulfonato de sodio hidrato; 0,2 mg/kg i.m.).
- Coloque el animal en un marco de estereotáctica. En este momento, aplicar jalea de lidocaína 2% para el oído-bares y pomada oftálmica en los ojos para prevenir la sequedad y dolor postoperatorio.
- Desinfectar la zona quirúrgica con solución de yodo y cubrir con cortinas esterilizadas. Aplicar jalea de lidocaína 2% para el lugar de la incisión de la piel.
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Procedimientos de implantación
- Haga una incisión en la piel unos 4 cm a través de la línea media del cuero cabelludo con un bisturí. Separar el músculo temporal del cráneo con una cureta hasta que toda el área quirúrgico está expuesto. Limpie los tejidos en la superficie del cráneo y detener el sangrado completamente con la hemostasia de la presión y con cera de hueso, si es necesario. Envuelva el borde de la piel y los músculos con una gasa humedecida. Mantenga la gasa humedecida durante la cirugía.
- Coloque el borde frontal de la matriz sobre el borde del poste frontal. Marque un área prevista para la craneotomía, ranuras y agujeros en el cráneo con un lápiz estéril. Dependerá de la ubicación de la craneotomía en el diseño de la matriz (figura 2).
- Perfore la craneotomía por mark 1, como se muestra en la figura 2. Mientras que perforan el hueso, soplar el aire a la vanguardia para mantener una visión clara para el cirujano. A continuación, cortar el hueso todo el camino alrededor de la marca 2, como el pedazo de hueso todavía se unirá a dura en el centro. Levante suavemente la pieza de un extremo y desprenderse de la duramadre con una espátula. Este proceso debe efectuarse lenta y cuidadosamente, o romperá la dura fácilmente.
- Quitar las puntas de hueso de la pieza de hueso y envolver la pieza con una gasa humedecida, como esta pieza será devuelto después de la implantación de la matriz.
- Realizar la craneotomía 3 y 4 como se muestra en la figura 2. Estos permiten la inserción de electrodos en las áreas occipitales y orbitofrontal respectivamente.
- Haga hendiduras en marca 5 como se muestra en la figura 2. Estas ranuras permiten el examen de la matriz para asegurarse de que está correctamente insertado.
- Ahora se expondrá la dura. Lavar la zona con solución salina y detener la hemorragia con presión hemostasia y una esponja de gelatina, si es necesario. El borde de la craneotomía abierta puede necesitar ser limpiado con una cureta o hueso rongeur.
- Hacer las ranuras (marcadas 6 en la figura 2) que se colocan los electrodos de referencia. Coloque los electrodos de referencia en el espacio epidural en las áreas de sensoriomotoras y occipitales contralateral. La posición debe ser determinada según necesidades experimentales.
- Perfore los agujeros de tornillo en cuatro puntos alrededor de cada tallo del conector con un tornillo de 1.0 mm (cruces en la figura 2). Para evitar daños a la materia dura, introducir una espátula bajo el cráneo. Estos agujeros deben ser ortogonales contra el cráneo. A continuación, Instale tornillos de PEEK (1.4 x 2.5 mm) como anclas para fijar el conector en el cráneo.
- Introduzca la matriz de ECoG en el espacio epidural. Uso plano pinzas para sostener la matriz.
Nota: La matriz debe insertarse sin doblar. Si la matriz está doblada, crear un espacio apropiado al introducir una espátula entre el cráneo y dura. Si la flexión fue causada por el tamaño relativamente pequeño del cerebro, corte algunos de los electrodos. - Fije los electrodos de referencia y de la tierra con un acrílico dental. Coloque los electrodos de referencia en el espacio epidural y electrodos de tierra en la superficie craneal. Ambos contactos deben enfrentar el cráneo.
- Vuelva a colocar la pieza de hueso y fijar el perno conectador y cabeza al cráneo con acrílico dental en los tornillos.
- Sutura piel con nylon 6-0 en la frente y la cabeza posterior y fijar la piel a los lados del conector mediante cierres de piel.
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Tras la implantación procedimientos
- Quitar el animal en la estructura estereotáxicas. Asegúrese de que el animal se mantiene caliente y con oxígeno durante los pasos siguientes.
- Inmediatamente después de la cirugía, se inyectan al animal con meloxicam (0,3 mg/kg i.m.) para disminuir el dolor postoperatorio. Administrar un corticosteroide antiinflamatorio (dexametasona; 2,0 mg/kg i.m.) y la infusión subcutánea (solución de Ringer entibiada; 5,0 mL), como la famotidina (0.5 mg/kg) como un gastroprotectant.
Nota: Un uso concurrente de AINES con esteroides tiene un potencial de efectos secundarios gastrointestinales. - Después el animal se haya recuperado (confirmar por pulso y SpO2), quitar control de constantes vitales y traslado del animal en la UCI durante 2-3 días.
3. postoperatorio tratamiento
Nota: Normalmente tarda 5 días para animales que se recuperan por completo de la cirugía.
- Para evitar el edema cerebral, administrar la dexametasona antiinflamatorio corticosteroide (2.0 mg/kg) dos veces al día el primer día después de la cirugía. A continuación, reducir la dosis a 1,5 mg/kg dos veces al día en el segundo y tercer día y 1 mg/kg dos veces al día en el cuarto día.
- Alivio del dolor (meloxicam; 0,1 mg/kg oral una vez al día) administrar un antihemorrágico (sodio carbazochrome sulfonato de hidrato; 0,2 mg/kg i.m. dos veces al día) durante 5 días después de la cirugía.
Nota: En nuestro caso, 1-2 días después de la cirugía, algunos monos tití (3 de 6) llegó a ser menos activo y vomitado. Esto puede deberse a aumento de la presión intracraneal debido a un coágulo de sangre. Cuando tití presenta estos síntomas, reabrió la cabeza y retirar el coágulo bajo anestesia general (alfaxalone). Si hay ningún doblez de la matriz de ECoG durante la implantación, el coágulo sanguíneo era probable en el espacio entre la matriz y donde volvió a la pieza de hueso. En este caso, el coágulo de sangre se pueden lavar lejos por correr salina en el espacio usando un catéter. Este procedimiento conduce generalmente a la recuperación del animal. -
Identificación de ubicaciones de electrodo
- Alrededor de 1 semana después de la cirugía, realizar una exploración de tomografía (CT) de computadora de la cabeza del animal.
Nota: Esta es una buena oportunidad para comprobar si pueden grabar señales correctamente. Abra la caja del conector y retire cualquier coágulos de sangre, si están presentes. - Alinee el T2-weighted MRI a coordenadas estereotáxicas usando AFNI software18 (https://afni.nimh.nih.gov) (Figura 3A). Alinear la imagen de CT a las imágenes de resonancia magnética anatómica T2-weighted con AFNI (figura 3B). AFNI y hormigas19registra un atlas del cerebro de Tití a MRI (figura 3).
- Alrededor de 1 semana después de la cirugía, realizar una exploración de tomografía (CT) de computadora de la cabeza del animal.
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Representative Results
La matriz de ECoG todo cortical puede capturar simultáneamente la actividad neuronal de la totalidad de un hemisferio. La figura 4 muestra ejemplos de potenciales evocados auditivos (PEA) de múltiples áreas auditivas en un tití despierto. Ecoge las grabaciones se realizaron en condiciones de escuchas pasivas. Cada tití fue expuesto a estímulos auditivos, que consistió en tonos puros al azar con 20 tipos de frecuencia. Luego, se calcularon los PEA promediando ECoGs alineado con los inicios de los tonos. Formas de onda diferentes se observaron de inferiores y superiores auditivas las áreas, que indica que la resolución espacial de ECoG gama puede capturar información diferente tratamiento en las diferentes áreas corticales.
Figura 1: preparación de una matriz de ECoG. (A) 32 y 64 ECoG arreglos de discos (parte inferior izquierda y derecha), un caso del conector (superior izquierda) y un front-end para los sistemas de grabación (parte superior derecha). La "G" y "R" de cada matriz indican gran y electrodos de referencia respectivamente. (B) matriz de ECoG montado. (C) se deben sellar todos los huecos (rectángulos rojos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: un ejemplo de la craneotomía. (A) el negro gris y grueso fino líneas indica esquemas de la matriz del ECoG y el área prevista de la craneotomía, respectivamente. Las cruces corresponden a los orificios de anclaje. El número en un círculo indica el orden de la perforación. Imagen de (B) un ejemplo CT de la craneotomía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: localización de cada electrodo. (A) T2-weighted MRI, CT (B) y (C) electrodo ubicaciones en el atlas. El atlas en este manuscrito es el Woodward versión 3-d basada en el Hashikawa-atlas20, que es un mapa de MRI-cytoarchitectual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: ejemplos de potenciales evocados auditivos. (A) área auditiva de mono J. (B) ejemplos de PEA. Electrodos en diferentes áreas auditivas muestran formas de onda diferentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 9:00 | Comienzan los preparativos |
| 10:00 | Haga una incisión en la piel |
| Exposición del cráneo (10 min) | |
| Craneotomía (30 min) | |
| 11:00 | Comenzar a insertar la matriz |
| Inserte la matriz (60 min) | |
| 12:30 | Piel cercana |
Tabla 1: Recomienda el curso del tiempo de la cirugía.
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Discussion
Para el éxito de la implantación, los animales deberían recibir una nutrición adecuada antes y después de la cirugía. Corto tiempo de funcionamiento también es importante para optimizar la recuperación del animal. Las preparaciones se deben acabar al menos un día antes de la cirugía. Para reducir el tiempo de funcionamiento, se recomienda la formación de craneotomía previa con inserción de electrodo array en animales terminados para propósitos experimentales. La tabla 1 muestra un ejemplo del curso del tiempo para este protocolo.
Modificamos el anestesia procedimiento y postoperatorio tratamiento caso por caso. En este protocolo de video, los animales fueron anestesiados y mantenido con una mezcla de isoflurano y el oxígeno a través de la intubación traqueal. Isoflurano puede reemplazarse con sevoflurano y la intubación traqueal puede ser reemplazada con una máscara. En otros casos, estamos anestesiados los animales con inyección intramuscular de una mezcla de ketamina y medetomidina. En este caso, los animales inicialmente fueron sedados con butorfanol (0.2 mg/kg i.m.) y anestesia quirúrgica se logró con una mezcla de ketamina (30 mg/kg i.m.) y medetomidina (0,35 mg/kg i.m.).
Porque ECoG registra directamente los cambios en campos eléctricos, su resolución temporal está limitada por el sistema de grabación. La resolución máxima del tiempo de nuestro sistema de grabación es de 30 kHz. Generalmente muestra señales a una frecuencia de muestreo de 1 kHz y han encontrado esto ser suficiente para la extracción de la información sensorial/motor.
Resolución espacial depende del diseño del electrodo. En el presente Protocolo, cada contacto de los electrodos era 0,8 mm de diámetro y tenía una distancia entre electroda de 2,5 mm. Observamos diferentes formas de onda de tres electrodos ubicados en diferentes áreas auditivas y separados por 2.5 mm (ch18, ch19 ch20 en la figura 4). Así, la resolución espacial de los electrodos se estima menos de 2,5 milímetros. En algunos casos, contactos del electrodo se encuentra más cerca uno al otro. En estos casos, la resolución espacial es más fina.
Con éxito se registraron las señales neuronales a largo plazo con buena calidad. En un caso, el conector y el acrílico dental fueron separadas del cráneo, y el electrodo fue rotos 4 meses después de la cirugía. Esto fue causado por el crecimiento del tejido debido a la sangre está contenida entre el acrílico dental y cráneo durante la cirugía. Otro tití fue terminado debido a un requisito experimental 5 meses después de la cirugía. Cuatro animales todavía están participando en experimentos (1 año, 7 meses, 4 meses, y 4 meses después de la cirugía, respectivamente).
Arreglos de discos de ECoG se implantan típicamente en el espacio subdural en los seres humanos y macacos. Sin embargo, menos implantes invasivos epidurales son más adecuados para los titíes, porque son animales delicados. Fina dura materia de titíes permitidos monitorear señales de alta frecuencia cerebrales, incluso si la matriz de ECoG se implantó en la duramadre. Uno de los inconvenientes de la implantación de la epidural es la dificultad para acceder a la corteza media y cualquier corteza dentro de un surco. Acercarse a estas cortezas requiere incisión de la materia dura. Además, debido a arreglos de discos de ECoG son electrodos de superficie, es difícil especificar la fuente de señal en términos de profundidad cortical. Para entender el procesamiento en la corteza de la información precisa, es necesario incluir otros métodos, tales como electrodos de profundidad o la proyección de imagen óptica. A pesar de estas limitaciones, nuestro método puede proporcionar nuevas perspectivas en el tratamiento de la información cortical. Por ejemplo, la Agencia sensorial ha se ha creído que emergen a través de la interacción rápida entre las áreas frontal y sensoriales; sin embargo, sus mecanismos todavía no están claros, puesto que este flujo de información rápido, cortical, a gran escala es difícil de controlar sin el método presentado aquí.
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Disclosures
MK está aplicando para una patente sobre todo cortical matriz de ECoG ha utilizado en este protocolo (no. 2018-210975).
Acknowledgments
Agradecemos a Yuri Shinomoto para proporcionar el cuidado de los animales, la formación y grabaciones despiertas. Los arreglos de discos de ECoG fueron fabricados por Cir-Tech (www.cir-tech.co.jp). Además, nos gustaría dar las gracias Editage (www.editage.jp) para la edición de lengua inglesa. Este trabajo fue apoyado por el mapeo cerebral por Neurotechnologies integrado de estudios de la enfermedad (cerebro/mente), la Agencia de Japón para investigación médica y el desarrollo (AMED) (JP18dm0207001), el proyecto de ciencia del cerebro del centro para iniciativas de ciencia novela ( CNSI), los institutos nacionales de Ciencias naturales (NINS) (BS291004, M.K.) y por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) KAKENHI (JP17H06034, M.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker (100 cc) | Outocrave | ||
| Cotton ball | Outocrave | ||
| Absorption triangles | Fine Science Tools Inc. | 18105-03 | Outocrave |
| Cotton swab with fine tip | Clean Cross Co., Ltd. | HUBY340 BB-013 | Outocrave |
| Gauze | Outocrave | ||
| Towel forceps | Outocrave | ||
| Scalpel handle | Outocrave | ||
| Needle Holder | Outocrave | ||
| Iris Scissor | Outocrave | ||
| Micro-Mosquito Forceps | Outocrave | ||
| Adson, 1x2 teeth | Outocrave | ||
| Bone Curette | Outocrave | ||
| Micro spatura | Fine Science Tools Inc. | 10091-12 | Outocrave |
| Needle Holders, 12.5 cm, Curved, Smooth Jaws | World Precision Instruments | 14132 | Outocrave |
| Vessel Dilator, 12 cm, 0.1 mm tip | Fine Science Tools Inc. | 18131-12 | Outocrave |
| Vessel Dilator, 12 cm, 0.2 mm tip | Fine Science Tools Inc. | 18132-12 | Outocrave |
| Fine-tipped rongeur | Fine Science Tools Inc. | 16221-14 | Outocrave |
| Manipurator of a stereotaxic frame | Gas sterilization | ||
| Wrench for the manipurator | Gas sterilization | ||
| Hand-made fixture for the connector | Gas sterilization | ||
| Silicon cup for dental acril | Gas sterilization | ||
| Silicon cup hlder | Gas sterilization | ||
| Paintbrush | Gas sterilization | ||
| Pencil | Gas sterilization | ||
| Micro screw, 1.4 mm x 2.0 mm | Nippon Chemical Screw Co., Ltd. | PEEK/MPH-M1.4-L2 | Gas sterilization |
| Screw driver for the micro screw | Gas sterilization | ||
| Micromotor handpiece of a drill | Gas sterilization | ||
| Stainless steel burr, 1.4 mm | Gas sterilization | ||
| Stainless steel burr, 1.0 mm | Gas sterilization | ||
| Drill bit, 1.2 mm | Gas sterilization | ||
| Rubber air blower | Gas sterilization |
References
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