Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Gensplejsning af Dictyostelium discoideum celler baseret på udvælgelse og vækst på bakterier

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/58981
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 3, 4,5, 1, 1
1MRC Laboratory of Molecular Biology, 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut, 3Cancer Research UK Beatson Institute Glasgow, 4MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 5Department of Cell and Developmental Biology, University College London

Summary

Dictyostelium discoideum er en populær model organisme at studere komplekse cellulære processer såsom celle migration, endocytose og udvikling. Nytten af organismen er afhængig af muligheden for genmanipulation. Vi præsenterer her, metoder til at transfect Dictyostelium discoideum celler, at overvinde eksisterende begrænsninger af dyrkningsbaserede celler i flydende medier.

Abstract

Dictyostelium discoideum er en spændende model organisme for studiet af celle differentiering processer under udvikling, celle signalering, og andre vigtige cellebiologi spørgsmål. De tilgængelige at genmanipulere Dictyostelium celler teknologier er veludviklet. Transfections kan udføres ved hjælp af forskellige valgbare markører og markør igen cykling, herunder homologe rekombination og pattedyrsceller mutagenese. Dette understøttes af et godt kommenteret genom. Men disse tilgange er optimeret til axenic cellelinjer vokser i flydende kulturer og er vanskelige at anvende til ikke-axenic wild-type celler, der lever kun af bakterier. De mutationer, der findes i axenic stammer forstyrre Ras signalering, forårsager overdreven macropinocytosis kræves til fodring, og forringe celle migration, som tilintetgør fortolkning af signaltransduktion og chemotaxis eksperimenter i disse stammer. Tidligere forsøg på at genmanipulere ikke-axenic celler har manglet effektivitet og krævede komplekse eksperimentelle procedurer. Vi har udviklet en simpel Transfektion protokol, der for første gang, overvinder disse begrænsninger. Disse serier af store forbedringer til Dictyostelium molekylær genetik tillade wild-type celler til at være manipuleret så let som standard laboratorium stammer. Ud over fordelene for at studere ufordærvede signalering og motilitet processer, kan mutanter, der forstyrrer macropinocytosis-baserede vækst nu let isoleret. Derudover er hele Transfektion arbejdsprocessen meget fremskyndet, med rekombinant celler, der kan genereres i dage snarere end uger. En anden fordel er, at molekylær genetik yderligere kan udføres med frisk isolerede vildtype Dictyostelium prøver fra miljøet. Dette kan bidrage til at udvide anvendelsesområdet for metoder, der anvendes i disse forskningsområder.

Introduction

Dictyostelium -slægten er jordlevende sociale amøbe, der primært lever af bakterier. Lægges i phylum Amoebozoa, et stort antal arter er blevet isoleret, kan inddeles i fire forskellige klader1. Arter Dictyostelium discoideum (D. discoideum) er blevet en populær model organisme at studere komplekse cellulære processer såsom celle migration og fagocytose. At kontrollere og standardisere forsøgsbetingelser, axenic celle linjer er blevet udviklet, som er i stand til at vokse i komplekse eller definerede flydende medium i mangel af bakterier2. Af særlig betydning er Ax2, Ax3, og Ax4 stammer, som blev genereret i 1970 ' erne og i sidste ende stammer fra en enkelt vild isolere NC43. Værktøjer til genteknologi blev udviklet i disse axenic stammer, hvilket resulterer i den første offentliggjorte knockout i 19874,5. Protokoller blev yderligere udviklet og optimeret til brug under axenic forhold6,7.

Tilpasning af disse protokoller til wild-type D. discoideum stammer, der ikke er i stand til at vokse i flydende bouillon har været forsøgt af flere laboratorier. Men dette er ikke blevet fuldt ud vellykket da Transfektion protokoller er komplekse og manglende effektivitet, delvis på grund af kapacitet af bakterierne til at fungere som en vask for selektiv reagenser8,9. Som et resultat, kommer det væsentlige alle molekylære data på D. discoideum fra efterkommere af en enkelt vildtype isolat. Vi ønskede at overvinde denne begrænsning og udvikle en metode til at genetisk ændre D. discoideum celler uafhængigt af deres evne til at vokse i flydende substrat. Behovet for en sådan metode kan forklares ved den konstatering, at det blev antaget i fortiden, at mutationer giver mulighed axenic vækst var overvejende neutrale og ikke forringe celle fysiologi. Denne antagelse er kun delvist korrekt. Generelt er der to markante forskelle; først, mellem de forskellige isoleret axenic stammer, og for det andet, hvornår disse axenic stammer er sammenlignet med ikke-axenic vilde isolater8,9.

Måske er den mest kritiske faktor den vigtigste axenic gen, axeB, der blev identificeret for nylig som RasGAP NF1. Den vigtigste funktion af NF1 som en RasGAP er at begrænse Ras aktivitet3. Sletning af enzym i alle axenic stammer fører til overdreven Ras aktivitet manifesteret som dannelsen af store aktive Ras patches. Disse udvidede Ras patches føre til ophobning af PIP3 i plasma membranen. De tilfældigt optræder lapper af PIP3 og aktiv Ras er en skabelon for dannelsen af en cirkulær flæse, der til sidst lukkes og fører til dannelsen af macropinosomes10. Konsekvensen er en for stor stigning i macropinocytic aktivitet. Macropinocytosis er en actin-drevet proces. En konkurrence for cytoskeletal komponenter for dannelsen af enten macropinosomes eller pseudopods er resultatet. Dens indvirkning på celle adfærd er afspejlet i den næsten komplet forebyggelse af chemotaxis vegetative celler til folat11. De massivt forstørret PIP3 patches er meget persistent. Selv i sultet celler, PIP3 patches forblive og kan mistolkes som pseudopods, som kan forårsage problemer tolkning undersøgelser på chemotaxis til lejren.

I nogle tilfælde er NF1 mutation eksperimentelt nyttige. Dette fører os til en anden motivation for at udvikle en Transfektion metode for bacterially dyrket D. discoideum celler, da stigningen i macropinocytosis sats gør axenic celler værdifulde for at undersøge grundlæggende aspekter af denne proces12 . Mutation i de gener, der er nødvendige for macropinocytosis, som Ras og PI3-kinaser10, har dog næsten afskaffet axenic vækst, hvilket gør det nødvendigt at manipulere disse celler gennem vækst på bakterier. En anden grund, der gengiver bakterier-baseret transfections værdifulde er den øgede anvendelse af Dictyostelids til at undersøge spørgsmål i udviklingen af multi celleforandringer13,14, kin anerkendelse15,16, og altruistiske cellulære adfærd, som hovedsagelig afhænger af anvendelsen af frisk isolerede vildtype isolerer17. Alle nævnte forskningsområder kan lettes ved effektive metoder til genetisk manipulation af vilde isolater, som er ikke-axenic og dyrker ikke i flydende bouillon.

Vores protokoller giver mulighed for at overvinde de beskrevne begrænsninger. Tilsammen, mulighed for at udføre genetiske manipulationer med bakteriel vokset D. discoideum celler rummer fordele for alle Dictyostelium forskere, selv om det er bare den øget hastighed af udvælgelsesprocessen grund hurtigere vækst af amoeba (4 h fordobling tid) på bakterier i forhold til væksten i axenic medier (10 h fordobling tid).

Protocol

1. forberedelse af celler og materialer

  1. SorMC buffer forberedelse
    1. Forberede 100 mL 100 x SorMC (Sorensen buffer herunder MgCl2 og CaCl2) buffer ved at opløse 20.36 g KH2PO4 (15 mM) og 5.47 g Na2HPO4·7 H2O (2 mM) i 100 mL ddH2O vand. Opløsningen omrøres ved stuetemperatur (RT) og bringe volumen på 100 mL med dH2O.
      Bemærk: Den resulterende buffer har en pH på 6 og behøver ikke yderligere justering.
    2. Producere 1000 mL 1 x arbejder løsning i ddH2O. tilsættes 50 µL hver af MgCl2 og CaCl2 at opnå endelige koncentrationer af 50 µM. Filter sterilisere den løsning ved hjælp af et 0,22 µm filter.
      Bemærk: Altid tilføje MgCl2 og CaCl2 til 1 x buffer til at undgå udfældning af salte i 100 x stamopløsning.
    3. Alternativt, forberede KK2 buffer (2,2 g KH2PO4 og 0,7 g K2HPO4 til 1 L buffer) suppleret med 50 µM MgCl2 og 50 µM CaCl2 (herefter omtalt som KK2MC). Brug denne buffer i hele i stedet for SorMC.
  2. Forberedelse af bakterier som fødekilde til D. discoideum
    1. Bruge en enkelt koloni af K. aerogenes og podes 1 L af LB-medie (lysogeny bouillon). Bruge en 2 L kolbe. Lad bakterier vokse natten over ved 37 ° C under omrystning på 220 rpm.
      Bemærk: Hvis store mængder af bakterier nødvendigt, bruge rigere medier som 2xTY (gær extract trypton medium) eller SOB (super optimal bouillon) i stedet for LB. I tilfælde af anvendelse af K. aerogenes bakterier ikke er tilladt på grund af sikkerhedsrestriktioner, kan BL21 E. coli bruges i stedet.
    2. Høste cellerne næste dag ved at dreje dem ned i to 500 mL centrifugeglas på ~ 6.600 x g i 20 min. vask bakterier engang med 500 mL af SorMC buffer.
    3. Resuspenderes i 20 mL af SorMC. Kontrollere OD600 (optisk tæthed på 600 nm) ved hjælp af et fotometer. Fortyndes med den samme buffer til en OD600 af omkring 100.
      Bemærk: K. aerogenes bakterier er vanskelige at pellet, så en relativt høj hastighed til spinding ned bakterier er nødvendige for at undgå tab af mad bakterier. Den resulterende bakteriel stamopløsning kan opbevares i op til 4 måneder i køleskab ved 4 ° C og bevare sin nytte som fødekilde for D. discoideum. 1 L af natten K. aerogenes suspension vokset i LB medium normalt giver 20 mL af en OD600 af omkring 100.
      Forsigtighed: For at sikre, at de forberedte bakterier en monokultur af K. aerogenes, skal du udføre alle trin under en hætte.
  3. Forberedelse af H40 elektroporation buffer
    1. Forberede 100 mL stødpudeopløsning, opløses 0.952 g af HEPES i ddH2O vand og tilføje 100 µL af MgCl2 af en stamopløsning, 1 M. Justeres til pH 7 ved hjælp af KOH for titrering. Sterilisere bufferen ved hjælp af et 0,22 µm filter eller en autoklave. Bruge syrefri HEPES og ikke natriumsalt.
  4. Udføre plasmid forberedelse efter producentens protokol og ved hjælp af kits opsummeret i Tabel af materialer. Bruge plasmider opsummeret i tabel 1.
    Bemærk: Kvaliteten af DNA anvendes til Transfektion er afgørende. Udvælgelsen af D. discoideum transfectants vokser på bakterier har specifikke krav for initiativtagerne kørsel udvælgelse og udtryk kassette (Se diskussion).
plasmid navn modstand/udvalg i bakterier modstand/udvalg i Dictyostelium Tag
extrachromosomal udtryk plasmider
pDM1203 Ampicilin G418 Nej
pDM1207 Ampicilin G418 N-terminale normal god landbrugspraksis
pDM1208 Ampicilin G418 N-terminal mCherry
pPI159 Ampicilin G418 N-terminal mNeon
pPI437 Ampicilin G418 N-terminal mScarlet
pPI54 Ampicilin G418 N-terminal mTurquoise2
pDM1209 Ampicilin G418 C-terminale normal god landbrugspraksis
pDM1210 Ampicilin G418 C-terminal mCherry
pPI143 Ampicilin G418 C-terminal mNeon
pPI459 Ampicilin G418 C-terminal mScarlet
pPI142 Ampicilin G418 C-terminal mTurquoise2
shuttle plasmider
pDM344 Ampicilin Nej Nej
pDM1019 Ampicilin Nej N-terminale normal god landbrugspraksis
pDM1018 Ampicilin Nej N-terminal mCherry
pPI152 Ampicilin Nej N-terminal mNeon
pPI418 Ampicilin Nej N-terminal mScarlet
pPI150 Ampicilin Nej N-terminal mTurquoise2
pDM1021 Ampicilin Nej C-terminale normal god landbrugspraksis
pDM1020 Ampicilin Nej C-terminal mCherry
pPI153 Ampicilin Nej C-terminal mNeon
pPI457 Ampicilin Nej C-terminal mScarlet
pPI151 Ampicilin Nej C-terminal mTurquoise2
inducerbar extrachromosomal udtryk plasmider
pDM1038 Ampicilin Hygromycin Nej
pDM1047 Ampicilin Hygromycin N-terminale normal god landbrugspraksis
pDM1046 Ampicilin Hygromycin N-terminal mCherry
pPI450 Ampicilin Hygromycin N-terminal mNeon
pPI452 Ampicilin Hygromycin N-terminal mScarlet
pPI449 Ampicilin Hygromycin N-terminal mTurquoise2
pDM1049 Ampicilin Hygromycin C-terminale normal god landbrugspraksis
pDM1048 Ampicilin Hygromycin C-terminal mCherry
pPI470 Ampicilin Hygromycin C-terminal mNeon
pPI460 Ampicilin Hygromycin C-terminal mScarlet
pPI469 Ampicilin Hygromycin C-terminal mTurquoise2
act5 sikkert tilflugtssted målretning plasmider
pDM1501 Ampicilin Hygromycin Nej
pDM1513 Ampicilin Hygromycin N-terminale normal god landbrugspraksis
pDM1514 Ampicilin Hygromycin N-terminal mCherry
pPI231 Ampicilin Hygromycin N-terminal mNeon
pPI419 Ampicilin Hygromycin N-terminal mScarlet
pPI228 Ampicilin Hygromycin N-terminal mTurquoise2
pDM1515 Ampicilin Hygromycin C-terminale normal god landbrugspraksis
pDM1516 Ampicilin Hygromycin C-terminal mCherry
pPI230 Ampicilin Hygromycin C-terminal mNeon
pPI458 Ampicilin Hygromycin C-terminal mScarlet
pPI229 Ampicilin Hygromycin C-terminal mTurquoise2
REMI udtryk plasmider
pDM1220 Ampicilin Hygromycin Nej
pDM1351 Ampicilin Hygromycin N-terminale normal god landbrugspraksis
pDM1259 Ampicilin Hygromycin N-terminal mCherry
pPI465 Ampicilin Hygromycin N-terminal mNeon
pPI468 Ampicilin Hygromycin N-terminal mScarlet
pPI466 Ampicilin Hygromycin N-terminal mTurquoise2
pDM1352 Ampicilin Hygromycin C-terminale normal god landbrugspraksis
pDM1305 Ampicilin Hygromycin C-terminal mCherry
pPI471 Ampicilin Hygromycin C-terminal mNeon
pPI467 Ampicilin Hygromycin C-terminal mScarlet
pPI472 Ampicilin Hygromycin C-terminal mTurquoise2
målrettet i rammen plasmider
pDM1355 Ampicilin Hygromycin C-terminale normal god landbrugspraksis
pPI461 Ampicilin Hygromycin C-terminal mCherry
pPI462 Ampicilin Hygromycin C-terminal mNeon
pPI464 Ampicilin Hygromycin C-terminal mScarlet
pPI463 Ampicilin Hygromycin C-terminal mTurquoise2
Knock-out plasmider
pDM1079 Ampicilin Blasticidin Nej
pDM1080 Ampicilin Nourseothricin Nej
pDM1081 Ampicilin Hygromycin Nej
pDM1082 Ampicilin G418 Nej
CRE udtryk plasmider
pDM1483 Ampicilin Nourseothricin Nej
pDM1489 Ampicilin Hygromycin Nej
pDM1488 Ampicilin G418 Nej

Tabel 1: Plasmid liste for ikke-axenic transfections.

  1. Opsætning af Dictyostelium celler for Transfektion
    1. Vokse K. aerogenes til sammenløbet i SM medium (næringsrige medium) overnatning på RT. kulturer kan opbevares i op til 2 uger ved 4 ° C.
    2. Tilføje omkring 400 µL af denne bakteriel suspension på en SM agar plade (pepton 10 g/L; gær extract 1 g/L; glukose 10 g/L; KH2PO4 1,9 g/L; K2HPO4 x 3 H2O, 1,3 g/L; MgSO4 vandfri 0,49 g/L; 1,7% agar) og jævnt fordelt. Tage en steril loop og podes med Dictyostelium celler. Sprede celler på kanten af pladen.
    3. Inkuber plade ved 22 ° C i 2 dage for at sikre tilstrækkelig stor vækst zoner for Transfektion.
      Bemærk: For Dictyostelium stammer, der ikke laver store vækst zoner (f.eks. Ax3, DH1 eller JH10), eller for uerfarne eksperimentatorer, bruge clearing plader i stedet. For dette, Følg instruktionerne i trin 1.5.4 til 1.5.6.
    4. Tage en steril loop og podes med Dictyostelium celler (ca. 2-4 x 105 celler). Overfør celler til 800 µL af en tætte K. aerogenes suspension i SM. Mix celler af pipettering op og ned.
    5. Overføre 400 µL, 200 µL, 100 µL og 50 µL på frisk SM agar plader. Føje til hver plade 400 µL af yderligere SM K. aerogenes suspension, jævnt fordelt, og tør.
    6. Inkuber plader ved 22 ° C i ca 2 dage indtil pladerne bliver gennemsigtig.
      Bemærk: På grund af deres hurtigere vækst, bakterier i første omgang producere en sammenflydende græsplæne og amøber "clear efterfølgende" plade af bakterier. Den nødvendige tid til denne proces kan variere afhængigt af stamme baggrund og evne af muterede celler til at vokse på bakterier.

2. Transfektion af Dictyostelium celler baseret på bakteriel udvalg

Figure 1
Figur 1 : Arbejdsgang for Transfektion af bakterier-vokset Dictyostelium celler. Trin til Transfektion er opført som følger. Vokse D. discoideum celler på en SM plade med K. aerogenes bakterier (rød). Høste celler kun forfra fodring (grøn), undgå celler, der allerede udvikler (mørk grøn). Vaske cellerne i H40. Resuspend celler til en afsluttende tæthed af 2-4 x 107 celler/mL. Bland cellesuspension med 1-2 µg af DNA. Overfør blandingen til en elektroporation kuvette og puls celler. Overføre cellerne direkte efter elektroporation til et fad med SorMC og bakterier. Tillad cellerne at inddrive for 5 h før du tilføjer den valgbar markør. Extrachromosomal plasmider, tilføje udvælgelse direkte til fadet. Transfectants er normalt synlige efter ~ 2 dage. For lineariserede konstruktioner, der sigter til enkelt integration i genomet, oprettet tre fortyndinger som anført og tilføje udvælgelse. Bakterier er taget fra OD600 = 100 stamopløsning. Bland rør godt og overføre cellerne i 96-godt flad bund vævskultur plader. Bruge to plader pr. fortynding. Tilsæt 150 µL af cellesuspension til hver brønd. Det tager ca 5 dage indtil stramme kolonier er synlige. De røde brønde viser et eksempel på det sædvanlige antal held transformerede celler fremstillet (øverste panel ændret fra tidligere offentliggørelse22). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. For at forberede plader med K. aerogenes suspension, der tilsættes 10 mL af SorMC buffer indeholdende K. aerogenes bakterier til en tæthed af OD600 = 2 (tilføje 200 µL af den forberedte OD600 = 100 K. aerogenes stamopløsning for den ønskede bakterier koncentration) i et 10 cm vævskultur behandlet petriskål.
    Bemærk: Denne plade er senere skulle dyrke de transfected D. discoideum celler. Alternativt, en 6-godt vævskultur plade kan bruges. I tilfælde af Transfektion af de extrachromosomal plasmider er 6-godt vævskultur plade mere ressourceeffektiv. Bruge 2 mL af K. aerogenes SorMC (OD600 = 2) suspension pr. brønd.
  2. Forberedelse af Dictyostelium celler
    1. Bruger en 10 µL engangs podning løkken, skrabe celler fra zonerne vækst (ca. 3 cm) kultur plade (kanten af området ryddet) eller clearing plade. Overfør celler ind i en 1,5 mL rør indeholdende 1 mL iskold H40 buffer.
      Bemærk: Timingen af høst celler fra clearing plader er afgørende. Høst for tidligt udbytte for lidt en mængde af celler, mens høst til sene øger udviklet risikoen for fremstilling af delvist celler.
    2. Cellerne vaskes af spinning ned for 2 min på 1.000 x g eller flash-spinning for 2 s på 10.000 x g. Supernatanten og resuspend celler i H40 buffer til en afsluttende tæthed af 2-4 x 107 celler/mL. Holde cellerne kold under hele Transfektion procedure. Bruge en is-vand gylle for at sikre direkte kontakt mellem rør og is.
  3. Elektroporation
    1. Tilføje 100 µL af celler til et rør med 1-2 µg af DNA. Der blandes omhyggeligt ved pipettering op og ned.
    2. Overføre celle/DNA blandingen til en pre kølet elektroporation kuvette (2 mm hul).
    3. Puls celler ved hjælp af følgende indstillinger for square-bølge: 350 V, 8 ms, 2 pulser og 1 s puls interval.
      Bemærk: Læg ikke mere end 2 µg af DNA. Større mængder er giftigt for celler og mindske Transfektion effektivitet. Samlet tilføjet DNA volumen ikke bør overstige 5 µL.
    4. Overfør celler straks til de tidligere parat 10 cm petriskål med K. aerogenes SorMC og tillade cellerne til at inddrive for 5 h.
      Bemærk: Se celler i petriskålen under en inverteret mikroskop. Celler vises runde direkte efter elektroporation men vil vende tilbage til deres amoeboid form efter ca 30 min, når de har haft tid nok til at vedhæfte ordentligt på overfladen.
  4. Udvalg af transfectants: afhængigt af hvorvidt Transfektion har til formål at generere en knock-out, knock-i eller act5 knock-i, eller til at udtrykke en fluorescerende reporter protein fra en extrachromosomal plasmid, udføre udvælgelsesprocessen gennem en af følgende beskrevne metoder.
    Bemærk: I modsætning til axenically dyrkede celler er bacterially dyrkede celler meget modstandsdygtigt over for blasticidin. Udvalg, derfor altid udføres ved hjælp af G418 eller hygromycin (Se diskussion).
    1. Knock-outs, knock-ins og act5 knock-ins
      1. Frigør cellerne omhyggeligt fra petriskålen ved gentagne gange tvinger væsken fra en pipette på overfladen.
      2. Oprette tre fortyndinger i SorMC K. aerogenes suspension (OD600 = 2) og tilføje den selektive agent ifølge den modstand benyttede (Se figur 1).
      3. Lav fortynding: 9 mL cellesuspension blandes med 20,4 mL af SorMC og 600 µL af K. aerogenes stamopløsning.
      4. Medium fortynding: mix 900 µL af cellesuspension med 28,5 mL af SorMC og 600 µL af K. aerogenes stamopløsning.
      5. Høj fortynding: Bland 90 µL af cellesuspension med 29.3 mL af SorMC og 600 µL af K. aerogenes stamopløsning.
      6. Tilføj 30 µL af valgbar markør (100 x stamopløsning).
      7. Distribuere de forberedte fortyndinger i 96-godt flad bund vævskultur plader af pipettering 150 µL af cellesuspension til hver brønd.
        Bemærk: Denne procedure tager sigte på at skærmen enkelt kloner snarere end populationer. Markeringen tager ca 5-7 dage, afhængigt af konstruktionen bruges.
    2. Extrachromosomal plasmider
      1. Tilføje valgbar markøren direkte til fadet, 10 mL (Se figur 1).
        Bemærk: Der er ingen grund til at konfigurere fortyndinger, da der ikke er noget ønske om for klonede populationer. Udvælgelsesprocessen for extrachromosomal plasmider er hurtigere på grund af høj kopi numre findes i D. discoideum celler. Transfectants kan forventes efter 32 h til 2 dage.
        Forsigtig: De antibiotika, der anvendes som valgbar markør er giftige. Bære handsker.
  5. Skærm fremstillet klonerne for positive tranfectants. Knock-out eller knock-i forsøg, Følg instruktionerne i trin 2.5.1. Kontrollere Transfektion succes for extrachromosomal plasmider ved at følge instruktionerne i trin 2.5.2.
    1. Til knock-outs udføre knock-ins og act5 knock-ins, den indledende skærm via PCR at bekræfte integration af konstruktionen i den korrekte genomisk locus.
      Bemærk: For at maksimere sandsynligheden for klonede populationer, bruge den højeste fortynding muligt der giver transfectants efter udvalg. Målet for plader, der er en højst en tredjedel af brønde besat.
      1. For at udvide klonede populationer, overføre kloner, som er vokset efter udvalg fra 96-brønd vævskultur plade i en 12-godt vævskultur plade til at vokse nok celler til isolering af genomisk DNA. Levere hver brønd med 1 mL af SorMC K. aerogenes (OD600 = 2) og frisk valgbar markør.
        Bemærk: 1 dag er normalt tilstrækkelig til at opnå en sammenflydende godt egnet til DNA isolation.
      2. For at udføre mini genomisk DNA isolation, høste celler af en sammenflydende godt og isolere genomisk DNA ved hjælp af en mini DNA udvinding kit efter fabrikantens anvisninger.
      3. Bruge den isolerede genomisk DNA sammen med passende primere og Taq-polymerase (Se Tabel af materialer) til PCR skærm til positive integrands.
        Bemærk: Efter bekræftelse af positiv integration i den korrekte genomisk locus, skal en sydlige skamplet analyse udføres. Dette sikrer større tillid, yderligere indsættelse begivenheder i uspecifik genomisk regioner ikke har fundet sted.
    2. For fluorescerende reporter proteiner, visuelt identificere positive fluorescerende celler og tjekke med et fluorescens mikroskop. Alternativt kan du udføre en vestlige skamplet med passende antistoffer for biokemiske identifikation.
PCR program
trin temperatur tid
Indledende denaturering 94 ° C 30 s
30 cykler 94 ° C 15-30 s
42 ° C 15-60 s
68 ° C 1 min/kb
Endelige udvidelse 68 ° C 5 min
Hold 4-10 ° C
Reaktion sammensætning
komponent 25 μL reaktion endelig koncentration
10 µM fremad Primer 0,5 ΜL 0,2 ΜM
10 µM omvendt Primer 0,5 ΜL 0,2 ΜM
DNA-Template variabel (ca. 5 µL) < 1.000 ng
2 x Master Mix med Standard Buffer herunder polymerase (se tabel over materialer) 12,5 ΜL 1 x
Nukleasen-frit vand til 25 µL < 1.000 ng

Tabel 2: PCR program og prøve sammensætning til forstærkning af D. discoideum genomisk DNA.

Representative Results

Extrachromosomal plasmider bruges til reporter undersøgelser, som har til formål at identificere lokalisering af visse proteiner inde i en celle eller ændringer i cellestruktur af muterede celler. For mange tilgange, såsom kontrol af cellecyklus, er det afgørende at udtrykke to journalister på samme tid. Det er nu muligt ved hjælp af vores dual reporter extrachromosomal plasmid system (tabel 1). På dag 1, var celler transfekteret før du tilføjer den valgbar markør G418 efter 5 h (figur 1). I eksemplet, NC4, DdB, Ax2 og uafhængigt afledte vilde isolaterne V12M2 og WS2162 (supplerende tabel 1) var transfekteret med plasmidet pPI289, som koder for normal god landbrugspraksis-TubulinA, en markør for mikrotubuli og mCherry-PCNA, et protein, der er bruges til at overvåge celle cyklus (figur 2A). Efter 32 h, blev cellerne observeret under mikroskop. Fleste celler udtrykt både fluorescerende-mærket fusion proteiner, rapporter konsistent med tidligere dette udtryk af to journalister fra de samme plasmid viser lignende udtryk niveauer, som er næsten umuligt, når du bruger to forskellige plasmider 18,19. En repræsentativ celle for hver cellelinje (NC4, DdB, Ax2, V12M2 og WS2162) udtrykker det ønskede dual reporter er vist i figur 2B. Transfektion effektivitetsgevinster er sammenfattet i fig.2 C. NC4-afledte cellelinjer vise de bedste Transfektion effektivitetsgevinster. Men for cellelinjer, V12M2 og WS2162, et betydeligt stort antal transfectants blev opnået.

Figure 2
Figur 2 : Udtryk for en extrachromosomal plasmid. (A) Extrachromosomal plasmider er direkte transfekteret i cirkulær form. Som et eksempel, er dobbelt reporter pPI289 vist. NgoMIV websteder angive indsættelse af den anden reporter i extrachromosomal udtryk plasmid. (B) Z-projektion af en repræsentativ celle udtryk for normal god landbrugspraksis-TubulinA (cytoplasmatisk) og mCherry-PCNA (overvejende nukleare) for fem forskellige wild-type cellelinier anvendes (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162). (C) Transfektion effektivitetsgevinster for de fem cellelinjer afbilledet i (B) blev beregnet. Vist er gennemsnit af to eksperimenter. Fejllinjer angive ± SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Integration af en målretning vektor i en bestemt genomisk locus er mere udfordrende og kræver mere grundig analyse af den genererede cellelinie. I figur 3forsøges en act5- mCherry KI i NC4. Først, plasmidet skal være lineariseret for at øge hyppigheden af rekombination begivenhederne efter Transfektion. For dette, er plasmidet pDM1514 skåret med NgoMIV. To bands er fremstillet efter løb digest'en på en agarosegel. 4127 bp band indeholder de ønskede konstruktion (figur 3). For Transfektion, fordøjet DNA skal udvindes fra gel og renset ved hjælp af en gel udvinding kit efter fabrikantens anvisninger.

Figure 3
Figur 3 : Udarbejdelse af act5 knock-i og DNA for Transfektion. Et eksempel på brugen af en handle5 knock-i plasmidet pDM1514 er vist. Forberedelsestrinnene er opført som følger. (A) før elektroporation, linearize plasmid ved hjælp af de angivne NgoMIV websteder. (B, C) Køre de afskårne plasmid på en agarosegel, indtil de to forventede bands er korrekt separeret. Skåret ud 4127 bp bandet indeholdende rekombination våben, mCherry og modstand-kassetten, og gel uddrag DNA. DNA er nu klar til Transfektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Oprenset DNA blev brugt til Transfektion af NC4 celler. Efter 5-6 dage af udvælgelsen, var kloner opnået. Repræsentative Transfektion effektivitetsgevinster og mængden af positivt identificeret kloner for flere act5 knock-i forsøg er sammenfattet i tabel 3. To kloner af NC4 Transfektion var tilfældigt valgt og analyseret af PCR (figur 4A), og begge viste de forudsagte band mønstre forventes af en knock-i og blev yderligere bekræftet med det sydlige skamplet analyse til at sikre en enkelt integration tilfælde af construct i genom20. Skamplet viser en klar enkelt integration i det ønskede act5 locus (fig. 4B). Den genererede NC4::act5-mCherry -cellelinie kan nu anvendes i eksperimenter.

Figure 4
Figur 4 : Validering af act5- mCherry KIs i NC4. (A) ordning og kontrol PCR'er for validering af positive integrationer til act5 locus. De angivne primere blev brugt til at analysere to uafhængige kloner og overordnet. Begge kloner viser de forventede bands for modstand-kassette og downstream (P1) eller opstrøms primer (P2), som ikke er til stede i forældrenes stammen. Primer kombination (P1/P2) bekræfter den korrekte integration af mCherry og modstand kassette i act5 locus. Wild-type NC4 viser den forventede 2800 bp band, mens begge KI kloner mangler dette band og i stedet vise en PCR produkt om 1400 basepar større. (B) ordning for brugte begrænsning digest og sydlige skamplet. Begge knock-i kloner Vis mindre 3400 bp bandet, som er resultatet af integrationen af konstruktionen i det handle5 locus, specielt den yderligere Bcljeg site i hygromycin modstand kassette. Wild-type kontrolelement viser den forventede 5,8 kb som følge af de to nedstrøms beliggende Bcljeg websteder. Skamplet blev beskåret og splejset for klarhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

målrettet konstruktion til act5 locus plasmid navn antallet af besatte brønde antallet af kontrollerede kloner Positive kloner Korrekte kloner (%) Dictyostelium stamme bruges Transfektion effektivitet (transfectants / 2 x 10 ^ 6/1 µg DNA)
LifeAct-mCherry pPI226 7 7 1 14.2 AX2 3.5 x 10 ^ -6
LifeAct-normal god landbrugspraksis pPI227 12 12 5 41,6 AX2 6 x 10 ^ -6
NORMAL GOD LANDBRUGSPRAKSIS pDM1513 3 3 2 66,6 AX2 1.5 x 10 ^ -6
mCherry pDM1514 3 3 1 33,3 AX2 1.5 x 10 ^ -6
NORMAL GOD LANDBRUGSPRAKSIS pDM1513 66 9 5 55,5 AX2 3.3 x 10 ^ -5
mCherry pDM1514 221 12 10 83,3 AX2 1.1 x 10 ^ -4
H2B-mCherry pPI420 3 3 1 33,3 AX2 1.5 x 10 ^ -6
H2B-mCherry pPI420 7 7 6 85,7 AX2 3.5 x 10 ^ -6
mCherry pDM1514 10 10 7 70 DdB 5 x 10 ^ -6
mCherry pDM1514 240 12 11 91,6 DdB 1.2 x 10 ^ -4
mCherry pDM1514 320 12 12 100 NC4 1,6 x 10 ^ -4

Tabel 3: Transfektion effektivitetsgevinster og mængden af opnået positive transfectants for generation af act5 KIs i forskellige stamme baggrunde 22 .

Den handle5 locus tilbyder relativt homogent udtryk for integreret reporter21. De genererede NC4::act5-mCherry celler tillade mix forsøg skal udføres med andre act5 knock-ins ved hjælp af en forskellige fluorescerende protein som normal god landbrugspraksis. For at understrege den store fordel ved dette system, er blande eksperimenter med Ax2::act5-normal god landbrugspraksis vist. På grund af manglende evne til at transfect ikke-axenic wild-type celler, kunne denne form for tilgang ikke udføres før. Mix eksperimenter er et vigtigt redskab til at analysere celle adfærd, fordi de tillader en direkte sammenligning mellem forskellige cellelinjer oplever samme forsøgsbetingelser. NC4 celler vokse hurtigere på bakteriel græsplæner end Ax2 celler (figur 5A). Dette kan skyldes en højere kapacitet til phagocytosis bakterier eller forbedret evne til at flytte og Vis chemotaxis mod en fødekilde. Ved hjælp af en manglende agar folat chemotaxis assay, var direkte sammenligning af en population af NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-normal god landbrugspraksis udført, viser, at NC4::act5-mCherry er meget mere effektiv i folat sensing. Efter 4 h var flere NC4::act5-mCherry celler i stand til at kravle ind under Agarosen end Ax2::act5-NGL celler (figur 5B). Analysere standard målinger af chemotaxis for celler migrerer under Agarosen viste, at NC4::act5-mCherry celler blev hurtigere og viste stærkere kemotaktisk respons end Ax2::act5-NGL celler (figur 5C-E ).

Figure 5
Figur 5 : Brug af handle5 KIs til image-baseret chemotaxis mix eksperimenter. (A) NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-NGL udtrykker den angivne fluorescerende protein fra den handle5 locus blev analyseret for mulighed for at vokse på en bakteriel græsplæne. Efter 4 dage, plaque diameter opstået fra ensomme forgyldt Dictyostelium celler blev målt. Ikke-axenic act5:: NC4 celler gøre betydeligt større plaques end axenic Ax2::act5-NGL celler (betyde ± SD, *** p < 0,0001, n = 3, skalere bar 5 mm). (B) For brug af under Agarosen folat chemotaxis assay22 at direkte sammenligne de kemotaktisk evner af NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-NGL anvendes i (A), bakterier-vokset amøber af begge stammer blev blandet i forholdet 50: 50. Celler fik lov til at kravle ind under agarosegelelektroforese. Efter 4 h, blev celler, der overfører op folat gradient afbildet ved hjælp af en Konfokal mikroskop. Antallet af NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-NGL celler blev derefter bestemt. NC4::act5-mCherry celler blev mere effektiv i sensing folat. Om 10-fold mere NC4::act5-mCherry celler blev fundet i forhold til Ax2::act5-NGL celler (betyde ± SD, *** p < 0,0001, n = 6, skala bar 100 µm). (C, D) Cellerne blev filmet i 60 min., og deres hastighed og kemotaktisk indeks blev beregnet. Efter foreløbig udvælgelse af de mest chemotactically lydhør celler (kun dem, der overføres under Agarosen), celler Ax2::act5-NGL viste lavere værdier for både celle hastighed og chemotaxis. Halvtreds celler pr. cellelinje blev analyseret. (median ± SD, * p < 0,01, n = 3). (E) numre med NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-GFPact5 knock-ins afbildes over 60 min, viser bevægelsen mere rettet mod chemoattractent kilden til NC4::act5-mCherry celler (median ± SD, ** * p < 0,0001, n = 6). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Act5 banke-i cellelinjer kan også bruges til flowcytometri. Som med vækst på bakterier, er der store forskelle i udvikling mellem axenic stammer og ikke-axenic vilde-typer. Efter udvikling, frugtsætning organer af NC4 celler er omtrent dobbelt så store som dem, der stammer fra Ax2 celler. Hvis celler er blandet, opnås en mellemliggende størrelse frugtsætning krop. For at analysere de begge cellelinjer bidrag mere kvantitativt, blev flowcytometri brugt. Disse analyser viste klart, at de mellemliggende mellemstore frugtsætning organer er på grund af forskellige niveauer af bidrag fra begge cellelinjer. Mens NC4::act5-mCherry celler lavet op omkring 75% af de målte sporer, bidrog Ax2::act5-NGL kun 25%, afslører en potentiel fitness fordel for ikke-axenic stammer (figur 6). Da analysen ikke overvåger stilk celle befolkning, er der to muligheder for at forklare ubalancen mellem Ax2 og NC4 udvikling. En mulighed er at Ax2 celler bidrager især til stilk cellen befolkningen i stedet ind i befolkningens spore celle. Alternativt, mere NC4 celler kan indtaste den udviklingsmæssige cyklus, med Ax2 relativt forsinket, og de er derfor ikke at bidrage til samling af et frugtsætning organ. Muligheden for at transfect ikke-axenic wild-type celler videreudvikler andre tilgange og forenkler eksperimentelle procedurer.

Figure 6
Figur 6: Act5 KIs Tillad analyse af mix eksperimenter ved hjælp af flowcytometri. (A) NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-normal god landbrugspraksis var udviklet separat eller i en 50: 50 blanding på ikke-næringsstoffer agar plader. NC4::act5-mCherry celler danner større frugtsætning organer end Ax2::act5-normal god landbrugspraksis. Mix i stedet viser en mellemliggende størrelse (skala bar 5 mm). Konfokal fluorescens lysmikroskopi foreslår en højere mængde af NC4::act5-mCherry sporer i spore hoveder stammer fra blandinger. (B) at kvantificere denne observation, mængder af sporer i høstede spore hoveder fra den blanding eksperiment i (A) blev analyseret ved flowcytometri. Omkring 75% af sporer stammer fra NC4::act5-mCherry celler, med kun 25% fra Ax2::act5-NGL celler. (C) repræsentative distribution af sporer fra begge cellelinjer, der er vist i et flow flowcytometri scatter. Ca. 0,05% vise positive mCherry og normal god landbrugspraksis signaler, tyder på at parasexual fusionsprocesser har fundet sted eller at sporerne stikker til hinanden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Cellelinie Genetisk baggrund Referencenummer Offentliggjort før Type
AX2 (Ka) DBS0235521 Bloomfield et al., 2008 vildtype
NC4 (S) Bloomfield et al., 2008 vildtype
act5::mCherry klon 5 NC4 HM1912 Paschke et al., 2018 act5 banke-i
act5::GFP klon 2 AX2 HM1930 Paschke et al., 2018 act5 banke-i
V12M2 Bloomfield et al., 2008 vildtype
WS2162 Bloomfield et al., 2008 vildtype

Supplerende tabel 1: forskellige stammer af Dictyostelium studerede.

Discussion

Brug af ikke-axenic, wild-type Dictyostelium celler har været meget begrænset hidtil i molekylær forskning. Tilgængelige metoder til genetisk modificering af disse stammer har manglet pålidelighed og effektivitet23, forhindrer deres generelle vedtagelse. De genererede materialer og protokoller præsenteres her kan bruges til enhver D. discoideum stamme uafhængigt af dens evne til at vokse i flydende substrat. Det bør nævnes, at denne protokol er optimeret til NC4-afledte cellelinjer. Transfektion effektivitetsgevinster for frisk isolerede stammer fra naturen adskiller sig fra NC4, som vi har observeret før og er vist her for V12M2 og WS21628,9. Elektroporation betingelser synes især at have en betydelig indflydelse på Transfektion effektivitet og kan kræve yderligere optimering for nogle stammer. Generelt, en tilstrækkelig mængde af transfectants er blevet observeret i alle stammer testet hidtil, viser, at disse metoder er gennemførlige. Antallet af positive transfectants opnås ved hjælp af NC4-afledte stammer er højere i forhold til andre ikke-axenic stammer, wild-type, men i alle tilfælde, er tilstrækkeligt antal transfectants opnået for at give mulighed for yderligere eksperimenter. Det, plus enkelheden af vores protokol, er en stor forbedring i forhold til tidligere forsøg på8,9.

Disse nye ikke-axenic protokoller dække alle genetiske standardprocedurer og tilføje yderligere fordele, da transfections kan udføres hurtigt og effektivt i parallel. Positive kloner fås i dage snarere end uger, siden vækst på bakterier halvdele division tid. De nyoprettede plasmider også arbejder under axenic forhold og kan være rutinemæssigt anvendes under begge vækstbetingelser, der er en anden udvikling af denne methology22. Som blev indført i protokollen, plasmid brugt til valg på bakterier har særlige krav, der er afgørende for succes af Transfektion. Især er initiativtagerne kørsel udtryk og modstand-kassetter vigtige for vellykket Transfektion. Ofte brugte act6 (aktin 6) promotor24 for at køre modstand eller udtryk kassetter mangler effektivitet, når celler dyrkes på bakterier. I vores plasmid system drev meget aktive act15 (aktin 15) selskabet alle udtryk kassetter, mens modstand kassetter er under kontrol af en coA (coactosin A) promotor, både som er aktiv på axenic vilkår og i celler dyrkes på bakterier. Krav til udtryk for reporter konstruktioner samt knock-i og knock-out konstruktioner gør det nødvendigt at bruge vores plasmid repertoire, men desværre begrænser brugen af vektorer allerede oprettet som bruger ineffektive act6 promotor.

Promotor effektivitetsgevinster er især kritisk til transfections, der afhænger af en enkelt integration begivenhed i den korrekte genomisk locus. På grund af vores forbedring af initiativtagerne kørsel resistens Gen-ekspression, er nok modstand protein produceret fra enkelt locus integrationer. En stor bekymring var favorisere af flere integrationer i genomet, når du bruger hygromycin eller G418 som beskrevet. Ingen favorisere af flere integrationer er blevet observeret så langt, som rapporteret tidligere for G418 markeringer med ældre promotor systemer25. Dette betyder, at både hygromycin og G418 er egnede valgbare markører for generation af ren knock-outs og knock-ins. Desværre, valgbar markør blasticidin fungerer ikke på ikke-axenic betingelser. Dette er en større ulempe for vores metode, da blasticidin modstand kassettebånd bruges rutinemæssigt til at generere knock-out konstruktioner i D. discoideum. Konstruktioner, der allerede blev genereret med blasticidin modstand kassetter skal være rederived ved hjælp af en af de anvendelige valgbare markører. En anden mulighed for at overvinde denne begrænsning er at kombinere den nyligt etablerede axenic D. discoideum CRISPR teknologi med denne Transfektion protokol26. Generation af egnet, enkelt guide RNA'er (sgRNAs) er enklere og hurtigere end genopbygningen af komplet knock-out konstruktioner. For fremtidige retninger, mulighed for at generere flere knock-outs ved hjælp af CRISPR/Cas9 kombineret med protokollens Transfektion er tiltalende og kan bane vejen for mange forskere i Fællesskabets Dictyostelium . Dog bør gennemførligheden af de etablerede forbigående ekspressionssystem anvendes til CRISPR/Cas9 i axenic dyrkede celler undersøges nøje.

Act5 banke-in system præsenteret tilbyder en pålidelig og sikker integrationssystem for generation af stabil cellelinjer i D. discoideum, med fordelen, at lignende sider etableret i andre organismer22. Det også afhænger af en enkelt integration begivenhed i genomet og tilbyder mange muligheder for forskellige retninger. Act5 promotor er stærkt aktiv og garanterer næsten homogent udtryk27 uafhængige af dyrkning betingelser. Fluorescerende reporter proteiner kan nemt integreres i dette fristed locus ved hjælp af de manipuleret målretning plasmider. Dette kan være nyttigt, for eksempel til celle-sporing formål, som vist her i en mix eksperiment. Cellerne Vis minimal celle til celle udtryk variabilitet, som kan hjælpe med automatiseret celle sporing. Vigtigere, vises indsættelsen af en ønsket rækkefølge i den handle5 locus fænotype neutral28,29. Som udtrykket ikke afhænger af en valgbar markør til at opretholde protein udtryk, som det ses i tilfældig integrants eller extrachromosomal vektor-bærende cellelinjer, kan act5 system være nyttige for redning eksperimenter, så godt. Da cellelinjer er homogen, kan alle celler analyseres. Det er ikke muligt ved hjælp af en extrachromosomal plasmid for udtryk, hvor der er stor heterogenitet i udtryk.

Ud over disse generelle forbedringer for alle stammer giver evne til at bruge ikke-axenic wild-type celler for Molekylær forskning en vurdering af virkningerne af akkumulerede mutationer i nuværende laboratorium stammer. Flere genetiske rearrangementer er blevet fundet siden vedtagelsen af Ax2 stamme i 1970, som det fremgår af tidligere udgivne microarray analyser26. Syntetisk fænotyper overholdes på grund af tilstedeværelsen af disse mutationer. For eksempel viser en rapporteret phg2 mutant nedsat adhæsion i ét laboratorium stamme baggrund og øget friktion i en anden3. Disse modstridende data kan nu løses ved at gentage forsøget i den fælles forfader stamme (i dette tilfælde, DdB). Styrken af denne tilgang har for nylig vist sig for den lille GTPase RasS30,31.

Evnen til at udføre genetiske eksperimenter i enhver D. discoideum stamme udvider potentiale af nye forskning retninger, der afhænger af brugen af vilde isolater, især dem der involverer social evolution, kin anerkendelse og seksuel cyklus22.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.

Acknowledgments

Forfatterne takke Kay lab for input til denne metode og LMB mikroskopi og flow flowcytometri faciliteter for fremragende videnskabelig og teknisk støtte. Dette arbejde blev finansieret af Medical Research Council grant MC_U105115237 til R. R. Kay, BBSRC (bioteknologi og biologiske Sciences Research Council) tilskud BB/K009699/1 til R. R. Kay, Cancer Research UK give A15672 til R. H. Insall, Wellcome Trust Senior Fellowship 202867, Z, 16/Z til Jonathan R Chubb og MRC finansiering (MC_U12266B) til MRC LMCB Universitet enhed på UCL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R ThermoScientific 05-400-002
Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor ThermoScientific 12823252
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers Sigma Aldrich EP6331000025
Gene Pulser X Cell, including CE & PC modules BioRad 1652660
Safety Cabinet Foruna - SCANLAF Labogene
BioPhotometer Plus Eppendorf
CLSM 710 Zeiss
Media & Agaroses
LoFlo Medium Formedium LF0501
Seakem GTG Agarose Lonza 50071
Low EEO Agarose BioGene 300-200
Purified Agar Oxoid LP0028
SM broth Formedium SMB0102
2x LB broth Formedium LBD0102
Chemicals
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoScientific S33102
1 Kb Plus DNA Ladder ThermoScientific 10787018
1 Kb DNA Ladder NEB N3232L
HEPES free acid Sigma Aldrich/Merck 391340 EMD
KH2PO4 VWR P/4800/53
Na2HPO4 * 2 H2O VWR 10028-24-7
MgCl2 * 6 H2O Sigma Aldrich/Merck 5982 EMD
CaCl2 * 2 H2O Sigma Aldrich 442909
Folic Acid Sigma Aldrich F7876
KOH VWR 26668.263
Cultur Dishes
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 3595
6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 3516
100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 353003
50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5 MatTek Corporation P50G-1.5-30-F
Antibiotics
Geneticin G418-sulphate Gibco by Life Technologies 11811-023
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1
Additional Consumables
2 mm gap electroporation cuvettes, long electrode Geneflow Limited E6-0062
10 µL Inoculating Loop, Blue 10 Micro L ThermoScientific 129399
Spreader, L-shaped, sterile greiner bio-one 730190
Combitips advanced 5 mL Eppendorf BIOPUR 30089669
Kits
ZR Plasmid Miniprep Classic Zymoresearch D4016
Quick DNA Miniprep Kit Zymoresearch D3025
Zymoclean DNA Recovery Kit Zymoresearch D40002
Enzymes
Restriction enzymes NEB
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer NEB M0482L
T4 DNA Ligase NEB M0202S
PrimeSTAR Max DNA Polymerase TakaraBio R045A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schaap, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum. Development. 138 (3), 387-396 (2011).
  2. Sussman, R., Sussman, M. Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).
  3. Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), 75 (2008).
  4. Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein. The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).
  5. De Lozanne, A., Spudich, J. A. Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination. Science. 236, 1086-1091 (1987).
  6. Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum. Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).
  7. Knecht, D., Pang, K. M. Electroporation of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).
  8. Wetterauer, B., et al. Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene. Plasmid. 36, 169-181 (1996).
  9. Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains. Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).
  10. Bloomfield, G., et al. Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium. eLife. 4, (2015).
  11. Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. eLife. 5, (2016).
  12. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).
  13. Hoeller, O., Kay, R. R. Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients. Current Biology. 17, 813-817 (2007).
  14. Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement. Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).
  15. Schaap, P., et al. Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas. Science. 314, 661-663 (2006).
  16. Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).
  17. Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes. Science. 333 (6041), 467-470 (2011).
  18. Strassmann, J. E., Queller, D. C. Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).
  19. Wolf, J. B., et al. Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success. Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).
  20. Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum. Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).
  21. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).
  22. Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), 0196809 (2018).
  23. Woznica, D., Knecht, D. A. Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).
  24. Dubin, M., Nellen, W. A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium. Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).
  25. de Hostos, E. L., et al. Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility. Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).
  26. Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium. Scientific Reports. 8 (1), 8471 (2018).
  27. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  28. Rosengarten, R. D., et al. Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum. BMC Genomics. 16, 294 (2015).
  29. Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).
  30. Gebbie, L., et al. Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium. Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).
  31. Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).

Tags

Genetik spørgsmålet 143 Dictyostelium Transfektion knock-out knock-in extrachromosomal plasmider act5 overekspression chemotaxis motilitet macropinocytosis
Gensplejsning af <em>Dictyostelium discoideum</em> celler baseret på udvælgelse og vækst på bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paschke, P., Knecht, D. A.,… More

Paschke, P., Knecht, D. A., Williams, T. D., Thomason, P. A., Insall, R. H., Chubb, J. R., Kay, R. R., Veltman, D. M. Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58981, doi:10.3791/58981 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter