Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

تصميم أفلام السيليكون مسامية كحاملة لعامل نمو العصب

doi: 10.3791/58982 Published: January 25, 2019

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لتصميم واختلاق الأفلام ذات البنية النانومترية السليكون المسامية (PSi) كحاملات للتحلل لعامل نمو العصب (ستموت). تتميز تمايز الخلايا العصبية وثمرة PC12 الفئران والخلايا الجذرية الظهرية العقدة (DRG) الخلايا العصبية عند المعاملة مع ناقلات محملة ستحل هذه المبادرة.

Abstract

وبالرغم من الإمكانات الكبيرة ستموت لعلاج أمراض الأعصاب، وإدارتها العلاجية يمثل تحديا كبيرا كالبروتين لا يعبر حاجز الدم – المخ، نظراً لخواصه الكيميائية، وتتطلب بالتالي طويلة الأجل التسليم إلى الدماغ أثرا بيولوجية. ويصف هذا العمل تصنيع الأفلام هذه المبادرة ذات البنية النانومترية كحاملات القابلة للتحلل من ستموت لإيصال المطرد لهذا البروتين الحساسة. حاملات هذه المبادرة هي مصممة خصيصا للحصول على كفاءة عالية تحميل والإفراج المستمر من ستموت لمدة أربعة أسابيع، مع الحفاظ على نشاطها البيولوجي. سلوك الناقلين PSi ستموت كنظام توصيل ستموت التحقيق في المختبر بفحص قدرتها على حمل تمايز الخلايا العصبية ويعتبر امتداداً للخلايا PC12 وينتابها DRG الخلايا العصبية. يتم تقييم جدوى خلية حضور أنيق وستموت-تحميل ناقلات هذه المبادرة. تتم مقارنة بيواكتيفيتي ستموت صدر من حاملات هذه المبادرة إلى العلاج التقليدي الإدارات ستموت الحرة المتكررة. تحليل تمايز الخلايا PC12 وتتميز بقياس ثلاث معلمات مورفولوجية مختلفة من الخلايا المتمايزة؛ (ط) عدد نيوريتيس استخراج من سوما الطول (ثانيا) نيوريتيس مجموع و (ثالثا) العدد من النقاط المتفرعة. الخلايا PC12 تعامل مع الناقلين ستموت-هذه المبادرة تبرهن تفريق عميق طوال فترة الإفراج. وعلاوة على ذلك، تظهر الخلايا العصبية DRG مثقف مع الناقلين PSi ستموت التكريس نورت واسعة النطاق، معاملة مماثلة للخلايا العصبية مع الإدارات ستموت الحرة المتكررة. إظهار الناقلين الانضباطي درس يزرع طويل الأجل لإطلاق سراح ستموت بإمكانية العلاج لأمراض الأعصاب.

Introduction

أمر ضروري لتطوير وصيانة الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المحيطي (PNS)1 ستموت ويلعب دوراً حاسما في بقاء والدالة forebrain القاعدية اتروبين الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي (CNS)2. إمكاناتها الدوائية عالية لعلاج أمراض الأعصاب المركزية، مثل الزهايمر وباركنسون، تم على نطاق واسع أثبت، مع التجارب السريرية حاليا في التقدم3،،من45، 6. التحدي الأكبر في إيصال ستموت للجهاز العصبي المركزي تكمن في قدرته على عبور حاجز الدم في الدماغ (BBB)، عندما تدار النظامية7. وعلاوة على ذلك، ستموت القابلية للتحلل الأنزيمي السريع يجعل نصف العمر القصير، ويحد بشكل كبير بالاستخدام العلاجي8،9. ولذلك، هناك تحد غير ملباة لتصميم نظم التسليم التي تسمح لإطلاق سراح المطولة والتي تسيطر عليها من ستحل بطريقة آمنة. وقد نظم إيصالها ستموت المختلفة، بما في ذلك الأنظمة المستندة إلى البوليمر، درس10،11،،من1213،،من1415، 16 , 17-الإفراج عن ملامح هذه النظم غالباً ما اتسمت باندفاع أولى متميزة يليه بيان مستمر بطيء، حيث كان معدل الإفراج منخفضة إلى حد كبير بالمقارنة مع الاندفاع الأولى11 في المرحلة الأخيرة ،،من1819. وعلاوة على ذلك، لوحظت المنظمة البروتين من منتجات التحلل الحمضي للبوليمرات (مثلاً، حمض poly(lactic-co-glycolic)) أو فقدان بيواكتيفيتي ستموت خلال عملية التغليف مع هذه النظم20.

هذه المبادرة ذات البنية النانومترية ويتسم بخصائص جذابة عدة، بما في ذلك المساحة السطحية العالية وكبر حجم المسامية، توافق مع الحياة، والانحلالية الانضباطي في سوائل الجسم، بريديستينينج ذلك واعدة المخدرات تسليم منصة21، 22،،من2324،25،26،،من2728. الاختيار المناسب لظروفها أنوديزيشن يسمح بسهولة ضبط الخصائص الهيكلية هذه المبادرة (الحجممثلاً، المسامية والمسام) للخياطة تحميل المخدرات وإطلاق سراح حركية21،27. وعلاوة على ذلك، تسمح مختلف الطرق الكيميائية مريحة تعديل سطح هذه المبادرة وذلك اللحن كذلك معدل انحلال سقالة Si الظروف الفسيولوجية ومعدلات إطلاق سراح22،المخدرات24، ،من 2930.

ويركز هذا العمل على تصميم نظام التسليم المستندة إلى هذه المبادرة لإطلاق سراح الخاضعة للرقابة مطول ستموت. أثر الناقلين ستموت-المبادرة في تمايز الخلايا العصبية وثمرة دراسة استخدام الخلايا PC12 وفصل الخلايا العصبية DRG. علينا أن نظهر أن ستموت محملة احتفظت به بيواكتيفيتي بحمل ثمرة نورت والتمايز العميق طوال فترة إصدار 1-الشهر داخل إدارة واحدة.

Protocol

كافة أساليب أقرها "أخلاقيات اللجنة من جامعة بار ايلان".

1-تصنيع حاملات PSi المؤكسدة (بسيو2)

  1. قص رقاقة Si (وحيد الجانب المصقول على الوجه < 100 > ويخدر بشدة من البورون، نوع p، 0.95 mΩ·cm) في عينات 1.5 سم × 1.5 سم باستخدام قلم مقلوب الماس.
  2. أكسدة في نماذج سي في أنبوب فرن على 400 درجة مئوية ح 2 في الهواء المحيط (معدل التسخين: 25 درجة مئوية/دقيقة، التبريد الطبيعية).
  3. تزج في نماذج سي في محلول مائي من حمض الهيدروفلوريك (HF) (48%)، ddH2س والايثانول (99.9%) (1:1:3 v/v/v) لمدة 5 دقائق؛ ثم شطف العينات مع الإيثانول ثلاث مرات والجاف تحت تيار نيتروجين.
    ملاحظة: تحضير وتخزين حل التردد في بلاستيكواري فقط، كالزجاج يذوب HF.
    تنبيه: التردد سائل أكال عاليا، وأنه ينبغي التعامل معها بعناية فائقة. في حالة التعرض، أشطف بعناية مع الماء وعلاج المنطقة المصابة بالتردد ترياق جل؛ التماس العناية الطبية فورا.
  4. تحميل نموذج سي في خلية النقش تترافلوروايثيلين، استخدام شريط من رقائق الألومنيوم كاتصال الخلفي ولفائف البلاتين كمسري العداد.
  5. حفر طبقة الذبيحة في حل 3:1 (v/v) التردد مائي والايثانول (99.9%) لمدة 30 ثانية في كثافة التيار مستمر من 250 mA/سم2؛ ثم شطف سطح هذه المبادرة الناجمة عن ذلك الفيلم ثلاث مرات مع الإيثانول والجاف تحت تيار نيتروجين.
  6. حل طبقة مسامية طازجة محفوراً في محلول هيدروكسيد الصوديوم مائي (0.1 M) لمدة 2 دقيقة. ثم شطف مع الإيثانول ثلاث مرات والجاف تحت تيار نيتروجين.
  7. تزج العينة في إيجاد حل للتردد مائي (48 في المائة)، ddH2س والإيثانول (99.9%) (1:1:3 v/v) لمدة 2 دقيقة. ثم شطف مع الإيثانول ثلاث مرات والجاف تحت تيار نيتروجين.
  8. اليكتروتشيميكالي أحفر العينة Si في حل 3:1 (v/v) التردد مائي والايثانول (99.9%) ل 20 ثانية في كثافة التيار مستمر من 250 mA/سم2؛ ثم شطف سطح هذه المبادرة الناجمة عن ذلك الفيلم ثلاث مرات مع الإيثانول والجاف تحت تيار نيتروجين.
  9. أكسدة حرارياً العينات هذه المبادرة حفرت حديثا في فرن أنبوب في 800 درجة مئوية ح 1 في الهواء المحيط (معدل التسخين: 25 درجة مئوية/دقيقة، التبريد الطبيعية) لتشكيل سقالة2 (بسيو2) SiO المليئة بالثغرات.
  10. عينات تدور-معطف بسيو2 مع مقاوم الضوء سميكة إيجابية على 4000 لفة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة؛ ثم خبز العينات المغلفة عند 90 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة (معدل التسخين: 5 درجة مئوية/دقيقة، التبريد الطبيعية).
  11. شاهد عينات الزهر بسيو2 إلى 8 × 8 مم العينات باستخدام لعب النرد.
  12. لإزالة مقاوم الضوء، نقع العينات مكعبات في الأسيتون ح 3؛ ثم أشطف جيدا مع الإيثانول والجاف تحت تيار نيتروجين.

2-تحميل بسيو2 مع ستموت

  1. إعداد ستموت تحميل الحل، حل 20 ميكروغرام من مورين β-ستموت في 400 ميليلتر من الحل 1:1 (v/v) من 0.01 م مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) وسين ddH2
  2. إضافة ميليلتر 52 تحميل الحل على رأس النموذج2 بسيو واحتضانها ح 2 في RT في صحن توج.
    ملاحظة: الاحتفاظ بالرطوبة العالية في الطبق لمنع جفاف الحل أثناء الحضانة.
  3. جمع الحل على رأس العينة اللاحقة التقدير الكمي لمحتوى ستموت داخل الناقل2 بسيو.
    ملاحظة: ينبغي إجراء التحميل ستموت إلى بسيو2 مباشرة قبل الاستخدام، والبروتوكول لا يمكن أن يكون مؤقتاً هنا بسبب خطر التجفيف، وتمسخ من البروتين.

3-التحديد الكمي لتحميل ستموت قبل أليسا ستحل

  1. إعداد لوحة أليسا، إضافة 100 ميليلتر من 0.5 ميكروغرام/مل التقاط جسم (الأرنب المضادة-hβ-ستموت) كل ختم جيدا، اللوحة واحتضان بين عشية وضحاها في الرايت
  2. نضح الآبار إزالة السائل وغسل اللوحة باستخدام أربع مرات 300 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (0.05% 20 توين في برنامج تلفزيوني) كل جيدا؛ بعد الغسيل الأخير عكس اللوحة إزالة بقايا المخزن المؤقت ولطخة على منشفة ورقية.
  3. إضافة 300 ميليلتر من كتلة المخزن المؤقت (1% البقري ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني) لكل بئر واحتضانها لمالا يقل عن 1 ح في الرايت ثم نضح وغسل اللوح أربع مرات كما هو موضح في الخطوة 3، 2.
  4. إعداد منحنى معايرة، تمييع ستموت تحميل الحل (راجع الخطوة 2، 1) في مخفف (0.05% 20 توين، جيش صرب البوسنة 0.1% في برنامج تلفزيوني) إلى 1 نانوغرام/مليلتر. ثم إجراء تخفيف المسلسل إضعاف من 1 نانوغرام/مليلتر إلى الصفر للحصول على عينات منحنى المعايرة.
  5. لإعداد العينات، تمييع الحل تحميل ستموت (من الخطوة 2، 1) والحل التي تم جمعها بعد انتهاء التحميل (من الخطوة 2، 3) في مادة 1: 100.000 والمضيفين على التوالي، للوصول إلى نطاق تركيزات طقم أليسا في استخدام (16-1,000 pg/mL).
  6. إضافة 100 ميليلتر عينات المخفف ومنحني معايرة العينات لكل جيدا في ثلاث نسخ، واحتضان في الرايت لح 2؛ ثم نضح وغسل اللوح أربع مرات كما هو موضح في الخطوة 3، 2.
  7. إضافة 100 ميليلتر من 1 ميكروغرام/مل الكشف عن أضداد (بيوتينيلاتيد أرنب المضادة-hβ-ستموت) لكل بئر واحتضان في RT ح 2. ثم نضح وغسل اللوح أربع مرات كما هو موضح في الخطوة 3، 2.
  8. تمييع 1:2,000 عبدين-الفجل البيروكسيديز (HRP) في مخفف وإضافة 100 ميليلتر كل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت الآن نضح وغسل اللوح أربع مرات كما هو موضح في الخطوة 3، 2.
  9. إضافة 100 ميليلتر من الركازة الحل لكل بئر واحتضان 25 دقيقة في RT للتنمية اللون. قياس امتصاص في 405 نانومتر مع تصحيح الطول الموجي مبلغ 650 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية.
  10. تحديد تركيز ستموت في تحميل الحل والحل تحميل بعد جمعها استناداً إلى منحنى المعايرة.
  11. لحساب كتلة ستموت تحميلها داخل الناقل2 بسيو، طرح كتلة ستموت في حل التحميل بعد جمعها من الكتلة ستحل في تحميل الحل. يتم حساب كفاءة تحميل ستموت بالمعادلة التالية:
    Equation

4. في المختبر الإفراج ستموت من بسيو2

  1. احتضان الناقلين بسيو محملة ستموت2 في 2 مل من برنامج تلفزيوني 0.01 متر يحتوي على 1% (w/v) جيش صرب البوسنة وأزيد الصوديوم 0.02% (w/v) عند 37 درجة مئوية، وتحت المدارية الانفعالات 100 لفة في الدقيقة.
  2. كل يومين جمع الحل واستبدله مع 2 مل من برنامج تلفزيوني جديد. تجميد عينات الإصدار التي تم جمعها في النتروجين السائل وتخزينه في-20 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.
  3. استخدام مقايسة أليسا ستحل المتاحة تجارياً للتحديد الكمي لمحتوى ستموت في عينات الإصدار كما هو موضح في الخطوات 3.1-3.9.
    ملاحظة: عند إعداد العينات الإفراج للقياس الكمي أليسا، ينبغي إجراء تخفيف مختلفة لنقاط زمنية مختلفة على طول فترة الإصدار (أي وقت سابق ينبغي إضعاف نقاط أكثر بكثير من النقاط الزمنية فيما بعد). وعلاوة على ذلك، لكل عينة الإفراج، تخفيف مختلفة اثنين على الأقل ينبغي أن يؤديها وكمياً لضمان الوصول إلى نطاق تركيزات طقم أليسا.
  4. تحديد تركيز ستموت في عينات الإفراج بناء على منحنى المعايرة وارسم رسم بياني لإطلاق سراح ستموت تراكمي على مر الزمن.

5-التقدير الكمي في المختبر تآكل Si "الحث يقترن البلازما الذرية الانبعاث الطيفي" (برنامج المقارنات الدولية--الخدمات المعمارية والهندسية)

  1. تمييع 1 مل من الإفراج عن العينات 01:10 في الإصدار المخزن المؤقت (0.01 M برنامج تلفزيوني يحتوي على 1% (w/v) جيش صرب البوسنة وأزيد الصوديوم 0.02% (w/v)) لإجمالي حجم 10 مل.
  2. رصد قمم الانبعاثات الذرية Si في 212.4 و 251.6 288.2 شمال البحر الأبيض المتوسط للعينات مخففة.
  3. تحديد تركيز Si في العينات التي تستند إلى منحنى معايرة.
  4. إنشاء التشكيل الجانبي تدهور Si، التعبير عن محتوى Si عند كل نقطة الوقت كنسبة مئوية من إجمالي المحتوى Si الناقلين (أي محتوى Si التراكمي على طول فترة الإفراج).
    ملاحظة: لضمان دقة القياس الكمي لمحتوى Si مجموع الناقلين، الإفراج عن العينات هي عينات 1 الشهر التالي نقطة النهاية للإفراج عن دراسة وتحليل لتركيز الرابطة باستخدام برنامج المقارنات الدولية--الخدمات المعمارية والهندسية. ملخص المحتوى Si التراكمي على طول فترة الإفراج ومحتوى Si في عينات بعد الإفراج عنهم يوفر 100 ٪ المحتوى Si.

6-خلية بقاء ونمو حضور حاملات2 تحميل ستموت بسيو

  1. ورم القواتم (PC12) فأر خلية ثقافة
    1. تعد المتوسطة النمو الأساسية بإضافة 10% الحصان المصل (النظام المنسق)، 5% مصل بقرى الجنين (FBS)، 1% ل الجلوتامين، 1% البنسلين والستربتوميسين والامفوتريسين 0.2% إلى متوسط كركديه بارك الطبية معهد (ربمي).
    2. إعداد متوسطة التمايز بإضافة 1% HS، 1% ل الجلوتامين، 1% البنسلين والستربتوميسين والامفوتريسين 0.2% إلى المتوسطة ربمي.
    3. تنمو خلية تعليق (106 خلايا) قارورة ثقافة2 75 سم مع 10 مل متوسط النمو الأساسية لمدة 8 أيام؛ كل يومين إضافة 10 مل متوسط النمو الأساسية قارورة.
    4. لإنشاء ثقافة الخلايا PC12 المتباينة، نقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد مركزي؛ الطرد المركزي خلايا لدقيقة 8 200 x ز وتجاهل الرايت المادة طافية.
    5. تعليق الخلايا في 5 مل متوسط نمو أساسية جديدة، وإعادة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 200 x ز و RT؛ تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 3 مل متوسط النمو الأساسية.
    6. لفصل مجموعات الخلايا، نضح الخلايا بعشر مرات استخدام المحاقن ز 23.
    7. عد الخلايا باستخدام عداد خلية هيموسيتوميتير والبذور 104 خلايا/سم2 منطقة عمل على نوع الكولاجين l مغلفة ألواح حضور متوسطة التمايز.
    8. بعد 24 ساعة، إضافة جديدة موريني β-ستموت (50 نانوغرام/مل) أو الناقل PSiO2 تحميل ستموت كل لوح.
      ملاحظة: أعلى تركيزات ستموت (> 50 نانوغرام/مليلتر) تمتلك التأثير الدقيق كتركيز محدد.
    9. تجديد متوسطة التمايز كل يومين.
    10. لتقييم جدوى الخلية وإضافة 10% (v/v) الحل مؤشر الجدوى (على أساس ريسازورين) في نقاط زمنية تمثيلية واحتضانها ح 5 في 37 درجة مئوية؛ قياس امتصاص في 490 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
  2. الفئران الجذرية الظهرية Ganglia (DRG) خلية ثقافة
    1. لعزل باﻷسعار من اثنين من الفئران C57bl عمرها 7 الأسبوع، أولاً إخماد الفئران مع الإيثانول 70% وجعل شق لإزالة الجلد.
    2. قص قاعدة الجمجمة وتتعرض عضلات جدار البطن حتى النخاع الشوكي.
    3. إزالة العمود الفقري بإجراء خفض في مستوى قصبة وتنظيف الأنسجة المحيطة بها.
    4. قص العمود إلى ثلاثة أجزاء؛ ثم قص كل قطعة في خط الوسط لتوليد نصفين وقشر خارج الحبل الشوكي.
    5. تحت مجهر، استخراج جميع DRG ganglia وتزج بها في هانك الباردة لحل متوازن الملح (حبس).
    6. تنظيف الأنسجة الضامة المحيطة بها متلهف باﻷسعار على طبق بيتري وإزالة السحايا المتبقية تحت مجهر لطف.
    7. فصل الخلايا الرسم التي تفرخ منهم لمدة 20 دقيقة في 1,000 يو من غراء.
    8. الطرد المركزي الخلايا لدقيقة 4 في 400 x ز. تجاهل المادة طافية وإبقاء بيليه الخلية.
    9. ريسوسبيند بيليه في حل الثاني ديسباسي كولاجيناز و 12 مغ/مل 10 ملغ/مل واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    10. الطرد المركزي الخلايا لمدة 2 دقيقة على 400 x ز؛ تجاهل المادة طافية وإبقاء بيليه الخلية.
    11. تريتوراتي بيليه الخلية في 1 مل حبس، الجلوكوز 10 ملم و 5 ملم حبيس (pH 7.35) بالمرور المتكررة خلال ماصة باستور مقيدة.
    12. إضافة الخلايا ينتابها بلطف إلى المتوسطة L-15 الذي يحتوي على 20% من القائم على السليكا الغروية المتوسطة لفصل الخلايا بكثافة التدرج الطرد المركزي؛ أجهزة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 1,000 س ز. نضح المادة طافية وإبقاء بيليه الخلية.
      ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو فصل وتنقية الخلايا العصبية من الحطام محواري وخلايا شوان والليفية.
    13. ريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل من F-12 المتوسطة؛ أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1,000 س ز؛ تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1 مل متوسطة F-12.
    14. عد الخلايا والبذور 2 × 104 خلايا في بولي-L-يسين و laminin مغلفة بالزجاج السفلي 35 مم ثقافة الأطباق، في متوسط خالية من المضادات الحيوية F-12 وتستكمل مع 10% FBS.
      ملاحظة: في البداية، بذور الخلايا الموجودة في وحدة تخزين صغيرة متوسطة (150-200 ميليلتر)؛ وعقب ح 2 الحضانة عند 37 درجة مئوية، إضافة المتوسطة لوحدة تخزين نهائي من 2 مل.
    15. بلطف إضافة بسيو محملة ستموت2 الناقل أو الطازجة مورين β-ستموت (50 نانوغرام/مل) للوحة الواحدة.
    16. بعد يومين، إصلاح ثقافة الخلية التي تفرخ أنه مع حل بارافورمالدهيد (PFA) 4% لمدة 15 دقيقة في الرايت؛ إيمونوستين خلية ثقافة استخدام الفلورة مشتركة تلطيخ الإجراء31.
    17. صورة ثقافة الخلية العصبية باستخدام مجهر [كنفوكل].

7-خلية تحليل التمايز

  1. الخلايا PC12 التمايز نسبة حضور حاملات2 تحميل ستموت بسيو
    1. احتضان الناقلين بسيو محملة ستموت2 في 2 مل متوسطة التمايز، في حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية التي تحتوي على 5% CO2.
    2. كل يومين، جمع الحل واستبدله مع 2 مل متوسطة جديدة. تجميد عينات الإصدار التي تم جمعها في النتروجين السائل وتخزينه في-20 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.
    3. بذور الخلايا PC12 في 12-جيدا المغلفة بالكولاجين لوحات كتعليمات في الفرع 4-1 (4.1.3-4.1.6).
    4. بعد 24 ساعة، يعرض الإفراج عن عينات من النقاط الزمنية الممثل (من قسم 5.1.2) إلى الآبار المختلفة؛ لمراقبة الآبار، إضافة جديدة مورين β-ستموت (50 نانوغرام/مل).
    5. بعد 24 ساعة، صورة الخلايا باستخدام مجهر ضوء.
    6. لتحديد النسبة المئوية للخلايا الحاملة نورت، يدوياً حساب عدد الخلايا التي تجاوزت نيوريتيس من أصل العدد الإجمالي للخلايا في الصور (n = 5 إطارات لكل بئر)؛ ارسم رسم بياني للنسبة المئوية للخلايا PC12 مع ثمرة نورت على مر الزمن.
      ملاحظة: الخلايا PC12 غير متمايزة فيما يبدو قد اعتقلت هيكل دون نيوريتيس، بينما يمكن تحديد الخلايا المتمايزة بثمرة نيوريتيس (من الحد الأدنى للطول تساوي قطره سوما خلية واحدة على الأقل) أو التغييرات الشكلية.
  2. تحليل شكلي للخلايا PC12 المتباينة
    1. لتحليل تجهيز الصور، الحصول على صور المرحلة الخلايا المزروعة تصل إلى 3 أيام بعد العلاج مع ستموت (ككاشف الحرة أو كمنتج الإصدار من ناقلات محملة ستموت بسيو2 ).
      ملاحظة: في نقاط زمنية لاحقة (بعد يوم 5) الخلايا تطوير شبكات معقدة للغاية، ومنع شكلي القياسات بدقة خلية مفردة.
    2. تحميل برنامج تجهيز الصورة نيروني، إيماجيج في المكونات، التي تمكن نورت شبه التلقائي تتبع وقياس الطول.
    3. تحويل ملف الصورة إلى تنسيق 8 بت والتدبير بكسل لنسبة ميكرومتر استخدام شريط مقياس الصورة.
    4. تعيين المقياس باستخدام تحليل | ضبط مقياس الأمر وقياس طول كل نيوريتي.
    5. يدوياً حساب عدد النقاط المتفرعة وعدد نيوريتيس الصادرة من سوما كل خلية.
      ملاحظة: بطول متوسط نورت بعد العلاج ستموت يوم 1 هو حوالي 30 ميكرومتر. نورت قياس الأطوال قد توزع على نطاق واسع.

Representative Results

المؤكسد PSi الأفلام ملفقة كما هو موضح في البروتوكول. رقاقة Si يخضع للنقش الكهروكيميائية ل 20 s 250 mA/سم2 (رقم 1ai)، تليها الأكسدة الحرارية في 800 درجة مئوية (الشكل 1aii) لإنتاج سقالة2 بسيو. عالي الاستبانة المسح الضوئي المجهر الإلكتروني تظهر الصور (الموارد البشرية-وزارة شؤون المرأة) للفيلم2 بسيو الناتجة في الشكل 1 باء، وجيم الأعلى-عرض صورة مجهرية من الفيلم (الشكل 1b) يصور طبيعتها المسامية العالية مع المسام لما يقرب من 40 نانومتر في القطر. ويكشف صورة مجهرية مستعرضة من فيلم ملصوق (الشكل 1 ج) سمك طبقة مسامية 2.9 ميكرومتر، تتميز بربط المسام أسطواني.

يتم تحميل أفلام2 بسيو مع ستموت تحميل الحل كما هو موضح في الشكل 1aiii. تحميل ستموت هو كمياً باستخدام أليسا ستحل عن طريق قياس تركيزات ستموت في حل التحميل قبل وبعد الحضانة مع الأفلام2 بسيو. يتم تحديد متوسط كتلة ستموت تحميل كل الأفلام2 بسيو ك 2.8 ± 0.2 ميكروغرام، الذي يقابل كفاءة عالية تحميل 90% (w/w) (البيانات لا تظهر31). من أجل إنشاء التشكيل الجانبي الإصدار ستموت من الناقلين2 بسيو، هي المحتضنة الأفلام المحملة في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية وهي عينات كل يومين مختبرين للتحديد الكمي لتركيز البروتين صدر أليسا ستحل باستخدام. وباﻹضافة إلى ذلك، المحتوى Si في عينات الإفراج هو كمياً باستخدام برنامج المقارنات الدولية--الخدمات المعمارية والهندسية وحركية تآكل سي بسيو2 الناقلين. ويبين الشكل 2 إطلاق سراح ستموت وملامح تدهور Si المقابلة الناقلين المليئة بالثغرات. ويتحقق إطلاق ستموت، مستمرة دون تأثير الانفجار، لمدة شهر واحد. الإصدار ستموت في الأسبوع الأول أسرع (المنحدر = 0.442) بالمقارنة إلى إطلاق سراح أبطأ بكثير في الأيام اللاحقة على طول فترة الإفراج (المنحدر 0.043). تجدر الإشارة إلى أن كمية ستموت صدر طوال فترة الإصدار 1-شهر كامل، كافياً ليحفز التمايز العميق من الخلايا PC12، كما ستناقش في وقت لاحق. وجد ستموت تراكمياً صدر في علاقة جيدة (ص2 = 0.971) مع الاشتراكية الدولية المتبقية المحتوى، كما هو مبين في الإطار الداخلي الرقم 2.

بعد ذلك، بيواكتيفيتي الناقلين2 تحميل ستموت بسيو تتسم في المختبر، DRG الخلايا العصبية وخلايا PC12 تستخدم كنماذج لتمايز الخلايا العصبية وثمرة. ينتابها DRG الخلايا العصبية وخلايا PC12 هي المصنف كما هو موضح في البروتوكول. أولاً، يتم فحص صلاحية خلية حضور حاملات2 بسيو بواسطة تفرخ الخلايا مع مرتبة (لم يتم تحميله) أو تحميل ستموت بسيو2؛ لوحات التحكم والخلايا تعامل مع أنيق بسيو2 تكملها مع ستموت مجاناً كل يومين. ويلاحظ لا سيتوتوكسيسيتي عند التعرض للخلايا لأنيق أو ستموت تحميل الناقلات2 بسيو (الشكل 3a)، مما يدل على أن بسيو2 متوافق حيويا مع هذا الخط خلية. ويبين الشكل 3b ممثل الموارد البشرية-وزارة شؤون المرأة ميكروجرافس من الخلايا PC12 تعامل مع شركات2 تحميل ستموت بسيو. السمة نيوريتيس ونموذج استخراج خلايا الملاحظة تشعبت الشبكات العصبية. يتم الحصول على نتائج مماثلة عند البذر فصل الخلايا العصبية DRG حضور حاملات2 تحميل ستموت بسيو. وتبين الصور [كنفوكل] إيمونوستاينيد DRG الخلايا المستزرعة مع الناقلين2 تحميل ستموت بسيو (رقم 3e) الشروع في نيوريتي واسعة النطاق واستطالة، مماثلة لمراقبة إيجابية (أي، العصبية وتستكمل مع الحرة ستموت، انظر الشكل 3d)، في حين أن السيطرة السلبية (أي، العصبية غير المعالجة، انظر الشكل 3 جيم)، يسلك بقدر فقراء من ثمرة نورت.

لتقييم نسبة تمايز الخلايا PC12 حضور ستموت صدر من الناقلين2 بسيو، هو كمياً التمايز طريق عد الخلايا مع ثمرة نورت خارج الخلية مجموع السكان. الشكل 4 يلخص النتائج من حيث النسبة المئوية للخلايا المتمايزة في نقاط زمنية مختلفة على مدى فترة 26 يوما. تحقيق قيم النسبة المئوية تمايز كبير طوال مدة الدراسة. جدير بالذكر أن حدت ستموت المفرج عنهم بعد 26 يوما، التفريق بين أعلى من 50%، نسبة مئوية تفريق الذي هو إلى حد كبير أعلى بالمقارنة مع الدراسات السابقة مع شركات النقل على أساس البوليمر16. تشير هذه النتائج إلى أنه فخ ستموت داخل البلد المضيف مسامية الحفاظ على النشاط البيولوجي من البروتين ليحفز التمايز العميق لمدة شهر ~ 1.

لمواصلة دراسة تأثير بسيو ستموت2 الناقلين على تمايز الخلايا العصبية، يتم قياس ثلاثة معلمات المورفولوجية المميزة للخلايا PC12 متباينة على مستوى الخلية الواحدة: (ط) عدد نيوريتيس استخراجها (سوما الثاني) نيوريتيس مجموع طول و (iii) عدد النقاط المتفرعة. الخلايا تعامل مع شركات2 تحميل ستموت بسيو أو مع الإدارة المتكررة من ستموت مجاناً (كل يوم 2)، كعنصر تحكم. الشكل 5a ج- يعرض تحليل شكلي للسكان خلية في أيام 1 و 3. الخلايا PC12 تعامل مع تحميل ستموت بسيو2 إظهار قيم شكلي مماثلة لمعاملة السيطرة لجميع المعلمات اختبار الثلاث. بعد 3 أيام، لوحظت قيم كافة المعلمات المورفولوجية لزيادة بنفس المعدل لكل من الناقلين2 بسيو محملة ستموت ومعاملة عنصر تحكم الإدارة المتكررة من ستموت مجاناً.

Figure 1
الشكل 1: تصنيع الأفلام2 بسيو. (أ) مخطط تلفيق الناقلين2 بسيو: (ط) السيليكون ويفر، يخضع للنقش الكهروكيميائية ل 20 s 250 mA/سم2، تليها الأكسدة الحرارية (ثانيا) على 800 درجة مئوية لإنتاج سقالة2 بسيو، و (ثالثا) ستموت تحميل من الامتزاز المادية (لا يتم رسم الخطط للمقياس). (ب-ج) عرض أعلى والمقطع العرضي ميكروجرافس إلكترون من فيلم2 بسيو المميزة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: الإفراج عن ستموت وملامح تآكل سي بسيو ستموت تحميل ناقلات2 - مدى تدهور الناقلين2 بسيو يرد كجزء محتوى Si المتبقية في كل نقطة وقت الخروج من مجموع محتوى Si الفيلم المسامية. اقحم يبين العلاقة بين ستموت تراكمياً صدر وتبقى Si المحتوى. تمثل أشرطة الخطأ SD, n = 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: خلية بقاء ونمو حضور حاملات2 تحميل ستموت بسيو. (أ) في المختبر توصيف سيتوتوكسيسيتي. يتم قياس صلاحية الخلايا PC12 في 1 و 3 و 7 أيام بعد تعرضها لأنيق حاملات2 بسيو (لم يتم تحميله)، بسيو محملة ستموت2 الناقلين أو ستموت مجاناً (50 نانوغرام/مل كل يومين، لوحات التحكم). (ب) ميكروجرافس إلكترون الخلايا PC12 مثقف مع تحميل ستموت بسيو2 الناقلين لمدة 9 أيام. اللوحة اليسرى: تكبير في، يصور ثمرة نورت من سوما الخلية؛ اللوحة اليسرى: تكبير/تصغير السحب، مشيراً إلى شبكة الخلايا العصبية البالغة التعقيد شكلت. (ج-ه) صور مجهرية [كنفوكل] من إيمونوستينيد DRG العصبية خلية ثقافة (2 أيام بعد البذر): (ج) دون علاج الخلايا؛ الخلايا (د) تستكمل مع الحرة ستموت (50 نانوغرام/مل)؛ () ستموت بسيو2 الناقلين. تلوين إيمونوفلوريسسينت من نيوروفيلامينت ح يمكن تصوير سوما الخلية ونيوريتيس أووتجرووينج. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: الخلايا PC12 قيم النسبة المئوية المفاضلة عند التعرض إلى ستموت صدر من الناقلين2 تحميل ستموت بسيو في نقاط زمنية الممثل. يتم التعبير عن نسبة التمايز كعدد الخلايا مع ثمرة نورت خارج الخلية مجموع السكان. معالجة عنصر تحكم يشير إلى خلايا تكملها ستموت الحرة (50 نانوغرام/مل). يصور صور مجهرية الخفيفة الممثل للخلايا عند نقاط زمنية مختلفة على طول المحور س؛ شريط المقياس = 25 ميكرومتر ميكروجرافس من أيام 2 و 8، 14، 26 و 50 ميكرون لعنصر التحكم صورة مجهرية. تمثل أشرطة الخطأ SD, n = 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تحليل شكلي للخلايا PC12 المتباينة. يتم قياس المعلمات المورفولوجية ثلاث خلايا PC12 المتباينة، على مستوى الخلية الواحدة، في يوم 1 و 3 بعد التعرض لناقلات محملة ستموت بسيو2 أو الإدارة المتكررة من الحرة ستموت كل يومين (المراقبة)؛ طول (ب) عدد () نيوريتيس مجموع استخراج نيوريتيس من الخلية سوما و (ج) عدد النقاط المتفرعة. تمثل أشرطة الخطأ SD, n = 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

الأفلام القابلة للتحلل ذات البنية النانومترية بسيو2 ملفقة وتستخدم كناقلات ستموت، مما يسمح للإفراج عنها متواصلة وطويلة، رغم احتفاظها النشاط البيولوجي. أظهر إمكانات بسيو2 لتكون بمثابة نظام التسليم ستموت في المختبر بإثبات قدرتها على إطلاق سراح الجرعة ستموت كافية للحث على تمايز الخلايا العصبية وتعزيز ثمرة DRG الخلايا العصبية وخلايا PC12. يمكن استخدام الأفلام هندسيا كخزانات طويلة الأجل من ستموت للمعالجة المستقبلية في فيفو.

الخصائص الهيكلية للأفلام PSi ملفقة كانت مصممة خصيصا لحمولة ستموت؛ وعدل الكثافة الحالية لعملية النقش الكهروكيميائية للحصول على حجم المسام لما يقرب من 40 نانومتر التي سوف تستوعب بسهولة ستموت، بروتين مع molecular weight من 26.5 كاتشين32 وقطر مميزة من شمال البحر الأبيض المتوسط ~ 433، داخل المصفوفة المليئة بالثغرات. وعلاوة على ذلك، أجرى الأكسدة الحرارية من السقالة المسامية لتمكين امتزاز المادية ستموت حسب الجذب الالكتروستاتيكي البروتين مشحونة بشكل إيجابي على سطح هذه المبادرة المؤكسد مشحونة سلبا. تمارس تأثير كبير على كفاءة تحميل الكيمياء السطحية لهذه المبادرة ويمكن ضبطها بسهولة من أجل تحسين مراقبة التفاعلات بين الحمولة والمصفوفة المليئة بالثغرات. وفي وقت لاحق تملي هذه التفاعلات هيكل الجزيئات البروتينية الممتزة وبهم بيواكتيفيتي34،،من3536. وفي الختام، تم تعديل النظام للحصول على تحميل الأمثل من ستموت بعناية تحديد حجم المسامية الملائمة، والخصائص السطحية والمثل الأعلى تحميل المذيبات والناتجة عن تأثير ما يمليه المعلمات المذكورة تحميل البروتين فعالية. لذلك، أي تغيير في تلفيق المعلمات (مثلاً، كثافة التيار، ووقت النقش، ونوع وتركيز يستعمل أو المنحل بالكهرباء)، الكيمياء السطحية أو تحميل تكوين الحل يمكن أن تؤثر على فعالية التحميل وبيواكتيفيتي من تحميل البروتين.

معدل الإفراج عن حمولة من المضيف2أوربسيو هذه المبادرة عموما تمليها مزيج من اثنين من الآليات المتزامنة، نشر الخارج من جزيئات الحمولة وتدهور سقالة سي37. تآكل ومعدل انحلال اللاحقة تتأثر بغرس الموقع، في علم الأمراض والأمراض الدولة28،38،39. أنشئت في الأعمال السابقة أن إذا كان سعر إصدار مختلفة المطلوبة لتطبيق علاجية معينة، يمكن تعديلها الشخصية الإصدار وأمدها بتغيير الكيمياء السطحية لهذه المبادرة السطحية38،40، 41. التعديلات الكيميائية المختلفة، مثل الأكسدة الحرارية والحرارية الكربنة والتقنيات هيدروسيليليشن، وقد ثبت أن تستقر على سطح هذه المبادرة وتؤثر في تدهور وما يترتب عليها من حمولة الإفراج عن35،42 ،43،،من4445. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن يؤدي تحميل ستموت في الناقلات بمرفق التساهمية من جزيئات البروتين إلى سقالة Si عبر مختلف طرق الكيمياء السطحية في بيان مطول أكثر لأن يطلق الحمولة فقط عندما يتم كسر أواصر تساهمية أو دعم الاشتراكية مصفوفة المتدهورة21.

وعلاوة على ذلك، في أعقاب عملية التصنيع فيها، يمكن أن تصبح هذه المبادرة إلى تكوينات مختلفة إلى جانب طبقات رقيقة، مثل المجهرية الدقيقة46،47 من جسيمات نانوية أو الأغشية بذاتها26، التي يمكن أن تستخدم أيضا كشركة نقل جوي ستموت والتطبيق محددة تلبية الاحتياجات.

لكي تكون ذات الصلة سريرياً، ينبغي التوصل إلى محتوى ستموت داخل شركات2 بسيو نطاق الجرعات العلاجية. في الأسلوب الموصوفة في البروتوكول، يتم عرض الناقلين2 تحميل ستموت بسيو متسقة إلى حجم 2 مل من خلية الإعلام أو عدلت تسفر عن المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني، ومن ثم تركز الحل تحميل وكتلة ستموت كل منها محملة وأطلق تركيزات ستموت ذات الصلة للنظام تم اختبارها في المختبر . عند استخدام هذا الأسلوب لأنظمة مختلفة، مثل بيئات فيفو السابقين أو في فيفو ، ينبغي زيادة تركيز ستموت تحميل الحل وتعديلها وفقا للجرعة اللازمة. وبدلاً من ذلك، يمكن الحصول على محتوى ستموت أعلى بإدخال عدة شركات في مجال اختبار أو بواسطة استخدام مساحات أكبر من العينات2 بسيو.

وعلاوة على ذلك، تجدر الإشارة إلى أن في نقاط زمنية لاحقة على طول فترة الإفراج، تركيزات ستموت المفرج عنهم أقل بكثير من نقاط زمنية سابقة. حقيقة أن تدفق ستموت ليست ثابتة على مر الزمن ويجب أن تؤخذ في الاعتبار عند تصميم النظام وفقا لاحتياجات التطبيق.

تسليم ستموت عديدة قد وضعت أنظمة وذكرت في الأدبيات، معظمهم من الأنظمة المستندة إلى البوليمر، تتألف من البوليمر الاصطناعية أو الطبيعية يرتبط10،11،،من1215 , 16 , 17-وقد أظهرت هذه النظم فعالة المطرد الإفراج عن التشكيلات الجانبية، ومع ذلك، الإفراج عن فترة امتدت على مدى فترة عدة أيام مع أثر انفجار كبير. بعض من هذه المنصات تسليم تعاني من القيود الحرجة مثل فقدان بيواكتيفيتي عند عملية التغليف، والتي تتطلب استخدام مختلف استقرار الوكلاء18،48، وكذلك متطورة ومعقدة تقنيات تصنيع16. واحدة من أكبر التحديات في تصميم نظم إيصالها للبروتينات هو القدرة على الحفاظ على بيواكتيفيتي الجزيئات عند فخ داخل منظومة الناقل. يمكن تحميل البروتينات أو الببتيدات في هذه المبادرة/بسيو2 في الرايت أو حتى في درجات الحرارة المنخفضة دون استخدام المذيبات العضوية القوية، التي تعتبر كلا من العوامل الهامة عند تحميل هذه الجزيئات الحيوية الحساسة. وقد أثبتت الدراسات السابقة أن هذه المبادرة/بسيو2 الكيمياء السطحية يلعب دوراً حاسما في التقليل إلى أدنى حد ممكن تمسخ البروتينات محملة35،36. ولذلك، رطل/بسيو2 نانوماتيريال مفيدة لتطوير نظم إيصالها لعوامل النمو بشكل عام وستموت خاصة.

ويتركز العمل الحالي في استخدام هذا الأسلوب كنهج علاجي جديد للإدارة المباشرة ستموت في الجهاز العصبي المركزي لعلاج محتمل لأمراض الأعصاب. يمكن زرعها الناقلين2 تحميل ستموت بسيو في أدمغة الفئران وفعالية النظام الأساسي كما يزرع طويل الأجل درس في فيفو. وعلاوة على ذلك، الجمع بين هذه شركات واعدة وغير الغازية الهلاميات49،50 قد تمكن واحد لإدارة الجسيمات2 تحميل ستموت بسيو في قرار للغاية مكانية لمنطقة مترجمة باستخدام هوائي رواية الشعرية بندقية لعلاج اضطرابات الأعصاب، حيث يقتضي الأمر وجود إدارة المخدرات الزمانية المكانية. وعلاوة على ذلك، يمكن توجيه ستموت نمو الخلايا العصبية طريقة متدرجة كيميائية51، مماثلة للجزيئات التوجيه إكسون. وهكذا، يمكن تحميل الناقلات2 بسيو بمثابة النقاط الساخنة جاذبة ستموت، لتوجيه نمو، مكملة للأخرى توجيه العظة52،53. وباﻹضافة إلى ذلك، الناقلين2بسيو يمكن أن تكون مصممة خصيصا لإدامة إيصال ستموت لفترة زمنية تمتد كثيرا لتصل إلى عدة أشهر بزيادة ضبط nanostructure2 بسيو وفي الكيمياء السطحية.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

مرض التصلب العصبي المتعدد ووفاق الاعتراف بالخدمات الأساسية ودعم من "مركز لوكي أولاً شاحنة" لعلوم الحياة والهندسة والدعم المالي لمعهد تكنولوجيا النانو بري راسل في معهد التخنيون.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiesmann, C., De Vos, A. Nerve growth factor: structure and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58, (5), 748-759 (2001).
  2. Dreyfus, C. F. Effects of nerve growth factor on cholinergic brain neurons. Trends in Pharmacological Sciences. 10, (4), 145-149 (1989).
  3. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Intracerebroventricular infusion of nerve growth factor in three patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 9, (5), 246-257 (1998).
  4. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Encapsulated cell biodelivery of nerve growth factor to the basal forebrain in patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 33, (1), 18-28 (2012).
  5. Eyjolfsdottir, H., et al. Targeted delivery of nerve growth factor to the cholinergic basal forebrain of Alzheimer's disease patients: application of a second-generation encapsulated cell biodelivery device. Alzheimer's Research & Therapy. 8, (1), 30 (2016).
  6. Tuszynski, M. H., et al. A phase 1 clinical trial of nerve growth factor gene therapy for Alzheimer disease. Nature Medicine. 11, (5), 551-555 (2005).
  7. Pan, W., Banks, W. A., Kastin, A. J. Permeability of the blood-brain barrier to neurotrophins. Brain Research. 788, (1), 87-94 (1998).
  8. Thorne, R. G., Frey, W. H. Delivery of neurotrophic factors to the central nervous system. Clinical Pharmacokinetics. 40, (12), 907-946 (2001).
  9. Tria, M. A., Fusco, M., Vantini, G., Mariot, R. Pharmacokinetics of nerve growth factor (NGF) following different routes of administration to adult rats. Experimental Neurology. 127, (2), 178-183 (1994).
  10. Bhang, S. H., et al. The effect of the controlled release of nerve growth factor from collagen gel on the efficiency of neural cell culture. Biomaterials. 30, (1), 126-132 (2009).
  11. Camarata, P. J., Suryanarayanan, R., Turner, D. A., Parker, R. G., Ebner, T. J. Sustained release of nerve growth factor from biodegradable polymer microspheres. Neurosurgery. 30, (3), 313-319 (1992).
  12. Cooper, A., Bhattarai, N., Zhang, M. Fabrication and cellular compatibility of aligned chitosan-PCL fibers for nerve tissue regeneration. Carbohydrate Polymers. 85, (1), 149-156 (2011).
  13. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 37 (2016).
  14. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7, (3), 1058-1066 (2015).
  15. Sridhar, R., et al. Electrosprayed nanoparticles and electrospun nanofibers based on natural materials: applications in tissue regeneration, drug delivery and pharmaceuticals. Chemical Society Reviews. 44, (3), 790-814 (2015).
  16. Valmikinathan, C. M., Defroda, S., Yu, X. Polycaprolactone and bovine serum albumin based nanofibers for controlled release of nerve growth factor. Biomacromolecules. 10, (5), 1084-1089 (2009).
  17. Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, (17), 3765-3772 (2002).
  18. Cao, X., Shoichet, M. S. Delivering neuroactive molecules from biodegradable microspheres for application in central nervous system disorders. Biomaterials. 20, (4), 329-339 (1999).
  19. Saltzman, W. M., Mak, M. W., Mahoney, M. J., Duenas, E. T., Cleland, J. L. Intracranial Delivery of Recombinant Nerve Growth Factor: Release Kinetics and Protein Distribution for Three Delivery Systems. Pharmaceutical Research. 16, (2), 232-240 (1999).
  20. Zhu, G., Mallery, S. R., Schwendeman, S. P. Stabilization of proteins encapsulated in injectable poly (lactide- co-glycolide). Nature Biotechnology. 18, 52 (2000).
  21. Anglin, E. J., Cheng, L., Freeman, W. R., Sailor, M. J. Porous silicon in drug delivery devices and materials. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, (11), 1266-1277 (2008).
  22. Canham, L. T., et al. Derivatized mesoporous silicon with dramatically improved stability in simulated human blood plasma. Advanced Materials. 11, (18), 1505-1507 (1999).
  23. Chen, F., et al. Organosilica Nanoparticles with an Intrinsic Secondary Amine: An Efficient and Reusable Adsorbent for Dyes. ACS Applied Materials & Interfaces. 9, (18), 15566-15576 (2017).
  24. Godin, B., et al. Tailoring the degradation kinetics of mesoporous silicon structures through PEGylation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 94A. 4, (4), 1236-1243 (2010).
  25. Kempen, P. J., et al. Theranostic Mesoporous Silica Nanoparticles Biodegrade after Pro-Survival Drug Delivery and Ultrasound/Magnetic Resonance Imaging of Stem Cells. Theranostics. 5, (6), 631-642 (2015).
  26. Low, S. P., Voelcker, N. H., Canham, L. T., Williams, K. A. The biocompatibility of porous silicon in tissues of the eye. Biomaterials. 30, (15), 2873-2880 (2009).
  27. Salonen, J., Kaukonen, A. M., Hirvonen, J., Lehto, V. -P. Mesoporous silicon in drug delivery applications. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, (2), 632-653 (2008).
  28. Tzur-Balter, A., Shatsberg, Z., Beckerman, M., Segal, E., Artzi, N. Mechanism of erosion of nanostructured porous silicon drug carriers in neoplastic tissues. Nature Communications. 6, (2015).
  29. Salonen, J., Lehto, V. -P. Fabrication and chemical surface modification of mesoporous silicon for biomedical applications. Chemical Engineering Journal. 137, (1), 162-172 (2008).
  30. Tzur-Balter, A., Massad-Ivanir, N., Segal, E. Surface Engineered Porous Silicon-based Nanostructures for Cancer Therapy. MRS Proceedings. 1416, (2012).
  31. Zilony, N., et al. Prolonged controlled delivery of nerve growth factor using porous silicon nanostructures. Journal of Controlled Release. 257, 51-59 (2017).
  32. Young, M., Saide, J. D., Murphy, R. A., Arnason, B. G. Molecular size of nerve growth factor in dilute solution. Journal of Biological Chemistry. 251, (2), 459-464 (1976).
  33. Erickson, H. P. Size and Shape of Protein Molecules at the Nanometer Level Determined by. Sedimentation, Gel Filtration, and Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 11, (1), 32 (2009).
  34. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Thermal oxidation for controlling protein interactions with porous silicon. Langmuir. 26, (17), 14316-14322 (2010).
  35. McInnes, S. J., et al. Surface engineering of porous silicon to optimise therapeutic antibody loading and release. Journal of Materials Chemistry B. 3, (20), 4123-4133 (2015).
  36. Prestidge, C. A., et al. Loading and release of a model protein from porous silicon powders. Physica Status Solidi (A. 204, (10), 3361-3366 (2007).
  37. Tzur-Balter, A., Young, J. M., Bonanno-Young, L. M., Segal, E. Mathematical modeling of drug release from nanostructured porous Si: combining carrier erosion and hindered drug diffusion for predicting release kinetics. Acta Biomaterialia. 9, (9), 8346-8353 (2013).
  38. Nieto, A., et al. Surface Engineering of Porous Silicon Microparticles for Intravitreal Sustained Delivery of Rapamycin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, (2), 1070-1080 (2015).
  39. Warther, D., et al. Porous silicon based intravitreal platform for dual-drug loading and controlled release towards synergistic therapy. Drug Delivery. 25, (1), 1537-1545 (2018).
  40. Li, W., et al. Tailoring Porous Silicon for Biomedical Applications: From Drug Delivery to Cancer Immunotherapy. Advanced Materials. 30, (24), 1703740 (2018).
  41. Yazdi, I. K., et al. Physicochemical properties affect the synthesis, controlled delivery, degradation and pharmacokinetics of inorganic nanoporous materials. Nanomedicine. 10, (19), 3057-3075 (2015).
  42. Fry, N. L., Boss, G. R., Sailor, M. J. Oxidation-Induced Trapping of Drugs in Porous Silicon Microparticles. Chemistry of Materials. 26, (8), 2758-2764 (2014).
  43. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Surface chemistry of porous silicon and implications for drug encapsulation and delivery applications. Advances in Colloid and Interface Science. 175, 25-38 (2012).
  44. Salonen, J., Mäkilä, E. Thermally Carbonized Porous Silicon and Its Recent Applications. Advanced Materials. 30, (24), (2018).
  45. Wang, M., et al. Influence of Surface Chemistry on the Release of an Antibacterial Drug from Nanostructured Porous Silicon. Langmuir. 31, (22), 6179-6185 (2015).
  46. Salonen, J., et al. Mesoporous silicon microparticles for oral drug delivery: loading and release of five model drugs. Journal of Controlled Release. 108, (2), 362-374 (2005).
  47. Park, J. -H., et al. Biodegradable luminescent porous silicon nanoparticles for in vivo applications. Nature Materials. 8, (4), 331-336 (2009).
  48. Johnson, P. J., Skornia, S. L., Stabenfeldt, S. E., Willits, R. K. Maintaining bioactivity of NGF for controlled release from PLGA using PEG. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 86, (2), 420-427 (2008).
  49. Shefi, O., et al. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, (23), 6119-6123 (2006).
  50. Zilony, N., Tzur-Balter, A., Segal, E., Shefi, O. Bombarding Cancer: Biolistic Delivery of therapeutics using Porous Si Carriers. Scientific Reports. 3, 2499 (2013).
  51. Zuidema, J. M., Provenza, C., Caliendo, T., Dutz, S., Gilbert, R. J. Magnetic NGF-Releasing PLLA/Iron Oxide Nanoparticles Direct Extending Neurites and Preferentially Guide Neurites along Aligned Electrospun Microfibers. ACS Chemical Neuroscience. 6, (11), 1781-1788 (2015).
  52. Baranes, K., Moshe, H., Alon, N., Schwartz, S., Shefi, O. Neuronal Growth on l- and d-Cysteine Self-Assembled Monolayers Reveals Neuronal Chiral Sensitivity. ACS Chemical Neuroscience. 5, (5), 370-376 (2014).
  53. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (15), 1700267 (2017).
تصميم أفلام السيليكون مسامية كحاملة لعامل نمو العصب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).More

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter