Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

多孔硅薄膜作为神经生长因子载体的设计

doi: 10.3791/58982 Published: January 25, 2019

Summary

在这里, 我们提出了一个方案, 设计和制造纳米结构多孔硅 (psi) 薄膜作为可降解载体的神经生长因子 (ngf)。pc12 细胞和小鼠背根神经节 (drg) 神经元的神经分化和生长特征是在与 ngf 负载 psi 载体治疗时的特征。

Abstract

尽管 ngf 在治疗神经退行性疾病方面具有巨大的潜力, 但它的治疗管理是一个重大挑战, 因为这种蛋白质由于其化学性质而没有越过血脑屏障, 因此需要长期的传递到大脑有生物作用。本研究描述了纳米结构 psi 薄膜作为 ngf 的可降解载体的制备, 以持续传递这种敏感蛋白质。psi 载体是专门为获得高负载功效和持续释放 ngf 四周, 同时保持其生物活性。通过研究 ngf-psi 载体作为 ngf 传递系统诱导 pc12 细胞和离解 drg 神经元分化和生长的能力,在体外研究了其行为。评估了在有整齐和装有 ngf 的 psi 载体的情况下的细胞活力。将 psi 载体释放的 ngf 的生物活性与重复的游离 ngf 管理的常规处理方法进行了比较。通过对三种不同形态参数的测定, 分析和表征了 pc12 细胞分化;(i) 从 soma 中提取的神经元的数目 (ii) 神经元的总长度和 (iii) 分枝点的数目。使用 ngf-psi 载体处理的 pc12 细胞在整个释放期间表现出深刻的分化。此外, 使用 ngf-psi 载体培养的 drg 神经元细胞表现出广泛的神经元起始, 类似于重复的免费 ngf 管理处理的神经元。研究的可调谐载体证明了长期植入的 ngf 释放具有治疗神经退行性疾病的潜力。

Introduction

ngf 是外周神经系统 (pns)1中神经元发育和维持的关键, 对中枢神经系统 (cns) 2 基底前脑胆碱能神经元的存活和功能起着至关重要的作用.它治疗阿尔茨海默氏症和帕金森症等中枢性神经退行性疾病的高药理潜力已得到广泛证实, 临床试验目前正在进行3,4,5, 6。向中枢神经系统输送 ngf 的最大挑战在于它无法跨越血脑屏障 (bbb), 而系统地给7。此外, ngf 对快速酶降解的敏感性使其半衰期较短, 并显著限制其治疗用途8,9。因此, 在设计能够以安全的方式长期和可控地释放 ngf 的交付系统方面存在着未得到满足的挑战。研究了各种 ngf 输送系统, 包括基于聚合物的系统,1011、1213、14、1516,17. 这些系统的释放概况的特点往往是明显的初始爆裂, 然后是缓慢的连续释放, 在后一阶段, 释放率与最初的爆裂相比明显较低11 ,18,19。此外, 在封装过程, 观察到聚合物的酸性降解产物 (如聚 (乳酸-乙二酸) 对蛋白质的失活或在封装过程中 ngf 生物活性的丧失。

纳米结构 psi 具有多种吸引人的特性, 包括其高表面积、大孔体积、生物相容性和体液中可调谐的降解性, 注定了它是一个有前途的药物输送平台21, 22232425、26、2728。通过正确选择阳极氧化条件, 可以轻松调整 psi 结构特性 (例如孔隙率和孔径), 以进行药物加载, 并释放动力学2127。此外, 各种方便的化学路线允许改变 psi 的表面, 并通过进一步调整 si 支架在生理条件下的溶解率和药物 22,24的释放率, 29,30

本工作的重点是设计一个基于 psis 的交付系统, 用于 ngf 的长控制释放。利用 pc12 细胞和离解 drg 神经元研究了 ngf-psi 载体对神经元分化和生长的影响。我们证明, 加载的 ngf 通过诱导神经元在一个单一的给药1个月的释放期内的生长和深刻分化来保持其生物活性。

Protocol

所有方法都已得到巴尔伊兰大学道德委员会的批准。

1. 氧化 psi (psio2) 载体的制备

  1. 使用钻石尖笔将硅晶片 (在 & lt;100> 面抛光的单面抛光, 在掺杂硼的 p 型、0.95 mω· cm 中, 0.95 mω· cm) 切割成1.5 厘米 x1.5 cm 的样品。
  2. 在400°c 的管式炉中, 在环境空气中将 si 样品氧化 2小时 (加热速率: 25°c/min, 自然冷却)。
  3. 将硅样品浸入含水氢氟酸 (hf) (48%)、ddh2o乙醇 (99.9%) 溶液中(1: 3 v\ v) 5分钟;然后用乙醇冲洗样品三次, 然后在氮气流下干燥。
    注: 只需在塑料制品中准备和储存高频溶液, 因为 hf 溶解玻璃。
    小心: hf 是一种高腐蚀性液体, 应极其小心地处理。在接触的情况下, 用清水彻底冲洗, 并用 hf 解毒剂凝胶治疗受影响的部位;立即就医。
  4. 将硅样品安装在聚四氟乙烯蚀刻电池中, 使用铝箔带作为后接触, 铂线圈作为反电极。
  5. 在 hf 和乙醇水 (99.9%) 的 3:1 (v/v) 溶液中, 以 250 ma/cm 2 的恒流密度为 30秒, 蚀刻牺牲层; 然后用乙醇冲洗生成的 psi 膜表面三次, 在氮气流下干燥。
  6. 将新鲜蚀刻的多孔层溶解在水 naoh 溶液 (0.1 m) 中, 时间为2分钟。然后用乙醇冲洗三次, 在氮气流下干燥。
  7. 将样品浸入 hf 水溶液 (48%)、ddh2o乙醇溶液中 (99.9%)(1:3 vv) 2分钟然后用乙醇冲洗三次, 在氮气流下干燥。
  8. 用化学方法将 si 样品在 hf 和乙醇水 (99.9%) 的 3:1 (v/v) 溶液中蚀刻 20秒, 电流密度为 250 ma/cm 2; 然后用乙醇冲洗生成的 psi 膜表面三次, 在氮气流下干燥。
  9. 在环境空气中, 在800°c 的管式炉中对新鲜蚀刻的 psi 样品进行热氧化 1小时 (加热速率: 25°c/min,自然冷却), 形成多孔 sio2 (psio2) 支架
  10. 在 4, 000 转/分的时间内, 用正厚光刻胶对 psio2 样品进行旋转涂层, 时间为 1分钟;然后在90°c 下烘烤涂层样品 2分钟 (加热速率: 5°cmmin, 自然冷却)。
  11. 使用切屑锯将 psio2 样品分解成8毫米 x8 毫米样品.
  12. 要取出光刻胶, 将切碎的样品浸泡在丙酮中 3小时;然后用乙醇彻底冲洗, 然后在氮气流下干燥。

2. 使用 ngf 加载 psio2

  1. 制备 ngf 负载溶液时, 将20μg 的小鼠β-ngf 溶解在 100-1 (v/v) 溶液的400μl 中, 该溶液为 0.01 m 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 和 ddh2o.
  2. 在 psio2 样品的顶部加入52μl 的加载溶液, 并在带盖的盘子中孵育2小时。
    注: 在盘中保持较高的湿度, 以防止在孵育过程中溶液干燥。
  3. 收集样品顶部的解决方案, 以便随后对 psio2 载体中的 ngf 含量进行量化。
    注: ngf 加载到 psio2应在预定使用之前立即执行, 由于蛋白质的干燥和变性的风险, 该协议不能在此处暂停。

3. 采用 ngf elisa 对 ngf 装载量进行定量

  1. 要制备 elisa 板, 请在每口井中加入 100μl 0.5μgl 捕获抗体 (兔抗 hβ-ngf), 然后密封板并在 rt 孵育一夜。
  2. 用300μl 的洗涤缓冲液 (pbs 中的 0.05% tween-20) 对井进行液的去除, 并清洗板四次 (pbs 中的0.05%最后清洗后倒置板, 去除纸布上的残留缓冲液和斑点。
  3. 在每口井中加入300μl 块缓冲液 (pbs 中的1% 牛血清白蛋白 (bsa)), 并在 rt 孵育至少1小时。然后吸气和清洗板四次, 如步骤3.2 所述。
  4. 为了准备校准曲线, 将 ngf 加载溶液 (见步骤 2.1) 稀释剂 (pbs 中0.05% 的 tween-20千克, 0.1% bsa) 稀释为 1 ng/ml。然后进行2倍串行稀释从 1 ngml 到零, 以获得校准曲线样本。
  5. 要准备样品, 分别在稀释剂1:100000 和1:10000 中稀释 ngf 加载液 (从步骤 2.1) 和收集到的后加载溶液 (从步骤 2.3), 以达到使用中的 elisa 试剂盒的浓度范围 (16-1000 pg/ml)。
  6. 将稀释后的样品和校准曲线样品添加 100μl, 每口井一式三份, 在 rt 孵育 2小时;然后吸气和清洗板四次, 如步骤3.2 中所述。
  7. 在每口井中加入100μl 的1μgml 检测抗体 (生物酰化家兔抗 hβ-ngf), 并在 rt 孵育2小时。然后吸气和清洗板四次, 如步骤3.2 所述。
  8. 稀释阿维丁-辣根过氧化物酶 (hrp) 1:2000 在稀释剂中, 每口添加 100μl, 在 rt 孵育30分钟。现在吸气和清洗盘子四次, 如步骤3.2 所述。
  9. 在每口井中加入100μl 的基板溶液, 并在 rt 孵育25分钟以进行颜色开发。使用微板读取器测量 405 nm 的吸收率, 波长校正设置为 650 nm。
  10. 根据校准曲线确定加载溶液和收集的后加载溶液中的 ngf 浓度。
  11. 为了计算 psio2 载体内加载的 ngf 质量, 从加载溶液中的 ngf 质量中减去收集到的后加载溶液中的 ngf 质量。ngf 加载效能由以下公式计算:
    Equation

4. psio2 体ngf释放

  1. 在37°c 和100转/时在轨道搅拌下, 将含有 1% (w/v) bsa 和 0.02% (w/v) 氮化钠的 2 ml ml 中培养 ngf 负载 psio2载体。
  2. 每2天收集解决方案, 并将其替换为2毫升的新鲜 pbs。将采集到的释放样品冷冻在液氮中, 并储存在-20°c, 以便进一步分析。
  3. 如步骤 3.1-3.9 所述, 使用市售的 ngf elisa 分析来量化释放样品中的 ngf 含量。
    注: 在准备用于 elisa 定量的释放样品时, 应在释放周期的不同时间点进行不同的稀释 (即,较早的时间点应比以后的时间点稀释得多)。此外, 对于每个释放样本, 至少应进行两种不同的稀释并进行量化, 以确保达到 elisa 试剂盒的浓度范围。
  4. 根据标定曲线确定释放样品中的 ngf 浓度, 并绘制一段时间内累积 ngf 释放的图。

5. 电感耦合等离子体原子发射光谱 (icp-aes) 对体外硅腐蚀的量化

  1. 在释放缓冲液中稀释1毫升释放样品1毫升 1:10 (0.01 m pbs, 含 1% (w/v) bsa 和 0.02% (w/v) 氮化钠), 总体积为 10 ml。
  2. 监测稀释样品的 si 原子排放峰值为212.4、251.6 和288.2 纳米。
  3. 根据校准曲线确定样品中的硅浓度。
  4. 为了建立硅降解剖面, 在每个时间点表示 si 含量占载体总硅含量的百分比 (即释放期间累积硅含量)。
    注: 为确保准确定量载体的总硅含量, 在释放研究终点后1个月对释放样品进行采样, 并使用 icp-aes 对硅浓度进行分析。总结释放期的累积硅含量和释放后样品中的硅含量, 提供了100% 的硅含量。

6. ngf 负载 psio2载体存在下的细胞活力和生长

  1. 大鼠嗜铬细胞瘤 (pc12) 细胞培养
    1. 在罗塞尔公园医学院 (rpmi) 中加入10% 的马血清 (hs)、5% 的胎牛血清 (fbs)、1% 的 l-谷氨酰胺、1% 的青霉素链霉素和0.2% 的两性霉素, 制备基本生长培养基。
    2. 在 rpmi 培养基中加入 1% hs、1% l-谷氨酰胺、1% 青霉素链霉素和0.2% 两性霉素制备分化培养基。
    3. 在75厘米2培养瓶中生长细胞悬浮液 (106 细胞), 基部培养基为10毫升,为期 8天;每2天在烧瓶中添加10毫升的基本生长介质。
    4. 为了产生分化的 pc12 细胞培养, 将细胞悬浮液转移到离心管;离心机细胞在 200 x g 和rt. 丢弃上清液8分钟。
    5. 将细胞悬浮在5毫升的新鲜基本生长介质中, 并在 200 x g 和 rt重新离心细胞 5分钟;在基本生长培养基的3毫升中丢弃上清液, 重新悬浮细胞颗粒。
    6. 要分离细胞簇, 使用 23 g 注射器抽吸细胞十次。
    7. 在分化培养基的存在下, 使用血细胞细胞计数器和种子 10 4 cellssexcm 2 在胶原蛋白类型 l 型涂层板上计数细胞.
    8. 24小时后, 在每个板上加入新鲜的小鼠β-ngf (50 ng/ml) 或装有 ngf 的 psio2 载体。
      注: 较高的 ngf 浓度 (& gt;50 ng/ml) 具有与规定浓度相同的确切效果。
    9. 每2天更新一次分化培养基。
    10. 为了评估细胞的活力, 在有代表性的时间点添加 10% (v/v) 的活力指标溶液 (基于雷沙嗪), 并在37°c 下孵育 5小时;用分光光度计测量490纳米的吸收率。
  2. 小鼠背根神经节 (drg) 细胞培养
    1. 为了从两只7周大的 c57bl 小鼠身上分离 drg, 首先用70% 的乙醇浇灌小鼠, 并做一个切口切除皮肤。
    2. 切割颅底和腹壁肌肉, 直到脊髓暴露。
    3. 通过在股骨水平上进行切割并清洁周围组织来切除脊柱。
    4. 把柱子切成三块; 把柱子切成三块。然后在中线切割每一块, 生成两个一半, 并剥离出脊髓。
    5. 在双目下, 提取所有 drg 神经节, 并将其浸入冷汉克的平衡盐溶液 (hbss) 中。
    6. 清洁周围的结缔组织, 将 drg 位于培养皿上, 轻轻取出双目下残留的脑膜。
    7. 将 drg 细胞分离, 在 1, 000 u 木瓜蛋白酶中孵育20分钟。
    8. 在 400 x g处离心细胞4分钟。丢弃上清液并保留细胞颗粒。
    9. 将颗粒在 10 mgml 胶原酶和 12mgml dispase-ii 溶液中再移植, 并在37°c 孵育20分钟。
    10. 在 400 x g处离心细胞 2分钟;丢弃上清液并保留细胞颗粒。
    11. 通过收缩的巴斯德移液器反复通过 hbss 1 毫升、10mm 葡萄糖和 5 mm hepes (ph 7.35) 中的细胞颗粒进行示踪。
    12. 在含20% 硅基胶体介质的 l-15 培养基中, 轻轻加入离解细胞, 用密度梯度离心分离细胞;离心机 8分钟, 1, 000 x。吸收上清液并保留细胞颗粒。
      注: 这一步的目的是分离和纯化神经元细胞从轴突碎片, 雪旺细胞和成纤维细胞。
    13. 在 f-12 培养基2毫升中重新弹性细胞颗粒;离心机 2分钟, 1, 000 x 克;丢弃上清液, 在 f-12 培养基1毫升中重新悬浮颗粒。
    14. 计数细胞和种子 2x104 细胞在多 l-赖氨酸和层压蛋白涂层玻璃底部35毫米培养, 在 f-12 抗生素耐药介质补充 10% fbs。
      注: 最初, 将细胞播种在少量介质 (150-200μl) 中;在37°c 孵育2小时后, 加入培养基, 最终体积为2毫升。
    15. 每片轻轻加入装有 ngfpsio2 载体或新鲜小鼠β-ngf (50 ng/ml)。
    16. 2天后, 用4% 的甲醛 (pfa) 溶液孵育细胞培养 15分钟;免疫染色细胞培养使用一个共同的免疫荧光染色程序31
    17. 用共聚焦显微镜成像神经元细胞培养。

7. 细胞分化分析

  1. pc12 细胞分化百分比在 ngf负载psio2 载体的存在
    1. 在培养基2毫升的培养基中, 在含有 5% co2 的37°c 加湿孵化器中培养装有 ngf 的 psio2 载体.
    2. 每隔 2天, 收集溶液, 并更换2毫升新鲜介质。将采集到的释放样品冷冻在液氮中, 并储存在-20°c, 以便进一步分析。
    3. 根据第4.1 节 (4.1.3-4.1.6) 的说明, 12 井胶原蛋白涂层板中的种子 pc12 细胞。
    4. 24小时后, 向不同井段介绍具有代表性的时间点 (从5.1.2 节) 的释放样本;对于控制井, 加入新鲜的小鼠β-ngf (50 ng/ml)。
    5. 24小时后, 用光学显微镜对细胞进行成像。
    6. 为了确定神经细胞的百分比, 手动从图像中的细胞总数中计算出超过神经元的细胞 (n = 每口5帧);绘制了 pc12 细胞与神经元生长的百分比图。
      注: 未分化的 pc12 细胞似乎具有无神经元的圆形结构, 而分化细胞则可以通过神经元的生长 (至少有一个最小长度等于细胞 soma 直径) 或形态变化来识别。
  2. 分化 pc12 细胞的形态分析
    1. 对于图像处理分析, 在使用 ngf (作为游离试剂或作为装有 ngf 负载的 psio2 载体的释放产物) 处理后3天内获得培养细胞的相像。
      注: 在以后的时间点 (超过第5天), 细胞发展高度复杂的网络, 防止在单个细胞分辨率的形态测量。
    2. 下载图像处理程序 nuronj, imagej 插件, 它可以实现半自动神经元跟踪和长度测量。
    3. 将图像文件转换为8位格式, 并使用图像刻度条测量像素到微米的比率。
    4. 使用"分析"设置比例设置 "缩放"命令并测量每个神经元的长度。
    5. 手动计算分支点的数量和来自每个细胞 soma 的神经数。
      注: ngf 治疗后的平均神经元长度约为30μm。测量到的神经元长度可以广泛分布。

Representative Results

如协议所述, 制备了氧化 psi 薄膜。硅晶片在 250 ma-cm 2 (图 1ai) 下进行了20秒的电化学蚀刻 , 然后在 800°c (图 1aii) 下进行热氧化, 以产生 psio2 支架.所产生的 psio2 薄膜的高分辨率扫描电子显微镜 (hr-sem) 图像如图 1b, c 所示. 薄膜的顶部显微图 (图 1b) 描述了其高度多孔性, 毛孔直径约为40纳米。裂解膜的横截面微图 (图 1c) 显示多孔层厚度为2.9 微米, 其特征是相互连接的圆柱形孔隙。

psio2薄膜加载 ngf 加载解决方案, 如图 1ii 所示。利用 ngf elisa, 通过测量 psio2 薄膜培养前后加载溶液中的 ngf 浓度, 对 ngf 负载进行量化。每片 psio2 膜加载的 ngf的平均质量被确定为2.8±0.2 微克, 这相当于 90% (w w) 的高加载效率 (数据未显示31)。为了建立 psio2载体的 ngf 释放剖面, 在37°c 的 pbs 中对加载的薄膜进行孵育, 每2天对 aliquots 进行采样, 以便使用 ngf elisa 对释放的蛋白质浓度进行定量。此外, 利用 icp-aes 对释放样品中的硅含量进行了定量, 建立了 psio2载体的硅侵蚀动力学。图 2描述了多孔载体的 ngf 释放和相应的 si 降解剖面。持续释放 ngf, 无爆裂效应, 达到1个月。与释放周期后期的缓慢释放相比, 第一周的 ngf 释放速度更快 (坡度 = 0.442)。需要注意的是, 在整个1个月的释放过程中, 释放的 ngf 量足以诱导 pc12 细胞的深度分化, 稍后将对此进行讨论。累积的 ngf 释放发现与剩余的硅含量有很好的相关性 (r2 = 0.971), 如图 2的内集所示。

其次, 对具有 ngf 负载的 psio2载体的生物活性进行了体表征, pc12 细胞和 drg 神经元被用作神经元分化和生长的模型。pc12 细胞和离解的 drg 神经元是按照协议中的描述播种的。首先, 在 psio2载体存在的情况下, 通过用整齐 (未加载) 或 ngf 负载的 psio2 培养细胞来检查细胞的活力;用整齐的 psio2处理的控制板和细胞每2天补充一次免费的 ngf。当细胞暴露在整洁或装有 ngf 的 psio2载体上时, 没有观察到细胞毒性 (图 3a), 这表明 psio2与该细胞系具有生物相容性。图 3b显示了用 ngf 负载 psio2载体处理的 pc12 细胞的代表性 hr-sem 显微图像。观察到的细胞提取神经元并形成特征分枝神经元网络。当在 ngf 负载的 psio2 载体的存在下播种离解 drg 神经元细胞时, 也得到了类似的结果。用 ngf 负载的 psio2载体培养的免疫染色 drg 细胞的共聚焦图像 (图 3e) 显示出广泛的神经体启动和伸长, 类似于阳性对照 (, 神经元补充自由ngf, 见图 3d), 而负控制 (未经处理的神经元, 见图 3d), 表现出神经元的生长程度很低。

为了评估 pc12 细胞在 psio2载体释放的 ngf 存在下的分化百分比, 通过从整个细胞群中计算神经元外生长的细胞来量化分化。图 4总结了在26天期间不同时间点的分化细胞百分比的结果。在整个研究期间, 显著的微分百分比值是可以达到的。值得注意的是, 26天后, 释放的 ngf 诱导分化超过 50%, 与以前使用聚合物基载体 16的研究相比, 这一分化率显著高于。这些结果表明, ngf 包裹在多孔宿主内保存了蛋白质的生物活性, 诱导深度分化约1个月。

为了进一步研究 ngf-psio2 载体对神经元分化的影响, 在单个细胞水平上测量了分化的 pc12 细胞的三个特征形态参数: (i) 从 soma 中提取的神经石数量 ((ii) 神经元的总长度和 (iii) 分枝点的数量。细胞用装有 ngf 的 psio2载体或重复的免费 ngf (每 2天) 进行处理 (每 2天) 作为对照。图 5a-c给出第1天和第3天细胞群的形态分析。用 ngf 加载的 psio2 处理的 pc12 细胞显示的形态值与所有三个测试参数的控制处理相似.3天后, 所有形态参数的值观察到, 在相同的速度增加, 无论是 ngf 负载 psio2载体和对照处理重复给药的免费 ngf。

Figure 1
图 1: psio2薄膜的制备。(a) psio2载体的制造方案: (一) 硅晶圆在 250 ma/cm2 处进行了20秒的电化学蚀刻, 然后是 (ii) 在800°c 时进行热氧化以产生 psio2支架, 以及 (iii) ngf 加载物理吸附 (原理图不按比例绘制)。(b-c)特征 psio2 薄膜的顶视图和横截面电子显微镜请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 装有 ngf 的 psio2 载体的 ngf释放和硅侵蚀剖面.将 psio2 载体的降解程度作为多孔膜总硅含量在每个时间点剩余硅含量的分数。该插页显示了累积 ngf 释放量与剩余硅含量之间的相关性。错误条表示 sd, n=3。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 在含有 ngf 负载的 psio2载体的情况下, 细胞活力和生长。(a) 体外细胞毒性特征。pc12 细胞的活力是在暴露于整齐 (未加载) psio2载体、ngf加载的psio 2 载体或游离 ngf (每 2天 50 ng/ml, 控制板) 后的1天、3天和7天内测量的。(b)用装有 ngf 的 psio2载体培养的 pc12 细胞的电子显微镜, 为期9天。左面板: 放大, 描绘神经元从细胞 soma 的生长;右面板: 一个缩小, 表示高度复杂的神经元网络形成。(c-e)免疫抑制 drg 神经元细胞培养 (播种后 2天) 的共聚焦显微镜图像: (c) 未经处理的细胞;(d) 补充游离 ngf 的细胞 (50 ng/ml);(e) ngf-psio2型载波。免疫荧光染色的神经纤维 h 可以成像细胞 soma 和生长外长的神经元。刻度栏 = 50μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图4:pc12 细胞在具有代表性的时间点接触 ngf释放的 ngf 时的分化百分比值.分化率表示为神经细胞在整个细胞群中的生长外细胞数量。控制治疗是指补充游离 ngf (50 ng/ml) 的细胞。沿 x 轴描绘不同时间点的细胞的代表性光显微镜图像;刻度条 = 25μm, 用于第2天、第8天、第14天、26天和50μm 的显微图, 用于控制显微图。错误条表示 sd, n=3。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 分化的 pc12 细胞的形态分析.在每两天接触 ngf 负载的 psio 2 载体或重复给药免费 ngf, 在单个细胞水平上测量分化的 pc12 细胞的三个形态参数 (对照);(a) 神经元的总长度 (b) 从细胞 soma 中提取的神经元的数量和 (c) 分枝点的数量。错误条表示 sd, n=3。请点击这里查看此图的较大版本.

Discussion

可降解纳米结构 psio2 薄膜被制备并用作 ngf 的载体, 使其能够连续和长期释放, 同时保持其生物活性。psio2作为ngf 的传递系统的潜力在体外得到了证明, 证明了它们能够释放足够的 ngf 剂量, 诱导神经元分化, 促进 pc12 细胞和 drg 神经元的生长。这些工程膜可作为 ngf 的长期储集层, 用于今后的体内处理。

针对 ngf 有效载荷, 专门定制了制备的 psi 薄膜的结构性能;对电化学蚀刻过程的电流密度进行了调整, 以获得大约40纳米的孔径, 从而很容易地容纳 ngf, ngf一种分子量为 26.5 kda 32 的蛋白质, 其特征直径约为 4 nm33,在多孔基体内。此外, 还对多孔支架进行了热氧化, 通过静电吸引带正电荷的蛋白质对带负电荷的氧化 psi 表面进行物理吸附, 使 ngf 得到物理吸附。psi 的表面化学对载荷效应有重要影响, 为了更好地控制载荷与多孔基体之间的相互作用, 可以很容易地进行调整。这些相互作用随后决定了吸附蛋白质分子的结构及其生物活性34,35,36。最后, 通过仔细选择合适的孔径、表面特性和理想的加载溶剂, 对系统进行了调整, 以获得 ngf 的最佳载荷, 由此产生的参数决定了蛋白质负载疗效。因此, 制造参数 (例如, 电流密度、蚀刻时间、掺杂物或电解质的类型和浓度)、表面化学或加载溶液成分的任何变化都会影响负载蛋白。

psi orpsio2 主机的有效载荷释放率通常由两种同时机制的组合决定, 即有效载荷分子的外扩散和 si 支架降解37。植入部位、其病理和疾病状态28、3839 都会影响侵蚀和随后的溶解率.在以前的工作中, 它被确定为, 如果需要不同的释放率的某种治疗应用, 释放轮廓可以修改和延长通过改变的表面化学的 psi 表面38,40, 41岁各种化学修饰, 如热氧化、热碳化和水雾化技术, 已被证明可以稳定 psi 表面, 并影响其降解和随后的有效载荷释放35,42 ,43,44,45。此外, 通过各种表面化学路线将蛋白质分子的共价附着到硅支架上, 将 ngf 加载到载体中, 应导致更长时间的释放, 因为只有当共价键破裂或支持硅矩阵降解 21

此外, psi 在其制造过程中, 除了薄膜外, 还可以呈现成各种配置, 例如微粒子46、纳米粒子47或独立膜26, 这些薄膜也可用作载体并满足特定的应用需求。

为了与临床相关, psio2载体中的 ngf 含量应达到治疗剂量的范围。在协议中描述的方法中, 将 ngf 加载的 psio2 载波引入到2毫升的电池介质或 pbs 缓冲液中, 从而调整加载溶液的浓度和各自加载的 ngf 质量, 从而产生释放的 ngf 浓度, 这是相关的测试体外系统。当将这种方法用于不同的系统时, 如在体内体内环境中, 应根据所需的剂量增加和调整 ngf 加载溶液的浓度。或者, 通过为每个测试区域引入多个载波或使用更大的 psio2 样品区域, 可以获得更高的 ngf 含量。

此外, 应当指出, 在释放期的后期时间点, 释放的 ngf 浓度远远低于早期的时间点。在根据应用需要设计系统时, 必须考虑到 ngf 流量不随时间变化的事实。

大量的 ngf 输送系统已经开发并在文献中得到报道, 其中大多数是聚合物基系统, 由合成聚合物共轭或天然聚合物共轭 10111215 组成.,16,17. 这些系统显示了有效的持续发布概况, 但发布期跨越了几天, 产生了重大的爆发效应。其中一些交付平台受到严重限制, 例如封装过程中的生物活性丧失, 需要使用不同的稳定剂18,48, 以及复杂和复杂的制造技术16。在设计蛋白质传递系统的最大挑战之一是能够在载体系统内被困时保持分子的生物活性。蛋白质或肽可以在 rt 或甚至在较低的温度下加载到 psi/psio2 中, 而不使用强的有机溶剂, 这两者都是加载这些敏感生物分子时的重要因素。以往的研究表明, psi/psio2表面化学在最大限度地减少负载蛋白质的可能变性方面发挥着至关重要的作用 35,36。因此, psi/psio2是开发一般生长因子输送系统, 特别是 ngf 的优势纳米材料。

目前的工作重点是利用该方法作为一种新的治疗方法, 直接给 ngf 到中枢神经系统治疗神经退行性疾病的潜在方法。ngf 负载 psio2 载体可植入小鼠大脑, 并在体内研究该平台作为长期植入物的有效性.此外, 将这种有前途的载体与非侵入性的生物学结合在一起 49,50可能使人们能够使用一种新型的气动方法, 以高度的空间分辨率将装有 ngf 的 psio2 粒子用于局部区域毛细血管枪治疗神经退行性疾病, 其中需要时空给药。此外, ngf 可以以化学梯度方式引导神经元生长51, 类似于轴突引导分子。因此, 加载的 psio2 载流子可以作为 ngf 的吸引热点, 直接生长, 与其他定向线索52,53互补.此外, psio2载体可以通过进一步调整 psio2纳米结构及其表面化学, 专门定制, 以在长达数月的时间内维持 ngf 的交付。

Disclosures

提交人声明没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

ms 和 es 感谢罗瑞 i. lokey 生命科学与工程中心的核心服务和支持, 以及以色列理工学院罗素·伯里纳米技术研究所的财政支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiesmann, C., De Vos, A. Nerve growth factor: structure and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58, (5), 748-759 (2001).
  2. Dreyfus, C. F. Effects of nerve growth factor on cholinergic brain neurons. Trends in Pharmacological Sciences. 10, (4), 145-149 (1989).
  3. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Intracerebroventricular infusion of nerve growth factor in three patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 9, (5), 246-257 (1998).
  4. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Encapsulated cell biodelivery of nerve growth factor to the basal forebrain in patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 33, (1), 18-28 (2012).
  5. Eyjolfsdottir, H., et al. Targeted delivery of nerve growth factor to the cholinergic basal forebrain of Alzheimer's disease patients: application of a second-generation encapsulated cell biodelivery device. Alzheimer's Research & Therapy. 8, (1), 30 (2016).
  6. Tuszynski, M. H., et al. A phase 1 clinical trial of nerve growth factor gene therapy for Alzheimer disease. Nature Medicine. 11, (5), 551-555 (2005).
  7. Pan, W., Banks, W. A., Kastin, A. J. Permeability of the blood-brain barrier to neurotrophins. Brain Research. 788, (1), 87-94 (1998).
  8. Thorne, R. G., Frey, W. H. Delivery of neurotrophic factors to the central nervous system. Clinical Pharmacokinetics. 40, (12), 907-946 (2001).
  9. Tria, M. A., Fusco, M., Vantini, G., Mariot, R. Pharmacokinetics of nerve growth factor (NGF) following different routes of administration to adult rats. Experimental Neurology. 127, (2), 178-183 (1994).
  10. Bhang, S. H., et al. The effect of the controlled release of nerve growth factor from collagen gel on the efficiency of neural cell culture. Biomaterials. 30, (1), 126-132 (2009).
  11. Camarata, P. J., Suryanarayanan, R., Turner, D. A., Parker, R. G., Ebner, T. J. Sustained release of nerve growth factor from biodegradable polymer microspheres. Neurosurgery. 30, (3), 313-319 (1992).
  12. Cooper, A., Bhattarai, N., Zhang, M. Fabrication and cellular compatibility of aligned chitosan-PCL fibers for nerve tissue regeneration. Carbohydrate Polymers. 85, (1), 149-156 (2011).
  13. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 37 (2016).
  14. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7, (3), 1058-1066 (2015).
  15. Sridhar, R., et al. Electrosprayed nanoparticles and electrospun nanofibers based on natural materials: applications in tissue regeneration, drug delivery and pharmaceuticals. Chemical Society Reviews. 44, (3), 790-814 (2015).
  16. Valmikinathan, C. M., Defroda, S., Yu, X. Polycaprolactone and bovine serum albumin based nanofibers for controlled release of nerve growth factor. Biomacromolecules. 10, (5), 1084-1089 (2009).
  17. Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, (17), 3765-3772 (2002).
  18. Cao, X., Shoichet, M. S. Delivering neuroactive molecules from biodegradable microspheres for application in central nervous system disorders. Biomaterials. 20, (4), 329-339 (1999).
  19. Saltzman, W. M., Mak, M. W., Mahoney, M. J., Duenas, E. T., Cleland, J. L. Intracranial Delivery of Recombinant Nerve Growth Factor: Release Kinetics and Protein Distribution for Three Delivery Systems. Pharmaceutical Research. 16, (2), 232-240 (1999).
  20. Zhu, G., Mallery, S. R., Schwendeman, S. P. Stabilization of proteins encapsulated in injectable poly (lactide- co-glycolide). Nature Biotechnology. 18, 52 (2000).
  21. Anglin, E. J., Cheng, L., Freeman, W. R., Sailor, M. J. Porous silicon in drug delivery devices and materials. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, (11), 1266-1277 (2008).
  22. Canham, L. T., et al. Derivatized mesoporous silicon with dramatically improved stability in simulated human blood plasma. Advanced Materials. 11, (18), 1505-1507 (1999).
  23. Chen, F., et al. Organosilica Nanoparticles with an Intrinsic Secondary Amine: An Efficient and Reusable Adsorbent for Dyes. ACS Applied Materials & Interfaces. 9, (18), 15566-15576 (2017).
  24. Godin, B., et al. Tailoring the degradation kinetics of mesoporous silicon structures through PEGylation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 94A. 4, (4), 1236-1243 (2010).
  25. Kempen, P. J., et al. Theranostic Mesoporous Silica Nanoparticles Biodegrade after Pro-Survival Drug Delivery and Ultrasound/Magnetic Resonance Imaging of Stem Cells. Theranostics. 5, (6), 631-642 (2015).
  26. Low, S. P., Voelcker, N. H., Canham, L. T., Williams, K. A. The biocompatibility of porous silicon in tissues of the eye. Biomaterials. 30, (15), 2873-2880 (2009).
  27. Salonen, J., Kaukonen, A. M., Hirvonen, J., Lehto, V. -P. Mesoporous silicon in drug delivery applications. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, (2), 632-653 (2008).
  28. Tzur-Balter, A., Shatsberg, Z., Beckerman, M., Segal, E., Artzi, N. Mechanism of erosion of nanostructured porous silicon drug carriers in neoplastic tissues. Nature Communications. 6, (2015).
  29. Salonen, J., Lehto, V. -P. Fabrication and chemical surface modification of mesoporous silicon for biomedical applications. Chemical Engineering Journal. 137, (1), 162-172 (2008).
  30. Tzur-Balter, A., Massad-Ivanir, N., Segal, E. Surface Engineered Porous Silicon-based Nanostructures for Cancer Therapy. MRS Proceedings. 1416, (2012).
  31. Zilony, N., et al. Prolonged controlled delivery of nerve growth factor using porous silicon nanostructures. Journal of Controlled Release. 257, 51-59 (2017).
  32. Young, M., Saide, J. D., Murphy, R. A., Arnason, B. G. Molecular size of nerve growth factor in dilute solution. Journal of Biological Chemistry. 251, (2), 459-464 (1976).
  33. Erickson, H. P. Size and Shape of Protein Molecules at the Nanometer Level Determined by. Sedimentation, Gel Filtration, and Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 11, (1), 32 (2009).
  34. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Thermal oxidation for controlling protein interactions with porous silicon. Langmuir. 26, (17), 14316-14322 (2010).
  35. McInnes, S. J., et al. Surface engineering of porous silicon to optimise therapeutic antibody loading and release. Journal of Materials Chemistry B. 3, (20), 4123-4133 (2015).
  36. Prestidge, C. A., et al. Loading and release of a model protein from porous silicon powders. Physica Status Solidi (A. 204, (10), 3361-3366 (2007).
  37. Tzur-Balter, A., Young, J. M., Bonanno-Young, L. M., Segal, E. Mathematical modeling of drug release from nanostructured porous Si: combining carrier erosion and hindered drug diffusion for predicting release kinetics. Acta Biomaterialia. 9, (9), 8346-8353 (2013).
  38. Nieto, A., et al. Surface Engineering of Porous Silicon Microparticles for Intravitreal Sustained Delivery of Rapamycin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, (2), 1070-1080 (2015).
  39. Warther, D., et al. Porous silicon based intravitreal platform for dual-drug loading and controlled release towards synergistic therapy. Drug Delivery. 25, (1), 1537-1545 (2018).
  40. Li, W., et al. Tailoring Porous Silicon for Biomedical Applications: From Drug Delivery to Cancer Immunotherapy. Advanced Materials. 30, (24), 1703740 (2018).
  41. Yazdi, I. K., et al. Physicochemical properties affect the synthesis, controlled delivery, degradation and pharmacokinetics of inorganic nanoporous materials. Nanomedicine. 10, (19), 3057-3075 (2015).
  42. Fry, N. L., Boss, G. R., Sailor, M. J. Oxidation-Induced Trapping of Drugs in Porous Silicon Microparticles. Chemistry of Materials. 26, (8), 2758-2764 (2014).
  43. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Surface chemistry of porous silicon and implications for drug encapsulation and delivery applications. Advances in Colloid and Interface Science. 175, 25-38 (2012).
  44. Salonen, J., Mäkilä, E. Thermally Carbonized Porous Silicon and Its Recent Applications. Advanced Materials. 30, (24), (2018).
  45. Wang, M., et al. Influence of Surface Chemistry on the Release of an Antibacterial Drug from Nanostructured Porous Silicon. Langmuir. 31, (22), 6179-6185 (2015).
  46. Salonen, J., et al. Mesoporous silicon microparticles for oral drug delivery: loading and release of five model drugs. Journal of Controlled Release. 108, (2), 362-374 (2005).
  47. Park, J. -H., et al. Biodegradable luminescent porous silicon nanoparticles for in vivo applications. Nature Materials. 8, (4), 331-336 (2009).
  48. Johnson, P. J., Skornia, S. L., Stabenfeldt, S. E., Willits, R. K. Maintaining bioactivity of NGF for controlled release from PLGA using PEG. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 86, (2), 420-427 (2008).
  49. Shefi, O., et al. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, (23), 6119-6123 (2006).
  50. Zilony, N., Tzur-Balter, A., Segal, E., Shefi, O. Bombarding Cancer: Biolistic Delivery of therapeutics using Porous Si Carriers. Scientific Reports. 3, 2499 (2013).
  51. Zuidema, J. M., Provenza, C., Caliendo, T., Dutz, S., Gilbert, R. J. Magnetic NGF-Releasing PLLA/Iron Oxide Nanoparticles Direct Extending Neurites and Preferentially Guide Neurites along Aligned Electrospun Microfibers. ACS Chemical Neuroscience. 6, (11), 1781-1788 (2015).
  52. Baranes, K., Moshe, H., Alon, N., Schwartz, S., Shefi, O. Neuronal Growth on l- and d-Cysteine Self-Assembled Monolayers Reveals Neuronal Chiral Sensitivity. ACS Chemical Neuroscience. 5, (5), 370-376 (2014).
  53. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (15), 1700267 (2017).
多孔硅薄膜作为神经生长因子载体的设计
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).More

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter