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Bioengineering

Conception de silicium poreux Films comme porteurs du facteur de croissance nerveuse

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/58982
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3, 1,4
1Department of Biotechnology and Food Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Bar-Ilan Institute of Nanotechnologies and Advanced Materials, 4Russell Berrie Nanotechnology Institute, Technion - Israel Institute of Technology

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à concevoir et fabriquer des films de silicium poreux (lb/po2) nanostructurés comme supports biodégradables pour le facteur de croissance de nerf (NGF). La différenciation neuronale et une excroissance des neurones des ganglions (DRG) racine dorsale souris et les cellules PC12 sont caractérisent par traitement avec les transporteurs chargés NGF PSi.

Abstract

Malgré son grand potentiel de NGF, pour le traitement des maladies neurodégénératives, son administration thérapeutique représente un défi important tel que la protéine ne franchit pas la barrière hémato - encéphalique, en raison de ses propriétés chimiques et nécessite donc à long terme livraison vers le cerveau pour avoir un effet biologique. Cet ouvrage décrit la fabrication de films de PSi nanostructurés comme dégradables porteurs de NGF pour la prestation continue de cette protéine sensible. Les transporteurs de PSi sont taillés sur mesure pour obtenir l’efficacité de charge élevée et les rejets continus de NGF pour une période de quatre semaines, tout en préservant son activité biologique. Le comportement des transporteurs NGF-PSi comme un système de diffusion de NGF est étudiée in vitro en examinant leur capacité à induire la différenciation neuronale et une excroissance des cellules PC12 et dissocié des neurones DRG. La viabilité des cellules en présence de transporteurs de PSi NGF chargés et soignées est évaluée. La bioactivité du NGF publié auprès des transporteurs de PSi est comparée au traitement conventionnel des administrations de NGF gratuits répétitives. La différenciation des cellules PC12 est analysée et caractérisée par la mesure des trois différents paramètres morphologiques des cellules différenciées ; (i) le nombre de neurites, extraction de soma, longueur des (ii) les neurites total et (iii) le nombre de bifurcations. Les cellules PC12 traitées avec les transporteurs de NGF-PSi montrent une différenciation profonde tout au long de la période de libération. En outre, les cellules neuronales GRD cultivées avec les transporteurs de NGF-PSi montrent une initiation des neurites, semblables aux neurones traitement avec les administrations répétées de NGF gratuites. Les transporteurs accordables étudiés montrent les implants à long terme pour la libération de NGF avec un potentiel thérapeutique pour les maladies neurodégénératives.

Introduction

NGF est essentiel pour le développement et la maintenance des neurones dans le système nerveux périphérique (SNP)1 et joue un rôle crucial dans la survie et la fonction des neurones cholinergiques du cerveau antérieur basal dans le système nerveux central (SNC)2. Son fort potentiel pharmacologique pour traiter les maladies neurodégénératives central, telles que l’Alzheimer et de Parkinson, a été largement démontrée, avec des essais cliniques actuellement en cours3,4,5, 6. Le plus grand défi dans la prestation de NGF au SNC réside dans son incapacité à franchir la barrière hémato-encéphalique (BHE), lorsqu’il est administré systématiquement7. En outre, la susceptibilité à la dégradation enzymatique rapide NGF restitue sa courte demi-vie et limite considérablement son utilisation thérapeutique8,9. Il y a donc un défi non satisfait à concevoir des systèmes de livraison permettant une libération prolongée et contrôlée de NGF de manière sûre. Divers systèmes de livraison de NGF, y compris les systèmes à base de polymères, ont été étudiés10,11,12,13,14,15, 16 , 17. les profils de sortie de ces systèmes sont souvent caractérisés par une explosion initiale distincte suivie d’une libération lente continue, où dans la dernière étape, le taux de libération était très faible par rapport à la première rafale11 ,18,19. En outre, l’inactivation de la protéine par les produits de dégradation de l’acide des polymères (par exemple, l’acide poly(lactic-co-glycolic)) ou de la perte de la bioactivité de NGF pendant le processus d’encapsulation ont été observés avec ce systèmes20.

Nanostructured PSi est caractérisée par plusieurs propriétés attrayantes, y compris sa grande surface, grand volume poreux, biocompatibilité et dégradabilité accordable dans les fluides corporels, il predestining pour un prometteur drogue livraison plate-forme21, 22,23,24,25,26,27,28. Une sélection adéquate de ses conditions d’anodisation permet d’ajuster facilement les propriétés structurales de PSi (p. ex., la porosité et le pore taille) pour adapter le chargement de drogue et de cinétique de libération21,27. En outre, diverses voies chimiques pratiques permettent de modifier la surface de la PSi et par là régler plus précisément le taux de dissolution de l’échafaudage Si dans des conditions physiologiques et le taux de libération de la drogue22,,24, 29,30.

Ce travail porte sur la conception d’un système de livraison lb/po2 pour Liberation prolongée du NGF. L’effet des transporteurs NGF-PSi sur la différenciation neuronale et une excroissance est examinée à l’aide de cellules PC12 et dissocié des neurones de la DRG. Nous démontrons que le NGF chargé a conservé sa bioactivité en induisant la croissance neuritique et différenciation profonde pendant une période de 1 mois communiqué au sein d’une administration unique.

Protocol

Toutes les méthodes ont été approuvés par le Comité d’éthique de l’Université Bar Ilan.

1. fabrication de transporteurs oxydé PSi (AIFP2)

  1. Couper une plaquette de Si (seul côté brillant sur le visage < 100 > et fortement dopé au bore, type p, mΩ·cm 0.95) dans des échantillons de 1,5 cm × 1,5 cm à l’aide d’un stylo à pointe de diamant.
  2. Oxyder les échantillons Si dans un four à tube à 400 ° C pendant 2 h dans l’air ambiant (vitesse de chauffage : 25 ° C/min, refroidissement naturel).
  3. Immerger les échantillons Si dans une solution aqueuse d’acide fluorhydrique (HF) (48 %), FD2O et éthanol (99,9 %) (1:1:3 v/v/v) pendant 5 min ; Ensuite, rincez les échantillons avec de l’éthanol trois fois et sécher sous un courant d’azote.
    NOTE : Préparer et stocker solution HF en contenants de plastique seulement, que le verre se dissout HF.
    Attention : L’acide Fluorhydrique est un liquide très corrosif, et il doit être manipulé avec précaution. En cas d’exposition, rincer abondamment à l’eau et de traiter la zone touchée avec gel d’antidote HF ; obtenir des soins médicaux immédiatement.
  4. Monter l’exemple Si dans une cellule de la gravure de polytétrafluoroéthylène, utilisant une bande de papier d’aluminium comme un arrière-contact et une bobine de platine comme la contre-électrode.
  5. Etch une couche sacrificielle dans une solution de 3:1 (v/v) de HF aqueux et d’éthanol (99,9 %) pendant 30 s à une densité de courant constante de 250 mA/cm2; puis rincer la surface de l’ISP qui en résulte avec de l’éthanol du film trois fois et sécher sous un courant d’azote.
  6. Dissoudre la couche poreuse fraîchement gravé dans une solution aqueuse de NaOH (0,1 M) pendant 2 min. Puis rincez avec de l’éthanol trois fois et sécher sous un courant d’azote.
  7. Immergez l’échantillon dans une solution aqueuse HF (48 %), FD2O et éthanol (99,9 %) (1:1:3 v/v) pendant 2 min. Puis rincez avec de l’éthanol trois fois et sécher sous un courant d’azote.
  8. Électrochimiquement etch de l’échantillon Si dans une solution de 3:1 (v/v) de HF aqueux et d’éthanol (99,9 %) pendant 20 s à une densité de courant constante de 250 mA/cm2; puis rincer la surface de l’ISP qui en résulte avec de l’éthanol du film trois fois et sécher sous un courant d’azote.
  9. Oxyder thermiquement les échantillons de PSi fraîchement gravé dans un four à tube à 800 ° C pendant 1 h dans l’air ambiant (vitesse de chauffage : 25 ° C/min, refroidissement naturel) pour former un échafaudage de2 (AIFP2) SiO poreux.
  10. Échantillons de l' AIFP2 spin-manteau avec une photorésine épaisse positive à 4 000 tr/min pendant 1 min ; puis cuire les échantillons couchés à 90 ° C pendant 2 min (vitesse de chauffage : 5 ° C/min, refroidissement naturel).
  11. Dés l’AIFP2 échantillons dans des échantillons de 8 × 8 mm à l’aide d’une scie de découpe.
  12. Pour enlever la résine photosensible, tremper les échantillons en dés dans de l’acétone pendant 3 h ; puis rincer abondamment avec de l’éthanol et sécher sous un courant d’azote.

2. chargement AIFP2 avec NGF

  1. Pour préparer le NGF chargement de solution, dissoudre 20 µg de β-NGF murin dans 400 µL de solution 1:1 (v/v) de 0,01 M de tampon phosphate salin (PBS) et FD2O.
  2. Ajouter 52 µL de la solution de chargement sur le dessus de l’AIFP2 échantillon et incuber pendant 2 heures au RT dans un plat plafonné.
    Remarque : Maintenir une humidité élevée dans le plat pour éviter l’assèchement de la solution durant l’incubation.
  3. Recueillir la solution sur le dessus de l’échantillon pour la quantification ultérieure du contenu NGF au sein de l’AIFP2 transporteur.
    Remarque : Un chargement NGF dans AIFP2 doit être effectué immédiatement avant l’utilisation prévue, le protocole ne peut pas être suspendu ici en raison du risque de séchage et de dénaturation de la protéine.

3. quantification des chargement de NGF par ELISA NGF

  1. Pour préparer la plaque ELISA, ajouter 100 µL d’anticorps de capture 0,5 µg/mL (lapin anti-hβ-NGF) pour chaque bien, de sceller la plaque et incuber une nuit à température ambiante.
  2. Aspirer des puits pour éliminer le liquide et laver la plaque quatre fois avec 300 µL de tampon de lavage (0,05 % Tween-20 dans du PBS) / puits ; après le dernier lavage il faut inverser la plaque pour retirer le tampon résiduel et épongez sur du papier absorbant.
  3. Ajouter 300 µL de tampon de bloc (1 % albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS) dans chaque puits et incuber pendant au moins 1 h à température ambiante. Puis aspirer et laver la plaque quatre fois comme indiqué au point 3.2.
  4. Pour préparer une courbe d’étalonnage, diluer NGF chargement de solution (voir étape 2.1) dans le diluant (0,05 % Tween-20, 0,1 % de BSA dans du PBS) à 1 ng/mL. Puis effectuer des dilutions successives 2 fois de 1 ng/mL à zéro pour prélever la courbe d’étalonnage.
  5. Pour préparer les échantillons, diluer la solution de chargement de NGF (à l’étape 2.1) et la solution recueillies après chargement (à l’étape 2.3) en diluant 1/100 000 et 1/10 000 respectivement, pour rejoindre la plage de concentrations du kit ELISA en cours d’utilisation (16-1 000 pg/mL).
  6. Ajouter 100 µL de sérums des dilués et échantillons de courbe d’étalonnage pour chaque bien en triple exemplaire et incuber à RT pendant 2 h ; Puis aspirer et laver la plaque quatre fois comme indiqué au point 3.2.
  7. Ajouter 100 µL à 1 µg/mL d’anticorps de détection (lapin biotinylé anti-hβ-NGF) dans chaque puits et incuber à RT pendant 2 h. Puis aspirer et laver la plaque quatre fois comme indiqué au point 3.2.
  8. Diluer la peroxydase avidine-raifort (HRP) 1:2,000 dans le diluant, ajouter 100 µL à chaque puits et incuber 30 min à température ambiante. Maintenant, aspirer et laver la plaque quatre fois comme indiqué au point 3.2.
  9. Ajouter 100 µL de solution de substrat dans chaque puits et incuber pendant 25 min à ta pour le développement de la couleur. Mesurer l’absorbance à 405 nm avec correction de la longueur d’onde fixée à 650 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
  10. Déterminer la concentration de NGF en la solution de chargement et la solution de recueillies après chargement basée sur la courbe d’étalonnage.
  11. Pour calculer la masse de NGF chargée au sein de l’AIFP2 transporteur, soustraire masse NGF dans la solution recueillies après chargement de la messe de NGF en solution de chargement. Efficacité de chargement NGF est calculée par l’équation suivante :
    Equation

4. in vitro NGF communiqué de l’AIFP2

  1. Incuber l’AIFP NGF-chargé2 transporteurs dans 2 mL de PBS 0,01 M contenant 1 % (p/v) BSA et 0,02 % (p/v) d’azide de sodium à 37 ° C et sous agitation orbitale de 100 tr/min.
  2. Tous les 2 jours recueillir la solution et remplacez-le par 2 mL de PBS frais. Congeler les échantillons collectés libération dans l’azote liquide et conserver à-20 ° C pour approfondir les analyses.
  3. Le test ELISA NGF disponible dans le commerce permet de quantifier la teneur en NGF dans les échantillons de libération comme décrit aux points 3.1 à 3.9.
    Remarque : Lors de la préparation des échantillons de sortie pour la quantification d’ELISA, différentes dilutions doivent être effectuées à des moments différents le long de la période de la libération (c.-à-d., époque révolue points doivent être dilués beaucoup plus de points dans le temps plus tard). En outre, pour chaque échantillon de libération, au moins deux dilutions différentes devraient être effectuées et quantifiées pour assurer l’atteinte de la gamme des concentrations du kit ELISA.
  4. Déterminer la concentration de NGF dans les échantillons de libération basé sur la courbe d’étalonnage et établir une courbe d’accumulation communiqué de NGF au fil du temps.

5. quantification in vitro Si l’érosion par inductivement couplé Plasma Atomic Emission Spectroscopy (ICP-AES)

  1. Diluer 1 mL de libération échantillons 01:10 dans le tampon de sortie (0,01 M de PBS contenant 1 % (p/v) de BSA et de 0,02 % (p/v) d’azide de sodium) pour un montant record de 10 mL.
  2. Surveiller Si des pics d’émission atomique à 212,4, 251,6 et 288,2 nm pour les échantillons dilués.
  3. Déterminer Si concentration dans les échantillons basé sur une courbe d’étalonnage.
  4. Pour établir le profil de dégradation Si, exprimer Si contenu à chaque instant sous forme de pourcentage de la teneur totale de Si des transporteurs (p. ex., le contenu Si cumulé le long de la période de la libération).
    Remarque : Pour assurer une quantification précise de la teneur totale Si les transporteurs, relâchement est échantillonnés 1 mois qui suit la fin de la publication étudier et Si concentration à l’aide d’ICP-AES analysée. Additionnant le cumulatif Si le long de la période de la libération et du contenu de tr dans les échantillons après la libération fournit le 100 % de la teneur en Si.

6. la viabilité et la croissance en présence de l’AIFP NGF-chargé2 transporteurs de cellules

  1. Culture de cellules rat phéochromocytome (PC12)
    1. Préparer le milieu de culture de base en ajoutant 10 % de sérum de cheval (HS), 5 % sérum fœtal (SVF), 1 % L-glutamine, streptomycine pénicilline 1 % et 0,2 % amphotéricine au milieu de Roselle Park Medical Institute (RPMI).
    2. Préparer le moyen de différenciation en ajoutant 1 % HS, 1 % L-glutamine, streptomycine pénicilline 1 % et 0,2 % amphotéricine au milieu RPMI.
    3. Cultiver la suspension (106 cellules) de cellules dans un flacon de culture de2 75 cm avec 10 mL de milieu de culture de base pour 8 jours ; tous les 2 jours ajouter 10 mL de milieu de culture de base dans le ballon.
    4. Pour générer la culture de cellules PC12 différenciée, transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger ; centrifuger les cellules pendant 8 min à 200 x g et RT. jeter le surnageant.
    5. Suspendre les cellules dans 5 mL de milieu de culture de base frais et re-centrifuger les cellules pendant 5 min à 200 x g et RT ; jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 3 mL de milieu de culture de base.
    6. Pour séparer les agrégats cellulaires, aspirer les cellules dix fois à l’aide d’une seringue de 23 G.
    7. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules hémocytomètre et 104 cellules/cm2 travail zone plaques de l enduit de type collagène en présence de moyen de différenciation des graines.
    8. Après 24 h, ajouter frais β-NGF murin (50 ng/mL) ou transporteur PSiO2 NGF-chargé par plaque.
      NOTE : Concentrations plus élevées de NGF (> 50 ng/mL) possèdent l’effet exact comme la concentration spécifiée.
    9. Renouveler le moyen de différenciation tous les 2 jours.
    10. Pour évaluer la viabilité des cellules, ajouter 10 % (v/v) de la solution d’indicateur de la viabilité (à base de résazurine) à des points représentatifs et incuber pendant 5 h à 37 ° C ; mesurer l’absorbance à 490 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
  2. Culture de cellules de souris de la racine dorsale ganglions (GRD)
    1. Pour isoler les DRG de deux souris C57bl de 7 semaines, d’abord éteindre les souris avec l’éthanol à 70 % et pratiquer une incision pour enlever la peau.
    2. Couper la base du crâne et les muscles de la paroi abdominale jusqu'à la moelle épinière est exposée.
    3. Supprimer la colonne vertébrale en faisant une coupure au niveau du fémur et de nettoyer les tissus environnants.
    4. Couper la colonne en trois morceaux ; puis couper chaque morceau dans la ligne médiane pour générer les deux moitiés et peler à la moelle épinière.
    5. Dans les jumelles, extraire tous les ganglions de la DRG et immerge-les dans la solution saline équilibrée d’un froid Hank (HBSS).
    6. Nettoyer les tissus conjonctif environnants en aspirant les DRGs sur une boîte de Pétri et retirer délicatement les méninges résiduelles dans les jumelles.
    7. Dissocier les cellules GRD en incubant eux pendant 20 min dans 1 000 U de la papaïne.
    8. Centrifuger les cellules pendant 4 min à 400 g. Jeter le surnageant et garder le culot cellulaire.
    9. Resuspendre le culot dans une solution d’a-II collagénase et 12 mg/mL 10 mg/mL et incuber pendant 20 min à 37 ° C.
    10. Centrifuger les cellules pendant 2 min à 400 x g; jeter le surnageant et garder le culot cellulaire.
    11. Triturer le culot dans 1 mL de HBSS, glucose de 10 mM et 5 mM HEPES (pH 7,35) par des passages répétés à travers une pipette Pasteur rétrécie.
    12. Ajouter doucement les cellules dissociées au milieu de L-15 contenant 20 % de milieu à base de silice colloïdal pour la séparation des cellules par centrifugation en gradient de densité ; centrifuger pendant 8 min à 1 000 x g. Aspirer le surnageant et garder le culot cellulaire.
      Remarque : Cette étape vise à séparer et purifier les cellules neuronales de projections axonales, des cellules de Schwann et des fibroblastes.
    13. Resuspendre le culot dans 2 mL de milieu de F-12 ; centrifuger pendant 2 min à 1 000 x g ; jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 1 mL de milieu de F-12.
    14. Compter les cellules et les cellules4 graines 2 × 10 sur la poly-L-lysine et laminine enduit verre bas 35 mm pétri, dans un milieu sans antibiotique F-12, additionné de 10 % FBS.
      Remarque : Des graines au début, les cellules dans un petit volume de milieu (150-200 µL) ; après 2 h d’incubation à 37 ° C, ajouter le support pour un volume final de 2 mL.
    15. Délicatement ajoutez AIFP NGF-chargé2 transporteur ou frais β-NGF murin (50 ng/mL) par plaque.
    16. Après 2 jours, difficulté à la culture de cellules en incubant il avec une solution de paraformaldéhyde (PFA) de 4 % pendant 15 min à RT ; réagissent la culture cellulaire à l’aide d’une commune immunofluorescence souillant procédure31.
    17. Images de la culture de cellules neuronales à l’aide d’un microscope confocal.

7. analyse de la différenciation cellulaire

  1. PC12 pourcentage de différenciation des cellules en présence de l’AIFP NGF-chargé2 transporteurs
    1. Incuber l’AIFP NGF-chargé2 transporteurs dans 2 mL de milieu de différenciation, dans un incubateur à 37 ° C, contenant 5 % de CO2à humidifié.
    2. Tous les 2 jours, recueillir la solution et remplacez-le par 2 mL de milieu frais. Congeler les échantillons collectés libération dans l’azote liquide et conserver à-20 ° C pour approfondir les analyses.
    3. Cellules PC12 de semences en plaques enduit de collagène 12 puits, comme indiqué au point 4.1 (4.1.3-4.1.6).
    4. Après 24h, introduire les échantillons de la libération des points représentatifs (à partir de la section 5.1.2) aux différents puits ; pour les puits de contrôle, ajouter frais β-NGF murin (50 ng/mL).
    5. Après 24h, l’image des cellules à l’aide d’un microscope optique.
    6. Pour déterminer le pourcentage de cellules porteuses neurites, compter manuellement les cellules qui avaient dépassé les neurites sur le nombre total de cellules dans les images (n = 5 images pour chaque puits) ; tracer un graphique montrant le pourcentage des cellules PC12 avec la croissance des neurites au fil du temps.
      Remarque : Les cellules PC12 indifférencié est apparu dispose d’une structure sans neurites, arrondis tandis que les cellules différenciées peuvent être identifiés par l’excroissance des neurites (au moins une des longueur minimale égale au diamètre de soma de cellule) ou des modifications morphologiques.
  2. Analyse morphométrique des cellules PC12 différenciées
    1. Pour analyse de traitement d’image, acquérir des images de phase de cellules cultivées jusqu'à 3 jours après le traitement avec NGF (comme réactif gratuit ou le produit en version de l’AIFP NGF-chargé2 transporteurs).
      NOTE : Aux points de temps plus tard (jour 5) au delà les cellules développent des réseaux très complexes, empêchant les mesures morphométriques à une résolution de cellule unique.
    2. Télécharger le programme de traitement d’image NeuronJ, un plug-in, ImageJ qui permet un traçage des neurites semi-automatique et mesure de la longueur.
    3. Convertir le fichier image en un format 8 bits et le pixel mesure ratio micromètre à l’aide de la barre d’échelle image.
    4. Définissez l’échelle à l’aide de l' Analyze | Commande La valeur Echelle et mesurez la longueur de chaque neurites.
    5. Manuellement, compter le nombre de points de ramifications et le nombre de neurites provenant de chaque soma de cellule.
      Remarque : Une longueur moyenne de neurites 1jour après traitement avec le NGF est approximativement de 30 µm. Les longueurs des neurites mesurée peuvent être largement distribués.

Representative Results

Films de PSi oxydés sont fabriqués comme décrit dans le protocole. La plaquette de Si est soumise à une gravure électrochimique pour 20 s à 250 mA/cm2 (Figure 1ai), suivie d’une oxydation thermique à 800 ° C (Figure 1aii) pour produire un échafaudage de2 AIFP. Haute résolution de microscopie électronique à balayage (HR-SEM) image du film2 AIFP qui en résultent sont affichées dans la Figure 1 bc. Micrographie de la vue de dessus du film (Figure 1 b) dépeint sa nature hautement poreuse avec pores d’environ 40 nm de diamètre. Micrographie transversale d’un film clivé (Figure 1C) révèle une épaisseur de couche poreuse de 2,9 µm, se caractérise par des pores cylindriques d’interconnexion.

L’AIFP2 films sont chargés avec le NGF chargement solution, comme illustré dans la Figure 1aiii. Chargement de NGF est quantifiée à l’aide de NGF ELISA en mesurant les concentrations de NGF dans la solution de chargement avant et après incubation avec l’AIFP2 films. La masse moyenne de la NGF chargé par l’AIFP2 film correspond à 2,8 ± 0,2 µg, qui correspond à une efficacité de charge élevée de 90 % (p/p) (données non présentées31). Afin d’établir le profil de libération NGF de l’AIFP2 transporteurs, les films chargés sont incubés dans du PBS à 37 ° C et chaque aliquotes de 2 jours sont échantillonnées pour la quantification de la concentration de protéine libéré à l’aide de NGF ELISA. En outre, le contenu de Si dans les échantillons de libération est quantifié à l’aide des ICP-AES et la cinétique de l’érosion du Si de l’AIFP2 transporteurs est établie. La figure 2 illustre la sortie de NGF et les profils de dégradation correspondants Si des transporteurs poreux. Une Liberation prolongee de NGF, sans effet d’éclatement, est atteint pour une période de 1 mois. Communiqué de NGF dans la première semaine est plus rapide (pente = 0,442) par rapport à une version beaucoup plus lente dans des jours plus tard le long de la période de la libération (pente 0,043). Il est à noter que pendant toute la période de déblocage 1 mois, le montant de NGF libéré est suffisant pour induire la différenciation profonde des cellules PC12, comme nous le verrons plus tard. Le NGF accumulatif libéré est constaté qu’une bonne corrélation (R2 = 0,971) avec le reste Si content, comme illustré dans l’encart de la Figure 2.

Ensuite, la bioactivité des transporteurs2 AIFP NGF-chargé est caractérisé en vitro, les cellules PC12 et neurones DRG sont utilisés comme modèles pour la croissance et la différenciation neuronale. Les cellules PC12 et dissocié des neurones DRG sont semés comme décrit dans le protocole. Tout d’abord, la viabilité des cellules en présence de l’AIFP2 transporteurs est examinée en incubant les cellules avec neat (non chargés) ou l’AIFP NGF-chargé2; plaques de contrôle et les cellules traitées avec l’AIFP soignée2 sont complétées avec NGF gratuit tous les 2 jours. Aucune cytotoxicité n’est observée lors de l’exposition des cellules à l’AIFP2 transporteurs soignées ou NGF-chargé (Figure 3 a), démontrant que l’AIFP2 est biocompatible avec cette lignée cellulaire. Figure 3 b montre les micrographies HR-SEM représentant des cellules PC12 traités avec l’AIFP NGF-chargé2 transporteurs. L’extrait de cellules observées neurites et forme caractéristique ramifié les réseaux neuronaux. Des résultats similaires sont obtenus lorsque l’ensemencement dissociée les cellules neuronales GRD en présence de l’AIFP NGF-chargé2 transporteurs. Images confocales de cellules de GRD immunomarquage cultivées avec l’AIFP NGF-chargé2 transporteurs (Figure 3e) montrent une vaste neurites initiation et l’élongation, semblable au contrôle positif (c'est-à-dire, les neurones complétés avec libre NGF, voir Figure 3d), tandis que le contrôle négatif (c'est-à-dire, les neurones non traités, voir Figure 3C), présente une mauvaise mesure de la croissance des neurites.

Evaluer PC12 pourcentage de différenciation des cellules en présence de NGF libéré de l’AIFP2 transporteurs, la différenciation est quantifiée par le comptage des cellules avec la croissance des neurites sur une population totale de cellules. La figure 4 résume les résultats en termes de pourcentage de cellules différenciées à différents moments sur une période de 26 jours. Les valeurs de pourcentage une différenciation significative sont atteints pendant toute la durée étudiée. Notamment, après 26 jours, le NGF libéré a induit la différenciation des supérieurs à 50 %, un pourcentage de différenciation qui est significativement plus élevé comparé à des études antérieures avec transporteurs à base de polymères,16. Ces résultats indiquent qu’entrapment NGF au sein de l’hôte poreux préservée de l’activité biologique de la protéine pour induire la différenciation profonde pour une période d’environ 1 mois.

Pour examiner davantage l’effet de NGF-AIFP2 transporteurs sur la différenciation neuronale, trois paramètres morphologiques caractéristiques des cellules PC12 différenciés sont mesurés au niveau de la cellule unique : (i) le nombre de neurites extraire de la (soma II) des les totales neurites longueur et (iii) le nombre de points de ramifications. Les cellules sont traitées avec AIFP NGF-chargé2 transporteurs ou administration répétitives de NGF libre (tous les 2 jours), comme un contrôle. Figure 5 a -c présente l’analyse morphométrique de la population cellulaire aux jours 1 et 3. Les cellules PC12 traités avec l' AIFP NGF-chargé2 indiquent les valeurs de morphométriques qui ressemblent à du traitement de contrôle pour les trois paramètres testés. Après 3 jours, les valeurs de tous les paramètres morphologiques sont observées à augmenter au même rythme pour les transporteurs de2 AIFP NGF-chargé et le traitement de contrôle d’administration répétitive de NGF gratuit.

Figure 1
Figure 1 : Fabrication de l’AIFP2 films. (a) schéma de Fabrication de l’AIFP2 transporteurs : wafer (i) silicium est soumis à une gravure électrochimique pour 20 s à 250 mA/cm2, suivie de l’oxydation thermique (ii) à 800 ° C, pour produire un échafaudage de2 AIFP et (iii) avec chargement par le NGF l’adsorption physique (schémas ne sont pas dessinés à l’échelle). (b-c) Micrographies vue de dessus et coupe transversale d’un film de2 AIFP caractéristique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Communiqué de NGF et profils d’érosion Si AIFP NGF-chargé2 transporteurs. L’ampleur de la dégradation de l’AIFP2 transporteurs se présente comme la fraction du contenu Si restant à chaque instant de la teneur totale en tr du film poreux. L’encart montre la corrélation entre l’accumulation NGF libéré et restant Si content. Représentent de barres erreur SD, n = 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : La viabilité cellulaire et la croissance en présence de l’AIFP NGF-chargé2 transporteurs. (a) In vitro caractérisation de cytotoxicité. La viabilité de cellules PC12 est mesurée sur 1, 3 et 7 jours après leur exposition à soigné (non chargés) AIFP2 transporteurs, NGF-chargé AIFP2 transporteurs ou NGF gratuit (50 ng/mL tous les 2 jours, les plaques de contrôle). (b) les micrographies des cellules PC12 cultivées avec AIFP NGF-chargé2 transporteurs pendant 9 jours. Panneau de gauche : un zoom-in, illustrant la croissance neuritique depuis le soma de la cellule ; panneau de droite : un zoom-out, qui indiquent le réseau neuronal hautement complex formé. (c-e) Images de microscopie confocale d’immunomarquage DRG neuronale culture (2 jours après le semis) cellulaire : (c) n’est pas traité les cellules ; libre de cellules (d) additionnés de NGF (50 ng/mL) ; (e), NGF-AIFP2 transporteurs. Immunofluorescence des neurofilaments H permet l’imagerie de la soma de cellule et les neurites outgrowing. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : au contact de NGF libéré de l’AIFP NGF-chargé2 transporteurs à des points représentatifs des valeurs de pourcentage de différenciation des cellules PC12. Pourcentage de différenciation est exprimée en nombre de cellules avec des neurites sur une population totale de cellules. Traitement de contrôle fait référence aux cellules additionnés de NGF gratuit (50 ng/mL). Images de microscopie photonique représentant des cellules à des points différents temps sont représentées sur l’axe x ; Echelle = 25 µm pour les micrographies de jours 2, 8, 14, 26 et 50 µm pour micrographie de contrôle. Représentent de barres erreur SD, n = 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : analyse morphométrique des cellules PC12 différenciées. Trois paramètres morphologiques des cellules PC12 différenciées sont évalués, au niveau de la cellule unique, à la journée gratuite de 1 à 3 après exposition à l’AIFP NGF-chargé2 transporteurs ou administration répétitive de NGF tous les 2 jours (contrôle) ; longueur (b) nombre des (a) total neurites de neurites extraire à partir du nombre de cellules soma et (c) des bifurcations. Représentent de barres erreur SD, n = 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Films dégradables nanostructurés AIFP2 sont fabriqués et utilisés comme supports pour NGF, permettant sa sortie continue et prolongée, tout en conservant son activité biologique. Le potentiel de l' AIFP2 pour servir comme un système de livraison des NGF est démontré in vitro en démontrant leur capacité à libérer la dose adéquate de NGF pour induire la différenciation neuronale et de promouvoir l’excroissance des cellules PC12 et neurones DRG. Les films ingénieries peuvent servir de réservoirs à long terme du NGF pour futur traitement in vivo.

Les propriétés structurales des films PSi préfabriqués ont été adaptées spécifiquement pour la charge utile de NGF ; la densité de courant du processus de gravure électrochimique a été ajustée pour obtenir la taille des pores d’environ 40 nm qui serait facilement accueillir le NGF, une protéine avec un molecular weight de 26,5 kDa32 et un diamètre caractéristique de ~ 4 nm33, au sein de la matrice poreuse. En outre, oxydation thermique de l’échafaudage poreux a été réalisée pour permettre à l’adsorption physique de NGF par attraction électrostatique de la protéine chargée positivement à la surface de PSi oxydée chargée négativement. La chimie de surface des PSi exerce un effet majeur sur l’efficacité de chargement et peut être facilement Assemblée afin de mieux maîtriser les interactions entre la charge utile et la matrice poreuse. Ces interactions dictent par la suite la structure des molécules protéiques adsorbé et leur bioactivité34,35,36. En conclusion, le système a été ajusté pour obtenir un chargement optimal de NGF en choisissant avec soin la taille des pores approprié, caractéristiques de la surface et l’idéal chargement solvant et l’effet qui en résulte des préceptes paramètres mentionnés le chargement de la protéine efficacité. Par conséquent, tout changement dans les paramètres de fabrication (par exemple, densité de courant, temps de gravure, type et concentration de dopant ou électrolyte), chimie de surface ou composition de la solution de chargement peut affecter l’efficacité de chargement et la bioactivité de la protéines chargées.

Le taux de libération d’une charge utile de l’hôte de2PSi orPSiO est généralement dicté par une combinaison de deux mécanismes simultanés, out-diffusion des molécules de charge utile et la dégradation de l' échafaudage de tr37. L’érosion et le taux de dissolution subséquente sont affectés par le site d’implantation, sa pathologie et la maladie état28,38,39. Il a été établi dans une étude antérieure, que si un taux différent est requis pour une certaine application thérapeutique, le profil de libération peut être modifié et prolongé en modifiant la chimie de surface du PSi surface38,40, 41. Diverses modifications chimiques, tels que l’oxydation thermique, thermique carbonisation et techniques hydrosilylation, auraient dû être divulguées pour stabiliser la surface lb/po2 et affectent sa dégradation et une charge utile version35,42 ,43,44,45. En outre, chargement du NGF dans les transporteurs par covalente de molécules de protéines à l’échafaud de Si par l’intermédiaire de diverses voies de la chimie de surface devrait se traduire par une version plus longue parce que la charge utile est libérée seulement lorsque les liaisons covalentes sont cassés ou le soutien Si matrice est dégradée21.

Par ailleurs, suite à son processus de fabrication, PSi peut être rendu dans différentes configurations en plus minces, comme les microparticules46, nanoparticules47 ou autoportantes membranes26, qui peuvent également être employées comme transporteurs NGF et besoins applicatifs spécifiques répondent.

Afin d’être cliniquement pertinent, le contenu de NGF au sein de l’AIFP2 transporteurs devrait atteindre l’éventail des doses thérapeutiques. Dans la méthode décrite dans le protocole, l’AIFP NGF-chargé2 transporteurs sont introduits dans un volume uniforme de 2 mL de milieux cellulaires ou de tampon PBS et par conséquent, la concentration de la solution de chargement et la masse de NGF respectif chargée ont été ajustés pour produire un libéré des concentration de NGF qui est pertinente pour le système testé in vitro . Lorsque vous utilisez cette méthode pour des systèmes différents, tels que les environnements ex vivo ou in vivo , la concentration de la NGF chargement de solution devrait être augmentée et ajustée en fonction de la dose nécessaire. Alternativement, une teneur plus élevée NGF trouvera en introduisant plusieurs transporteurs testés surfacique ou en utilisant de plus grands secteurs de l’AIFP2 échantillons.

En outre, il est à noter que, dans des points de temps plus tard le long de la période de libération, les concentrations de NGF libérées sont beaucoup plus faible que dans les moments plus tôt. Le fait que le flux de NGF n’est pas constant dans le temps doit prendre en considération lors de la conception du système selon les besoins de l’application.

Livraison de NGF nombreux systèmes ont été développés et rapportées dans la littérature, la plupart d'entre eux sont des systèmes à base de polymères, comprenant des polymères synthétiques ou naturels conjugués10,11,12,15 , 16 , 17. ces systèmes ont montré efficaces Liberation prolongee profils, toutefois, la période de libération répartie sur une période de plusieurs jours avec un effet de rupture significative. Certaines de ces plateformes de distribution souffrent de limites critiques tels que la perte de la bioactivité sur le processus d’encapsulation, nécessitant l’utilisation de différents stabilisateurs agents18,48, ainsi qu’il est sophistiqué et complexe techniques de fabrication16. Un des plus grands défis dans la conception de systèmes de livraison de protéines est la capacité de préserver la bioactivité des molécules sur la provocation policière au sein du système de transporteur. Peptides ou protéines peuvent être chargés dans PSi/AIFP2 RT ou même à des températures plus basses sans utilisation de solvants organiques solides, qui sont deux facteurs importants lors du chargement de ces biomolécules sensibles. Des études antérieures ont démontré que PSi/AIFP2 chimie de surface joue un rôle crucial dans la réduction éventuelle dénaturation des protéines chargées35,36. PSi/AIFP2 est donc un nanomatériau avantageux pour le développement des systèmes de livraison de facteurs de croissance en général et de NGF en particulier.

Les travaux en cours se concentre sur l’utilisation de cette méthode comme une nouvelle approche thérapeutique pour l’administration directe du NGF dans la SNC pour le traitement potentiel des maladies neurodégénératives. L’AIFP NGF-chargé2 transporteurs peuvent être implantés dans le cerveau de souris et l’efficacité de la plateforme comme implants à long terme est étudié in vivo. En outre, alliant cette prometteuse transporteurs non invasif biolistics49,,50 peuvent permettent d’administrer les particules de2 AIFP NGF-chargé dans une résolution très spatiale d’une zone localisée à l’aide d’un roman pneumatique pistolet capillaire pour le traitement des maladies neurodégénératives, où une administration de drogue spatio-temporelle est requise. En outre, NGF peut orienter la croissance neuronale dans une manière gradient chimique51, semblables aux molécules de guidage axonal. Ainsi, les transporteurs chargés de2 AIFP peuvent servir de points chauds attractant à NGF, à orienter la croissance, complémentaire aux autres dirigeant cues52,53. En outre, l’AIFP2transporteurs peuvent être taillés sur mesure pour soutenir la prestation de NGF pendant un laps de temps très étendu de jusqu'à plusieurs mois par le réglage supplémentaire de l’AIFP2 nanostructure et sa chimie de surface.

Disclosures

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

MS et ES reconnaissent les services de base et de soutien du camion I. Lokey centre pour les sciences de la vie et de génie et de l’appui financier de l’Institut de nanotechnologie Berrie Russell au Technion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

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Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

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