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Bioengineering

Progettazione di film di silicio poroso come elementi portanti del fattore di crescita del nervo

doi: 10.3791/58982 Published: January 25, 2019

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per progettare e fabbricare film nanostrutturati di silicio poroso (PSi) come elementi portanti degradabili per il fattore di crescita del nervo (NGF). Differenziamento neuronale e la conseguenza di PC12 cellule e topi radice dorsale neuroni gangliari (DRG) sono caratterizzati dal trattamento con i vettori di NGF-caricato PSi.

Abstract

Nonostante il grande potenziale di NGF per il trattamento di malattie neurodegenerative, la sua somministrazione terapeutica rappresenta una sfida significativa come la proteina non attraversa la barriera ematomeningea, grazie alle sue proprietà chimiche e richiede quindi a lungo termine consegna al cervello per avere un effetto biologico. Questo lavoro descrive la fabbricazione di film nanostrutturati di PSi come elementi portanti degradabili di NGF per sostenuta consegna di questa proteina sensibile. I vettori di PSi sono studiate appositamente per ottenere il caricamento ad alta efficacia e rilascio continuo di NGF per un periodo di quattro settimane, pur conservando la sua attività biologica. Il comportamento degli elementi portanti della NGF-PSi come un sistema di consegna di NGF è studiato in vitro esaminando la loro capacità di indurre il differenziamento neuronale e conseguenza delle cellule PC12 e neuroni DRG dissociati. La vitalità cellulare in presenza di vettori PSi ordinate e NGF-caricato viene valutata. La bioattività di NGF rilasciato dalle portaerei PSi viene confrontata con il trattamento convenzionale delle amministrazioni di NGF gratis ripetitive. Differenziazione delle cellule PC12 è analizzata ed è caratterizzata tramite la misura di tre differenti parametri morfologici delle cellule differenziate; (i) il numero dei neurites estrazione dal soma in lunghezza (ii) il totale dei neurites e (iii) il numero dei punti di ramificazione. Le cellule PC12 trattate con i vettori di NGF-PSi dimostrano una profonda differenziazione durante tutto il periodo di rilascio. Inoltre, le cellule neuronali coltivate con i vettori di NGF-PSi DRG mostrano un'iniziazione di vasto del neurite, simili ai neuroni trattati con amministrazioni di NGF gratis ripetitive. I vettori sintonizzabili studiati dimostrano le protesi a lungo termine per il rilascio di NGF con un potenziale terapeutico per le malattie neurodegenerative.

Introduction

NGF è essenziale per lo sviluppo e la manutenzione di neuroni nel sistema nervoso periferico (PNS)1 e svolge un ruolo cruciale nella sopravvivenza e nella funzione dei neuroni colinergici del forebrain basale nel sistema nervoso centrale (SNC)2. Suo alto potenziale farmacologico per il trattamento di malattie neurodegenerative centrale, quali Alzheimer e Parkinson, è stato ampiamente dimostrato, con studi clinici attualmente in corso3,4,5, 6. La più grande sfida nella consegna di NGF al SNC risiede nella sua incapacità di attraversare la barriera ematoencefalica (BBB), somministrati sistemicamente7. Inoltre, NGF suscettibilità alla degradazione enzimatica rapida rende la sua breve emivita e limita notevolmente il suo uso terapeutico8,9. Di conseguenza, c'è una sfida non soddisfatta per progettare sistemi di erogazione che consente un rilascio prolungato e controllato di NGF in modo sicuro. Vari sistemi di consegna di NGF, inclusi quelli a base di polimeri, sono stati studiati10,11,12,13,14,15, 16 , 17. i profili di rilascio di questi sistemi sono stati spesso caratterizzati da un distinto scoppio iniziale seguito da un rilascio lento e continuo, dove in quest'ultima fase il tasso di rilascio era notevolmente basso rispetto agli altri scoppio iniziale11 ,18,19. Inoltre, l'inattivazione della proteina da perdita di bioattività di NGF o prodotti di degradazione acida dei polimeri (ad es., acido poly(lactic-co-glycolic)) durante il processo di incapsulamento sono stati osservati con questo sistemi20.

Nanostrutturati PSi è caratterizzato da molte proprietà attraente, includendo la sua elevata area superficiale, grande volume poroso, biocompatibilità e degradabilità sintonizzabile in liquidi corporei, si predestining per un promettente droga consegna piattaforma21, 22,23,24,25,26,27,28. Corretta selezione delle sue condizioni di anodizzazione permette di regolare facilmente le proprietà strutturali (ad es., porosità e poro size) di PSi per sartoria carico di droga e rilascio cinetica21,27. Inoltre, vari percorsi chimici convenienti e consente di modificare la superficie del PSi e da quello ottimizzare ulteriormente il tasso di dissoluzione dell'impalcatura Si in condizioni fisiologiche e i tassi di rilascio del farmaco22,24, 29,30.

Questo lavoro si concentra sulla progettazione di un sistema di consegna basato su PSi per prolungato rilascio controllato di NGF. L'effetto degli elementi portanti della NGF-PSi sul differenziamento neuronale e la conseguenza è esaminato usando cellule PC12 e dissociato neuroni DRG. Dimostriamo che il NGF caricato ha conservato la sua bioattività inducendo la conseguenza del neurite e profonda differenziazione durante un periodo di 1 mese di rilascio all'interno di una singola somministrazione.

Protocol

Tutti i metodi sono stati approvati dal comitato di etica dell'Università Bar Ilan.

1. fabbricazione di elementi portanti ossidati PSi (PSiO2)

  1. Tagliare un wafer di Si (singolo lato lucido sul viso < 100 > e pesantemente drogato con boro, p-tipo, mΩ·cm 0,95) in campioni di 1,5 cm × 1,5 cm utilizzando una penna a punta di diamante.
  2. Ossidare i campioni Si in un forno tubolare a 400 ° C per 2 h nell'aria ambiente (velocità di riscaldamento: 25 ° C/min, raffreddamento naturale).
  3. Immergere i campioni Si in una soluzione acquosa dell'acido fluoridrico (HF) (48%), ddH2O di etanolo (99.9%) (1:1:3 v/v/v) per 5 min; quindi sciacquare i campioni con etanolo tre volte e asciugare sotto un flusso di azoto.
    Nota: Preparare e conservare la soluzione di HF in plasticware solo, come vetro dissolve HF.
    Attenzione: HF è un liquido altamente corrosivo e deve essere maneggiata con estrema attenzione. In caso di esposizione, sciacquare abbondantemente con acqua e trattare la zona interessata con gel di antidoto HF; cercare immediatamente assistenza medica.
  4. Montare il campione Si in una cella di acquaforte di politetrafluoroetilene, utilizzando una striscia di carta stagnola come un back-contact e una spiralina di platino come il controelettrodo.
  5. Etch uno strato sacrificale in una soluzione di 3:1 (v/v) di HF acquosa ed etanolo (99.9%) per 30 s a una densità di corrente costante di 250 mA/cm2; quindi sciacquare la superficie del PSi risultante della pellicola con etanolo tre volte e asciugare sotto un flusso di azoto.
  6. Sciogliere lo strato poroso appena inciso in una soluzione acquosa di NaOH (0,1 M) per 2 min. Poi sciacquare con etanolo tre volte e asciugare sotto un flusso di azoto.
  7. Immergere il campione in una soluzione acquosa HF (48%), ddH2O ed etanolo (99.9%) (1:1:3 v/v) per 2 min. Poi sciacquare con etanolo tre volte e asciugare sotto un flusso di azoto.
  8. Elettrochimicamente etch il campione Si in una soluzione di 3:1 (v/v) di HF acquosa ed etanolo (99.9%) per 20 s a una densità di corrente costante di 250 mA/cm2; quindi sciacquare la superficie del PSi risultante della pellicola con etanolo tre volte e asciugare sotto un flusso di azoto.
  9. Termicamente ossidare i campioni di PSi appena inciso in un forno tubolare a 800 ° C per 1 h nell'aria ambiente (velocità di riscaldamento: 25 ° C/min, raffreddamento naturale) per formare una porosa impalcatura di SiO2 (PSiO2).
  10. Campioni di spin-cappotto il PSiO2 con un positivo photoresist spessa a 4.000 giri/min per 1 min; poi cuocere i campioni verniciati a 90 ° C per 2 min (velocità di riscaldamento: 5 ° C/min, raffreddamento naturale).
  11. Dice i PSiO2 campioni in campioni di 8 × 8 mm utilizzando una sega a dadini.
  12. Per rimuovere il photoresist, immergere i campioni a dadini in acetone per 3h; quindi sciacquare abbondantemente con etanolo e asciugare sotto un flusso di azoto.

2. caricamento PSiO2 con NGF

  1. Per preparare il soluzione di caricamento di NGF, sciogliere 20 µ g di β-NGF murino in 400 µ l di soluzione di 1:1 (v/v) di 0,01 M tampone fosfato salino (PBS) e ddH2O.
  2. Aggiungere 52 µ l della soluzione di caricamento in cima il PSiO2 campione e incubare per 2 ore a RT in un piatto con un massimo di.
    Nota: Mantenere alta umidità nel piatto per evitare il prosciugamento della soluzione durante l'incubazione.
  3. Raccogliere la soluzione sulla parte superiore il campione per la successiva quantificazione del contenuto di NGF entro il PSiO2 vettore.
    Nota: Caricamento di NGF nel PSiO2 deve essere eseguito immediatamente prima dell'uso, il protocollo non può essere messo in pausa qui dovuto il rischio di essiccazione e denaturazione della proteina.

3. quantificazione del carico di NGF da NGF ELISA

  1. Per preparare la piastra ELISA, aggiungere 100 µ l di anticorpo di cattura (coniglio anti-hβ-NGF) di 0,5 µ g/mL per ogni bene, sigillare la piastra e incubare per una notte a TA.
  2. Aspirare i pozzetti per rimuovere liquido e lavare la piastra quattro volte con 300 µ l di tampone di lavaggio (0.05% Tween-20 in PBS) per pozzetto; dopo l'ultimo lavaggio, capovolgere la piastra per rimuovere il tampone residuo e asciugare su carta assorbente.
  3. Aggiungere 300 µ l di tampone di blocco (1% albumina di siero bovino (BSA) in PBS) ad ogni pozzetto e incubare per almeno 1 h a TA. Poi aspirare e lavare la piastra quattro volte come descritto al punto 3.2.
  4. Per preparare una curva di taratura, diluire la soluzione di caricamento di NGF (Vedi punto 2.1) nel diluente (0.05% Tween-20, 0.1% BSA in PBS) a 1 ng/mL. Quindi eseguire 2 volte diluizioni seriali da 1 ng/mL a zero per ottenere gli esempi di curva di calibrazione.
  5. Per preparare i campioni, diluire la soluzione di caricamento di NGF (dal punto 2.1) e la soluzione di post-caricamento raccolta (dal punto 2.3) in diluente 1: 100.000 e 1: 10.000, rispettivamente, per raggiungere la gamma di concentrazioni del kit ELISA in uso (16-1.000 pg/mL).
  6. Aggiungere 100 µ l dei campioni diluiti e curva di taratura campioni a ciascuno in triplice copia ed incubare a temperatura ambiente per 2 h; poi aspirare e lavare la piastra quattro volte come descritto al punto 3.2.
  7. Aggiungere 100 µ l di anticorpo di rilevazione 1 µ g/mL (biotinylated coniglio anti-hβ-NGF) ad ogni pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 2 h. Poi aspirare e lavare la piastra quattro volte come descritto al punto 3.2.
  8. Diluire 1:2,000 avidina-rafano perossidasi (HRP) in diluente, aggiungere 100 µ l per pozzetto e incubare per 30 minuti a TA. Ora aspirare e lavare la piastra quattro volte come descritto al punto 3.2.
  9. Aggiungere 100 µ l di soluzione substrato in ogni pozzetto e incubare per 25 minuti a RT per lo sviluppo del colore. Misurare l'assorbanza a 405 nm con correzione di lunghezza d'onda insieme a 650 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
  10. Determinare la concentrazione di NGF in sia la soluzione di caricamento e la soluzione di post-caricamento raccolto basato sulla curva di calibrazione.
  11. Per calcolare la massa di NGF caricata all'interno di2 PSiO, sottrarre massa NGF nella soluzione di post-caricamento raccolto dalla massa NGF di caricamento della soluzione. L'efficacia di caricamento di NGF è calcolata con la seguente equazione:
    Equation

4. il rilascio in vitro NGF da PSiO2

  1. Incubare i NGF-caricato PSiO2 vettori in 2 mL di PBS 0,01 M contenente 1% (p/v) BSA e sodio azide 0,02% (p/v) a 37 ° C e sotto agitazione orbitale di 100 giri/min.
  2. Ogni 2 giorni raccogliere la soluzione e sostituirlo con 2 mL di PBS fresco. Congelare i campioni raccolti rilascio in azoto liquido e conservare a-20 ° C per ulteriori analisi.
  3. Utilizzare il metodo di NGF ELISA disponibile in commercio per quantificare il contenuto di NGF nei campioni del rilascio come descritto ai punti 3.1-3.9.
    Nota: Quando la preparazione dei campioni di rilascio per la quantificazione di ELISA, varie diluizioni devono essere eseguite per intervalli di tempo differenti lungo il periodo di rilascio (vale a dire, tempo precedente punti devono essere diluiti molto di più intervalli di tempo successivi). Inoltre, per ogni campione di rilascio, almeno due diluizioni diverse dovrebbero essere eseguite e quantificati per garantire raggiungendo l'intervallo di concentrazioni del kit ELISA.
  4. Determinare la concentrazione di NGF nei campioni rilascio basato sulla curva di calibrazione e tracciare un grafico di accumulativo rilascio di NGF nel corso del tempo.

5. quantificazione di in vitro Si erosione di Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectroscopy (ICP-AES)

  1. Diluire 1 mL di rilascio campioni 01:10 nel buffer di uscita (0.01 M PBS contenente BSA 1% (p/v) e 0.02% (p/v) di sodio azide) per un volume totale di 10 mL.
  2. Monitor Si picchi di emissione atomica a 212,4, 251.6 e 288,2 nm per i campioni diluiti.
  3. Determinare la concentrazione Si nei campioni basato su una curva di calibrazione.
  4. Per stabilire il profilo di degradazione Si, esprimere Si contenuto in ogni punto del tempo come una percentuale del contenuto totale di Si dei vettori (cioè, il contenuto Si cumulativo lungo il periodo di rilascio).
    Nota: Per garantire la quantificazione accurata del contenuto Si totale degli elementi portanti, rilascio campioni sono campionate 1 mese che segue il punto finale del rilascio studiare e analizzati per concentrazione Si mediante ICP-AES. Sommando il contenuto Si cumulativo lungo il periodo di rilascio e il contenuto di Si nei campioni post-rilascio fornisce il 100% del contenuto di Si.

6. cellula vitalità e la crescita in presenza di NGF-caricato Psio2 vettori

  1. Coltura delle cellule di ratto feocromocitoma (PC12)
    1. Preparare il supporto di crescita di base con l'aggiunta di 10% di siero equino (HS), 5% siero bovino fetale (FBS), 1% L-Glutammina, streptomicina penicillina 1% e 0,2% anfotericina per mezzo di Roselle Park Medical Institute (RPMI).
    2. Preparare il supporto di differenziazione con l'aggiunta di 1% HS, 1% L-Glutammina, penicillina 1% streptomicina e anfotericina 0,2% a medium RPMI.
    3. Crescere la sospensione cellulare (106 cellule) in un matraccio di cultura2 75 cm con 10 mL di medium di crescita di base per 8 giorni; ogni 2 giorni aggiungere 10 mL di terreno di crescita di base al pallone.
    4. Per generare la coltura delle cellule PC12 differenziata, trasferire la sospensione cellulare in una provetta per centrifuga; Centrifugare le cellule per 8 min a 200 x g e RT. scartare il surnatante.
    5. Sospendere le cellule in 5 mL di terreno di crescita di base fresca e ri-Centrifugare le cellule per 5 min a 200 x g e RT; eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 3 mL di terreno di crescita di base.
    6. Per separare gruppi di cellule, aspirare le cellule dieci volte usando una siringa di 23 G.
    7. Contare le celle utilizzando un contatore di cellule emocitometro e 104 area di lavoro di2 cellule/cm su piastre di collagene tipo l rivestito in presenza di mezzo di differenziazione del seme.
    8. Dopo 24 h, aggiungere β-NGF murino fresco (50 ng/mL) o vettore PSiO2 NGF-caricato per piastra.
      Nota: Le più alte concentrazioni di NGF (> 50 ng/mL) possiedono l'effetto esattamente come la concentrazione specificata.
    9. Rinnovare il mezzo di differenziazione ogni 2 giorni.
    10. Per valutare la vitalità cellulare, aggiungere il 10% (v/v) della soluzione di indicatore di redditività (basato su resazurin) intervalli di tempo rappresentativo e incubare per 5 h a 37 ° C; misurare l'assorbanza a 490 nm utilizzando uno spettrofotometro.
  2. Coltura cellulare di topi radice dorsale (DRG) i gangli
    1. Per isolare DRGs da due 7-settimana-vecchi topi C57bl, prima di bagnare i topi con etanolo al 70% e fare un'incisione per rimuovere la pelle.
    2. Tagliare la base del cranio e muscoli della parete addominale fino al midollo spinale è esposto.
    3. Rimuovere la colonna vertebrale facendo un taglio al livello dei femori e pulire i tessuti circostanti.
    4. Tagliare la colonna in tre pezzi; quindi tagliare ogni pezzo nel midline per generare due metà e sbucciare fuori il midollo spinale.
    5. Sotto il binocolo, estrarre tutti i gangli DRG e immergerli in soluzione salina bilanciata di Hank un freddo (HBSS).
    6. Pulire i tessuti connettivi circostanti di struggimento DRGs su una piastra di Petri e rimuovere delicatamente i residue meningi sotto il binocolo.
    7. Dissociare le cellule di DRG incubando per 20 min a 1.000 U di papaina.
    8. Centrifugare le cellule per 4 min a 400 x g. Scartare il surnatante e tenere il pellet cellulare.
    9. Risospendere il pellet in una soluzione di dispase-II di collagenasi e 12 mg/mL 10 mg/mL e incubare per 20 min a 37 ° C.
    10. Centrifugare le cellule per 2 min a 400 x g; scartare il surnatante e tenere il pellet cellulare.
    11. Triturare il pellet cellulare in 1 mL di HBSS, glucosio di 10 mM e 5 mM HEPES (pH 7,35) da ripetute passaggio attraverso una pipetta di Pasteur ristretta.
    12. Aggiungere delicatamente le cellule dissociate per mezzo di L-15 contenente 20% di base di silice colloidale medium per separazione cellulare di centrifugazione in gradiente di densità; Centrifugare per 8 min 1.000 x g. Aspirare il supernatante e tenere il pellet cellulare.
      Nota: Lo scopo di questo passaggio è per separare e purificare le cellule di un neurone da detriti assonale, cellule di Schwann e fibroblasti.
    13. Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di terreno di F-12; Centrifugare per 2 min 1.000 x g; eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno di F-12.
    14. Contare le celle e celle seme 2 × 104 poli-L-lisina e laminin rivestito vetro inferiore 35 mm piastre di coltura, in un F-12 privo di antibiotico supplementato con 10% FBS.
      Nota: Inizialmente, seme le cellule in un piccolo volume del mezzo (150-200 µ l); dopo 2 h di incubazione a 37 ° C, aggiungere il terreno per un volume finale di 2 mL.
    15. Aggiungere delicatamente il NGF-caricato PSiO2 vettore o fresco β-NGF murino (50 ng/mL) per ciascuna piastra.
    16. Dopo 2 giorni, difficoltà di coltura delle cellule incubando con una soluzione di paraformaldeide (PFA) 4% per 15 min a RT; immunostain la coltura cellulare utilizzando un comune immunofluorescenza che macchia procedura31.
    17. Immagine la cultura di un neurone delle cellule usando un microscopio confocale.

7. cellula differenziazione analisi

  1. Percentuale di differenziazione di cellule PC12 in presenza di NGF-caricato PSiO2 vettori
    1. Incubare i NGF-caricato PSiO2 vettori in 2 mL di mezzo di differenziazione, in un incubatore a 37 ° C, contenente 5% CO2.
    2. Ogni 2 giorni, raccogliere la soluzione e sostituirlo con 2 mL di terreno nuovo. Congelare i campioni raccolti rilascio in azoto liquido e conservare a-20 ° C per ulteriori analisi.
    3. Cellule PC12 seme in 12-pozzetti piastre rivestite con collagene come indicato al punto 4.1 (4.1.3-4.1.6).
    4. Dopo 24 h, introdurre i campioni di rilascio di punti di tempo rappresentativo (dalla sezione 5.1.2) nei diversi pozzetti; per pozzetti di controllo, aggiungere β-NGF murino fresco (50 ng/mL).
    5. Dopo 24 h, immagine le celle utilizzando un microscopio ottico.
    6. Per determinare la percentuale delle cellule del neurite-cuscinetto, manualmente contare le celle che avevano superato i neurites rispetto al numero totale delle cellule nelle immagini (n = 5 fotogrammi per ciascun pozzetto); tracciare un grafico della percentuale di cellule PC12 con neuriti nel corso del tempo.
      Nota: Cellule PC12 indifferenziato è sembrato hanno arrotondato struttura senza neurites, mentre cellule differenziate possono essere identificate di conseguenza dei neurites (almeno uno di lunghezza minima uguale al diametro di soma della cellula) o cambiamenti morfologici.
  2. Analisi morfometrica delle cellule PC12 differenziate
    1. Per l'analisi di elaborazione immagine, acquisire immagini di fase delle cellule coltivate fino a 3 giorni dopo il trattamento con NGF (reagente libero o come il prodotto di release degli elementi portanti2 PSiO NGF-caricato).
      Nota: Intervalli di tempo successivi (oltre 5 giorno) le cellule si sviluppano reti altamente complesse, impedendo le misure morfometriche ad una risoluzione di singola cellula.
    2. Scarica il programma di elaborazione di immagine NeuronJ, un ImageJ plug-in, che permette l'analisi semiautomatica del neurite e lunghezza di misura.
    3. Convertire il file di immagine in un formato a 8 bit e pixel di misura al rapporto di micrometro utilizzando la barra della Scala immagine.
    4. Imposta la scala utilizzando l' utilità Analyze | Comando Imposta scala e misura la lunghezza di ogni neurite.
    5. Manuale di contare il numero di punti di ramificazione e il numero dei neurites che provengono da ogni soma di cella.
      Nota: Una lunghezza media del neurite 1 giorno dopo il trattamento di NGF è circa 30 µm. Le lunghezze misurate del neurite possono essere ampiamente distribuite.

Representative Results

Ossidato film PSi sono fabbricati come descritto nel protocollo. La cialda Si è sottoposto ad acquaforte elettrochimica per 20 s a 250 mA/cm2 (Figura 1ai), seguita da ossidazione termica a 800 ° C (Figura 1aii) per produrre un'impalcatura di2 PSiO. Ad alta risoluzione di microscopia elettronica a scansione (HR-SEM) immagini del film2 PSiO risultante sono indicate in Figura 1bc. Microfotografia di vista dall'alto del film (Figura 1b) raffigura la sua natura altamente poroso con pori di circa 40 nm di diametro. Micrografo della sezione trasversale di una pellicola spaccata (Figura 1C) rivela uno spessore di strato poroso di 2.9 µm, caratterizzata da pori cilindrici di interconnessione.

PSiO2 film sono caricati con il soluzione di caricamento, come illustrato nella Figura 1aiiidi NGF. Caricamento di NGF è quantificato utilizzando NGF ELISA misurando le concentrazioni di NGF nella soluzione di caricamento, prima e dopo l'incubazione con il PSiO2 film. La massa media del NGF caricato ogni PSiO2 film è determinata come 2,8 ± 0,2 µ g, che corrisponde ad un carico elevata efficacia del 90% (w/w) (dati non mostrati31). Al fine di stabilire il profilo di rilascio di NGF da parte dei vettori PSiO2 , i film caricati sono incubati in PBS a 37 ° C e aliquote ogni 2 giorni vengono campionate per la quantificazione della concentrazione proteica rilasciato usando ELISA di NGF. Inoltre, il contenuto di Si nei campioni del rilascio è quantificato mediante ICP-AES e la cinetica di erosione Si degli elementi portanti2 PSiO è stabilita. Figura 2 descrive il rilascio di NGF e i relativi profili di degradazione Si dei vettori porosi. Un rilascio prolungato di NGF, senza effetto di scoppio, è raggiunto per un periodo di 1 mese. Rilascio di NGF nella prima settimana è più veloce (pendenza = 0.442) rispetto ad un rilascio molto più lento nei giorni successivi lungo il periodo di rilascio (pendenza 0,043). Dovrebbe essere notato che durante tutto il periodo di rilascio 1 mese intero, la quantità di NGF rilasciato è sufficiente per indurre la profonda differenziazione delle cellule PC12, come sarà discusso più tardi. Il NGF accumulativo rilasciato si trova ad per essere in una buona correlazione (R2 = 0,971) con il restante Si contenuto, come mostrato nella rientranza della Figura 2.

Successivamente, la bioattività dei vettori2 PSiO NGF-caricato è caratterizzato in vitro, le cellule PC12 e neuroni DRG sono usati come modelli per escrescenza e differenziamento neuronale. Cellule PC12 e neuroni DRG dissociati sono seminati come descritto nel protocollo. In primo luogo, viene esaminato attuabilità delle cellule in presenza di elementi portanti2 PSiO incubando le cellule con accurato (non caricato) o NGF-caricato PSiO2; placche di comando e le cellule trattate con ordinata PSiO2 sono completate con NGF gratuito ogni 2 giorni. Nessuna citotossicità è osservata sopra l'esposizione delle cellule a puro o caricato NGF PSiO2 vettori (Figura 3a), dimostrando che PSiO2 è biocompatibile con questa linea cellulare. Figura 3b Mostra rappresentative micrografi di HR-SEM delle cellule PC12 trattate con i vettori di2 PSiO NGF-caricato. La caratteristica di Estratto di celle osservate i neurites e forma ramificata reti neuronali. Risultati simili si ottengono quando semina dissociato cellule di un neurone di DRG in presenza di NGF-caricato PSiO2 vettori. Immagini confocal di cellule di DRG immunostained coltivate con i vettori di2 PSiO NGF-caricato (Figura 3e) mostrano un'estesa del neurite iniziazione e allungamento, simile al controllo positivo (cioè, neuroni completati con libero NGF, vedere figura 3d), mentre il negativo di controllo (cioè, neuroni non trattati, Vedi Figura 3C), esibisce un povero limite di neuriti.

Per valutare la percentuale di differenziazione di cellule PC12 in presenza di NGF rilasciato dagli elementi portanti2 PSiO, differenziazione è quantificata contando le cellule con la conseguenza del neurite fuori la popolazione totale delle cellule. Figura 4 riepiloga i risultati in termini di percentuale di cellule differenziate in diversi momenti nel corso di un periodo di 26 giorni. I valori in percentuale significativa differenziazione sono raggiunti per tutta la durata ha studiata. In particolare, dopo 26 giorni, il NGF liberato ha indotto la differenziazione di oltre il 50%, una percentuale di differenziazione che è significativamente più alto rispetto agli studi precedenti con vettori polimerici16. Questi risultati indicano che l'allettamento di NGF all'interno dell'host poroso conservato l'attività biologica della proteina per l'induzione della differenziazione profonda per un periodo di ~ 1 mese.

Per più ulteriormente esaminare l'effetto di NGF-PSiO2 vettori sul differenziamento neuronale, tre parametri morfologici caratteristici delle cellule PC12 differenziate sono misurati a livello di singola cellula: (i) il numero di neuriti estrazione dal soma ( II) degli il totale neurites lunghezza e (iii) il numero dei punti di ramificazione. Le cellule vengono trattate con NGF-caricato PSiO2 vettori o con ripetitiva somministrazione di NGF gratuito (ogni 2 giorni), come un controllo. Figura 5a -c riporta l'analisi morfometrica della popolazione cellulare ai giorni 1 e 3. Le cellule PC12 trattate con il NGF-caricato PSiO2 mostrano valori morfometrici che sono simili per il trattamento di controllo per tutti i tre parametri testati. Dopo 3 giorni, i valori di tutti i parametri morfologici sono osservati per aumentare allo stesso tasso per i vettori di2 PSiO NGF-caricato e il trattamento di controllo dell'amministrazione ripetitive di NGF gratis.

Figure 1
Figura 1: Fabbricazione di PSiO2 film. (a) schema di montaggio degli elementi portanti2 PSiO: wafer (i) silicio viene sottoposto ad acquaforte elettrochimica per 20 s a 250 mA/cm2, seguita da ossidazione termica (ii) a 800 ° C per produrre un'impalcatura di2 PSiO e (iii) NGF caricamento di adsorbimento fisico (schemi non vengono disegnati in scala). (b-c) Vista dall'alto e sezione trasversale micrografi di un caratteristico PSiO2 film. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Rilascio di NGF e profili di erosione Si di NGF-caricato PSiO2 vettori. L'entità della degradazione dei vettori2 PSiO è presentato come la frazione del restante contenuto Si in ogni punto del tempo fuori il contenuto totale di Si del film poroso. L'inserto Mostra la correlazione tra il NGF accumulativo rilasciato e restanti Si contenuto. Errore barre rappresentano SD, n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: La vitalità cellulare e la crescita in presenza di NGF-caricato PSiO2 vettori. (a) In vitro caratterizzazione di citotossicità. La vitalità di cellule PC12 è misurata su 1, 3 e 7 giorni che seguono la loro esposizione ordinata (non caricato) PSiO2 vettori, NGF-caricato PSiO2 vettori o gratuito NGF (ng/50ml ogni 2 giorni, placche di comando). (b) i micrografi elettronici delle cellule PC12 coltivate con NGF-caricato PSiO2 vettori per 9 giorni. Pannello di sinistra: uno zoom-in, raffigurante la conseguenza del neurite dal soma cellulare; Pannello di destra: uno zoom-out, che indica la rete neuronale altamente complessa formata. (c-e) Immagini di microscopia confocal di immunostained DRG neuronale cella cultura (2 giorni dopo la semina): (c) non trattato le cellule; (d) cellule completate con gratis NGF (50 ng/mL); (e), NGF-PSiO2 vettori. Macchiatura immunofluorescente del neurofilamento H permette l'imaging del soma della cellula e i neurites numero. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: cellule PC12 valori percentuali di differenziazione sopra l'esposizione di NGF rilasciato da NGF-caricato PSiO2 vettori in punti rappresentativi tempo. Percentuale di differenziazione è espressa come il numero delle cellule con la conseguenza del neurite fuori la popolazione totale delle cellule. Trattamento di controllo si riferisce a cellule completate con NGF gratis (50 ng/mL). Immagini di microscopia chiara rappresentativo delle cellule in diversi momenti sono rappresentati lungo l'asse x; barra della scala = 25 µm per micrografie di giorni 2, 8, 14, 26 e 50 µm per microfotografia di controllo. Errore barre rappresentano SD, n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: analisi morfometrica delle cellule PC12 differenziate. Tre parametri morfologici delle cellule PC12 differenziate sono misurati, a livello di singola cellula, al giorno gratis 1 e 3 dopo l'esposizione a NGF-caricato PSiO2 vettori o ripetitiva somministrazione di NGF ogni 2 giorni (controllo); numero di lunghezza (b) dei (a) totale neurites neurites estrarre dalla cella soma e (c) numero dei punti di ramificazione. Errore barre rappresentano SD, n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Film nanostrutturati degradabile PSiO2 sono fabbricati e utilizzati come elementi portanti per NGF, consentendo per il suo rilascio continuo e prolungato, pur mantenendo la sua attività biologica. Il potenziale del PSiO2 per servire come un sistema di consegna per NGF è dimostrato in vitro dimostrando la loro capacità di rilasciare dosaggio di NGF sufficiente per indurre la differenziazione neuronale e promuovere la conseguenza delle cellule PC12 e neuroni di DRG. I derivati dal film utilizzabile come serbatoi a lungo termine di NGF per futuro trattamento in vivo.

Le proprietà strutturali dei fabbricati film PSi erano studiate specificamente per i payload di NGF; la densità di corrente del processo elettrochimico acquaforte è stata regolata per ottenere la dimensione dei pori di circa 40 nm che sarebbe facilmente ospitare il NGF, una proteina con un molecular weight di 26,5 kDa32 e un diametro caratteristico di ~ 4 nm33, all'interno della matrice porosa. Inoltre, ossidazione termica dello scaffold porosi avveniva per abilitare adsorbimento fisico di NGF per attrazione elettrostatica della proteina positivamente alla superficie caricata negativamente ossidata PSi. La chimica di superficie di PSi esercita un effetto importante sull'efficacia di caricamento e può essere facilmente regolata al fine di controllare meglio le interazioni tra il payload e la matrice porosa. Successivamente, queste interazioni dettano la struttura delle molecole adsorbite proteine e loro bioattività34,35,36. In conclusione, il sistema è stato adeguato per ottenere un carico ottimale di NGF selezionando attentamente la dimensione dei pori appropriato, caratteristiche della superficie e l'ideale caricamento solvente e l'effetto risultante dei dettami parametri descritti il caricamento di proteina efficacia. Pertanto, qualsiasi cambiamento nei parametri di fabbricazione(ad esempio, densità di corrente, tempo di attacco, tipo e concentrazione del drogante o elettrolito), chimica delle superfici o la composizione della soluzione di caricamento può influenzare l'efficacia di caricamento e la bioattività della proteina caricata.

Il tasso di rilascio di un payload dall'host2PSi orPSiO generalmente è dettato da una combinazione di due meccanismi di simultanee, out-diffusione delle molecole payload e il degrado del patibolo Si37. L'erosione e la velocità di dissoluzione successiva sono interessati dal sito di impianto, sua patologia e malattia stato28,38,39. È stato stabilito nel precedente lavoro che se un tasso di rilascio diverse è necessario per una determinata applicazione terapeutica, il profilo di rilascio può essere modificato e prolungato modificando la chimica di superficie del PSi superficie38,40, 41. Varie modifiche chimiche, quali l'ossidazione termica, termica carbonizzazione e idrosililazione tecniche, sono state indicate per stabilizzare la superficie di PSi e influenzare la sua degradazione e conseguente carico utile rilascio35,42 ,43,44,45. Inoltre, caricamento del NGF in elementi portanti di legame covalente delle molecole della proteina al patibolo Si attraverso varie vie di chimica di superficie dovrebbe provocare un rilascio più prolungato perché il payload viene rilasciato solo quando i legami covalenti sono rotti o la sostegno Si matrix è degradato21.

Inoltre, seguendo il suo processo di fabbricazione, PSi può essere reso in varie configurazioni oltre a film sottile, come ad esempio microparticelle46, nanoparticelle47 o freestanding membrane26, che può essere impiegato anche come elementi portanti per NGF e soddisfare specifiche esigenze applicative.

Al fine di essere clinicamente rilevanti, il contenuto di NGF entro i PSiO2 vettori dovrebbe raggiungere l'intervallo delle dosi terapeutiche. Nel metodo descritto nel protocollo, i NGF-caricato PSiO2 vettori sono introdotti in un consistente volume di 2 mL di media delle cellule o tampone PBS e, quindi, la concentrazione della soluzione caricamento e la massa di NGF rispettiva caricata erano regolati per produrre un rilasciato la concentrazione di NGF che è rilevante per il sistema testato in vitro . Quando si utilizza questo metodo per i diversi sistemi, come ad esempio ambienti ex vivo o in vivo , la concentrazione di NGF soluzione di caricamento dovrebbe essere aumentata e regolata secondo la dose necessaria. In alternativa, più alto contenuto di NGF può essere ottenuto introducendo elementi portanti multipli per testata di superficie o utilizzando più grandi zone di PSiO2 campioni.

Inoltre, si deve osservare che in punti successivi di tempo lungo il periodo di rilascio, le concentrazioni di NGF liberate sono molto inferiori rispetto ai precedenti punti di tempo. Il fatto che il flusso di NGF non è costante nel tempo deve tener conto quando si progetta il sistema secondo le esigenze applicative.

Consegna di NGF numerosi sistemi sono stati sviluppati e riportati in letteratura, la maggior parte di loro sono sistemi a base di polimeri, composto di polimeri sintetici o naturali coniugati10,11,12,15 , 16 , 17. questi sistemi hanno dimostrato efficaci profili di rilascio prolungato, tuttavia, il periodo di rilascio ha misurato su un periodo di diversi giorni con un effetto di scoppio significativo. Alcune di queste piattaforme di distribuzione soffrono di limiti critici come perdita di bioattività sul processo di incapsulamento, che richiedono l'utilizzo di diversi stabilizzante agenti18,48, nonché sofisticate e complesse tecniche di fabbricazione16. Una delle più grandi sfide nella progettazione di sistemi di consegna per le proteine è la capacità di conservare la bioattività delle molecole all'allettamento all'interno il sistema di trasporto. Proteine o peptidi possono essere caricati in PSi/PSiO2 a RT o anche a temperature inferiori senza uso di solventi organici forti, che sono entrambi fattori importanti durante il caricamento di queste biomolecole sensibili. Gli studi precedenti hanno dimostrato che la chimica di superficie2 PSi/PSiO svolge un ruolo cruciale nel ridurre al minimo possibile denaturazione delle proteine caricato35,36. Di conseguenza, PSi/PSiO2 è un nanomateriale vantaggiosa per lo sviluppo di sistemi di consegna per i fattori di crescita in generale e di NGF in particolare.

Il lavoro attuale si concentra su come utilizzare questo metodo come nuovo approccio terapeutico per la somministrazione diretta di NGF nello SNC per il trattamento potenziale di malattie neurodegenerative. I vettori di2 PSiO NGF-caricato possono essere impiantati nel cervello di topi e l'efficacia della piattaforma come impianti a lungo termine è studiato in vivo. Inoltre, combinando questo promettente vettori con non-invasiva biolistics49,50 può abilitare uno amministrare le particelle di2 PSiO NGF-caricato in una risoluzione spaziale molto a una zona localizzata utilizzando un romanzo pneumatico pistola capillare per il trattamento di patologie neurodegenerative, dove è necessaria una somministrazione di farmaco spatiotemporal. Inoltre, NGF può dirigere la crescita neuronale in un modo gradienti chimici51, simili alle molecole di orientamento dell'assone. Così, i vettori di2 PSiO caricati possono servire come attractant hot spot di NGF, per dirigere la crescita, complementare ad altri regia spunti52,53. Inoltre, i vettori di2PSiO possono essere adattati specificamente per sostenere la consegna di NGF per un periodo di tempo molto esteso fino a diversi mesi di ulteriore ottimizzazione PSiO2 nanostruttura e sua chimica di superficie.

Disclosures

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

MS ed ES riconosce i servizi di base e supporto dal centro di Dario I. autocarro per scienze naturali e ingegneria e il sostegno finanziario dell'Istituto di nanotecnologia Berrie Russell al Technion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

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Progettazione di film di silicio poroso come elementi portanti del fattore di crescita del nervo
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Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).More

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

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