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Bioengineering

신경 성장 인자의 사업자로 서 다공성 실리콘 필름을 디자인

doi: 10.3791/58982 Published: January 25, 2019

Summary

여기, 우리 디자인 하 고 신경 성장 인자 (NGF)에 대 한 분해 운반대로 nanostructured 다공성 실리콘 (PSi) 영화를 조작 프로토콜 제시. 신경 감 별 법 및 PC12 세포 및 마우스 지 루트 신경 절 (DRG) 뉴런의 파생물은 NGF 로드 PSi 사업자와 치료 시 특징 이다.

Abstract

신경 퇴행 성 질환 치료를 위한 NGF의 위대한 잠재력에 불구 하 고 치료 관리 단백질 때문에 화학 속성, 혈액-뇌 장벽, 교차 하지 않는 중요 한 도전을 대표 하며 따라서 장기 생물 학적 효과를 뇌에 배달 합니다. 이 일이 중요 한 단백질의 지속적인 배달 NGF의 분해성 운반대로 nanostructured PSi 영화의 제작을 설명합니다. PSi 사업자는 특히 그것의 생물 학적 활동을 유지 하면서 4 주 동안 높은 로드 효능과 NGF의 지속적인 출시를 맞게 됩니다. NGF 배달 시스템으로 NGF PSi 사업자의 동작은 신경 감 별 법 및 PC12 세포와 해리 DRG 뉴런의 파생물을 유도 하는 그들의 기능을 검사 하 여 조사 생체 외에서 입니다. 단정 하 고 NGF 로드 PSi 사업자의 세포 생존 능력 평가 됩니다. PSi 통신사에서 출시 NGF의 bioactivity 반복적인 무료 NGF 행정부의 기존의 치료와 비교 됩니다. PC12 세포 분화를 분석 하 고 차별화 된 셀;의 세 가지 다른 형태학 매개 변수 측정에 의해 특징 (i) (ii) 총 neurites' 길이 및 (iii) 분기 점의 수는 소마에서 추출 neurites의 수입니다. PC12 세포 NGF PSi 사업자로 치료 릴리스 기간 동안 깊은 차별화를 보여 줍니다. 또한, DRG 신경 세포 NGF PSi 사업자와 교양 반복적인 무료 NGF 행정부와 비슷한 신경 치료는 광범위 한 neurite 개시 표시. 공부 가변 운반대는 장기 임 플 란 트 NGF 릴리스에 대 한 신경 퇴행 성 질환에 대 한 치료 가능성을 보여 줍니다.

Introduction

NGF의 개발 및 말 초 신 경계 (PNS)1 에서 뉴런의 유지 보수에 대 한 필수적 이며 중앙 신경 시스템 (CNS)2에서 생존 및 기저 개 해 신경의 기능에 중요 한 역할. 중앙 신경 퇴행 성 질환, 알츠하이머병, 파 킨 슨 병, 등 치료에 대 한 높은 약리 잠재력 널리 입증 되었습니다, 진행3,,45, 현재 임상 시험으로 6. CNS에 NGF의 전달에 가장 큰 도전 (BBB), 체계적으로 관리 될 때7혈액 두뇌 방 벽을 교차 하는 그것의 무 능력에 있는. 또한, NGF 민감성 급격 한 효소 저하에 그것의 짧은 반감기를 렌더링 하 고 크게 제한 하는 그것의 치료 사용8,9. 따라서, NGF의 연장과 제어 릴리스 안전한 방식으로 허용 하는 전달 시스템을 설계 하는 충족 되지 도전이 이다. 폴리머 기반 시스템을 포함 한 다양 한 NGF 전달 시스템 되었습니다 공부10,11,12,13,,1415, 16 , 17. 이러한 시스템의 릴리스 프로필 종종 별개 초기 버스트 어디 후자 단계에서 릴리스 율은 초기 버스트11 에 비해 크게 낮은 느린 연속 방출 다음 특징 이었다 ,1819. 또한, 캡슐화 과정 (예를 들어, poly(lactic-co-glycolic) 산) 고분자의 산 성 저하 제품 또는 NGF bioactivity의 손실에 의해 단백질의 비활성화는 시스템20이 관찰 되었다.

Nanostructured PSi는 유망 약물 전달 플랫폼21, predestining 체액에는 높은 표면적, 다공성 대용량, 생체 적합성, 및 가변 분해성을 포함 한 몇 가지 매력적인 속성에 의해 특징입니다. 22,23,,2425,26,27,28. 그 양극의 적절 한 선택 쉽게 마약 로드 및 릴리스 속도 론21,27조정에 대 한 PSi 구조 속성 (예를 들면, 다공성 및 기 공 크기)를 조정할 수 있습니다. 또한, 다양 한 편리한 화학 노선 PSi의 표면 수정 및 그 추가 조정 시 비 계 생리 적 조건 하에서 해산 속도 약22,24의 출시 속도를 허용합니다 29,30.

이 작품은 NGF의 장기간 제어 릴리스 PSi 기반 배달 시스템 설계에 집중 한다. 신경 감 별 법 및 파생물 NGF PSi 캐리어의 효과 PC12 세포를 사용 하 여 검사 및 DRG 뉴런 해리. 우리는 로드 NGF neurite 결과 단일 관리 내에서 1 개월 출시 기간 동안 깊은 차별화를 유도 하 여 그것의 bioactivity를 유지 하고있다 보여줍니다.

Protocol

모든 메서드는 윤리 위원회의 바 Ilan 대학에 의해 승인 되었습니다가지고.

1. 산화 PSi (PSiO2) 사업자의 제조

  1. Si 웨이퍼 (단면 < 100 > 얼굴에 윤이 나 고 무 겁 게 보론 첨가, p 형, 0.95 ㏁) 1.5 c m × 1.5 c m 샘플 다이아몬드 기울 ㄴ 펜을 사용 하 여 잘라.
  2. 주위 공기에서 2 h 400 ° C에서 튜브로 있는 Si 샘플 산화 (난방 속도: 25 ° C/min, 자연 냉각).
  3. 몰입할 수 소산 (HF) (48%), ddH2O와 에탄올 (99.9%)의 솔루션에 Si 샘플 (1:1:3 v/v/v) 5 분; 그리고 에탄올과 샘플 3 번 씻어 건조 한 질소 스트림 아래.
    참고: 준비 하 고 HF 녹이 고 유리만 plasticware에서 HF 솔루션을 저장 합니다.
    주의: HF는 높은 부식성 액체, 그리고 주의 처리 해야 합니다. 노출의 경우 물으로 깨끗이 씻어 하 고 HF 해독 제 젤;과 영향을 받는 영역을 치료 즉시 의료 서비스에 대 한 추구 합니다.
  4. 소계 에칭 셀에서 시 샘플 카운터 전극으로 위로-연락처 및 백 금 코일으로 알루미늄 포 일의 스트립을 사용 하 여 탑재 합니다.
  5. 수성 HF와 30에 대 한 에탄올 (99.9%)의 3:1 (v/v) 솔루션에서 희생 층 에칭 250 mA/cm2; 다음 결과 PSi의 표면 세 번 에탄올과 영화 및 질소 스트림 아래 건조 린스의 일정 전류 밀도에서 s.
  6. NaOH 용액 (0.1 m M) 2 분 동안에 갓 에칭 다공성 층을 분해. 다음 세 번 에탄올으로 씻어 하 고 건조 한 질소 스트림 아래.
  7. 수성 HF (48%), ddH2O와 에탄올 (99.9%)의 솔루션에 샘플을 담가 (1:1:3 v/v) 2 분. 다음 세 번 에탄올으로 씻어 하 고 건조 한 질소 스트림 아래.
  8. 화학적 에칭 수성 HF와 20 에탄올 (99.9%)의 3:1 (v/v) 솔루션 Si 샘플 250 mA/cm2; 다음 결과 PSi의 표면 세 번 에탄올과 영화 및 질소 스트림 아래 건조 린스의 일정 전류 밀도에서 s.
  9. 주위 공기에서 1 h 800 ° C에서 튜브 용광로에서 갓 에칭 PSi 샘플 열 산화 (난방 속도: 25 ° C/min, 자연 냉각) 다공성 SiO2 (PSiO2) 비 계를 형성 하기 위하여.
  10. 1 분;에 대 한 4000 rpm에서 긍정적인 두꺼운 포토 레지스트와 스핀 코트 PSiO2 샘플 그런 다음 2 분 동안 90 ° C에서 코팅된 샘플을 구워 (난방 속도: 5 ° C/min, 자연 냉각).
  11. 거 푸 집 PSiO2 샘플 사용 하는 다이 싱 8 m m × 8 m m 샘플으로 보았다.
  12. 포토 레지스트를 제거 하려면 3 h; 위한 아세톤에 절단된 샘플을 담근 다 철저 하 게 에탄올 헹 구 고 건조 한 질소 스트림 아래.

2. 로드 NGF와 PSiO2

  1. NGF 솔루션 로드를 준비 하려면 20 µ g murine β-NGF 0.01 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 및 ddH2오의 1:1 (v/v) 솔루션의 400 µ L에의 해산
  2. PSiO2 샘플 위에 로드 솔루션의 52 µ L을 추가 하 고 출장된 요리에 RT에서 2 h에 품 어.
    참고: 부 화 하는 동안 솔루션의 건조를 방지 하기 위해 접시에 높은 습도 유지 합니다.
  3. 상단의 PSiO2 캐리어 내에서 NGF 콘텐츠의 후속 정량화에 대 한 샘플 솔루션을 수집 합니다.
    참고: NGF 로드 PSiO2 로 즉시 사용 하기 전에 수행 되어야 합니다, 그리고 프로토콜 여기 건조의 위험 및 단백질의 변성 일시 수 없습니다.

3. NGF ELISA에서 NGF 로드의 정량화

  1. ELISA 격판덮개를 준비 하려면 0.5 µ g/mL 캡처 항 체의 (토끼 안티-hβ-NGF) 각 잘, 접시 및 실시간에서 밤새 품 어를 100 µ L를 추가
  2. 액체를 제거 하 고 씻어 4 번 워시 버퍼의 300 µ L를 사용 하 여 접시를 우물 발음 (0.05 %PBS 트윈-20) 당 잘; 마지막 세척 후 잔여 버퍼를 제거 하 고 종이 수건에 얼룩을 접시 반전.
  3. 각 잘을 블록 버퍼 (1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에)의 300 µ L을 추가 하 고 실시간에 적어도 1 시간에 대 한 품 어 그런 다음 발음 하 고 씻어 접시 4 번 단계 3.2에에서 설명 된 대로.
  4. 보정 곡선을 준비 하려면 희석 NGF 솔루션을 로드 (단계 2.1 참조) 희석제에 (0.05% 트윈 20, PBS에 0.1 %BSA) 1 ng/ml. 그런 다음 교정 곡선 샘플을 얻기 위해 0 1 ng/mL에서 2-fold 직렬 희석을 수행 합니다.
  5. 샘플 준비, 희석 (2.1 단계)에서 NGF 로드 솔루션 및 희석제 1:100,000와 1:10,000 (2.3 단계)에서 수집 된 후 로드 솔루션 각각 ELISA 키트 사용 (16-1000 pg/mL)의 농도 범위에 도달.
  6. 2 h;에 대 한 실시간에 희석된 샘플 및 교정 곡선 각 샘플 3 중에서 고 품 어의 100 µ L를 추가 그런 다음 발음 하 고 씻어 접시 4 번 단계 3.2에에서 설명 된 대로.
  7. 각 우물에 1 µ g/mL 탐지 항 체 (biotinylated 토끼 안티-hβ-NGF)의 100 µ L을 추가 하 고 2 시간에 대 한 RT에서 품 어. 그런 다음 발음 하 고 씻어 접시 4 번 단계 3.2에에서 설명 된 대로.
  8. Avidin-양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 1:2,000 희석 액에 희석, 잘 당 100 µ L을 추가 하 고 실시간에 30 분 동안 품 어 이제 발음 하 고 세척 접시 4 번 단계 3.2에에서 설명 된 대로.
  9. 각 잘 하 기판 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 색상 개발에 대 한 실시간에 25 분을 품 어. 405에서 흡 광도 측정 nm 파장 보정 설정 650 nm microplate 리더를 사용 하 여.
  10. NGF 농도가 로딩 솔루션에 보정 곡선에 따라 수집 된 후 로딩 솔루션을 결정 합니다.
  11. NGF 질량 PSiO2 캐리어 내의 로드를 계산 하려면 솔루션을 로드에서 NGF 질량에서 수집된 후 로딩 솔루션에서 NGF 질량을 뺍니다. NGF 로드 효능은 다음 수식으로 계산 됩니다.
    Equation

4. PSiO2 에서 NGF 릴리스 생체 외에서

  1. 0.01 M PBS 포함 하는 1% (w/v) BSA와 0.02% (w/v) 나트륨 아 지 드와 100 rpm의 궤도 동요에서 37 ° C에서의 2 mL에서 NGF 로드 PSiO2 운반대 품 어.
  2. 2 일 마다 솔루션을 수집 하 고 신선한 PBS의 2 mL와 함께 그것을 대체. 액체 질소에서 수집 된 자료 샘플을 동결 하 고 추가 분석에 대 한-20 ° C에서 저장 합니다.
  3. 상용 NGF ELISA 분석 결과 사용 하 여 릴리스 샘플 단계 3.1 3.9에에서 설명 된 대로에서 NGF 콘텐츠 계량.
    참고: 지금까지 ELISA 정량화에 대 한 릴리스 샘플을 준비 하는 때에 다른 희석 다른 시간 포인트 릴리스 기간 (즉, 이전 시간 포인트를 나중 시간 점 보다 훨씬 더 희석 한다)에 따라 수행 되어야 한다. 또한, 각 릴리스 샘플을 적어도 두 개의 서로 다른 희석 해야 수행 되며 ELISA 키트의 농도 범위에 도달 되도록 계량.
  4. 보정 곡선에 따라 릴리스 샘플에서 NGF 농도 결정 하 고 시간이 지남에 축적 NGF 릴리스의 그래프를 플롯.

5. 시험관에 유도 결합 플라즈마 원자 방출 분 광 법 (ICP-AES) 하 여 Si 침식의 정량화

  1. 10 ml 전체 볼륨에 대 한 샘플 릴리스 1: 릴리스 버퍼 (0.01 M PBS 1% (w/v) BSA와 0.02% (w/v) 나트륨 아 지 드를 포함)에 10의 1 mL를 희석.
  2. Si 원자 방출 봉우리 212.4, 251.6 288.2 nm 희석된 샘플에 대 한 모니터링 합니다.
  3. 보정 곡선에 따라 샘플에서 Si 농도 결정 합니다.
  4. 시 저하 프로필을 설정 하려면 (즉, 릴리스 기간 따라 누적 시 콘텐츠) 사업자의 총 시 콘텐츠의 각 시간 지점에서 시 콘텐츠를 표현 한다.
    참고: 항공사의 총 시 콘텐츠의 정확한 정량화를 위해 자료 샘플 샘플된 1 개월 다음 릴리스 끝점 공부 및 ICP AES를 사용 하 여 Si 농도 분석 있다. 출시 기간 따라 누적 시 콘텐츠 및 후 릴리스 샘플에서 Si 콘텐츠 요약 시 콘텐츠의 100%를 제공 합니다.

6. 세포 생존 및 성장 NGF 로드 Psio2 캐리어의 존재

  1. 쥐 pheochromocytoma (PC12) 세포 배양
    1. 10% 말 혈 청 (HS), 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1 %L-글루타민, 1% 페니실린 스, 0.2% 암포 Roselle 공원 의료 연구소 (RPMI) 매체를 추가 하 여 기본 성장 매체를 준비 합니다.
    2. 1%를 추가 하 여 차별화 매체를 준비 HS, 1 %L-글루타민, 1% 페니실린 스와 RPMI 보통 0.2% 암포.
    3. 8 일;에 대 한 기본적인 성장 매체의 10 mL와 75 cm2 문화 플라스 크에 세포 현 탁 액 (106 셀) 성장 2 일 마다 플라스 크를 기본 성장 매체의 10 mL를 추가합니다.
    4. 차별화 된 PC12 세포 배양을 생성 하려면 전송 세포 현 탁 액 분리기 관; 200 x g 및 실시간 삭제에서 8 분에 대 한 셀은 상쾌한 원심.
    5. 5 ml 신선한 기본 성장 매체의 세포를 중단 하 고 다시 200 x g 와 RT;에 5 분에 대 한 셀을 원심 상쾌한 삭제 하 고 기본 성장 매체의 3 mL에 셀 펠 릿 resuspend.
    6. 셀 클러스터, 별도로 10 번 23 G 주사기를 사용 하 여 셀을 발음.
    7. Hemocytometer 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 104 셀/cm2 작업 영역 차별화 매체 존재 콜라겐 유형 l 코팅 판에 씨앗.
    8. 24 시간 후 신선한 murine β-NGF (50 ng/mL) 또는 접시 당 NGF 로드 PSiO2 캐리어 추가 합니다.
      참고: 높은 NGF 농도 (> 50 ng/mL) 지정 된 농도 정확한 효과 보유.
    9. 차별 매체 2 일 마다 갱신 합니다.
    10. 세포 생존 능력을 평가 하기 위해 대표적인 시간 지점에서 생존 표시기 솔루션 (resazurin 기반)의 10% (v/v)을 추가 하 고 37 ° C에서 5 h에 대 한 품 어 490에서 흡 광도 측정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여.
  2. 쥐 지 느 러 미 루트 신경 절 (DRG) 세포 배양
    1. 2 7 주 된 C57bl 쥐에서 Drg를 격리 하기 위해 먼저 70% 에탄올과 쥐 불 하 고 제거는 피부를 절 개.
    2. 두개골의 기지를 잘라와 척수까지 복 벽 근육 노출.
    3. 척추는 화관의 수준에서 절단 하 여 제거 하 고 주변 조직 청소.
    4. 열; 3 개의 조각으로 잘라 다음 2 개 반 생성 및 척수에 밖으로 껍질을 중간에 각 조각 잘라.
    5. 쌍안경에서 모든 DRG 중추를 추출 하 고 찬 행 크의 균형된 소금물 (HBSS)에서 그들을 담가.
    6. 주변 결합 조직 배양 접시에 Drg를 갈망 하 여 깨끗 하 고 부드럽게 제거는 눈 밑 잔여 meninges.
    7. Papain의 U 1000에 20 분 동안 그들을 배양 하 여 DRG 세포 분열.
    8. 400 x g에서 4 분에 대 한 셀 원심 상쾌한 삭제 하 고 셀 펠 릿을 유지.
    9. 10 mg/mL 콜라와 12 mg/mL dispase II 솔루션에 펠 릿을 resuspend 하 고 37 ° c.에 20 분 동안 품 어
    10. 400 x g;에서 2 분에 대 한 셀을 원심 상쾌한 삭제 하 고 셀 펠 릿을 유지.
    11. HBSS, 10 mM 포도 당 및 5 mM HEPES (pH 7.35) 죄이 고 파스퇴르 피 펫을 통해 반복된 통행에 의해의 1 mL에 셀 펠 릿 triturate
    12. 부드럽게 L-15 매체 조밀도 기온 변화도 원심 분리; 여 세포 분리를 위한 실리 카 기반 콜 로이드 매체의 20%를 포함 된 천연된 셀 추가 원심 분리기 1000 x g에 8 분. 발음은 상쾌한 고 셀 펠 릿을 유지.
      참고:이 단계의 목표는 분리 axonal 파편에서 신경 세포, Schwann 세포, 섬유 아 세포를 정화 하는.
    13. F-12 매체; 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend 1000 x g;에서 2 분 동안 원심 분리기 삭제는 상쾌한 고 F-12 매체의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.
    14. 셀과 폴 리-L-리 신에 씨앗 2 × 104 셀 계산 및 laminin 코팅 유리 하단 35 m m 문화 요리, 10% 보충 F-12 항생제 없는 매체에서 FBS.
      참고: 처음에, 매체 (150-200 µ L);의 작은 볼륨에서 셀 씨앗 37 ° C에서 2 h 인큐베이션, 다음 매체 2 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다.
    15. 부드럽게 NGF 로드 PSiO2 캐리어 또는 신선한 murine β-NGF (50 ng/mL) 접시 당 추가 합니다.
    16. 2 일 후 RT;에서 15 분 동안 4 %paraformaldehyde (PFA) 솔루션으로 그것을 배양 하 여 세포 배양을 해결 immunostain 일반적인 면역 형광 검사 절차31얼룩을 사용 하 여 세포 배양.
    17. 이미지는 confocal 현미경을 사용 하 여 신경 세포 배양.

7. 세포 감 별 법 분석

  1. PC12 세포 NGF 로드 PSiO2 사업자의 차별화 비율
    1. NGF 로드 PSiO2 사업자의 차별화, 5% CO2를 포함 하는 37 ° C에서 습도 인큐베이터에 2 mL에 품 어.
    2. 2 일 마다 솔루션을 수집 하 고 신선한 매체의 2 mL와 함께 그것을 대체. 액체 질소에서 수집 된 자료 샘플을 동결 하 고 추가 분석에 대 한-20 ° C에서 저장 합니다.
    3. 12 잘 콜라겐 코팅 접시 지시로 섹션 4.1 (4.1.3-4.1.6)에서 종자 PC12 세포.
    4. 24 시간 후 대표 시간 포인트 (5.1.2 절) 다른 웰 스;의 릴리스 샘플 소개 제어 웰 스에 대 한 신선한 murine β-NGF (50 ng/mL)을 추가 합니다.
    5. 24 시간 후 가벼운 현미경을 사용 하 여 셀을 이미지.
    6. Neurite 베어링 셀의 비율을 확인 하려면 수동으로 neurites 이미지에서 셀의 총 수에서 능가 했다 셀의 개수 (n = 각 잘 5 프레임); 시간이 지남에 neurite 결과 PC12 세포의 비율의 그래프를 플롯 합니다.
      참고: Undifferentiated PC12 세포 등장 하면서 차별화 된 세포 파생물 neurites (최소 길이 셀 소마 직경 크거나 중 하나 이상) 또는 형태학 상 변화에 의해 확인 될 수 있다 neurites, 없이 구조를 둥근.
  2. 차별화 된 PC12 세포의 형태학 분석
    1. 이미지 처리 분석을 위해 (무료 시 약 또는 NGF 로드 PSiO2 운반대의 출시 제품) NGF와 치료 후 3 일 배양된 세포의 단계 이미지까지 취득.
      참고: (5 일) 넘어 나중 시간 지점에서 셀 단일 셀 해상도 형태학 측정을 방지 하는 매우 복잡 한 네트워크를 개발 합니다.
    2. 이미지 처리 프로그램 NeuronJ, 반자동 neurite 추적 및 길이 측정을 가능 하 게 한 ImageJ 플러그인을 다운로드 합니다.
    3. 8 비트 포맷 및 이미지 눈금 막대를 사용 하 여 마이크로 미터 비율 측정 픽셀 이미지 파일을 변환 합니다.
    4. 분석 을 사용 하 여 축척 설정 | 비율 설정 명령 그리고 측정 각 neurite 길이.
    5. 수동으로 분기 포인트의 수와 neurites 소마 각 셀에서에서 발생 수를 계산 합니다.
      참고: 평균 neurite 길이 NGF 처리 후 1 일은 약 30 µ m. 측정된 neurite 길이 광범위 하 게 배포할 수 있습니다.

Representative Results

산화 PSi 영화 프로토콜에 설명 된 것 처럼 조작 됩니다. Si 웨이퍼는 20에 대 한 전기 화학 에칭에 따라서 800 ° C (그림 1aii) PSiO2 비 계 생산에 열 산화 뒤 250 mA/cm2 (그림 1ai), s. 고해상도 스캐닝 전자 현미경 검사 법의 결과 PSiO2 영화 (HR-SEM) 이미지 표시 됩니다 그림 1bc 탑 뷰 현미경 사진 필름 (그림 1b)의 약 40의 숨 구멍을 가진 높게 다공성 자연 묘사 nm 직경에서. 쪼개진된 영화 (그림 1c)의 횡단면 현미경 사진 원통형 모 상호 특징 2.9 µ m의 다공성 층 두께를 보여준다.

PSiO2 영화 NGFaiii 그림 1볼 수 있듯이 솔루션 로드와 함께 로드 됩니다. NGF 로드 NGF ELISA PSiO2 영화와 함께 보육 전후 로딩 솔루션에서 NGF 농도 측정 하 여 정량 이다. PSiO2 영화 당 로드 NGF의 평균 질량의 90% (w/w) (데이터31표시 되지 않음) 높은 로드 효능에 해당 2.8 ± 0.2 µ g으로 결정 됩니다. PSiO2 통신사에서 NGF 릴리스 프로필을 설정 하려면 로드 영화 37 ° C에서 PBS에서 incubated 하 고 매 2 일 aliquots NGF ELISA를 사용 하 여 릴리스 단백질 농도의 정량화에 대 한 샘플링 됩니다. 또한, ICP AES를 사용 하 여 릴리스 샘플에서 Si 콘텐츠를 계량 하 고 PSiO2 사업자의 Si 침식 활동 설정 됩니다. 그림 2 NGF 릴리스 및 다공성 사업자의 해당 시 저하 프로필을 보여 주며. 버스트 효과 없이, NGF의 지속적인된 출시가 1 달의 기간 동안 달성 했다. NGF 출시 첫 주에는 더 빠른 (기울기 = 0.442) 훨씬 느린 릴리스 릴리스 기간 (슬로프 0.043) 따라 나중 일에서에 비해. 그것은 전체 1 개월 출시 기간 동안 출시 NGF의 금액은 나중에 토론 될 것 이다로 PC12 세포의 심오한 분화 유도 대 한 충분 한 그 지적 한다. 누적 NGF 출시 좋은 상관 관계에서 발견 된다 (R2 = 0.971) 콘텐츠, 그림 2인세트와 같이 나머지 시와.

다음, NGF 로드 PSiO2 운반대의 bioactivity 특징이 생체 외에서, PC12 세포와 DRG 신경 신경 감 별 법 및 파생물에 대 한 모델로 사용 됩니다. PC12 세포와 해리 DRG 뉴런 프로토콜에 설명 된 대로 시드 있습니다. 첫째, PSiO2 사업자의 세포 생존 능력은 스트레이트 (하지 로드)와 셀 또는 NGF 로드 PSiO2; 잠복기 검사 제어 접시와 깔끔한 PSiO2 로 치료 하는 세포는 보충 무료 NGF 매 2 일. 아니 세포 독성 PSiO2 는 생체이 셀 라인을 보여주는 깔끔한 또는 NGF 로드 PSiO2 사업자 (그림 3a)에 세포의 노출 시 관찰 됩니다. 그림 3b PC12 세포 NGF 로드 PSiO2 통신 사업자와 함께 치료의 대표 인사-SEM 현미경을 보여줍니다. 관찰 된 세포 추출 neurites 및 형태 특성 분기 신경 네트워크. NGF 로드 PSiO2 사업자의 DRG 신경 세포를 해리 시드 때 비슷한 결과 얻을 수 있습니다. Immunostained DRG 셀 NGF 로드 PSiO2 사업자 (그림 3e)와 교양된의 공초점 이미지 표시는 광범위 한 neurite 개시와 신장, (, 뉴런 무료 보충 긍정적인 컨트롤과 유사 하 게 NGF, 그림 3참조) 부정적인 제어 하는 동안, (, 신경 치료, 그림 3 c참조), 전시물 neurite 결과의 가난한 범위.

PC12 세포 분화 비율 PSiO2 통신사에서 출시 NGF의 존재를 평가 하려면 차별화 총 셀 인구 neurite 결과 셀을 계산 하 여 정량 이다. 그림 4 는 26 일 동안 다른 시간 지점에서 차별화 된 셀의 비율 측면에서 결과 요약합니다. 중요 한 차별화 백분율 값은 공부 기간에 걸쳐 달성 했다. 특히, 26 일 후 발표 NGF 폴리머 기반 사업자16높은 이전 연구에 비해 크게는 차별화 비율 50% 이상의 차별화를 유도 했다. 이러한 결과 표시 다공성 호스트 내에서 NGF 함정 ~ 1 달의 기간에 대 한 깊은 분화 유도 대 한 단백질의 생물 학적 활동을 유지.

더 신경 분화에 NGF PSiO2 사업자의 영향 조사, 차별화 된 PC12 세포의 3 개의 특성 형태학 매개 변수 단일 세포 수준에서 측정 된다: (i) neurites 소마 (에서 추출 수 ii) 총 neurites' 길이 고 (iii) 분기 점의 수. 셀 컨트롤 NGF 로드 PSiO2 운반대 또는 무료 NGF (매 2 일)의 반복적인 관리 처리 됩니다. 그림 5a -c 1-3 일에 셀 인구의 형태학 분석을 선물 한다. PC12 세포 NGF 로드 PSiO2 치료 모든 3 테스트 매개 변수에 대 한 제어 치료와 유사한 형태학 값 표시. 3 일 후, 모든 형태학 매개 변수 값은 NGF 로드 PSiO2 사업자 및 무료 NGF의 반복적인 관리 제어 치료에 대 한 동일한 속도로 증가 관찰 됩니다.

Figure 1
그림 1: PSiO2 영화 제작. (a) PSiO2 사업자의 제조 계획: (i) 실리콘 웨이퍼는 20에 대 한 전기 화학 에칭에 따라서 s 250 mA/cm2, PSiO2 비 계 및 (iii) NGF에 의해 로드 800 ° C에서 열 산화 (ii) 다음 물리적 흡착 (회로도 그려 하지 규모). (b-c) 특성 PSiO2 영화의 탑 뷰 및 횡단면 전자 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: NGF 릴리스 및 NGF 로드 PSiO2 사업자의 Si 침식 프로필. PSiO2 사업자의 저하의 정도 다공성 필름의 총 시 콘텐츠 각 시간 지점에서 나머지 시 콘텐츠의 일부분으로 제공 됩니다. 삽입 콘텐츠 누적 NGF 발표 및 시 남은 간의 상관 관계를 보여 줍니다. 오류 막대 대표 SD, n = 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 세포 생존 능력 및 NGF 로드 PSiO2 사업자의 성장. (a) 체 외에서 세포 독성 특성. PC12 세포 생존 능력은 1, 3, 7 일 깔끔한 (하지 로드) PSiO2 사업자, NGF 로드 PSiO2 운반대 또는 무료 NGF에 그들의 노출에 측정 (50 ng/mL 매 2 일 제어 판). (b) 9 일 동안 NGF 로드 PSiO2 사업자와 교양된 PC12 세포의 전자 현미경 사진. 왼쪽된 패널: 한 줌-인, neurite 결과 셀 소마;에서 묘사 오른쪽 패널: 줌 아웃, 매우 복잡 한 신경 네트워크를 나타내는 형성. (c-e) Confocal 현미경 이미지 immunostained DRG 신경의 세포 배양 (시드 후에 2 일): (c) 치료 세포; (d) 세포 보충 무료 NGF (50 ng/mL); (e) NGF PSiO2 항공사. Immunofluorescent 얼룩 neurofilament H의 셀 소마와 outgrowing neurites 이미징이 있습니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: PC12 세포 NGF 대표 시간 지점에서 NGF 로드 PSiO2 통신사에서 출시에 노출 되 면 차별화 백분율 값. 차별화 비율 총 셀 인구 neurite 결과 포함 된 셀의 수로 표현 된다. 제어 치료 무료 NGF 보충 셀 가리킵니다 (50 ng/mL). 다른 시간에 세포의 대표적인 가벼운 현미경 이미지; x 축을 따라 표시 됩니다. 스케일 바 컨트롤 현미경 사진에 대 한 일 2, 8, 14, 26, 50 µ m의 현미경에 대 한 25 µ m =. 오류 막대 대표 SD, n = 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 차별화 된 PC12 세포의 형태학 분석. 차별화 된 PC12 세포의 3 개의 형태학 매개 변수는 측정, 단일 세포 수준에서 NGF 로드 PSiO2 운반대 또는 반복적인 관리에 1 및 3 다음 노출 무료 NGF (제어); 2 일 마다 하루에 (a) 총 neurites neurites 분기 포인트의 셀 소마와 (c) 수에서 추출의 길이 (b) 수입니다. 오류 막대 대표 SD, n = 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

분해성 nanostructured PSiO2 영화는 날조 고 NGF의 생물 활성을 유지 하는 동안 지속적이 고 장시간 출시에 대 한 허용에 대 한 사업자로 서. NGF에 대 한 배달 시스템으로 역할을 PSiO2 의 잠재력 충분 한 NGF 복용량 신경 분화 유도 및 홍보 PC12 세포와 DRG 뉴런의 파생물을 출시 그들의 능력을 입증 함으로써 생체 외에서 설명 했다. 설계 된 영화는 미래의 치료 비보에 대 한 NGF의 장기 저수지로 사용할 수 있습니다.

조작된 PSi 영화의 구조적 속성 NGF 페이로드; 구체적으로 맞게 했다 전기 화학 에칭 과정의 전류 밀도 약 40의 기 공 크기를 조정 했다 NGF,33~ 4 nm 특성 직경 26.5 kDa32 의 molecular weight와 단백질을 쉽게 수용할 것 nm 다공성 매트릭스 내. 또한, 다공성 발판의 열 산화 NGF의 물리적 흡착 수 있도록 부정 청구 산화 PSi 표면에 충전 된 단백질의 정전기 매력에 의해 수행 되었다. PSi의 표면 화학 로드 효능에 큰 효과 발휘 하 고 더 나은 페이로드 및 다공성 매트릭스 사이의 상호 작용을 제어 하기 위해 쉽게 조정 될 수 있다. 이러한 상호 작용은 이후에 흡착된 단백질 분자의 구조와 그들의 bioactivity34,,3536을 지정합니다. 결론적으로, 시스템 적절 한 기 공 크기, 표면 특성 및 용 매와 언급 한 매개 변수 지정의 효과 단백질 로드 로드 이상 신중 하 게 선택 하 여 NGF의 최적의 로드를 조정 했다 효능입니다. 따라서, 표면 화학 제조 매개 변수 (예를 들면, 전류 밀도, 에칭 시간, 유형 및 불순물 또는 전해질의 농도), 변경 또는 솔루션 구성 로드 로드 효능과의 bioactivity에 영향을 미칠 수 있는 로드 된 단백질입니다.

PSi orPSiO2호스트에서 페이로드의 출시 속도 일반적으로 두 개의 동시 메커니즘, 페이로드 분자의 아웃 확산과 시 비 계37의 저하의 조합에 의해 결정 됩니다. 침식과 후속 해산 속도 이식 사이트, 그것의 병 리 및 질병 상태28,38,39에 의해 영향을 받습니다. 그것은 이전 작업에는 다른 방출 속도 특정 치료 응용 프로그램에 필요한 경우 릴리스 프로필 수정 고 수 PSi 표면38,40의 표면 화학을 변경 하 여 연장 설립 41. PSi 표면 안정화의 저하 및 필연적인 페이로드 릴리스35,42 영향을 다양 한 화학 수정, 열 산화, 열 탄 등 hydrosilylation 기술, 보였다 ,43,,4445. 또한, 다양 한 표면 화학 경로 통해 시 비 계 단백질 분자의 화학식 첨부 하 여 사업자에 NGF의 로드 초래 한다 더 장기간된 릴리스 때 공유 결합이 페이로드 릴리스입니다만 있기 때문에 나는 매트릭스는 Si 지원21저하.

또한, 그것의 제조 공정에 따라 PSi 렌더링할 수 미46, 나노47 등 무료 서 막26, 사업자로 서도 사용할 수 있는 얇은 필름 외 다양 한 구성으로 NGF와만 나 특정 응용 프로그램 요구.

임상 관련 있을, PSiO2 사업자 내에서 NGF 콘텐츠 치료 복용량의 범위가 되어야만 합니다. 프로토콜에서 설명 하는 방법을에서 NGF 로드 PSiO2 사업자 셀 미디어의 2 mL의 일관 된 볼륨에 소개 또는 PBS 버퍼 및 따라서, 로딩 솔루션 및 각각 NGF 대량 로드의 농도를 조정 했다는 NGF 농도를 시험 생체 외에서 시스템에 대 한 관련 된 발표 했다. 다른 시스템, 전 비보 비보에 환경,이 방법을 활용 하면 솔루션을 로드 NGF의 농도 증가 고 필요한 복용량에 따라 조정 해야 합니다. 또는, 높은 NGF 콘텐츠 테스트 영역 당 여러 항공사를 도입 하 여 또는 PSiO2 샘플의 더 큰 영역을 사용 하 여 얻을 수 있습니다.

또한, 출시 기간 따라 나중 시간 포인트에서 릴리스 NGF 농도가 이전 시간 포인트에서 보다 훨씬 낮은는 주목 한다. NGF 플럭스는 시간이 지남에 따라 일정 하지 않은 사실은 응용 프로그램 요구에 따라 시스템을 설계할 때 고려 사항으로 기울여야 합니다.

수많은 NGF 배달 시스템 개발 되 고 문학, 그들의 대부분에는 폴리머 기반 시스템,10,11,,1215 변화 합성 또는 천연 폴리머의 구성 , 16 , 그러나 17.이 시스템은 효과적인 나타났습니다 지속적인된 출시 프로 파일,, 중요 한 폭발 효과 함께 몇 일의 기간 동안 스팬 릴리스 기간. 이러한 전송 플랫폼의 일부 캡슐화 과정, 다른 안정화 에이전트18,48, 뿐만 아니라 정교 하 고 복잡 한의 사용 요구에 따라 bioactivity의 손실과 같은 중요 한 한계에서 고통 제조 기법16. 단백질을 위한 전달 시스템 설계에 가장 큰 과제 중 하나 캐리어 시스템 내 함정에 분자의 bioactivity를 유지 하는 기능입니다. PSi/PSiO2 RT 또는 낮은 온도에 단백질 또는 펩 티 드 이러한 민감한 생체를 로드할 때 모두 중요 한 요소는 강한 유기 용 매를 사용 하지 않고 로드할 수 있습니다. 이전 학문은 PSi/PSiO2 표면 화학 로드 단백질35,36의 가능한 변성을 최소화에 있는 중요 한 역할을 설명 했다. 따라서 PSi/PSiO2 는 특히 일반적 성장 요인에 대 한 전달 시스템을 개발 하 고 NGF 유리한 접한 이다.

현재 작업은 신경 퇴행 성 질환의 잠재적인 치료에 대 한 CNS에 NGF의 직접 관리에 대 한 새로운 치료 방법으로이 방법을 활용에 초점. NGF 로드 PSiO2 사업자는 쥐 두뇌에서 이식 될 수 이며 장기 이식으로 플랫폼의 효능 공부 vivo에서. 또한, 비-침략 적 biolistics49이 유망 사업자 결합,50 수 수 있게 소설 공기를 사용 하 여 지역화 된 영역을 높은 해상도에서 NGF 로드 PSiO2 입자 관리 모 세관 총 spatiotemporal 약국이 필요한 신경 퇴행 성 질환 치료를 위한. 또한, NGF는 화학 그라데이션 방식으로51, 축 삭 지도 분자와 비슷한 신경 성장 보낼 수 있습니다. 따라서, 로드 PSiO2 캐리어 유인 핫스팟 NGF, 성장, 다른 감독 신호52,53를 보완 하 게 될 수 있습니다. 또한, PSiO2사업자 추가 조정 PSiO2 nanostructure 및 그것의 표면 화학 NGF의 배달 몇 개월의 시간이 훨씬 연장 기간에 대 한 유지 하기 위해 구체적으로 맞출 수 있습니다.

Disclosures

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

Acknowledgments

MS, ES 핵심 서비스를 인정 하 고 생명 과학 및 공학와는 Technion에서 러셀 Berrie 나노기술 연구소의 재정 지원에 대 한 트럭 I. Lokey 센터에서 지원 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

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신경 성장 인자의 사업자로 서 다공성 실리콘 필름을 디자인
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Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).More

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

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