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Bioengineering

Diseño de películas de silicio poroso como portadores de Factor de crecimiento nervioso

doi: 10.3791/58982 Published: January 25, 2019

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para el diseño y fabricación de películas de silicio poroso (PSi) nanoestructurados como portadores degradables para el factor de crecimiento nervioso (NGF). La diferenciación neuronal y en consecuencia de PC12 células y ratones raíz dorsal (GRD) del ganglio las neuronas se caracterizan sobre el tratamiento con los portadores cargados de NGF PSi.

Abstract

A pesar del gran potencial del NGF para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, su administración terapéutica representa un reto importante ya que la proteína no cruza la barrera blood - brain, debido a sus propiedades químicas y por lo tanto requiere a largo plazo entrega al cerebro para ejercer un efecto biológico. Este trabajo describe la fabricación de las películas nanoestructurados PSi como degradables portadores de NGF para la entrega sostenida de esta proteína sensible. Los portadores de la PSi están específicamente diseñados para obtener eficacia de carga alta y continua liberación de NGF por un período de cuatro semanas, manteniendo su actividad biológica. El comportamiento de los portadores de NGF-PSi como un sistema de entrega de NGF es investigado en vitro examinando su capacidad de inducir la diferenciación neuronal y en consecuencia de células PC12 y disociada de las neuronas DRG. Se evalúa la viabilidad de las células en presencia de portadores de PSi limpio y cargado de NGF. La bioactividad de NGF liberado de los portadores de la PSi es comparada con el tratamiento convencional de repetidas administraciones de NGF gratis. Diferenciación de las células PC12 es analizada y caracterizada por la medición de tres diferentes parámetros morfológicos de las células diferenciadas; (i) el número de neuritas extracción de la soma de longitud (ii) el total neurites y (iii) el número de puntos de ramificación. Las células PC12 tratadas con los portadores de NGF-ISP demuestran una diferenciación profunda durante todo el período de lanzamiento. Además, células neuronales DRG con los portadores de NGF-PSi muestran una iniciación neurite extensa, similar a las neuronas tratadas con administraciones repetidas de NGF gratis. Los portadores tunable estudiados demuestran los implantes a largo plazo para la liberación de NGF con un potencial terapéutico para enfermedades neurodegenerativas.

Introduction

NGF es esencial para el desarrollo y mantenimiento de las neuronas en el sistema nervioso periférico (PNS)1 y desempeña un papel crucial en la supervivencia y la función de las neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal en el sistema nervioso central (SNC)2. Su alto potencial farmacológico para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas central como la enfermedad de Alzheimer y de Parkinson, ha sido ampliamente demostrada, con ensayos clínicos actualmente en progreso3,4,5, 6. El mayor desafío en la entrega de NGF al SNC reside en su incapacidad para atravesar la barrera hematoencefálica (BBB), cuando se administra sistémicamente7. Más aún, NGF susceptibilidad a rápida degradación enzimática hace que su vida media corta y limita significativamente su uso terapéutico8,9. Por lo tanto, es un desafío para diseñar sistemas que permiten una liberación prolongada y controlada de NGF en forma segura. Diversos sistemas de entrega de NGF, incluyendo sistemas basados en polímeros, han sido estudiados10,11,12,13,14,15, 16 , 17. los perfiles de liberación de estos sistemas se caracterizan a menudo por un distinto estallido inicial, seguido de una liberación lenta y continua, donde en la última etapa la tasa de liberación fue significativamente baja en comparación con la explosión inicial11 ,18,19. Además, la inactivación de la proteína por los productos ácidos de la degradación de los polímeros (por ejemplo, ácido poly(lactic-co-glycolic)) o la pérdida de bioactividad del NGF durante el proceso de encapsulación fueron observadas con este sistemas20.

Nanoestructurados PSi se caracteriza por varias propiedades atractivas, incluyendo su superficie, gran volumen poroso, biocompatibilidad y degradabilidad sintonizable en fluidos corporales, predestinó para un prometedor fármaco entrega plataforma de21, 22,23,24,25,26,27,28. La selección apropiada de las condiciones de anodizado permite ajustar fácilmente las propiedades estructurales del PSi (tamañop. ej., la porosidad y poro) para adaptar la carga de droga y liberación cinética21,27. Por otra parte, diversas rutas químicas convenientes permiten modificar la superficie de la PSi y por ajustar aún más la velocidad de disolución del andamio Si bajo condiciones fisiológicas y las tasas de liberación de la droga22,24, 29,30.

Este trabajo se centra en el diseño de un sistema de entrega PSi para liberación controlada prolongada de NGF. El efecto de los portadores de NGF-PSi en la diferenciación neuronal y en consecuencia se examina usando las células PC12 y disociado las neuronas DRG. Demostramos que el NGF cargado ha conservado su bioactividad induciendo la consecuencia del neurite y profunda diferenciación a lo largo de un período de 1 mes lanzamiento dentro de una sola administración.

Protocol

Todos los métodos han sido aprobados por el Comité de ética de Universidad de Ilan de Bar.

1. fabricación de portadores oxidado PSi (PSiO2)

  1. Cortar una oblea de Si (solo lado pulido en la cara < 100 > y pesadamente dopada con boro, tipo p, mΩ·cm 0,95) en muestras de 1,5 cm x 1,5 cm utilizando un rotulador de punta de diamante.
  2. Oxidar las muestras Si en un horno de tubo a 400 ° C por 2 h en el aire ambiente (velocidad de calentamiento: 25 ° C/min, refrigeración natural).
  3. Sumerja las muestras Si en una solución acuoso ácido fluorhídrico (HF) (48%), ddH2O y etanol (99.9%) (1:1:3 v/v/v) durante 5 minutos; luego las muestras con etanol tres veces y seque con un chorro de nitrógeno.
    Nota: Prepare y almacene la solución de HF en recipientes de plástico, como vidrio de disoluciones de HF.
    PRECAUCIÓN: El HF es un líquido altamente corrosivo y debe manipularse con extremo cuidado. En caso de exposición, enjuague bien con agua y tratar la zona afectada con gel antídoto de HF; Busque atención médica inmediatamente.
  4. Montaje de la muestra Si en una celda de la aguafuerte del politetrafluoetileno, utilizando una tira de papel de aluminio como un contacto trasero y una bobina de platino como el contraelectrodo.
  5. Grabe una capa sacrificial en una solución de 3:1 (v/v) de HF acuoso y etanol (99,9%) durante 30 s en una constante densidad de corriente de 250 mA/cm2; luego enjuague la superficie de la PSi resultante tres veces la película con etanol y secar bajo una corriente de nitrógeno.
  6. Disolver la capa porosa recién grabado al agua fuerte en una solución acuosa de NaOH (0,1 M) por 2 min. Luego enjuagar con etanol tres veces y secar bajo una corriente de nitrógeno.
  7. Sumergir la muestra en una solución de HF acuoso (48%), ddH2O y etanol (99.9%) (1:1:3 v/v) durante 2 minutos. Luego enjuagar con etanol tres veces y secar bajo una corriente de nitrógeno.
  8. Electroquímicamente grabado el ejemplo Si en una solución de 3:1 (v/v) de HF acuoso y etanol (99,9%) durante 20 s en una constante densidad de corriente de 250 mA/cm2; luego enjuague la superficie de la PSi resultante tres veces la película con etanol y secar bajo una corriente de nitrógeno.
  9. Térmicamente se oxida las muestras recién grabado PSi en un horno de tubo a 800 ° C por 1 h en el aire ambiente (velocidad de calentamiento: 25 ° C/min, refrigeración natural) para formar un andamio poroso que SiO2 (PSiO2).
  10. Muestras el PSiO2 spin-capa con una fotoresistencia gruesa positiva a 4.000 rpm por 1 minuto; entonces, cueza al horno las muestras revestidas a 90 ° C por 2 min (velocidad de calentamiento: 5 ° C/min, refrigeración natural).
  11. Cortar el PSiO2 muestras en muestras de 8 × 8 mm usando una sierra de corte en cuadritos.
  12. Para quitar la fotoresistencia, remoje las muestras dados en acetona durante 3 h; Luego enjuagar con etanol y secar bajo una corriente de nitrógeno.

2. carga PSiO2 con NGF

  1. Para preparar el NGF carga solución, disolver 20 μg del β-NGF murino en 400 μL de solución 1:1 (v/v) de 0.01 M tampón fosfato salino (PBS) y ddH2O.
  2. Añadir 52 μl de la solución de carga en la parte superior el PSiO2 muestra e incubar por 2 h a temperatura ambiente en un plato tapado.
    Nota: Mantener alta humedad en el plato para evitar la desecación de la solución durante la incubación.
  3. Recoger la solución en la parte superior de la muestra para la cuantificación posterior de contenido NGF en el PSiO2 portador.
    Nota: Carga de NGF en PSiO2 debe realizarse inmediatamente antes del uso, el Protocolo no se detuvo aquí debido al riesgo de sequía y desnaturalización de la proteína.

3. cuantificación de la carga de NGF por NGF ELISA

  1. Para preparar la placa de ELISA, añada 100 μl del anticuerpo de captura 0,5 μg/mL (conejo anti-hβ-NGF) cada uno, sellar la placa e incubar durante la noche a TA.
  2. Aspirar los pocillos para eliminar el líquido y lavar el plato cuatro veces con 300 μL de tampón de lavado (0.05% Tween-20 en PBS) por pozo; después del último lavado, invertir la placa para quitar el tampón residual y secar sobre una toalla de papel.
  3. Añadir 300 μL de tampón de bloqueo (1% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS) en cada pocillo e incubar durante al menos 1 h a TA. Luego aspirar y lavar el plato cuatro veces como se describe en el paso 3.2.
  4. Para preparar una curva de calibración, diluir NGF carga solución (véase el paso 2.1) en diluyente (0.05% Tween-20, 0.1% de BSA en PBS) a 1 ng/mL. Realizar diluciones seriadas 2 dobleces de 1 ng/mL a cero para obtener las muestras de la curva de calibración.
  5. Para preparar las muestras, diluir la solución de carga de NGF (del paso 2.1) y la solución de carga posterior recogida (del paso 2.3) en Diluyente 1: 100.000 y 1: 10,000 respectivamente, para llegar a la gama de concentraciones del kit ELISA en uso (16-1.000 pg/mL).
  6. Añadir 100 μl de muestras diluidas y curva de calibración muestras a cada bien por triplicado e incuban a temperatura ambiente por 2 h; luego aspirar y lavar el plato cuatro veces como se describe en el paso 3.2.
  7. Añadir 100 μl de anticuerpo de detección de 1 μg/mL (conejo biotinilado anti-hβ-NGF) a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 2 h. Luego aspirar y lavar el plato cuatro veces como se describe en el paso 3.2.
  8. Diluir 1:2,000 de avidina con peroxidasa (HRP) en diluyente, agregar 100 μl por pozo e incubar por 30 min a TA. Ahora aspirar y lavar el plato cuatro veces como se describe en el paso 3.2.
  9. Añadir 100 μl de substrate solution a cada pocillo e incubar a 25 min a temperatura ambiente para desarrollo de color. Medir la absorbancia a 405 nm con corrección de longitud de onda fija en 650 nm utilizando un lector de microplacas.
  10. Determinar la concentración de NGF en la solución de carga y la solución recogida carga posterior basada en la curva de calibración.
  11. Para calcular la masa de NGF cargado dentro de PSiO2 portador, restar masa de NGF en la solución de carga posterior recogida de la masa de NGF en la solución de carga. Eficacia de cargamento del NGF se calcula mediante la siguiente ecuación:
    Equation

4. in vitro liberación de NGF de PSiO2

  1. Incubar el NGF cargado PSiO2 portadores en 2 mL de PBS de 0,01 M con 1% BSA (w/v) y azida de sodio 0,02% (p/v) a 37 ° C y bajo agitación orbital de 100 rpm.
  2. Cada 2 días recolectar la solución y reemplazarla con 2 mL de PBS fresco. Congelar las muestras de la versión recogida en nitrógeno líquido y almacenar a-20 ° C para mayores análisis.
  3. Utilizar el ensayo de NGF ELISA disponible comercialmente para cuantificar el contenido de NGF en las muestras de lanzamiento como se describe en los pasos 3.1-3.9.
    Nota: Durante la preparación de las muestras de liberación para la cuantificación de ELISA, deben realizarse diluciones diferentes para momentos diferentes a lo largo del período de lanzamiento (es decir, tiempo anterior puntos deben diluirse más que momentos más tardías). Además, para cada muestra de la liberación, por lo menos dos diluciones diferentes deben realizadas y cuantificadas para asegurarse de llegar a la gama de concentraciones del kit ELISA.
  4. Determinar la concentración de NGF en las muestras de liberación basado en la curva de calibración y una gráfica de la liberación de NGF acumulado con el tiempo.

5. cuantificación de en vitro Si la erosión por inductivamente acoplado Plasma emisión Espectroscopia atómica (ICP-AES)

  1. Diluir 1 mL de liberación las muestras 1:10 en tampón de lanzamiento (0.01 M PBS con BSA 1% (p/v) y azida sódica al 0.02% (w/v)) para un volumen total de 10 mL.
  2. Monitorear Si picos de emisión atómica en 212,4, 251.6 y 288.2 nm para las muestras diluidas.
  3. Determinar la concentración de Si en las muestras basadas en una curva de calibración.
  4. Para establecer el perfil de degradación Si, expresar contenido de Si en cada momento como un porcentaje del contenido total de Si de los portadores (es decir, el contenido de Si acumulativo a lo largo del período de lanzamiento).
    Nota: Para asegurar la exacta cuantificación del contenido total de Si de los portadores, muestras de liberación son muestreados 1 mes siguientes el punto final de la versión de estudio y analizan para determinar Si concentración mediante ICP-AES. Suma el contenido de Si acumulativo a lo largo del periodo de liberación y el contenido de Si en las muestras posterior a la liberación proporciona el 100% de contenido de Si.

6. viabilidad y crecimiento en la presencia de NGF cargado Psio2 portadores de la célula

  1. Cultivo de células de rata feocromocitoma (PC12)
    1. Preparar el medio de crecimiento básico mediante la adición de 10% de suero equino (HS), 5% de suero bovino fetal (FBS), 1% L-glutamina, estreptomicina penicilina de 1% y 0.2% de anfotericina a medio de Roselle Park Medical Institute (RPMI).
    2. Preparar medio de diferenciación mediante la adición de 1% HS, 1% L-glutamina, estreptomicina penicilina de 1% y 0.2% de anfotericina a Medio RPMI.
    3. Aumentan los suspensión de células (106 células) en un matraz de cultivo de 75 cm2 con 10 mL de medio de crecimiento básico de 8 días; cada 2 días añadir 10 mL de medio de cultivo básico en el matraz.
    4. Para generar cultura de células PC12 diferenciada, transferir la suspensión de células a un tubo de centrífuga; Centrifugar células 8 min a 200 x g y RT. Deseche el sobrenadante.
    5. Suspender las células en 5 mL de medio de crecimiento básico fresco y volver a centrifugar las células durante 5 minutos a 200 x g y RT; Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 3 mL de medio de crecimiento básico.
    6. Para separar racimos de célula, aspirar las células diez veces con una jeringa de 23 G.
    7. Contar las células usando un contador de células hemocitómetro y semilla 104 células/cm2 área de trabajo en el colágeno tipo l cubierta placas en presencia de medio de diferenciación.
    8. Después de 24 h, añadir β-NGF murino fresco (50 ng/mL) o el portador de la PSiO2 cargado de NGF por placa.
      Nota: Mayores concentraciones de NGF (> 50 ng/mL) poseen el efecto exacto que la concentración especificada.
    9. Renovar el medio de diferenciación cada 2 días.
    10. Para evaluar viabilidad celular, agregar 10% (v/v) de la solución de indicador de viabilidad (a base de resazurina) en momentos representativos e incube durante 5 h a 37 ° C; medir la absorbancia a 490 nm usando un espectrofotómetro.
  2. Cultivo de células de ratones raíz Dorsal (GRD) de los ganglios
    1. Para aislar el GRD de dos ratones C57bl de 7 semanas de edad, primero moje los ratones con etanol al 70% y hacer una incisión para retirar la piel.
    2. Cortar la base del cráneo y los músculos de la pared abdominal hasta la médula espinal está expuesta.
    3. Retire la columna haciendo un corte a nivel de los fémures y limpie los tejidos circundantes.
    4. Cortada la columna tres; luego cortar cada pieza en el midline para generar dos mitades y pelar hacia fuera de la médula espinal.
    5. En los binoculares, extrae todos los ganglios DRG y sumergirlos en una solución salina equilibrada de un frío Hank (HBSS).
    6. Limpie los tejidos conectivo circundantes por pining el DRGs en una placa Petri y suavemente Retire meninges residual bajo los binoculares.
    7. Disociar las células DRG por les incubar durante 20 min en 1.000 U de la papaína.
    8. Centrifugar las células durante 4 min a 400 x g. Deseche el sobrenadante y mantener el sedimento celulares.
    9. Resuspender el precipitado en una solución de dispase II de colagenasa y 12 mg/mL de 10 mg/mL e incubar por 20 min a 37 ° C.
    10. Centrifugar las células por 2 min a 400 x g; Deseche el sobrenadante y mantener el sedimento celulares.
    11. Triturate el precipitado de células en 1 mL de HBSS, glucosa 10 mM y 5 mM HEPES (pH 7,35) por el paso repetido a través de una pipeta Pasteur estrecha.
    12. Añadir con cuidado las células disociadas a medio L-15 que contiene 20% de basados en sílice coloidal medio para separación de células por centrifugación de gradiente de densidad; centrifugar durante 8 min a 1.000 x g. Aspirar el sobrenadante y mantener el sedimento celulares.
      Nota: El objetivo de este paso es separar y purificar las células neuronales de escombros axonal, las células de Schwann y fibroblastos.
    13. Resuspender el precipitado de células en 2 mL de medio de F-12; centrifugar durante 2 min a 1.000 x g; Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de medio de F-12.
    14. Contar las células y las células de semilla 2 × 104 poly-L-lisina y laminina revestido vidrio inferior 35 mm cultura platos, en un medio libre de antibiótico F-12, suplementado con 10% FBS.
      Nota: La semilla inicialmente, las células en un volumen pequeño de medio (150-200 μL); Tras 2 h de incubación a 37 ° C, añadir medio para un volumen final de 2 mL.
    15. Suavemente agregar el NGF cargado PSiO2 portador o fresco murino β-NGF (50 ng/mL) por placa.
    16. Después de 2 días, fije el cultivo celular por incubación con una solución de paraformaldehido (PFA) de 4% durante 15 min a temperatura ambiente; el cultivo de células utilizando una común inmunofluorescencia que manchaba procedimiento31immunostain.
    17. Imagen de la cultura de células neuronales con un microscopio confocal.

7. Análisis de la diferenciación celular

  1. Porcentaje de diferenciación de las células PC12 en presencia de NGF cargado PSiO2 portadores
    1. Incubar el NGF cargado PSiO2 portadores en 2 mL de medio de diferenciación, en un incubador humedecido a 37 ° C con 5% CO2.
    2. Cada 2 días, recoger la solución y reemplazarla con 2 mL de medio fresco. Congelar las muestras de la versión recogida en nitrógeno líquido y almacenar a-20 ° C para mayores análisis.
    3. Células PC12 semilla 12-bien placas recubiertas de colágeno según las instrucciones en la sección 4.1 (4.1.3-4.1.6).
    4. Después de 24 h, introducir las muestras de la liberación de tiempo representativa puntos (sección 5.1.2) para los diferentes pozos; para los pozos de control, añadir β-NGF murino fresco (50 ng/mL).
    5. Después de 24 h, imagen de las células utilizando un microscopio de luz.
    6. Para determinar el porcentaje de células de cojinete de neurite, contar manualmente las células que habían superado los neurites en el número total de células en las imágenes (n = 5 fotogramas para cada pozo); gráfica de porcentaje de células PC12 con neurite consecuencia con el tiempo.
      Nota: Las células PC12 indiferenciada parecen redondeados estructura sin neuritas, mientras que las células diferenciadas pueden identificarse por la extensión de neuritas (al menos uno de longitud mínima igual al diámetro del soma de la célula) o cambios morfológicos.
  2. Análisis morfométrico de las células PC12 diferenciadas
    1. Para el análisis de procesamiento de imagen, adquirir imágenes de la fase de células cultivadas hasta 3 días después del tratamiento con NGF (como reactivo libre o como la versión del producto de los portadores de2 PSiO cargado de NGF).
      Nota: En momentos posteriores (más allá del día 5) las células desarrollan redes altamente complejas, evitando las mediciones morfométricas en una resolución de única célula.
    2. Descargar el programa de procesamiento de imagen NeuronJ, un plug-in, ImageJ que permite un seguimiento semiautomático neurita y medir la longitud.
    3. Convertir el archivo de imagen a un formato de 8 bits y píxeles medida relación micrómetro utilizando la barra de escala de la imagen.
    4. Establecer la escala usando el análisis | Comando Set de la escala y medida de la longitud de cada neurita.
    5. Contar manualmente el número de puntos de ramificación y el número de neuritas origina cada soma de la célula.
      Nota: Una neurita promedio longitud 1 día después del tratamiento de NGF es aproximadamente 30 μm. Las longitudes de la neurita medidos pueden distribuirse ampliamente.

Representative Results

Películas de PSi oxidadas se fabrican como se describe en el protocolo. La ostia Si se somete a la aguafuerte electroquímica por 20 s a 250 mA/cm2 (figura 1ai), seguido de oxidación térmica a 800 ° C (figura 1aii) para producir un PSiO2 andamio. Alta resolución, microscopía electrónica de barrido (HR-SEM) imágenes del PSiO2 film resultante se muestran en la Figura 1bc. Micrografía de la vista superior de la película (Figura 1b) muestra su naturaleza altamente poroso con poros de aproximadamente 40 nm de diámetro. Micrografía corte transversal de una película exfoliada (figura 1C) revela un espesor de capa porosa de 2,9 μm, caracterizado por la interconexión de los poros cilíndricos.

El PSiO2 películas se cargan con el NGF solución de carga como se muestra en la figura 1aiii. Carga de NGF se cuantifica mediante ELISA de NGF midiendo las concentraciones de NGF en la solución de carga antes y después de la incubación con el PSiO2 películas. La masa media del NGF cargado por PSiO2 película está determinada como 2.8 ± 0.2 μg, que corresponde a una carga alta eficacia de 90% (w/w) (datos no mostrados31). Para establecer el perfil de liberación de NGF de los portadores de PSiO2 , se incuban las películas cargadas en PBS a 37 ° C y se muestrean cada alícuotas de 2 días para la cuantificación de la concentración de proteína liberada mediante ELISA de NGF. Además, el contenido de Si en las muestras de liberación se cuantifica mediante ICP-AES y la cinética de erosión Si de los portadores de2 PSiO se establece. Figura 2 muestra la liberación de NGF y los perfiles de degradación Si correspondientes de los portadores de porosos. Se logra una liberación sostenida del NGF, sin efecto de la explosión, por un período de 1 mes. Liberación de NGF en la primera semana es más rápido (pendiente = 0.442) en comparación con una liberación mucho más lenta en los días posteriores a lo largo del período de lanzamiento (cuesta 0,043). Cabe señalar que durante el período de liberación 1 mes entero, la cantidad de NGF liberado es suficiente para inducir la profunda diferenciación de las células PC12, como se discutirá más adelante. El NGF acumulado liberado se encuentra en una buena correlación (R2 = 0.971) con el restante Si contenido, como se muestra en el recuadro de la figura 2.

A continuación, la bioactividad de los portadores de2 PSiO cargado de NGF es caracterizado en vitro, las células PC12 y las neuronas DRG se utilizan como modelos para derivación y diferenciación neuronal. Se siembran las células PC12 y disociada de las neuronas DRG como se describe en el protocolo. En primer lugar, se examina viabilidad celular en presencia de los portadores de PSiO2 por incubación de las células con aseado (no carga) o cargado de NGF PSiO2; placas de control y células tratadas con aseado PSiO2 se complementan con NGF libre cada 2 días. Citotoxicidad no se observa con la exposición de las células a los limpios o cargado de NGF PSiO2 portadores (figura 3a), demostrando que el PSiO2 es biocompatible con esta línea celular. Figura 3b muestra micrografías de SEM HR representante de células PC12 tratadas con los cargados de NGF PSiO2 portadores. La característica de neuritas y la forma de células observadas extracto ramificadas redes neuronales. Resultados similares se obtienen cuando se siembra disocia células neuronales de DRG en presencia de los portadores de2 PSiO cargado de NGF. Imágenes confocales de células DRG immunostained cultivadas con el NGF cargado PSiO2 portadores (figura 3e) muestran un extenso neurite iniciación y elongación, similar al control positivo(es decir, las neuronas con libre NGF, ver Figura 3d), mientras que el control negativo (es decir, las neuronas no tratadas, ver figura 3 c), exhibe un pobre grado de consecuencia del neurite.

Para evaluar el porcentaje de diferenciación de las células PC12 en presencia de NGF liberado de los portadores de PSiO2 , la diferenciación se cuantifica por contar las células con neurite consecuencia fuera de la población total de la célula. Figura 4 resume los resultados en términos de porcentaje de células diferenciadas en momentos diferentes durante un período de 26 días. Se alcanzan valores de porcentaje de diferenciación significativa durante todo el estudio. En particular, después de 26 días, NGF liberado ha inducido la diferenciación de sobre el 50%, un porcentaje de diferenciación que es significativamente superior en comparación con estudios previos con portadores basados en polímeros16. Estos resultados indican que captura de NGF en el host poroso conserva la actividad biológica de la proteína para inducir la diferenciación profunda durante un período de ~ 1 mes.

Para examinar más lejos el efecto del NGF-PSiO2 portadores en la diferenciación neuronal, se miden tres parámetros morfológicos característicos de las células PC12 diferenciadas a nivel unicelular: (i) el número de neuritas extraer del (de soma II) los neurites total longitud y (iii) el número de puntos de ramificación. Las células son tratadas con NGF cargado PSiO2 portadores o con la administración repetitiva de NGF libre (cada 2 días), como un control. Figura 5a -c se presenta el análisis morfométrico de la población de la célula en los días 1 y 3. Las células PC12 tratadas con NGF cargado PSiO2 muestran valores morfométricos que son similares para el tratamiento de control para los tres parámetros de prueba. Después de 3 días, se observaron los valores de los parámetros morfológicos para aumentar al mismo ritmo para los portadores de2 PSiO cargado de NGF y el tratamiento de control de la administración repetitiva de NGF gratis.

Figure 1
Figura 1: Fabricación de PSiO2 películas. (a) esquema de fabricación de los portadores de PSiO2 : oblea (i) silicio se somete a la aguafuerte electroquímica por 20 s a 250 mA/cm2, seguido de oxidación térmica (ii) a 800 ° C para producir un PSiO2 andamio y (iii) NGF de carga por adsorción física (esquemas no están dibujados a escala). (b-c) Vista superior y corte transversal micrográfos de electrón de una característica PSiO2 película. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Liberación de NGF y perfiles de erosión Si de NGF cargado PSiO2 transportistas. El grado de degradación de los portadores de PSiO2 se presenta como la fracción del contenido restante Si cada momento fuera el contenido total del Si de la película porosa. El recuadro muestra la correlación entre el NGF acumulado liberado y el resto Si contenido. Representan barras de error SD, n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Viabilidad celular y el crecimiento en la presencia de NGF cargado PSiO2 portadores. (a) In vitro caracterización de citotoxicidad. La viabilidad de las células PC12 se mide sobre 1, 3 y 7 días después de su exposición a aseado (no cargado) PSiO2 portadores, cargado de NGF PSiO2 portadores o NGF gratis (50 ng/mL cada 2 días, placas de control). (b) micrográfos de electrón de células PC12 cultivadas con NGF cargado PSiO2 portadores por 9 días. Panel de la izquierda: un zoom-in, que representa la consecuencia del neurite desde el soma de la célula; panel de la derecha: un zoom-out, lo que indica la red neuronal muy compleja formada. (c-e) Imágenes de microscopía confocal de immunostained DRG neuronal de la célula cultura (2 días después de la siembra): (c) no se trata de células; libre de células (d) complementadas con NGF (50 ng/mL); (e) NGF-PSiO2 portadores. Tinción inmunofluorescente de neurofilamentos H permite la proyección de imagen de soma de la célula y los neurites creciente. Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: valores de porcentaje de diferenciación con la exposición al NGF liberado de NGF cargado PSiO2 portadores en momentos representativos de células PC12. Porcentaje de diferenciación se expresa como el número de células con neurite consecuencia fuera de la población total de la célula. Tratamiento de control se refiere a células con NGF gratis (50 ng/mL). Imágenes de microscopía representativo de las células en los diferentes puntos temporales son descritos a lo largo del eje x; barra de escala = 25 μm de micrografías de días 2, 8, 14, 26 y 50 μm de micrografía de control. Representan barras de error SD, n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: análisis morfométrico de las células PC12 diferenciadas. Se miden tres parámetros morfológicos de las células PC12 diferenciadas, en el nivel unicelular, en el día 1 y 3 exposición siguiente cargado de NGF PSiO2 transportistas o la administración repetitiva de gratis NGF cada 2 días (control); número de longitud (b) (a) total neurites de neurites extraer del célula soma y (c) el número de puntos de ramificación. Representan barras de error SD, n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Películas degradables nanoestructurados PSiO2 son fabricadas y empleadas como portadores de NGF, permitiendo su liberación constante y prolongada, manteniendo su actividad biológica. El potencial del PSiO2 servir como un sistema de entrega para NGF es demostrado en vitro demostrando su capacidad para liberar la suficiente dosis de NGF para inducir la diferenciación neuronal y promover la extensión de células PC12 y las neuronas DRG. Las películas de ingeniería pueden utilizarse como reservorios a largo plazo de NGF para futuros tratamientos en vivo.

Las propiedades estructurales de las películas fabricadas de PSi fueron específicamente diseñadas para carga de NGF; la densidad de corriente del proceso de la aguafuerte electroquímica fue ajustada para obtener el tamaño de los poros de aproximadamente 40 nm que sería fácilmente acomodar el NGF, una proteína con un molecular weight de 26.5 kDa32 y un diámetro característico de ~ 4 nm33, dentro de la matriz porosa. Por otra parte, oxidación térmica del andamio poroso fue realizada para permitir la adsorción física de NGF por atracción electrostática de la proteína cargada positivamente a la superficie oxidada cargada negativamente de la PSi. La química superficial de PSi ejerce un efecto importante sobre la eficacia de la carga y puede ajustarse fácilmente con el fin de mejorar el control de las interacciones entre la carga y la matriz porosa. Posteriormente, estas interacciones determinan la estructura de las moléculas de proteína adsorbida y su bioactividad34,35,36. En conclusión, el sistema se ajustó para obtener una óptima carga de NGF seleccionando cuidadosamente el tamaño de poro adecuado, las características de superficie y el ideal carga del solvente y el efecto resultante de los dictados de los parámetros mencionados la carga de la proteína eficacia. Por lo tanto, cualquier cambio en los parámetros de fabricación (por ejemplo, densidad de corriente, tiempo de grabado, tipo y concentración de dopante o electrolitos), química de superficies o cargar la composición de la solución puede afectar la eficacia de la carga y la bioactividad de la cargados proteínas.

La tasa de liberación de una carga desde el host de2PSi orPSiO es dictada generalmente por una combinación de dos mecanismos simultáneos, hacia fuera-difusión de las moléculas de la carga útil y la degradación del andamio Si37. La erosión y la velocidad de disolución subsecuente son afectados por el sitio de implantación, su patología y enfermedad estado28,38,39. Fue establecido en trabajos anteriores que si una tasa de liberación diferentes es necesaria para una determinada aplicación terapéutica, el perfil de liberación puede ser modificado y prolongado, cambiando la química superficial de los PSi superficie38,40, 41. Han demostrado modificaciones químicas diversas, tales como la oxidación térmica, térmica carbonización y hydrosilylation técnicas, para estabilizar la superficie de PSi y afectan a su degradación y consecuente carga lanzamiento35,42 ,43,44,45. Por otra parte, carga de NGF en los portadores por el accesorio covalente de las moléculas de proteína al andamio Si a través de varias rutas de superficie química dará lugar a una liberación más prolongada debido a la carga sólo se libera cuando se rompen los enlaces covalentes o los apoyo Si matriz es degradado21.

Además, a raíz de su proceso de fabricación, PSi se puede procesar en varias configuraciones además de películas delgadas, tales como micropartículas46, nanopartículas47 o membranas independientes26, que también se puede emplear como portadores de para NGF y satisfacer necesidades específicas.

Para ser clínicamente relevantes, el contenido de NGF en el PSiO2 portadores debe alcanzar el rango de dosis terapéuticas. En el método descrito en el protocolo, los portadores de2 PSiO cargado de NGF se introducen en un volumen constante de 2 mL de medio de celular o tampón PBS y por lo tanto, la concentración de la solución de carga y la masa correspondiente de NGF cargada se ajustaron para rendir un libertad concentración de NGF que es relevante para el sistema probado en vitro . Al utilizar este método para diversos sistemas, tales como ambientes ex vivo o en vivo , la concentración de NGF carga solución debe ser aumentada y ajustada según la dosis necesaria. Por otra parte, mayor contenido de NGF puede obtenerse mediante la introducción de múltiples portadoras por área probado o mediante el uso de áreas más grandes de PSiO2 muestras.

Por otra parte, cabe señalar que en momentos posteriores a lo largo del período de lanzamiento, las concentraciones de NGF liberadas son mucho menores que en anteriores momentos. El hecho de que el flujo de NGF no es constante en el tiempo debe tomarse en cuenta al diseñar el sistema según las necesidades de aplicación.

Entrega de NGF numerosos sistemas han sido desarrollados y divulgados en la literatura, la mayoría de ellos son sistemas basados en polímero, compuesto de polímeros sintéticos o naturales conjugados10,11,12,15 , 16 , 17. estos sistemas han demostrado eficaces perfiles de liberación sostenida, sin embargo, el período de lanzamiento abarcó durante un período de varios días con un efecto de explosión significativa. Algunas de estas plataformas de distribución sufren de limitaciones críticas tales como la pérdida de bioactividad en el proceso de encapsulación, que requieren el uso de diferentes estabilizadores agentes18,48, así como de sofisticados y complejos técnicas de fabricación16. Uno de los mayores retos en el diseño de sistemas de administración de las proteínas es la capacidad para mantener la actividad biológica de las moléculas al quedar atrapado en el sistema. Proteínas o péptidos se pueden cargar en PSi/PSiO2 a temperatura ambiente o incluso a temperaturas más bajas sin necesidad de utilizar solventes orgánicos fuertes, que son dos factores importantes al cargar estas biomoléculas sensibles. Estudios anteriores han demostrado que PSi/PSiO2 química superficial juega un papel crucial en la reducción al mínimo posible desnaturalización de las proteínas cargados35,36. Por lo tanto, PSi/PSiO2 es un nanomaterial ventajosa para el desarrollo de sistemas de entrega para factores de crecimiento en general y NGF en particular.

El trabajo actual se centra en utilizar este método como un nuevo enfoque terapéutico para la administración directa del NGF en el SNC para el tratamiento potencial de enfermedades neurodegenerativas. Los portadores de2 PSiO cargado de NGF pueden ser implantados en el cerebro de ratones y la eficacia de la plataforma de los implantes a largo plazo es estudiada en vivo. Además, con este prometedor portadores biolística invasiva49,50 puede permiten administrar las cargado de NGF PSiO2 partículas en una resolución muy espacial a un área localizada mediante una novela neumática pistola capilar para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, donde se requiere una administración de la droga espaciotemporal. Más aún, NGF puede dirigir crecimiento neuronal en una manera gradiente química51, similares a las moléculas de la dirección del axon. Así, los portadores cargados de2 PSiO pueden servir como focos de atrayente a NGF, para dirigir el crecimiento, complementaria a otras señales dirección52,53. Además, los portadores de PSiO2pueden ser adaptados específicamente para mantener la entrega de NGF por un período de tiempo tan extendido de hasta varios meses más templando el PSiO2 nanoestructura y su química superficial.

Disclosures

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

MS y ES reconocer los principales servicios y apoyo Lorry I. Lokey del centro de la ingeniería, Ciencias de la vida y el apoyo financiero del Instituto de nanotecnología Russell Berrie en el Technion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

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Diseño de películas de silicio poroso como portadores de Factor de crecimiento nervioso
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Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).More

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

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