멀티 주입-모 세관 전기 이동 법 질량 분석을 사용 하 여 높은 처리량 및 포괄적인 약물 감시

Summary

여기 멀티 주입-모 세관에 따라 품질 관리와 향상 된 해상도 및 약물 남용 및 그들의 대사 산물의 대형 패널의 검출에 대 한 허용 하는 포괄적인 약물 감시 하는 높은 처리량 방법 설명 전기 이동 법 질량 분석입니다.

Abstract

새로운 분석 방법 긴급 한 놀라운 opioid 처방전 약물 위기와 공중 보건에 주어진 높은 처리량, 아직 포괄적인 약물 검사 수 있도록 필요 합니다. 가스 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (GC-MS/MS) 다음 기존의 소변 마약 테스트 기반 2 계층 immunoassay 화면 또는 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 메서드는 비싸고 바이어스 하는 경향이 있는 동안 학대 (DoA)의 알려진된 약물의 타겟된 패널에 제한 됩니다. 여기, 우리는 멀티 사출 모 세관 전기 이동 법 질량 분석 (MSI-CE-MS)를 사용할 때 해상도 DoA와 그들의 대사 산물의 확장 된 패널의 검출에 대 한 수 마약 감시에 대 한 개선된 방법 개요. 전체 스캔 데이터 수집을 사용 하 여 시간-의-비행 id에 대 한 긍정적인 이온 모드 감지에서 질량 분석기 (TOF-MS) 수와 함께에서 ce (< 3 분/샘플) 품질 관리와 함께 10 개의 소변 샘플의 분판 다중화와 위의 DoA의 정량화 커트 오프 수준을 권장합니다. 약물이 성체 및 분포, 배경 간섭 등의 우수한 해상도 어디에 정확한 샘플 세그먼트 사이 electrokinetic 스페이서와 MSI-CE-MS를 사용 하 여 달성 된다의 comigration 함께 질량/분자 수식 한 내부 표준 및 하나 검색 deuterated 일치 하거나 더 많은 바이오 변형 metabolites 넓은 탐지 창 DoA 식별을 용이 하 게 합니다. 또한, 소변 샘플은 복잡 한 샘플 검사 결과 없이 빠른 심사에 대 한 효소 deconjugation 하지 않고 직접 분석할 수 있습니다. MSI-CE-MS 수 있습니다 처방된 약물 준수 확인, 불법 마약 사용/대체, 공개 및 최적의 복용량 정권 평가 포함 하 여 위험이 높은 환자의 치료 모니터링에 필요한 DoA의 광범위 한 스펙트럼의 감시를 정밀 의학의 새로운 발전을 위해 필요에 따라.

Introduction

오용 및 만성 통증 관리를 위한 opioids에 중독에 놀라운 증가 나타냅니다 70000 약물 과다 사망 2017¹에서 예상 하는 미국에와 공중 보건에 성장 위협을. 마찬가지로, 다른 다양 한 정신 약물 또한 널리 어린이 불안, 우울증, 그리고 정신 건강 문제²의 치료에 대 한 젊은 성인에 게 처방 됩니다. 그 결과, 소변 마약 검사 방법, 직장 및 법정 독물학, 널리 개발 포용 력 및 의존^3,4경향이 있는 처방된 약물 치료 모니터링에 중요 한 중요성 이다. 이 잠재적인 대체, 불법 또는 nonprescribed 약물 오용 등을 공개 하면서 준수, 최적의 치료 효능과 환자 안전 보장 하기 위해 필요 합니다. 소변 약물 검사 사망에 대 한 2 계층 접근 방식에 의존 하는 현재는 초기 경쟁 immunoassay 화면 통해 이루어진 포인트의 케어 장치 또는 실험실 분석기, 뒤 확실 한 테스트를 큰 GC-MS/MS를 기반으로 그리고, 점점, LC-MS/MS⁵. 그러나, immunoassays는 경향이 편견, 항 체 약 바인딩할 nonspecifically 다양 한 약물 클래스는 신뢰할 수 있는 식별 및 특정 약물 또는 복잡 한 약물의 정량화 추정 화면-긍정적인 결과 생성 하 혼합물의⁶. 이러한 맥락에서 더 정확한 소변 약물 검사의 포괄적인 polydrug 화면⁷ 디자이너 약물을 포함 하 여 엄청난 비용을 감안할 때 필요한 긴급 하 고 합성 소변 제품 기존의 것 들을 대상으로 분석 합니다.

함께 고해상도 MS (HRMS) 또는 orbitrap TOF 질량 분석기를 사용 하 여 높은 효율 분판 polypharmacy와 DoA^{8,9 패널 확장의 시대에 마약 감시를 위한 nontargeted 전략으로 제안} . 그러나, 기존의 LC 분판 느린 (> 15 분) 때문에 긴 차입 시간 해상도 대 한 화학적으로 다양 한 클래스의 DoA의 및 그들의 대사 산물을 사용 하 여 그라데이션 차입 프로그램, 정기 마약 검사에 대 한 샘플 처리량을 제한 하는. 또는 직접 분석 방법을 탈 착 이온화 (DESI)¹⁰ 에 따라 하 고 레이저 다이오드 열 탈 착 (LDTD) 분리¹¹없이 심사 빨리 마약에 대 한 허용. 그러나, 이러한 주변 이온화 방법 복잡 한 소변 표본, 따라서 독립적인 확인 테스트 요구를 분석할 때 isobaric/이성질체 방해 하는 경향이 있다.

우리 연구소는 최근 MSI-CE-MS¹²에 따라 고효율 분리의 해상도 데이터 충실도 유지 하면서 샘플 처리량 증가를 다중화 분리 플랫폼을 개발 했다. 새로운 데이터 워크플로 디자인 될 수 있다 MSI-CE-MS에서 볼륨 제한 biospecimens의 (즉, metabolomics) 프로 파일링 nontargeted 대사 산물에 대 한 품질 컨트롤 (QC) 대규모 인구에 필요한 일괄 수정에 대 한 허용 하는 반면 연구¹³. 이 경우에, 분판 단일 내에서 10 개 이상의 샘플의 직렬 주사 수 있는 기존의 칼 집 액체 인터페이스를 사용 하는 경우 정상 용 매 조건 하에서 발생 하는 용 질 이온화와 isocratic 버퍼를 사용 하 여 수행 됩니다. DoA와 그들의 대사 산물¹⁴의 다양 한 클래스의 급속 한 아직 선택적 심사에 대 한 실행 합니다. 이 연구의 초점은 더 MSI-CE-MS 효소 가수분해¹⁵에 대 한 필요성을 피할 수 "희석-와-쏴" 방법을 사용 하 여 임상 우울증 환자의 대표적인 일대에서 본격적인 소변 샘플의 직접 분석에 대 한 유효성을 검사 하. 또한, MSI-CE-MS¹⁶ 직렬 샘플 플러그 사이 electrokinetic 스페이서의 구현 더 다양 한 약물이 성체/분포의 해상도 개선, 요도 방해 배경 수행 및 크로스-간섭 DoA의 대형 패널을 검사 하는 경우. 내부 표준 deuterated 일치를 사용 하는 경우 소변 표본에서 DoA의 절대 정량화 (d-는) MSI-CE-MS를 사용 하 여 때 설명 된다. 이 방법은 또한 화면-긍정적인 경우에 권장 약물 패널 혼합물에 비교 될 때의 올바른 샘플 위치 추론 뿐만 아니라 마약 식별 용이 하 게 심사 마감 수준 내에서 내부 참조/QC도 작동 같은 실행 합니다.

Protocol

멀게 소변 샘플 친절 하 게 그의 연구는 해밀턴 통합 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 세인트 조셉의 병원 (해밀턴, 캐나다), 기분 장애 클리닉에서 박사 자 Samaan에 의해 제공 되었다.

1. 시 약 및 샘플 솔루션 준비

1. 배경 전해질 준비
   1. 배경 전해질 (BGE) 격주, 1 M 개미의 산 성, pH 1.8, 유기 한정자로 15 %v / v 이기와 50 mL를 준비 합니다.
   2. aliquot 1.9 mL 50 mL 부피 플라스 크에 포 름 산 주식 (26.5 M)를 집중 하 고 7.5 mL 이기와 40.6 mL 50 ml 전체 볼륨을가지고 이온된 수의를 추가 합니다. 그런 다음, 15 분에 대 한 솔루션을 sonicate 고 꽉 밀봉과 소독된 한 병에 그것을 전송.
2. 칼 집 액체 준비
   1. 칼 집 액체 솔루션의 매주 0.1% 개미 산 성과 (MeOH:H₂O)에 구성 된 200ml를 준비 합니다.
   2. Aliquot 200 µ L 120 mL MeOH와 H₂O 칼 집 액체와 15 분 동안 드의 80 mL를 포함 하는 병으로 포 름 산 (26.5 M 주식)의.
   3. 다음 각 다음 참조 이온, 퓨 린 및 hexakis의 10 µ L를 추가 (2,2,3,3 tetrafluoropropoxy) m에 지속적인 대량 신호를 제공 하기 위해 칼 집 액체에 (HP-921), phosphazine /z 121.05087와 m/z 922.00979, 각각.
      참고: 이러한 참조 이온 실시간 대량 수정에 대 한 허용 하 고 또한 분리 하는 동안 잠재적인 매트릭스 유도 이온 억제 또는 향상 효과 대 한 모니터링.
3. 표준 준비
   1. 임상 심사 컷오프 x 3에 84-마약 패널 혼합물 화학 공급 업체에서 구입한 약물 표준을 사용 하 여 메탄올의 1 ml에서 (L6)¹⁴ 레벨을 포함 하는 표준 솔루션을 준비 합니다. 메탄올의 1 mL에 84-약물 혼합 보다 10 높은 농도에서 deuterated 내부 마약 표준 (d-ISs) 일치 하는 48의 혼합물을 별도로 준비 합니다. 또한, 4의 200 µ M를 포함 하는 재고 솔루션을 준비-플 루 오로-L-페닐알라닌 (F-페)와 3-클로-L-티로신 (Cl-Tyr) 이온된 H₂o.의 1 mL에
   2. 4-fluorophenylalanine (F-페, 10 µ L) 및 3-chlorotyrosine (Cl-Tyr, 10 µ L) 총 수 있도록 인증된 합성 소변 매트릭스 (40 µ L)의 10 배 희석 뿐만 아니라 위에서 언급 한 84 약물 혼합 (20 µ L)와 48 d-ISs (20 µ L), 오부 희석을 수행 250 µ L 원심 분리기 튜브에서 100 µ L의 볼륨.
4. 외부 교정 곡선 준비
   1. 준비 5-포인트 외부 보정 곡선 (아래 설명 참조) quadruplicate에서 (n = 4) 84-마약 표준 혼합물 및 단계 1.3.1에서에서 만든 그들의 해당 d ISs의 48를 사용 하 여 20-fold 동적 범위. 예를 들어 5-포인트 외부 보정 곡선을 만들기 위한 2-, 4-, 10-, 20-84-마약 혼합물 (L6, 단계 1.3.1) diluting 확인 및 40-fold, d-ISs (20 µ L) 및 4-F-페 (10 배 희석의 오부 희석을 준비 해야 하는 반면 10 µ L) 및 Cl Tyr (10 µ L) 100 µ L의 총 볼륨을 합성 소변 매트릭스에 추가입니다. 경우에서 일치 하는 d는 특정 약물에 대 한 사용할 수 없는 경우 데이터 정규화에 대 한 사용 4-F-페 대리로 이다.
      참고: 방지 크로스 방해 추가 d-ISs의 포함 (isobaric) 그들은 완전히 해결 되지 CE 분리 하는 경우 패널 내에서 다른 DoA와.
5. 소변 샘플 준비
   1. Deidentified 아침 소변 샘플 알려진된 처방전 약 역사 10 임상 우울증 환자의 대표적인 코 호트에서 녹여 그들은 분석에 대 한 해 동 할 때까지-80 ° C에서 소변 샘플 수집 후 저장 합니다.
      참고: 여러 freeze-thaw 주기를 소변 또는 특정 사망 대사 산물 그리고 그들의 어원이 같은 말의 화학 안정성에 미치는 영향으로 인해 컬렉션 다음 실 온에서 지연된 저장 하지 마십시오.
   2. 소용돌이 deidentified 아침 소변 샘플 30 s 고, 다음, 침에 대 한 14000 x g 에서 1 분 동안 원심. 그 후, 위에서 언급 한의 aliquot 10 µ L 처리 소변, 10 µ L d의-, 그리고 이온 H₂O, 그리고 1 분에 대 한 소용돌이의 F-페/Cl-Tyr와 25 µ L의 5 µ L (기술적인 정밀도 평가 하기 위해 3 중에이 단계를 반복 하는). 분석에 대 한 폴 리 프로필 렌 유리병을 위에 설명 된 혼합물의 20 µ L 약 수를 전송 합니다.

2. CE TOF MS 시스템의 설치

1. 매개 변수를 조절 하는 비 코팅된 융합 된 실리 카 모 세관
   1. 모든 표준, 외부 보정 곡선, 그리고 소변 샘플 섹션 1.3-1.5에서 50 μ m, 360 µ m의 외부 직경의 내부 직경이 uncoated 오픈 관 융합 된 실리 카 코팅 구체의 모 세관을 사용 하 여 분리 되어 있는지 확인 및 총 모 세관 길이 135 cm입니다.
      참고: 다이아몬드 커터 도구 플러시 및 부드러운 컷을 보장 하기 위해 검사 더 일관 된 모 세관을 보장 하기 위해 사용 됩니다.
   2. 모두 말 초 모 세관 끝에서 잠재적인 구체의 유기 용 매와 접촉 하면 붓기를 방지 하는 모 세관 창 메이커 샘플 이어지기를 줄이기 위해 사용 하 여 폴 리 이미 드 코팅의 약 7 m m를 제거 합니다.
   3. CE 분무기 바늘에서 모 세관 출구의 약 2 mm를 내 다 고 두 360 ° 회전을 반복 하 여 CE 카트리지에서 모 세관 입구를 설치 해야 합니다. 그럼, 신중 하 게 CE에 CE 카트리지를 설치 하 고 모 세관을 컨디셔닝 때 이온 소스에서 CE 분무기를 배치.
      참고: 컷 그것으로 일관 되 게 모 세관 출구 현재 MS에 결합 될 때 안정적인 분무 보장 위해 결정적 이다. 두 개의 다른 스프레이이 작품에서 사용 되었다: CE 분무기 샘플 분석을 위해 사용 되었다 그리고 LC 분무기 대량 캘리브레이션에 사용 되었다.
   4. 이온 소스에 배치 되지 CE 분무기와 컨디셔닝 모 세관을 수행할 수 있는지 확인 합니다. LC 분무기 이온 소스에 넣어.
      참고:이 이후에 TOF MS에 결합 하는 동축 칼 집 액체 인터페이스의 어떤 오염 든 지 피하고 있는 동안 대량 교정할 수 있습니다.
   5. 악기를 제어 하 고 다음 순서에 따라 4 개의 다른 용 매에 대 한 각 30 분에 플러시의 지속 시간을 설정 하는 데 사용 하는 공급 업체의 소프트웨어에 플러시 기능 (940 mbar)를 선택 하 여 새로운 모세 혈관을 조건: 메탄올, 1 M NaOH, 이온된 물, 그리고 BGE입니다. 모 세관 조절 기간 동안 대기에서 isocratic 펌프를 넣어 있는지 확인 합니다.
   6. CE-MS 분무기 MeOH/H₂O 어떤 잔여 소금 예금을 제거 하에 배어 조직 닦아 닦아.
   7. 샘플을 분석 하기 전에 CE-MS 시스템의 일일 예방 유지 관리를 수행 합니다. 메탄올을 사용 하 여 CE 전극 (입구)의 아래로 닦아 하지만 소 프로 파 놀을 사용 하 고 물 청소 소금 형성을 방지 하 고 잠재적인 샘플 수행을 제한 하는 것이 중요 하다는 CE MS 인터페이스 (50: 50) 혼합물.
   8. 이온 소스에서 LC 분무기를 제거 하 고 CE MS 동축 칼 집 액체 인터페이스에 새로 에어컨된 모 세관으로 청소 스프레이 위치.
   9. Isocratic 펌프를 켜고 30의 전압을 적용 안정적인 CE 현재 프로필 소변 분석 전에 달성 되도록 15 분 kV.
2. CE를 사용 하 여 주입 및 분리 상태
   1. CE 매개 변수를 설정 하 고 선택 하는 단계를 거치기에 악기를 제어 하기 위한 사용 하는 공급 업체 소프트웨어를 엽니다. 설정 기능을 플러시 600의 BGE 유리병 위치를 지정 하 고.
      참고: 외부 물 냉각기로이 볼륨 제한 샘플의 대규모 배치를 분석할 때 샘플 증발을 방지 하는 데 필요한 샘플 트레이 기능, 냉각 부족 CE 시스템에 연결 해야 합니다.
   2. Hydrodynamically 5 100 mbar에서 샘플을 주사를 주입 기능 설정 s electrokinetically 30 BGE 스페이서를 삽입 하 고 75 k v s.
      참고:이 프로세스 (다른 유리병 위치)에서 총 11 이산 샘플 분석 소프트웨어에 방법 프로그램 내에서 자동으로 수행 되는 (동일한 유리병 위치)에서 BGE 공백 뒤 각 샘플 주입이 반복 되는 같은 때 MSI 형식을 사용 하 여 실행 합니다. 10 소변 샘플을 분석 심사 마감에 84-패널 약물 혼합 후 임의의 순서로 수준 각 MSI-CE-MS 실행에 대 한 첫 번째 샘플 위치도 주입.
   3. 설정 하는 전압을 적용 30 kV, 25 ° C, 및 총 런타임 카트리지 온도 시간표를 사용 하 여 40 분 적용 2min mbar의 압력 기온 변화도 0 분에서 40 분을 분리 하는 동안.
      참고: 그라디언트 압력 일부 약하게, 기본적인 benzodiazepines 포함 느린 마이그레이션 약물과 중립/산 성 약물 (예를 들어, 아 세트 아미노 펜, 바비 투르)의 차입에 대 한 허용 하도록 분리 하는 동안 적용 됩니다. 그러나, 가장 기본적인 DoA와 그들의 대사 산물 암페타민, opioids, 그리고 알 카 로이드의 다른 클래스를 포함 하 여 25 분 이내 양이온으로 마이그레이션합니다.
   4. 샘플 수집을 완료 한 후 다음 날까지 BGE와 낮은 압력 (50 mbar)에 모 세관을 씻어 있는지 확인 하십시오. 그렇지 않으면, 린스 600 모 세관 높은 압력 (900 mbar) 물으로 그리고 600 s s 공기, 다음 사용 때까지 분무기 홀더에 저장.
3. Isocratic 펌프와 액체 칼 집
   1. CE-MS 분무기에 10 µ L/min의 속도로 칼 집 액체 (0.1 %v / v 포 름 산과 MeOH:H₂O)를 제공 하는 인피니티 Isocratic 펌프와 무한대 Degasser를 사용 합니다.
4. TOF-MS 설정
   1. TOF-MS, 동축 칼 집 액체 분무 이온 소스와가 열 된 질소 가스는 CE 장치를 갖추고 있는지 확인 합니다.
   2. 긍정적인 이온 탐지 를 m의 질량에서 TOF MS 운영 /z 50-1700, 데이터 수집 속도 500 ms/스펙트럼의. 되도록 프로필 및 중심 데이터 ".d" 파일 형식으로 저장 됩니다.
   3. 되도록 분무 이온화 조건 설정: Vcap 및 노즐 2000 V 전압, 10 psi에 분무기 가스 건조 가스 배달 195 ° c.에 3.5 L/min의 칼 집 가스 흐름 300 ° C에서 8 L/분 또한, MS 전압 설정을 설정 fragmentor, 제비 갈매기, 그리고 Oct1 RF의 120, 65, 및 750 V, 각각.
      참고: 분무기 가스 뿐 아니라 Vcap 및 노즐 전압 설정이 해제 되어 있었고 MSI-CE-MS에서 사용 하는 직렬 샘플 주입 순서 동안 하지만 켜야 다시 1 분 전류를 방지 하기 위해 전기 이동 별거의 개시 후에 분무 짜여졌다 오류 suctioning 효과 때문입니다.
   4. 공급 업체의 소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 인스트루먼트 컨트롤 및 데이터 수집을 수행 합니다.
5. 데이터 분석
   1. MSI-CE-MS 데이터 처리, 데이터 스무 딩, 그리고 대표 사망에 대 한 추출된 이온 electropherograms (EIEs)의 통합 및 그들의 대사 산물을 포함 한 공급 업체의 소프트웨어를 사용 하 여 분석 합니다.
   2. 소프트웨어를 열고 다음 매개 변수를 설정 합니다.
      1. Chromatograms에서 추출 데이터 형식, 그리고 프로 파일 모드에 크로마와 질량 스펙트럼 데이터 포맷 을 선택 합니다.
      2. 이차/큐빅 Savitzky Golay 다듬기 기능 및 함수 폭 15 포인트를 선택 합니다.
      3. 다음 통합 (MS)를클릭 합니다 Agile, 되도록 통합 설정 하 고 피크 필터아래에서 가장 큰 11 봉우리 제한의 최대 수를 선택 합니다.
      4. 보기를 클릭 하 고 통합 피크 목록, 클릭 한 최대 수, 보존 시간 (RT), 피크 면적, 피크 높이및 신호 대 잡음 비율 (SNR)를 선택 합니다.
      5. 고유한 메서드 이름 아래 이러한 매개 변수를 저장 합니다. 이 메서드는 프로세스에 적용 하 고 각 데이터 집합을 해석.
         참고: 최대 수와 요약 표, RT, 피크 면적 및 높이 및 SNR 오른쪽에 표시 됩니다. 측정 된 RT와 d를 중 하나는 일치 하는 각 사망에 대 한 통합 된 피크 지역에 대 한 데이터 정규화를 수행-은 또는 (해당 되는 경우 사용할 수 없음) F-페 분석 정밀도 향상 시키기 위해.

3. 소변 샘플 및 외부 교정 곡선의 분석

1. MSI-CE-MS에서 사용 하는 다른 직렬 주입 구성
   1. 첫 번째 직렬 샘플 주입 구성, 약물이 성체/동 해상도 (그림 1A)를 설명 하는 데 사용에 대 한 확인 5 주사는 d 84 마약 표준의 혼합물에 수행 반복-는 4-F-페/Cl-Tyr, 뒤는 6 주입, 빈 샘플에에서 있는 합성 소변, 그리고 표준 약물 혼합물의 5 개의 추가 주사.
   2. 두 번째 직렬 샘플 주입 구성, 알려진된 처방 (그림 2A)를 가진 환자에서 개별 소변 샘플에서 DoA의 탐지를 보여 주기 위해 사용에 대 한 첫 번째 샘플 플러그에 84-마약 표준 혼합물의 혼합물 인지 하는 것을 확인 한 컷오프 심사 수준 (긍정적인 제어) x 1 다음 10 희석된 소변 샘플의 무작위 주사 환자에서: #293, #88, #309, #43, #281, #64, #221, #208, #183, 및 #50.
   3. 세 번째 직렬 샘플 주입 구성, 단일 실행에서 외부 교정 곡선의 인수를 설명 하는 데 사용에 대 한 사망에 대 한 calibrant 솔루션 20-fold 선형 동적 범위 0.25에 준비가 확인 x, 1 x 0.5 x 2.5 x, 그리고 d-F-페/Cl-Tyr 그리고 합성 소변 매트릭스에 추가 그대로 일치 함께 컷오프 농도 x 5 (n = 4).

Representative Results

MSI-CE-MS의 처리량을 크게 향상 시켜 단일 실행 내에서 10 개 이상의 개별 샘플 직렬 주입 수 있습니다 (< 3 분/샘플) 복잡 한 경 음악 수정, 열 전환 프로그램 또는 비용이 많이 드는 인프라 없이 투자 (그림 1A)입니다. BGE의 샘플의 유체역학 주사와 electrokinetic의 대체 시리즈 이온의 구역 전기 이동 별거 강산 전해질 조건 (pH에서 발생, 한 수정 되지 않은 융합 된 실리 카 모 세관 내에서 수행 1.8). 용액의 이온화도 정상 상태 조건 하에서 발생 합니다. 이 경우 동축 칼 집 액체, 대량 calibrant 사용 됩니다 인터페이스 CE MS에 대 한 최소한의 이온의 억제 또는 강화 효과 대량 calibrant 이온 신호에 의해 모니터링으로 긍정적인 이온 모드 감지 아래. TOF는 MSI-CE-MS를 사용 하는 경우 nontargeted 심사/마약 감시 응용 프로그램에 적합 한 빠른 데이터 수집으로 강력한 아직 비용 효과적인 HRMS를 나타냅니다. 예를 들어 다양 한 isobaric/이성질체 DoA와 3 opioid 구조이 성체, 즉 norhydrocodone, hydromorphone, 그리고 모 르 핀 (그림 1B)의 구조이 성체를 포함 하 여 그들의 대사 산물에 대 한 인상적인 해상도 달성 된다. 이 경우에, 30 해결 마약 혼합물의 10 독립 샘플에서 봉우리 샘플 수행 하지 않고 검색 됩니다. 합성 소변 빈/부정적인 소변 제어 직렬 주입 시리즈 내에서 포함 되어 있습니다 (샘플 위치 #6). 또한, 두 개의 다른 isobaric opioids, 즉 6-acetylmorphine (비활성 헤로인 대사 산물)과 naloxone (한 opioid 수용 체 길 항 근 opioid 약물의 응급 치료를 위해 사용) 전체 스캔 데이터 수집 (20 가지 봉우리로 완벽 하 게 해결 됩니다. 그림 1C)입니다. 마찬가지로, 두 암페타민 위치이 성체 MSI-CE-MS phentermine, 체중 감소 식욕 억제제로 사용 되는 처방된 자극 제의 잠재적인 오용 불법 메 담 페타 민 남용 구별에 완벽 하 게 해결 됩니다.

그림 1: 시리즈의 대표적인 사망이 성체/분포 10 샘플 및 단일 실행 내 빈을 분석 하 여 MSI-CE-MS에 의해 해결에 대 한 추출된 이온 electropherograms (EIE). (A) 회로도의 MSI-CE-MS 합성 소변에 84-DoA 패널 사용 하는 직렬 주입 구성을 나타냅니다. 이 다중화 분리 방법을 사용 하 여 11 이산 샘플 및 빈의 유체역학 주사의 대체 시리즈 버퍼의 electrokinetic 주사와 이온, 전체 스캔 데이터 다음의 구역 전기 이동 별거를 시작 긍정적인 이온 모드 감지 TOF MS에 의해 취득. (B) 3 isobaric 기능 그룹 opioid이 성체 (m/z 286.1438), 세 륨, norhydrocodone, hydromorphone, 그리고 모 르 핀을 포함 하 여 10 개별 샘플 주사에서 30 해결된 봉우리를 구성 하 여 분리. (C) 2 isobaric opioid 약물과 그들의 대사 산물 (m/z 328.1543), ce, 6-acetylmorphine (헤로인 대사 산물) 등 naloxone 10 개별 샘플 주사에서 20 해결된 봉우리로 구성 된 분리. (D) 2 isobaric 기능 그룹 암페타민이 성체, CE, 구분 20 해결된 봉우리 10 개별 샘플 주사, 메 담 페타 민, phentermine 등으로 구성 된. 모든 경우에, 부정적인 소변 컨트롤/공백 MSI-CE-MS는 6 샘플 위치에 소개 샘플 수행의 사소한 증거를 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

DoA 검열, MSI-CE-MS에서 직렬 주입 구성 권장에 84-마약 패널 혼합물을 사용 10 대표 소변의 무작위 분석 뒤에 커트 오프 농도 (모든 실행에 대 한 첫 번째 주입 위치)으로 심사 알려진된 처방전 역사를 가진 임상 우울증된 환자에서 샘플. 긍정적인 심사 메타 돈에 대 한 결과 테스트 하는 예를 들어, (m/z 310.2165) 환자에서 #208 (그림 2A) (사출 # 9에서에서 발생 하는) 낮은 메타-d3와 comigrates는 큰 신호 피크의 검출에 의해 추론 오류 질량 (< 5 ppm). 다른 신호는 동일한 실행 내에서 다른 소변 샘플에서 검출 된다. 메타 돈 농도 기준 약 혼합물/QC (사출 #1)와 샘플 (사출 #9)에서 측정 된 이온 응답 비율을 비교할 때 13 배 권장된 마감도 초과 하 고 사중 소변 희석 요인에 의해 수정. 따라서,이 결과 메타 돈 정비 치료는 환자의 준수를 확인합니다. Nonprescribed 암페타민 섭취 (그림 2B)의 증거는 높은 암페타민 수준으로 표시 됩니다 (m/z 136.1121)는만 한 환자 (환자 #50, 주입 # 11에서에서) MSI-CE-MS 실행 내에서 감지 되었다. 측정 된 농도 약간 권장된 컷오프 수준 초과 (1.3 x). 이 암페타민 d5와 comigrates 그리고 상위권 분자 공식 경기와 낮은 대량 오류가 발생 했다. 항우울제 벤라팍신에 대 한 긍정적인 테스트 결과 (m/z 278.2115), 선택적 세로토닌-노르 재흡수 억제제 환자 #281 (사출 #6)에 설명 된다. 이 경우에, 농도 초과 권장된 컷오프 수준 (15 x),이 의해 그것의 정확한 질량 또는 분자 공식-일치, comigrating 벤라팍신-d6 (그림 2C) 함께 식별 됩니다. 후자의 기준의 정확한 질량에 전적으로 의존 하는 경우 주의 대 한 필요성을 강조 하는 EIE 추적 내에서 감지 하는 알 수 없는 동에 대 한 충족 되지. 또한,의 뿐만 아니라 neuropathic 고통의 처리를 위해 소정의 pregabalin의 확실 한 검색 일반화 불안 또한 환자 # 309에 대 한 설명, 권장 위에 그것의 조잡 한 높은 농도 (64 x)에 따라 차단 수준 (그림 2D)입니다. 그러나 그것은,, 하지 감지는 9 다른 환자 소변 샘플 같은 내 분석 실행. 다른 화면-긍정적인 경우와 마찬가지로, #4, 주입 pregabalin-d6, MSI-CE-MS에 의해 분석 하는 모든 소변 샘플에 포함 되어 있는 comigrates.

그림 2: 일련의로 10 임상 우울증 환자의 코 호트에서 대표적인 화면-긍정적인 소변 마약 테스트 결과 대 한 추출된 이온 electropherograms (EIE) 때 권장에 84-마약 패널 MSI-CE-MS를 사용 하 여 확인 차단 수준, 내부 참조/QC로 첫 번째 샘플 주입 위치와 주입. (A) EIE 오버레이 해당 메타 돈-d3, 메타 돈으로 comigrates 하는 단 한 소변 샘플을 강조 (주입 위치 #9) 메타 돈 농도 커트 오프 수준을 초과 상승. (B) EIE 오버레이 암페타민-d3, 암페타민과 comigrates에 그 하나만 소변 샘플을 강조 (주입 위치 #11) 커트 오프 수준 이상의 농도 상승. (C) EIE 그 하나만 소변 샘플을 강조 벤라팍신-d6, 벤라팍신과 comigrates, 해당 오버레이 (주입 위치 #6) 차단 수준 이상의 농도 상승. (D) EIE 그 하나만 소변 샘플을 강조 pregabalin-d6, pregabalin와 comigrates, 해당 오버레이 (주입 위치 #4) 조잡 한 커트 오프 수준을 초과 하는 농도 상승. 모든 소변 샘플 d를 일치의 추가 함께 이온된 수에 오부 희석 후 직접 분석 했다-(사용 가능한 경우)입니다. D-ISs 낮은 대량 오류와 함께 comigrates 약에 해당 하는 MSI-CE-MS에서 화면 양성 결과 (< 5 ppm) 및 그 농도 초과 잘라 내부 참조/QC로 동일한 실행 내에서 분석 하는 정확한 분자 공식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

MSI-CE-MS 외부 교정 곡선에 따라 단일 실행 내에서 빠르게 인수는 DoA에 대 한 참조 calibrant 표준을 사용 하 여 사용 DoA와 그들의 대사 산물의 절대 정량화를 또한 얻을 수 있다. 예를 들어, 직렬 희석 84-약 calibrant 혼합물의 일치 하는 함께 d-에 고정된 농도 복잡 한 소변 샘플에서 신뢰할 수 있는 정량 분석을 제공 합니다. 이 샘플 사이의 모 세관에 주입 볼륨 변화 뿐만 아니라 잠재적인 매트릭스 유도 이온 억제 또는 강화에 대 한 보상. 경우에서 일치 하는 d은 상업적으로 사용할 수 없거나 특정 사망에 대 한 비용 금지 대리는 이전 같이 d-IS에서 동일한 약물 클래스 또는 합성 화합물에서 찾을된 수 없습니다 소변 (F-페), 같은 데이터 정규화에 사용 되 ¹⁴. 대표 EIEs 및 옥 시 코 돈에 대 한 외부 교정 곡선 그림 3A, B에에서 나와 있습니다. 그리고 citalopram 그림 3C, D에에서 대 한. 이 널리 처방 진통제와 항우울제, 각각, 남용 잠재력. 상대 이온 응답 비율을 일치 하는 그들의 d-는 측정 됩니다. 이 경우에, MSI-CE-MS, 5 다른 약 calibrants, 구성에서 직렬 주입 구성 중복 합성 소변 빈 함께 단일 실행 내에서 분석 된다. 전반적으로, 좋은 선형성 (R² > 0.990) 20-fold 농도 이상의 범위 패널 내에 84-마약 DoA와 (즉, 양이온 alkaloids) 그들의 대사 산물의 대부분의 검색에 대 한 적절 한 감도와 달성 했다 ¹⁴. 모든 경우에, 약물 metabolites 감지 됩니다 그들의 심사 마감 위에 그들의 protonated 분자 이온 [MH⁺] 제한 (> 50 ng/mL), 특정 산 성/중성 약에서 가난한 이온화 효율을 제외 하 고는 (예를 들면, 마리화나-COOH), 바비 (예, secobarbital), cannabinoids 및 면제가 (예를 들어, 캐 러) 등 긍정적인 이온 모드.

그림 3: 일련의 대표 DoA의 정량화에 대 한 추출된 이온 electropherograms (EIE). 그들의 상대 이온 응답 비율에 따라 외부 교정 곡선을 생성 하 여 이렇게 한 일치 d-20-fold 선형 동적 범위입니다. (A)의 옥 시 코 돈-d3 및 빈 옥 시 코 돈 calibrants의 5-포인트 보정 곡선의 주입을 중복. 옥 시 코 돈, 파생 (슬로프) 및 선형성 (R²), 선형 회귀 ±1σ를 나타내는 오차 막대와 다음에 대 한 (B) 외부 보정 곡선 (n = 4). (C) 주입의 citalopram d6 및 빈 citalopram calibrants 5-포인트 보정 곡선의 중복. (D) 외부 교정 곡선 citalopram, 감도 (슬로프) 및 선형성 (R²), 파생 선형 회귀 오류와 함께 다음과 같은 바 대표 ± 1 SD (n = 4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

기존의 크로마 분판은 일반적으로 복잡 한 약 혼합물 및 열 가공을 해결 하기 위한 그라데이션 차입 뒤 다음 실행 당 단일 샘플 주입에 의존 합니다. 이러한 요구 사항을 근본적으로 제한 샘플 처리량 및 듀티 사이클 최적의 열 전환 프로그램을 사용 하는 경우에. 이러한 맥락에서 직장, 독성, 또는 GC-MS/MS와 LC-MS/MS 점점, 치료 모니터링 응용 프로그램에 대 한 높은 볼륨 소변 약물 분석은 이렇게 병렬로 수행 하지만 두 번째 계층으로 우선적으로 사용 또는 확정 때 테스트 (즉, 법적 또는 의료 컨텍스트) 필요. 이것은 데이터 분석 합병증 뿐 아니라 훨씬 더 높은 자본 투자 및 운영 비용, 공인된 실험실 내에서 여러 수단이 플랫폼 분석 샘플을 비교 했을 때. 결과적으로 immunoassays는 여전히 경향이 가양성 및 false 네거티브 많은 마약 클래스 중 신흥 디자이너 약물에 대 한 항 체 시 약에 제한 된 액세스로 임에도 불구 하 고 일상적인 마약 검사에 대 한 기본 방법 남아 있다. 이전 연구는 MSI-CE-MS에 따라 멀티플렉스 분판 한 크기 순서까지 샘플 처리량을 향상 시키기 위해 간단한 솔루션을 제공을 증명 하고있다. 또한,이 방법은 높은 데이터 충실도 효과적인 일괄 수정 및 품질 관리^12,,1314의 구현에 따라 바이오 마커 발견에 대 한 새로운 데이터 워크플로 디자인에 대 한 수 있습니다. 그러나, 10 또는 더 연속 유체역학 주사 MSI-CE-MS에 도입 효율 분판, DoA에 그들의 대사 산물을 분석 하는 경우 선택도 손상 될 수 있는 유지 하는 데 필요한 효과적인 모 세관 길이 단축 인간의 소변

분리를 사용할 때 중요 한 약물 분포/이 성체의 해상도 향상 전체 모 세관 길이 (120 cm), 활용 되도록 각 유체역학 샘플 주입 다음 BGE의 electrokinetic 주사 여기, 도입 전체 검색 TOF-MS (그림 1A)에 의해 데이터 수집 합니다. 최근 보고서¹⁴의 경우에 비해 더 나은 해상도 큰 마약 패널 심사 때이 매우 중요 몇 가지 중요 한 isobaric/이성질체 DoA와 그들의 대사 산물에 대 한 달성 된다. 예를 들어, 몇 가지 중요 한 구조/기능 그룹이 성체의 해상도 실현 되었다, 3 개의 유사한 opioid 약물/대사 산물 (그림 1B), 두 메 담 페타 민, 2 개의 비관련된 opioid 분포 (그림 1C), 등 위치이 성체 (그림 1D) 모든 경우에 동일한 실행 내에서 서로 다른 calibrant 솔루션의 직렬 주입에서 샘플 이성 부정적인 소변 제어/빈에 의해 확인으로 중요 하지 않습니다. 또한, 향상 된 해상도 또한 특정 d-ISs cotinine d3 및 3, 4-methylenedioxyamphetamine (MDA), EDDP d3 등 imipramine, 패널 isobaric 약물과 관련 된 여러 간 간섭에 대 한 실현은 norfentanyl d5 및 케 타 민, 코데인-d6 및 설트랄린, 코카인-d3 그리고 졸 피 뎀. 이 결과 주요 배경 요도 방해 뿐만 아니라 다른 isobaric 방해 패널 내에서 약물이 연구 (예를 들어, noroxycodone/oxymorphone, normeperidine/methylphenidate), 더 나은 해결 확장 (예: , 소스 조각 암페타민과 크의 이온)¹⁴. 실제로, 특정 DoA의 putative 식별을 위해 두 개의 직교 매개 변수에 대 한 액세스가 거짓인 isobaric 간섭, 즉 정확한 인해 대량 d-ISs와 comigration와 결합을 줄이기 위한 중요 합니다. 또한, 하나 이상의 biotransformed 대사 산물 부모 약 hydroxylated, demethylated, 또는 그대로 glucuronide 마약 등 동일한 샘플 내에서 검색 conjugate(s), 창 확대 하면서 마약 식별으로 자신감을 더 추가 대 한 검색.

소변 약물 검사에 대 한 권장된 마감 레벨에서 지침에 따라 방법을 바이어스를 줄이기 위해 그들의 약 동학, 독성, 그리고 배경 간섭에 따라 (1000 ng/mL에서 50까지) DoA의 다른 클래스에 대 한 광범위 하 게 다 약물 남용 및 정신 건강 서비스 행정 (SAMHSA)¹⁴. MSI-CE-MS를 감지 하 여 최소한의 샘플 전처리와 소변에 직접 DoA의 다양 한 클래스를 식별에 대 한 잠재적인 알려진된 처방 기록 임상 우울증된 환자 그룹에 적용 되었습니다. 메타 돈 (처방), 암페타민 (nonprescribed/불법), 벤라팍신 (처방), 희석, 아직 nonhydrolyzed, 소변 샘플에 (처방) pregabalin의 확실 한 식별 MSI-CE-MS를 사용 하 여 때 시연 했다. 이 권장에서 첫 번째 샘플 위치에 84-약물 혼합 한 특정 주입 위치에서 검색 된 약물의 직접적인 비교에 근거 했다 심사는 내부 참조/QC 및 긍정적인 통제로 인하 수준 (그림 2)입니다. 또한, 절대 마약 정량화 때 가능한의 d 기준으로 약물에 대 한 측정 이온 응답 비율에 따라 외부 보정 곡선 (그림 3)를 사용 하 여-이다. 가장 컬럼에 분판, 달리는 마이그레이션 시간 차이 d에 영향을 미치는 중수소 효과가 없습니다-은 및 그것의 nondeuterated 약물 때문에 유사한 전기 이동 mobilities ce에서 무료 솔루션 보유. 실제로, DoA의 마이그레이션 동작 정확 하 게 ce, 즉 분자 볼륨 및 효과적인 충전 (pK는_는)¹⁴그들의 기본적인 물리 화학적 속성/화학 구조에 따라 모델링 됩니다. 때문에 많은 약물도 심사 마감 레벨 조정으로 그들의 측정된 농도 보다 낮은 예상에 비해 필요 (예를 들어, 모 르 핀 glucuronide), 소변에서 배설 하기 전에 중요 한 이차 대사를 받 다 총 약물 검출을 위한 효소 가수분해를 활용 하는 방법. "희석-와-쏴" 소변 약물 테스트, 비용/시간, 샘플 처리, 그리고 잠재적인 편견 또는 일괄 유사 때문에 불완전 한 효소 가수분해를 줄이는 외의 주요 혜택은 그 추정 화면-긍정적인 경우 추가 확인은 동일한 샘플 내에서 하나 이상의 관련된 약물 metabolites의 탐지. 이것 또한 제공 한다 마약에 대 한 깊은 통찰력 개별 환자에 대 한 약 동학 및 최적 복용량 요구를 "빠른" metabolizers 또는 짧은 반감기와 처방/불법 마약에 대 한 검색을 개선 하는 동안. 또한, comigration는 일치와 d-MSI-CE-MS를 사용 하 여 때 상영 하는 신뢰할 수 있는 약물에 대 한 재생 두 가지 중요 한 기능입니다-즉, 이온의 차이 또한 수정 하는 동안 (즉, 환자 #) 정확한 샘플 주입 위치 식별 향상 된 정밀도 정확도 대 한 응답/주입 양.

미래 작동 다중화 분판 HRMS 대량 소변 마약 QC/QA 테스트에 필요한 결합의 자동화 된 데이터 처리를 촉진 하기 위하여 사용자 지정 된 소프트웨어 도구를 개발 하는 것을 목표로 합니다. DoA의 넓 스펙트럼 심사에 대 한 MSI-CE-MS의 엄격한 유효성 검사는 또한 조사 위험이 높은 환자의 큰 동료 중 처방된 약 준수 및 잠재적인 오용/대체 손상 시킬 수 있는 객관적으로 평가 하기 위해 치료 효능, 환자 안전, 및 정신 평가/진단 또한 천연/합성 cannabinoids의 포괄적인 검사에 대 한 부정적인 이온 모드 감지 필요에 따라 알칼리 성 조건 하에서 산 성/음이온의 클래스 DoA와 그들의 대사 산물의 상호 보완적인 분석 MSI-CE-MS에 의해 수행 됩니다. 이것은 중요 한 캐나다와 미국의 여러 레크리에이션 마리화나의 합법화의 어렴 풋 한 공중 위생 의미를 주어진입니다. TOF-MS에 의해 전체 스캔 데이터 수집의 중요 한 이점은 이다 소변 표본은 더 이상 후속 테스트에 사용할 수 있는 반면 다른 생활 또는 식이 노출 더 잘 평가 될 수 있다 경우에 샘플의 회고전 분석 수행할 수 없습니다. 약물 치료에 대 한 차동 응답 이해. 요약 하자면, MSI-CE-MS에 의해 급속 한 아직 정확한 약물 감시 방법 방법을 제공 합니다 직접 주입/주변 뿐만 아니라 기존의 타겟된 immunoassays 상당한 이점을 이온화-MS/MS 확인할 때 방해/바이어스 하는 경향이 있는 DoA와 증분 비용에서 복잡 한 생물 학적 샘플에서 그들의 대사 산물의 확장 된 패널.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
7100 Capillary Electrophoresis System	Agilent Technologies Inc.	G7100A	CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation
6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer	Agilent Technologies Inc.	G6230B	HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation
CE-ESI-MS Sprayer Kit	Agilent Technologies Inc.	G1603A	CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette
1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser	Agilent Technologies Inc.	G1310B	Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant
MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01)	Agilent Technologies Inc.	--	Software used for control of CE-MS system
MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01)	Agilent Technologies Inc.	--	Software used for processing of CE-MS data
Shortix Capillary Cutter	Agilent Technologies Inc.	5813-4620	Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries
Capillary Window Maker	Microsolv Inc.	07200-S	Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary
Flexible Fused-silica Capillary Tubing	Polymicro Technologies Inc.	TSP05375	Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD)
Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE)	Cerilliant Inc.	Miscellaneous	Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine)